Sự kiện MON 89034 và đánh giá an toàn sinh học giống ngô MON89034 tại Mỹ

- Năm 2010, MON 89034 được thương mại hóa ở Mỹ với thương hiệu "YieldGard™ VT Pro™" - Tính trạng biểu hiện liên quan đến gen chuyển: Sự kiện MON 89034 được tạo ra bằng phương pháp chuyển

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mục lục

I Đặt vấn đề

II Nội dung

1 Giới thiệu – Mô tả sự kiện

2 Các nội dụng đánh giá an toàn sinh học đối với sự kiện MON 89034

3 Hiện trạng cấp phép đối với sự kiện MON 89034

III Kết luận

I Đặt vấn đề

Bạn đã bao giờ nhìn thấy lá cây bị các loài sâu bệnh thực vật tàn phá hoặc chứng kiến mùa màng bị mất trắng do côn trùng tấn công chưa ? Sâu bệnh thực vật gây rarất nhiều vấn đề cho người nông dân cũng như những người làm vườn Vì vậy, những người nông dân chỉ còn cách liên tục phun thuốc trừ sâu lên các cây trồng của mình Tuy nhiên, thật không may là một số loại thuốc trừ sâu đã gây ra những ảnh hưởng đến sức khỏe của những người tiếp xúc với chúng

Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang tìm cách nghiên cứu những biện pháp mới trong việc phòng chống bệnh thực vật Một trong những biện pháp đã được thực hiện là biện pháp chuyển gen BT vào cây ngô

BT, viết tắt của Bacillus thuringiensis, là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập

ở vùng Thuringia, Đức Bt có khả năng tổng hợp protein gây tê liệt ấu trùng của một số loài gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô Châu

Á và Châu Âu Chúng đều là những loài sâu hại thực vật phổ biến và có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng

3

Vi khuẩn

Trên thế giới có 14 sự kiện chuyển gen Bt ở cây ngô

Event Company Description

176 Syngenta

Seeds, Inc

Insect-resistant maize produced by

inserting the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensissubsp kurstaki The genetic

modification affords resistance to attack bythe European corn borer (ECB)

Insect-resistant and herbicide tolerant maize produced by inserting

the cry1Ab gene fromBacillus thuringiensis subsp kurstaki, and the

fromBacillus thuringiensis subsp tolworthi

and phosphinothricin acetyltransferase

(PAT) from Streptomyces hygroscopicus.

DAS-06275-8

DOW AgroSciences LLC

Lepidopteran insect resistant and glufosinate ammonium herbicide-tolerant maize variety produced by inserting

the cry1F gene fromBacillus thuringiensis var aizawai and the

Event Company Description

phosphinothricin acetyltransferase (PAT)

from Streptomyces hygroscopicus.

DAS-59122-7

DOW AgroSciences LLC and Pioneer Hi-Bred

International Inc

Corn rootworm-resistant maize produced

by inserting

the cry34Ab1 and cry35Ab1 genes from Bacillus thuringiensis strain

PS149B1 The PAT encoding gene

from Streptomyces viridochromogenes was

introduced as a selectable marker

DBT418 Dekalb

Genetics Corporation

Insect-resistant and glufosinate ammoniumherbicide tolerant maize developed by inserting genes encoding Cry1AC protein

from Bacillus thuringiensis subsp kurstaki

and phosphinothricin acetyltransferase

(PAT) from Streptomyces hygroscopicus

MIR162 Syngenta

Seeds, Inc

Insect-resistant maize event expressing a

Vip3A protein from Bacillus thuringiensis and the Escherichia coli PMI

selectable marker

MON80100 Monsanto

Company

Insect-resistant maize produced by

inserting the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensissubsp kurstaki The genetic

modification affords resistance to attack bythe European corn borer (ECB)

MON802 Monsanto Insect-resistant and glyphosate herbicide

5

Event Company Description

Company tolerant maize produced by inserting the

genes encoding the Cry1Ab protein

fromBacillus thuringiensis and the

Corn root worm resistant maize produced

by inserting the cry3Bb1 gene from Bacillus

thuringiensis subsp kumamotoensis.

