nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành y sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phổ biến ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển UTV chiếm gần 30% các loại ung thư ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 5 trong số các loại ung thư Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm trên toàn thế giới

có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 465.000 ca tử vong Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong [33] Ở Mỹ, năm 2010, hơn 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và ước tính có tới 39.800 ca tử vong [38] Tại Việt Nam, theo ghi nhận UT giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh tỷ lệ này

là 19,4/100.000 dân, đứng đầu trong các loại UT ở nữ [1] [2] [16]

Mặc dù vào những năm 1990 trở về đõy đó có nhiều tiến bộ trong tầm soát, chẩn đoán sớm và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp UTV được chẩn đoán ở giai đoạn muộn dẫn đến việc điều trị tốn kém về kinh tế cho bệnh nhân mà hiệu quả điều trị lại thấp Các phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker) Mỗi loại phương pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn đoán chính xác và chẩn đoán sớm UTV Trong những năm gần đây, cùng với

sự phát triển mạnh mẽ của ngành y sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã được ứng dụng Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các gen gây UT có tính

chất gia đình, các gen nguy cơ, gen gây UT và các thương tổn đột biến gen đặc hiệu cho UT Việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ cỏc mụ UT qua sinh thiết hoặc phẫu thuật sẽ có nhược điểm lớn là phát hiện muộn khi khối u

đã lớn, gây đau đớn cho bệnh nhân, khó làm nhiều lần, phụ thuộc vào kỹ thuật sinh thiết nên không thể được xem là phương pháp thường quy để chẩn đoán hoặc theo dõi trong quá trình điều trị Do vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu ngoại vi có ưu điểm và đang được các nhà nghiên cứu chú ý Các tế bào UT có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyờn phỏt hoặc các khối u đã di căn, sau đó thâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell -CTC) Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các tế bào UT trước khi cú cỏc biểu hiện lâm sàng Hơn nữa, việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ mẫu máu ngoại vi sẽ có ưu điểm ớt gõy đau đớn cho bệnh nhân, có thể làm nhiều lần

Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu ngoại vi đóng vai trò quan trọng, có thể góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh Một số gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó có mRNA Survivin Gen Survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Protein này được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là protein này không biểu hiện ở cỏc mụ bình thường [4] Có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ thị mRNA của Survivin còn biểu hiện trong các bệnh nhân UT chưa có hạch, do vậy gen Survivin có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm

và tiên lượng UTV Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này trong ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu ngoại vi chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi ” với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng qui trình phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư

vú lưu hành trong máu ngoại vi.

2 Bước đầu nhận xét giá trị của xét nghiệm phát hiện gen Survivin trong chẩn đoán ung thư vú.

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 Khái niệm bệnh và dịch tễ học UTV.

1.1.1 Khái niệm bệnh

Ung thư vú là tên gọi của ung thư có nguồn gốc từ mụ vỳ, phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu thuỳ.UTV có nguồn gốc từ ống sữa được gọi là

UT biểu mô tuyến sữa và UT có nguồn gốc từ tiểu thuỳ được gọi là UT biểu

mô tiểu thuỳ.Cú nhiều dạng UTV khác nhau với trạng thái khác nhau, sự ác tính khác nhau, bản chất di truyền khác nhau và tỷ lệ sống sót khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố này

1.1.2 Dịch tễ học UTV

* Tình hình ung thư vú trên thế giới

Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ

mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều nước Nguy cơ mắc bệnh UTV theo suốt cuộc đời người phụ nữ Tỷ lệ mắc thay đổi nhiều, từ 25-35/100.000 dân tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan và Canada đến 1-5/100.000 dân tại Nhật Bản, Mexico, Venezuela [16] [18] [19]

Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở Mỹ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu,Tõy Âu và thấp nhất ở châu Á UTV có xu hướng tăng lên ở tất cả các nước đặc biệt ở Nhật Bản và Singapore, nơi có lối sống đang được phương Tây hoá và chế độ ăn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển UTV [16] Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 465.000

ca tử vong Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong (Hobday & Perez, 2005) Ở Mỹ năm 2007 có 178.480 ca

mới được xác định mắc bệnh UTV trong đó 40.460 ca tử vong (American cancer society, statistics 2007).

Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau

độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách nhanh chóng (khoảng 6,5% ở tuổi 30-40) Theo thống kê của hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-34 lên đến 200/100.000 dân ở

độ tuổi từ 45-49 [3] Tuy nhiên người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này tăng chậm ở độ tuổi từ 45-50 Điều này gợi ý rằng UTV là loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết Tỷ lệ chết do UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [3] Tuy nhiên, ở một số nước phát triển mặc dù tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức ổn định nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thành tựu đạt được trong điều trị

Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong các năm qua như Nhật Bản, Singapore, một số thành phố của Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở cỏc vựng này phần nào được giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển, ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế

độ ăn

* Tình hình ung thư vú tại Việt Nam

Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT ở Hà Nội, TP Hồ Chí Minh

và một số tỉnh trong nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm 2000 là 17,4/100.000 dõn,đứng đầu trong các loai UT ở phụ nữ Khác với các nước phương tây, ở Việt Nam UTV bắt đầu tăng nhanh ở độ tuổi 35 và đạt tỷ lệ cao nhất ở độ tuổi trước và sau mãn kinh( 45-54 tuổi) rồi sau đó có xu hướng giảm xuống rõ rệt

Tại Việt Nam giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở

Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh và Cần Thơ là 19,4/100.000 dân,

ở Hải phòng là 10,5/100.000 dân, ở Thái Nguyên là 11,6/100.000 dân, ở Huế là 12,2/100.000 dân Đây là loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu ở phụ nữ Việt Nam

Tóm lại, UTV là bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở phụ

nữ trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.2 Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú.

1.2.1 Tiến triển ung thư vú.

Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau giữa các bệnh nhân Đa số các trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô của thùy hoặc của ống dẫn của tuyến vú Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày một chu kỳ Ước tính, từ khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có kích thước 1cm thì phải mất khoảng thời gian vài năm Chỉ một số ít bệnh nhân (< 3%) ngay sau khi xuất hiện các triệu chứng, UTV tiến triển nhanh và tử vong trong vài tháng [4] [5] UTV có khả năng chữa khỏi ở nhiều bệnh nhân nếu bệnh được chẩn đoán trong giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng)

Green Wood, Bloom và CS theo dõi những trường hợp UTV không điều trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ khi chẩn đoán là 31 tháng, tỷ lệ sống thêm 3 năm là 40% và 5 năm là 18 - 20%, có 4% sống thêm 10 năm [3]

Giai đoạn tại chỗ:

Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết của tuyến vú Sau đó phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy

tổ chức tuyến vú bình thường Xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm

mô xung quanh đến các cấu trúc lân cận như da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ và loét da Khi chỳng xõm nhiễm đến cân cơ ngực và thành ngực tạo thành một khối cứng

Giai đoạn lan tràn:

+ Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc,

UTV lan tới các chặng hạch trong đó hạch nách là vị trí hay gặp do đây là vị trí chính dẫn lưu dịch, bạch huyết của vú Tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi đi vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, đám rối này được nối trực tiếp với vú qua mạch máu liên sườn

+ Theo đường máu: Các tế bào UTV có thể di căn đến khắp nơi trong

cơ thể, tuy nhiên UTV thường di căn tới xương, phổi, gan, não Khoảng 20 - 30% các bệnh nhân hạch nách âm tính nhưng có di căn xa chứng tỏ di căn theo đường máu là chủ yếu ở các bệnh nhân này Đôi khi sự lan tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh mạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi Các tế bào UTV thường di căn rất sớm và tại thời điểm chẩn đoán được bệnh không thể phát hiện được các di căn này bằng các phương pháp chẩn đoán hiện có, do vậy vai trò của điều trị toàn thân được đặt ra ngay từ khi bệnh ở giai đoạn sớm [6] [7]

1.2.1.Các giai đoạn của ung thư vú.

* Hệ thống xếp giai đoạn TNM

Dưới đây là hệ thống xếp GĐ (2004) của ủy ban Liên kết chống Ung thư Mỹ (AJCC) [27] Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu trong đó cú cỏc nghiên cứu đa quốc gia áp dụng hệ thống xếp GĐ này

T: U nguyờn phỏt

T0 Không có u nguyờn phỏtTis (UTBM tại chỗ): UTBM nội ống, UTBM thùy tại

chỗ, bệnh Paget núm vú không có u

T1 U có đường kính lớn nhất ≤ 2cm

T2 U có đường kính lớn nhất > 2cm và ≤ 5cmT3 U có đường kính lớn nhất > 5cm

T4 U xâm lấn thành ngực hoặc da bất kể kích thước (thành ngực gồm xương sườn, cơ gian sườn, cơ răng cưa trước, không tính cơ ngực)