MON88017 Monsanto

Company

Corn rootworm-resistant maize produced

by inserting the cry3Bb1 gene from Bacillus

thuringiensis subspecies kumamotoensisstr

ain EG4691 Glyphosate tolerance derived

by inserting a phosphate synthase (EPSPS) encoding

5-enolpyruvylshikimate-3-gene from Agrobacterium

Event Company Description

tumefaciens strain CP4.

MON89034 Monsanto

Company

Maize event expressing two different

insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis providing resistance to

number of lepidopteran pests

TC1507 Mycogen (c/o

Dow AgroSciences); Pioneer (c/oDupont)

Insect-resistant and glufosinate ammoniumherbicide tolerant maize produced by

inserting the cry1F gene from Bacillus thuringiensis var aizawai and the

1 Giới thiệu và mô tả sự kiện MON 89034

1.1 Mô tả sự kiện

- MON 89034 là một giống ngô chuyển gen Bt của công ty Monsanto

- Bộ Nông nghiệp Mỹ đã cấp phép cho sự kiện MON 89034 vào ngày 24 tháng 7 năm 2008

- Năm 2010, MON 89034 được thương mại hóa ở Mỹ với thương hiệu

"YieldGard™ VT Pro™"

- Tính trạng biểu hiện liên quan đến gen chuyển:

Sự kiện MON 89034 được tạo ra bằng phương pháp chuyển gen nhờ chủng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens ABI, sử dụng plasmid PV-ZMIR245, biểu hiện

của 2 protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 mang đặc tính kháng đối với một số loài sâu

hại bộ Cánh vảy (Lepidoptera), như sâu đục thân (Ostrinia sp.), sâu đục bắp

(Helicoptera sp.) và sâu khoang (Spodoptera sp.).

1.2 Sinh vật nhận gen

Dòng ngô sử dụng trong chuyển gen tạo sự kiện MON 89034 là dòng thuần

LH172 Dòng thuần LH172 được biết đến như là một trong số ít các dòng ngô có

khả năng thích ứng với chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và

khả năng tái sinh cao Vật liệu sử dụng để chuyển gen là các phôi non của dòng LH172 được phân lập riêng rẽ

1.3 Vector chuyển gen

Sự kiện MON 89034 sử dụng plasmid vector PV-ZMIR245

Plasmid vector PV-ZMIR245 là một vector chuyển gen nhị thể gồm 2 T-DNA riêng biệt T-DNA thứ nhất, được gọi là T-DNA I, có chứa 2 cấu trúc biểu hiện gen

cry1A.105 và cry2Ab2 T-DNA thứ hai, được gọi là T-DNA II, chứa cấu trúc biểu hiện gen nptII mã hóa enzyme neomycin phosphotransferase kháng neomycin và

paromomycin Trong quá trình chuyển gen, cả 2 T-DNA được chèn vào hệ gen ngô

sử dụng làm giống nền Sau đó, bằng phương pháp chọn giống truyền thống chọn

ra các cây trồng chỉ mang T-DNA I (chứa các cấu trúc biểu hiện gen cry1A.105 và cry2Ab2).

Kết quả là tạo ra sự kiện MON 89034 kháng sâu bộ Cánh vảy - không chứa chỉ thị

chọn lọc phân tử nptII.

9

T-DNA I:

Trong sự kiện MON 89034, T-DNA I chứa 2 cấu trúc biểu hiện gen cry1A.105 và cry2Ab2 có mang tính trạng kháng sâu bộ Cánh vảy.