N: Hạch vùng

N0 Không di căn hạch vùngN1 Di căn hạch nỏch cựng bờn di độngN2 Di căn hạch nỏch cựng bờn cố định hoặc dính nhau

hoặc di căn hạch vú trong cựng bờn nhưng không di căn hạch nách

N3 Di căn hạch hạ đũn cựng bên có hoặc khụng kốm

hạch nỏch cựng bờn, hoặc di căn hạch vú trong cựng bờn kốm di căn hạch nỏch cựng bờn, hoặc di căn hạch thượng đũn cựng bên có hoặc khụng kốm hạch nách hoặc hạch vú trong cựng bờn

M: Di căn xa

M0 Không di căn xaM1 Có di căn xaPhân loại có những điểm mới: di căn hạch hạ đòn xếp vào N3 (trước không đề cập), di căn hạch thượng đũn khụng xếp M1 nữa mà thành N3 Di căn hạch vú trong trước đây xếp vào N3, nay phân ra khụng kốm đi căn hạch nách (N2b) và kèm di căn hạch nách (N3b)

* Xếp giai đoạn lâm sàng

Bảng 1.1 Phân chia giai đoạn UTV

T3 N0 M0

IIIA

T0 N2 M0T1 N2 M0T2 N2 M0T3 N1 M0T3 N2 M0IIIB

T4 N0 M0T4 N1 M0T4 N2 M0

+ Lâm sàng: khối u và tính chất khối u

+ Chụp tuyến vú

+ Mô bệnh học: chọc hút bằng kim nhỏ

Nếu một trong 3 yếu tố này còn nghi ngờ phải sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định Ngoài 3 phương pháp thông dụng trờn cũn một số phương pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng cho từng trường hợp Hiện nay, do nhiều lý do mà chẩn đoán UTV bằng kỹ thuật sinh học phân tử chưa được ứng dụng rộng rãi, mặc dù kỹ thuật này thường cho kết quả chẩn đoán chính xác và độ tin cậy cao Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân

tử vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV ở phụ nữ

1.3.2 Chẩn đoán phân biệt:

- U xơ tuyến vú: thường gặp ở phụ nữ trẻ, u thường tròn nhẵn, ranh giới rõ ràng, di động Để chẩn đoán phân biệt phải chụp X - quang tuyến vú, làm xét nghiệm mô bệnh học

- Viêm xơ tuyến vú mang hóa: có thể gặp một nang đơn độc hoặc nhiều nang to nhỏ rải rác cả hai bờn vỳ Kích thước có thể to từ vài mm đến 10cm, khi khám có cảm giác cũng phải chẩn đoán phân biệt nhờ vào siêu âm

- Viờm giãn tuyến vú: chảy dịch đầu vú dai dẳng lúc đầu là dịch vàng trong, sau đó có thể bội nhiễm thành dịch vàng mủ hoặc chất bã có mùi hôi, một số khác chảy dịch máu

- Áp xe tuyến vú: có triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau

- Nang sữa: hình thành sau quá trình viêm tắc ống dẫn sữa, nang sữa có thể lỏng nhưng có thể đặc sền sệt

- U nhú nội ống: là những tổn thương trong lòng ống dẫn sữa thường gặp ở những ống dẫn sữa chính, tính chất u tròn, mềm có thể gây chảy dịch, máu qua núm vú

- U mỡ hoặc hoại tử mỡ ở vú: hiếm gặp

- U phyloide lành tuyến vú

1.3.3 Chẩn đoán mô bệnh học

Carcinom chiểm khoảng 90% trong đó:

- Carcinom ống tuyến xâm nhập : 78%

- Carcinom tiểu thùy : 9%

- Carcinomdạng tủy : 1,5%

- Carcinom dạng kéo : 1,5%

- Sarcom, paget không xếp loại, nhưng bệnh paget có khối u được phân loại theo kích thước của u

1.4.Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV

Các quyết định trong điều trị bổ trợ UTV được dựa vào các yếu tố tiên lượng Bên cạnh việc đánh giá các yếu tố tiên lượng kinh điển như kích thước

u, loại mô học, độ mô học, tình trạng hạch nỏch, cỏc nhà nghiên cứu đang có

xu hướng đi sâu về bệnh học phân tử và gen để tìm ra bản chất phát triển của khối u nhằm đưa ra một phương thức điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân

1.4.1 Hạch vùng

Hạch nách: Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan

trọng nhất liên quan đến tỷ lệ tái phát và sống thêm của bệnh nhân UTV Tỷ

lệ sống thêm, tái phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan chặt chẽ với số lượng hạch di căn [8]

1.4.2 Khối u nguyờn phỏt

Kích thước u nguyờn phỏt: Kích thước u nguyờn phỏt cú mối liên quan

với thời gian sống thêm của bệnh nhân và tình trạng di căn hạch vùng Kích thước

u tăng làm tăng hệ thống huyết quản và bach mạch làm tăng nguy cơ di căn

1.4.5 Loại mô học

Hai thể mô học chính của UTBM tuyến vú là loại xâm lấn và loại không xâm lấn Trong hai loại này UTBM thể không xâm lấn có tiên lượng tốt hơn

Ung thư biểu mô tại chỗ bao gồm cả ung thư ống và tiểu thuỳ tại chỗ là loại có thể chữa khỏi hoàn toàn, và chỉ có 1% là di căn căn hạch nách Theo báo cáo của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, loại này chiếm khoảng 6,3% tổng số bệnh nhân UTV

Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập chiếm tỷ lệ cao nhất là 67,9%, tỷ lệ sống thêm chung sau 5 năm ở nhóm này là 79% Ung thư biểu mô thể tiểu thuỳ xâm nhập chiếm khoảng 6,3%, tỷ lệ sống thêm chung sau 5 năm là 82% [9] [10]

1.4.6 Độ mô học (ĐMH)

Độ mô học là một yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù nú khụng sử dụng để đánh giá giai đoạn bệnh Độ mô học dựa vào sự hình thành ống nhỏ,

sự đa hình thái của nhân và hoạt động nhân chia Có rất nhiều hệ thống chia

độ nhưng hệ thống chia độ của Bloom và Richardson có hiệu quả nhất trong tiên lượng bệnh [11]

Bảng 1.2 : Độ mô học theo Scarff - Bloom - Richardson

Mức độ đa dạng

của nhân

Nhân đồng đều Nhân không đồng

đều vừa phải

Nhiều nhõn quỏi

Nhân chia Tối đa 1/ vi trường 2/ vi trường ít nhất 3/vi

trườngTổng cộng : 3,4,5 : xếp độ I - tiên lượng thuận lợi

6 hoặc 7 : xếp độ II - tiên lượng trung bình

8 hoặc 9 : xếp độ III - tiên lượng xấu

1.4.7 Tỷ lệ sống theo giai đoạn

Bảng 1.3 : Tỷ lệ sống thêm theo giai đoạn

1.5 Điều trị ung thư vú

Cho tới nay, việc nghiên cứu điều trị UTV vẫn đang được tiếp tục và ngày càng hoàn thiện Điều trị UTV là sự phối hợp điển hình giữa phương pháp điều trị tại chỗ (phẫu thuật, tia xạ) và điều trị toàn thân (hoá chất, nội tiết miễn dịch)

Trên thực tế lâm sàng, trước khi quyết định áp dụng phương pháp điều trị các thầy thuốc căn cứ vào nhiều yếu tố bao gồm giai đoạn bệnh, thể mô học, độ mô học, tuổi và một số yếu tố khác Giai đoạn bệnh là yếu tố chính quyết định việc lựa chọn phương pháp điều trị [16].

1.6 Các dấu ấn ung thư trong chẩn đoán và theo dõi điều trị UTV.

Dấu ấn ung thư là một nhúm cỏc chất (enyme, hormone, receptor, protein,…v.v) được các tế bào khối u trực tiếp sản xuất hoặc do các tế bào bình thường sản xuất do tác động kích ứng của các tế bào ung thư đi vào vòng tuần hoàn và có thể được sử dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư Các dấu ấn huyết thanh gồm CEA, CA 15-3, và CK-BB Cỏc mụ có thể được phân tích đối với các receptor estrogen và progesterone, receptor của yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor- EGF), Sự lựa chọn cách điều trị phụ thuộc vào các định lượng trên

1.6.1 Dấu ấn có bản chất là protein.

Nhiều protein huyết thanh do tế bào UT sản xuất ra lưu thông trong mỏu đó được sử dụng như dấu ấn UT Dấu ấn là protein thường đặc hiệu hơn dấu ấn là enzyme, hormone và dễ phát hiện hơn so với các dấu ấn khác vì vậy được sử dụng khá phổ biến Tuy nhiên để chẩn đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa

- CEA (Carcino Embryonic Antigen) được Gold và Freedman mô tả lần

đầu tiên vào năm 1965, là kháng nguyên ung thư bào thai có bản chất là glycoprotein CEA được sản xuất trong thời kỳ bào thai đặc biệt ở dạ dày, tụy

và gan Sau khi sinh chỉ tồn tại với hàm lượng rất trong huyết thanh của người bình thường và tăng cao trong một số loại ung thư CEA được coi là dấu ấn đặc hiệu cho ung thư đại tràng, tuy nhiên CEA còn thấy tăng trong ung thư

vú, đường tiờu hoỏ, phổi, buồng trứng, tụy và tuyến tiền liệt Hơn nữa, nó cũng tăng lên ở người nghiện rượu, viêm ruột, xơ hoá bàng quang (cystic

fibrosis) và ở những người hút thuốc lá nặng Mặc dù CEA không đặc hiệu cho chẩn đoán, nhưng có giá trị tiên lượng và theo dõi điều trị Việc định lượng CEA ở những bệnh lý u khác nhau cho phép đánh giá về khả năng sử dụng và xác lập giá trị giới hạn của nó trong từng trường hợp cụ thể Nồng độ CEA cao sau điều trị là cơ sở nghĩ đến sự tiến triển của khối u hay di căn.

- CA 15-3 (Carbohydrat Antigen) bản chất là một glycoprotein không

đặc hiệu nhưng nhạy cảm đối với UTV Bình thường có trong huyết thanh người với nồng độ 30 U/ml, CA 15-3 tăng kèm theo phosphatase kiềm dự báo khả năng tái phát của UTV Do vậy CA 15-3 thường được sử dụng để sàng lọc, theo dõi điều trị và phát hiện tái phát UTV sau giai đoạn điều trị

1.6.2 Dấu ấn có bản chất là enzym.

Các xét nghiệm về enzyme huyết thanh để chẩn đoán UT thường có độ đặc hiệu kém do vậy hiện nay rất ít được sử dụng trong chẩn đoán Enzym CK-BB là enzyme được sử dụng trong chẩn đoán UTV Tuy nhiên để chẩn đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa

- Creatine kinase: Isoenzyme creatine kinase BB (CK1, CK-BB) có

trong huyết thanh nguồn gốc từ não và liên quan đến nhiều bệnh ung thư ác tính CK-BB tăng trong huyết thanh trong một số bệnh UT ác tính như: UTV,

UT buồng trứng, UT não, UT phổi, CK-BB trong huyết thanh bệnh nhân UTV di căn khoảng 13% Tuy nhiên CK-BB trong huyết thanh không đặc hiệu Isoenzym CK-BB được phát hiện và định lượng nhờ điện di

1.6.2 Dấu ấn có bản chất là receptor.

Các receptor của tế bào là các cấu trúc protein khu trú trờn cỏc màng ngoài của tế bào Chức năng của receptor là nhận biết và gắn đặc hiệu vào các chất gắn (ligand) như hormone Phức hợp ligand- receptor sau đó mở đầu cho một đáp ứng sinh học ở tế bào đích Có nhiều loại receptor khác nhau, mỗi loại receptor gắn với một chất gắn đặc hiệu khởi đầu cho một đáp ứng tế bào riêng biệt Các receptor có chức năng phù hợp đối với sự điều hòa hoạt động bình thường của tế bào Sự sản xuất các receptor được điều hòa một phần bởi nồng độ của ligand Có những thiếu hụt receptor do quá trình tổng hợp hoặc suy giảm chức năng của receptor do di truyền, hoặc do sự rối loạn tự miễn dịch (kháng thể trực tiếp chống lại receptor) Rất nhiều khối u ác tính gây những biến đổi về chức năng và số lượng receptor nờn cỏc receptor có thể được sử dụng như dấu ấn UT Các dấu ấn có bản chất là receptor thường được

sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị đú cỏc receptor estrogen và progesterone, receptor của yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor- EGF) Có hai phương pháp cơ bản để định lượng receptor của tế bào: Định lượng trên mẫu mô sinh thiết hoặc tổ chức u sau khi phẫu thuật cắt bỏ

- Thụ thể estrogen và progesteron (ER và PR): ER và PR đã được

nghiên cứu rộng rãi khoảng 10 năm trở lại đõy Cỏc ER và PR được định lượng trong lâm sàng để xác định các bệnh nhân bị UTV có thể đáp ứng với phương pháp điều trị bằng hormon Có khoảng 50 - 85% các khối u nguyờn phỏt và 45 - 55% các u di căn có ER dương tính Có nhiều nghiên cứu cho thấy giảm tỷ lệ tử vong và tái phát từ 20% - 30% ở những BN có ER (+) được điều trị nội tiết bổ trợ Khi cả ER và PR (+) khoảng 80% trường hợp u sẽ đáp ứng với phương pháp điều trị nội tiết Những u càng biệt hoá cao thì tỷ lệ dương tính với ER và PR cao Những ung thư biểu mô dương tính với ER và PR có tiên lượng tốt hơn so với những u âm tính với hai thụ thể này [5] [8] [29]

- Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor

receptor- EGFR): là thụ thể của các yếu tố sinh trưởng biểu mô (EFG) và yếu

tố biến đổi sinh trưởng tế bào α (transforming growth factor α TGF-α) Họ thụ thể của các yếu tố sinh trưởng gồm các thụ thể: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), HER3/c-neu (ErbB-3), HER4/c-neu (ErbB-4) Sự vắng mặt của thụ thể này tỉ lệ thuận với một đáp ứng tốt với tamoxifen Nồng độ cao của thụ thể có liên quan đến sự tái phát khối u và sự sống sót của bệnh nhân UTV

1.6.3 Gen đặc hiệu trong UTV.

Các gen gây UT của tế bào (gen ung thư tế bào) là các gen bình thường

có liên quan tới sự sinh trưởng, tăng sinh, biệt hóa và hoạt hóa phiờn mó Cỏc gen gây UT của tế bào có thể biểu hiện một cách bất thường bởi sự đột biến gen hoặc do sự sắp xếp lại/sự chuyển vị, khuyếch đại biểu hiện gen hoặc thông qua việc mất các yếu tố điều hoà kiểm soát sự biểu hiện Với các khiếm khuyết đú thỡ chỳng được gọi là gen gây UT Sự biểu hiện lầm lạc sẽ phát triển sự tăng sinh tế bào và gây ác tính Tới nay đó cú 60 gen gây UT đã được xác định có liên quan với nhiều loại khối u trong đó có UTV Đầu thập kỷ 90, bắt đầu cú cỏc chương trình nghiên cứu về gen được tiến hành, trong đó có 3 gen được tập trung nghiên cứu và có khả năng liên quan nhiều đến UTV là BRCA1 ( breast cancer 1), BRCA2 và p53.Gen BRCA1 là gen ức chế khối u nằm trờn nhỏnh dài của NST 17 có vai trò trong sửa chữa DNA, một số nghiên cứu cho rằng có khoảng 80- 90% gặp đột biến gen này và gặp ở những gia đình có UTV và UT buồng trứng Gen BRCA2 nằm trờn nhỏnh dài của NST 13 có vai trò cố định các tổn thương DNA Gen BRCA2 chiếm khoảng 35-40% UTV mang tính di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình

bị UTV Gen p53 là gen ức chế khối u nằm trên NST 17 tham gia vào quá trình điều hòa chu kỳ tế bào và ức chế sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) gây hậu quả ác tính ở rất nhiều tế bào đích và các cơ quan Đột

biến gen p53 được tìm thấy khoảng gần 30% trong UTV hay gặp ở người trẻ ,độ mô học cao,thụ thể nội tiết âm tính, nhìn chung có tiên lượng xấu Cho đến nay bằng kỹ thuật PCR và hiện đại hơn là RT- PCR, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều gen mà sự thể hiện của nó đánh giá mức bệnh UTV: Cytokeratin

19 (CK 19), Cytokeratin 20 (CK 20), mammaglobin (hMAM), c-Met, maspin, thụ thể yếu tố phát triển biểu mô( EGFR), Her-2/neu, MUC1, Survivin, CD44, human telomerase ( hTERT) và CEA Theo những giả thuyết trước đây, sự di căn của các tế bào ung thư chỉ xảy ra ở giai đoạn muộn, các tế bào ung thư vú có thể di căn tới hạch bạch huyết trước khi tới máu ngoại vi và tổ chức khác Nhưng ngày nay người ta đã chứng minh được rằng di căn xảy ra chỉ khoảng 50% bệnh nhân UTV tại chỗ, và 30% bệnh nhân UTV với hạch bạch huyết âm tính sẽ vẫn có di căn xa trong vòng 5 năm [34] [35] [36] [37] Hiện nay bằng kỹ thuật sinh học phân tử với độ nhạy cao, các nhà khoa học

đã chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ các khối u, sau đó xâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi từ giai đoạn rất sớm trước khi có biểu hiện lâm sàng Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC) mang gen đặc trưng khối u mà ở người bình thường không có Sự xuất hiện và di chuyển của các khối u vào máu ngoại vi bao gồm nhiều giai đoạn Ban đầu các tế bào ung thư phát triển nhanh, cần nhiều oxy nên phát triển xâm lấn Các tế bào này có mật độ thụ thể trên bề mặt thấp dẫn tới sự giảm liên kết với nhau và chống lại quá trình chết theo chương trình Kết quả là các tế bào này có khả năng sống sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào mỏu Trờn mô hình nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10 000 CTC Kết quả này mở ra triển vọng có thể phát hiện sớm khối u dựa vào việc phát hiện các CTC mang những gen chỉ thị đặc trưng cho khối u lưu hành trong mỏu.Vỡ thế bên cạnh

việc tìm ra các dấu ấn ung thư có bản chất là protein, các dấu ấn ung thư là các gen đặc hiệu có thể góp phần chẩn đoán sớm UTV.