Gen cry1A.105 và protein Cry1A.105

Gen cry1A.105 mã hóa protein Cry1A.105 Protein Cry1A.105 trong sự kiện MON

89034 có trọng lượng phân tử là 133 kDa, gồm 1177 axit amin Cry1A.105 là một protein Bt cải tiến gồm các miền (domain) I và II từ protein Cry1Ab hoặc Cry1Ac (protein Cry1Ab và Cry1Ac có trình tự axit amin ở miền I và miền II giống hệt nhau), miền III từ protein Cry1F và miền đầu cuối C (C-terminal domain) từ

protein Cry1Ac Các protein Cry1Ab, Cry1Ac, và Cry1F được biết đến rộng rãi vớiđặc tính kháng sâu hại bộ Cánh vảy

Về tổng thể, sự tương đồng về trình tự axit amin của protein Cry1A.105 so với các protein Cry1Ab, Cry1Ac, và Cry1F tương ứng là 90,0%, 93,6% và 76,7% Theo cơ

sở phân loại của các protein Bt tinh thể đã được thừa nhận thì protein Cry1A.105

có thể được xếp vào nhóm protein Cry1Ac dựa trên tính tương đồng rất cao của chúng

Protein Cry1A.105 trong sự kiện MON 89034 có cấu trúc và chức năng tương tự như các protein Cry1A sản sinh ra trong cây trồng chuyển gen (ví dụ, ngô kháng sâu đục thân YieldGard, bông kháng sâu Bollgard® và BollgardII®) đã được khẳng định có lịch sử sử dụng an toàn

11

Gen cry2Ab2 và protein Cry2Ab2

Gen cry2Ab2 mã hóa protein Cry2Ab2 Protein Cry2Ab2 trong sự kiện MON

89034 là một protein thuộc nhóm protein Cry2Ab với 98,9% trình tự axit amin

tương đồng và là biến thể của protein Cry2Ab2 phân lập từ loài phụ Bacillus

thuringiensis subsp kurstaki với sự khác nhau là 01 axit amin duy nhất.

Protein Cry2Ab có 88% trình tự axit amin tương đồng với protein Cry2Aa - thành phần của các chế phẩm vi sinh mang đặc tính kháng sâu Dipel® và Crymax® có lịch sử sử dụng an toàn

T-DNA II:

Ngoài trình tự T-DNA I mang 2 cấu trúc gen cry1A.105 và cry.2Ab2, sự kiện MON

89034 còn mang trình tự T-DNA II chứa gen nptII kháng kháng sinh Trình tự

TDNA II này sẽ bị phân ly ở thế hệ F1 của sự kiện MON 89034

Gen nptII mã hóa protein neomycin phosphotransferase II (NPT II):

Gen nptII có tác dụng làm bất hoạt các loại kháng sinh là kanamycin, neomycin và paromomycin Việc sử dụng gen chọn lọc như nptII là cần thiết trong quá trình

chọn lọc các tế bào chuyển nạp trong môi trường nuôi cấy chọn lọc Trong môi

trường có bổ sung paromomycin thì chỉ có các tế bào chuyển nạp mang gen nptII

có khả năng sống sót, trong khi các tế bào không mang gen nptII sẽ bị chết do ảnh hưởng của kháng sinh paromomycin này Trình tự cấu trúc biểu hiện gen nptII bao

gồm các nguyên tố di truyền là promoter (P-e35S) của vùng 35SRNA của virus gây bệnh khảm ở súp lơ (CaMV) Trình tự mã hóa protein NPTII còn có mặt đầu

3’của gen tổng hợp hợp chất noplalin (nos) từ Agrobacterium tumefaciens đóng vai

trò kết thúc phiên mã và là tín hiệu gắn chuỗi polyA được chứa vùng tăng cường sao mã

1.4 V i khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gram âm, gây bệnh khối u ở thực

vật 2 lá mầm, có hệ thống Ti-plasmid được ứng dụng phổ biến trong CNSH Cho đến nay, chưa có thông tin, hay thực tế chứng minh Agrobacterium.sp gây bệnh trên người

1.5 Sơ đồ cấu trúc các nguyên tố di truyền đoạn gen chèn vào tạo sự kiện MON 89034

Sơ đồ cấu trúc các nguyên tố di truyền của đoạn gen được chèn vào trong sự kiện MON 89034 được xác định bằng phương pháp PCR Có 7 cặp mồi sử dụng để khuyếch đại được thiết kế trên nguyên tắc khuyếch đại liên tiếp từ đầu đến cuối vùng chèn vào (có độ dài 9.3 kb)

1.6 Quá trình chuyển gen

Sự kiện MON 89034, ngô Bt kháng sâu bộ Cánh vảy được tạo ra bằng phương

pháp chuyển gen nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ABI, sử dụng

plasmid PV-ZMIR245 Dòng ngô sử dụng trong chuyển gen tạo sự kiện MON

89034 là dòng thuần LH172 Vật liệu sử dụng để chuyển gen là các phôi non của dòng LH172 được phân lập riêng rẽ

Sau giai đoạn nuôi ủ trên môi trường nuôi cấy, các phôi non được chuyển sangmôi trường nuôi cấy chọn lọc có chứa chất kháng sinh carbenicillin (để loại bỏ vi

khuẩn Agrobacterium), và paromomycin (để loại bỏ các tế bào không được chuyển

gen) Trên môi trường chọn lọc này, chỉ những phôi có chứa cấu trúc chuyển gen (T-DNA II hoặc/và chứa tổ hợp T-DNA I + T-DNA II) có khả năng sống sót và tái sinh Các tế bào thu được này sau đó được tiếp tục nuôi cấy trong những môi trường chọn lọc nhiều lần để tạo thành sự kiện ngô chuyển gen MON 89034 theo như quy trình đã được mô tả bởi Armstrong và Phillips (1998)

Trong quá trình chọn giống tiếp theo, các cây trồng có đoạn chèn riêng biệt TDNA

15

I hoặc T-DNA II bị phân ly Các cây trồng có chứa đoạn chèn T-DNA I (mang các

cấu trúc gen cry1A.105 và cry2Ab2) được chọn lọc bằng phân tích phân tử, trong khi các cây trồng mang cấu trúc biểu hiện nptII (T-DNA II) bị loại bỏ qua quá trình

chọn giống truyền thống Các phân tích phân tử như lai Southern hay ELISA sau

này cũng đã khẳng định gen nptII đã được loại bỏ hoàn toàn và không có sự hiện

diện của protein NPTII trong sự kiện MON 89034

2 Các nội dung đánh giá an toàn sinh học đối với sự kiện MON 89034

2.1 Đánh giá an toàn sinh học của sự kiện MON 89034 đối với sức khỏe con người

a Đánh giá thành phần và giá trị dinh dưỡng của sự kiện MON 89034

Phân tích tiến hành trên 77 hợp chất trong đó có 9 hợp chất trong thân, 68 hợp chấttrong hạt và được tiến hành đối chứng với 5 giống được thu thập từ 5 địa điểmkhảo nghiệm ở Hoa Kì và Argentina (2004-2005)

17

 Đánh giá thành phần hợp chất trong hạt và thân ngô MON 89034:

 Trong thân: proximates (protein, chất béo, tro và độ ẩm); chất xơ tẩy rửaaxit(ADF), chất xơ tẩy rửa trung tính(NDF); khoáng chất(Ca, P);carbonhydrate

 Trong hạt: proximate (protein, chất béo, tro, và độ ẩm); ADF; NDF; tổngxơ(TDF); axit amin; axit béo (C8-C22); vitamin (B1, B2, B6, E, niacin,

và axít folic); các chất chống dinh dưỡng (axít phytic và raffinose); chấtchuyển hóa thứ cấp (axít ferulic, axít p-coumaric, 2-furaldehyde); khoángchất (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, P, K, Na và Zn); carbonhydrate

 Kết quả: phân tích 61 hợp chất cho thấy 58/61 hợp chất (chiếm 95%) không có sự khác biệt và 3 hợp chất có ý nghĩa thống kê giữa MON

89034 và đối chứng.