Gen Survivin trong ung thư vú.

Hình 1.4 Gen Survivin

Survivin là protein được mã hóa bởi gen BIRC5 Survivin là một protein thuộc nhóm chất ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (IAP) Survivin được phát hiện vào năm 1997 bởi kỹ thuật Hybridization Screening từ thư viện hệ gen của người Chức năng protein Survivin ức chế hoạt hoá caspase là enzyme thủy phân protein, điều hòa sự phân chia tế bào

và thúc đẩy quá trình hình thành mạch, từ đó dẫn đến ức chế quá trình apoptosis Gen Survivin có chiều dài 15kb, nằm ở vị trí NST 17q25 Gen Survivin có 3 intron và 4 exon, mã hóa cho protein gồm 142 aa với TLPT vào khoảng 16,5 kDa Survivin được biểu hiện rất cao trong quá trình phát triển phôi, bào thai và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV Điều đặc biệt có

ý nghĩa là các protein này không phát hiện được trong mô của người bình thường [28] Kiểu biểu hiện của protein này và chức năng ức chế quá trình apoptosis cho thấy vai trò quan trọng của Survivin đối với việc duy trì sự sống của tế bào ung thư và kiểm soát quá trình apoptosis [31] Survivin biểu hiện cao nhất trong cỏc dũng tế bào UTV và UTP và thấp hơn nhiều trong các UT khác [30] mRNA Survivin đã được phát hiện tới 69,2% -93,8% của UTV giai đoạn đầu [24] Chớnh vì lý do này mà Survivin có thể là một mục tiêu lý tưởng trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi điều trị UTV

1.7 Các kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng trong nghiên cứu.

Phản ứng PCR điển hình cú cỏc thành phần sau: DNA polymerase, khuôn mẫu DNA, các đoạn mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược, các deoxynucleoside triphosphat, dung dịch đệm, các cation hóa trị 2 (thường sử dụng Mg2+), cation hóa trị 1(thường là K+) Tổng thể tích cho một phản ứng PCR thường từ 15-100àl

* Nguyên tắc thiết kế mồi

Mồi có ý nghĩa quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và hiệu quả cao, việc chọn mồi là yếu tố quyết định ở PCR và phải theo một số nguyên tắc:

- Độ dài của mồi khoảng 18-30 nucleotides để đảm bảo sự đặc hiệu cho trình tự DNA cần gắn kết

- Thành phần GC khoảng 40-60%, không có poly G hoặc poly C, có G hoặc C ở đầu 3’ và có ít nhất một A hoặc T trong 3 base cuối

- Không có bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và ngược, không tạo cấu trúc

“kẹp túc” do bắt cặp bổ sung các thành phần khác nhau của mồi

- Nhiệt độ chảy (Tm) của mồi xuôi và ngược nên tương đương, không cách biệt quá xa, nhiệt độ bắt cặp (Ta) thấp hơn Tm khoảng 5ºC [12] [13] [15] [25].

- Khởi đầu: cho nhiệt độ tăng đến 94-98oC, kéo dài 1-9 phút

- Biến tính: là bước đầu tiên của các chu kỳ lặp lại, ở nhiệt độ 94-98oC sẽ phá vỡ nối hydrogen của chuỗi đôi DNA tạo thành các chuỗi đơn

- Bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55-65oC để các đoạn mồi bắt cặp bổ xung vào hai đầu của đoạn DNA đích

- Kéo dài chuỗi: nhiệt độ phụ thuộc vào DNA polymerase sử dụng, thường là 72oC, thích hợp cho hoạt tính của DNA polymerase kộo cỏc dNTPs lại đầu 3’của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để tổng hợp mạch bổ xung mới

- Kéo dài kết thúc: thường được thực hiện ở nhiệt độ 70-74oC trong 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo tất cả các chuỗi đơn DNA được kéo dài đủ

- Giữ nhiệt kết thúc: ở nhiệt độ 4-15oC, thời gian không cố định để lưu giữ phản ứng trong thời gian ngắn

Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đớch đó được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25-35 lần thì từ 1 DNA đích sẽ được khuếch đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao [12] [13] [25].Thông thường tổng số chu kỳ dưới 30,nếu càng kéo dài thì khả năng xảy ra đột biến càng cao và tạo sản phẩm PCR ngoài mong muốn

1.7.2 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

RT-PCR(hay còn gọi là phiờn mó ngược PCR) là một kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên chuỗi DNA bổ sung (cDNA), gồm có 2 giai đoạn: 1) Giai đoạn thứ nhất tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ RNA dưới tác dụng của enzyme phiờn mó ngược và các mồi oligo-(T) hoặc các mồi ngẫu nhiên; 2) giai đoạn nhân bản gen quan tâm từ cDNA bằng PCR với các mồi đặc hiệu

Nguyên liệu của quá trình này là dNTP với sự tham gia của enzyme phiên mã ngược MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Trancriptase) và các thành phần khác như : Taq polymerase, dung dịch đệm PCR, mồi ngẫu nhiên (Random primer), chất ức chế enzyme RNA (RNAase inhibitor), protease inhibitor, nước cất

RT-PCR bao gồm ba bước chính:

- Bước đầu tiên là phiên mã ngược (RT), trong đó RNA được phiờn mó ngược để tổng hợp cDNA dưới tác dụng của enzyme phiờn mó ngược Bước này rất quan trọng để thực hiện phản ứng PCR bởi vì DNA polymerase có thể hoạt động chỉ trờn khuụn DNA Bước RT sử dụng nhiệt độ từ 40°C và 50°C, phụ thuộc vào các tính chất của enzyme phiờm mó ngược được sử dụng

- Bước tiếp theo liên quan đến việc biến tính của DNA ở 95°C, hai sợi khác nhau và mồi có thể gắn kết lại ở nhiệt độ thấp hơn và bắt đầu một phản ứng dây chuyền mới Sau đó, nhiệt độ giảm cho đến khi nó đạt đến nhiệt độ gắn mồi có thể thay đổi tùy theo cặp mồi được sử dụng, nồng độ mồi, các đầu

dò và nồng độ của nó (nếu sử dụng), và nồng độ các cation Tất nhiên điều quan trọng khi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu là nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi và đầu dò (nếu sử dụng) Nhiệt độ gắn mồi chọn cho PCR phụ thuộc trực tiếp vào chiều dài và thành phần của mồi Đây là kết quả của sự khác biệt của các liên kết hydro giữa AT (2 liên kết) và GC (3 liên kết) Thường sử dụng nhiệt độ gắn mồi thấp hơn Tm khoảng 5oC

- Bước cuối cùng là nhân bản gen quan tâm bằng PCR là kéo dài DNA nhờ Taq DNA polymerase chịu nhiệt ở 72°C, tại đó các enzyme hoạt động tối ưu

1.7.3.Phương pháp giải trình tự DNA

Giải trình tự DNA giúp xác định trình tự của các nucleotide (A, G, C, T) trong một chuỗi DNA oligonucleotide Năm 1975, trình tự DNA bộ gen đầu tiên được xác định là bacteriophage ỉX174 dài 5kb Lần lượt sau đó các trình tự DNA khác được xác định là virus SV40 (dài 5kb, năm 1977), DNA ti thể người (16kb, 1981), bacteriophage lambda (47kb, 1982) Đến năm 1995,

trình tự bộ gen sinh vật đầu tiên được xác định là vi khuẩn Haemophilus

influenza với kích thước 1800kb Chỉ 6 năm sau đó, HGP (Human Genome

Project) và công ty tư nhân Celera đã xác định được trình tự DNA bộ gen người với độ dài không dưới 3 tỷ cặp base Cuộc cách mạng này đã tạo điều kiện phát triển kỹ thuật giải trình tự DNA số lượng lớn [25]

Trước đây, sử dụng 2 phương pháp giải trình tự bằng tay:

- Phương phỏp hoá học của Maxam- Gilbert

- Phương pháp enzyme của Sanger và cộng

* Phương pháp Maxam-Gilbert

Năm 1976-1977, Allan Maxam và Walter Gilbert đã xây dựng một phương pháp giải trình tự DNA dựa vào biến đổi hóa học của DNA và cắt liên tiếp các vị trí base đặc hiệu Với phương pháp này, DNA có thể được sử dụng trực tiếp sau khi được tinh sạch

Trước hết, DNA cần giải trình tự được đánh dấu một đầu bằng phospho đồng vị phóng xạ (32P) Sau đó chúng được chia làm 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn được xử lý hóa học chuyên biệt biến đổi một loại nucleotide và cắt phân

tử DNA tại nucleotide đó Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C Kết quả xử lý hóa học là tạo 5 nhóm oligonucleotide, các oligonucleotide trong một nhúm cú kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide Các đoạn này được phân tích bằng điện di