 Đánh giá dinh dưỡng trong hạt và thân ngô MON 89034:

 Phân tích hàm lượng chất dinh dưỡng phát hiện có 3 hợp chất sai khácPhotpho, axit stearic, axit arachidic trong hạt

 Sự khác biệt này tương đối nhỏ (3,4-19,2) và có thể coi là kết quả biếnđổi tự nhiên bởi vì giá trị trung bình nằm và khoảng dao động nằm trongdung khai 99% của giống ngô thương mại

 Hàm lượng dinh dưỡng tương dương với giống ngô truyền thống Việc chuyển gen Cry1A.105 và gen Cry2Ab2 tạo ngô MON 89034 không làm thay đổi thành phần hợp chất và giá trị dinh dưỡng của thân, hạt so với đối chứng.

b Đánh giá khả năng gây ngộ độc của sự kiện MON 89034

- Protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 được phân lập từ chủng vi khuẩn Bt, vikhuẩn đã được thương mại hóa tại Hoa Kỳ từ năm 1958 để sản xuất các chếphẩm vi sinh có hoạt tính kháng sâu và là các sản phẩm có lịch sử sử dụng

an toàn hơn 45 năm qua

- Protein Cry1A.105 không có sự tương đồng với các chất gây độc, chất cóhoạt tính gây độc có ảnh hưởng bất lợi đối với sức khỏe con người và vậtnuôi đã biết

- Protein Cry2Ab2 trong sự kiện MON 89034 được phân lập từ loài phụ Bt kurstaki với sự khác nhau là 01 axit amin duy nhất so với loài dại Protein Cry2Ab có 88% trình tự tương đồng với protein Cry2Aa là thành phần của các chế phẩm vi sinh mang đặc tính kháng sâu Dipel® và Crymax®)

Protein Cry2Ab2 sản sinh trong sự kiện ngô MON 89034 và bông BollgardII

là hoàn toàn tương đồng với nhau về trình tự axit amin Bông BollgardII đã được thương mại hóa từ năm 2003 và cho đến nay chưa có một tài liệu nào công bố về ảnh hưởng bất lợi của sự kiện bông này

- Khả năng gây ngộ độc cấp tính của protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 đượcnghiên cứu trên chuột: cho chuột ăn hàm lượng protein Cry là 2072 và 2198mg/kg trọng lượng cơ thể chuột nhưng không có bất kỳ biểu hiện ngộ độccấp tính nào

- Mức độ phơi nhiễm của protein Cry1A.105 và Cry2Ab2:

Protein Cry1A.105 chiếm một tỷ lệ rất nhỏ, tương ứng là 0.005% tổng lượng

protein có trong hạt ngô MON 89034 Kết quả đánh giá an toàn thực phẩm cho thấy ngưỡng phơi nhiễm (MOEs) của protein Cry1A.105 đối với người dân Hoa

Kỳ nói chung đều lớn hơn hoặc bằng 199.000 Đối với trẻ em tuổi từ 3-5 năm tuổi, nhóm tuổi có mức tiêu thụ ngô cao nhất, MOEs của protein Cry1A.105 đều lớn

19

hơn hoặc bằng 79.400 Mặt khác, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy > 95% protein Cry1A.105 bị phân giải rất nhanh trong vòng 30 giây trong dịch dạ dày mô phỏng Kết quả này cho phép kết luận không tồn tại nguy cơ rủi ro của protein Cry1A.105 đối với sức khỏe con người và động vật khi sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

Protein Cry2Ab2 chiếm một tỷ lệ rất nhỏ, tương ứng là 0.001% tổng lượng protein

có trong hạt ngô MON 89034 Kết quả đánh giá an toàn thực phẩm cho thấy

ngưỡng phơi nhiễm (MOEs) của protein Cry2Ab2 đối với người dân Hoa Kỳ nói chung đều lớn hơn hoặc bằng 981.000 Đối với trẻ em tuổi từ 3-5 năm tuổi, nhóm tuổi có mức tiêu thụ ngô cao nhất, MOEs của protein Cry2Ab2 đều lớn hơn hoặc bằng 390.000 Mặt khác, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy > 99% protein

Cry1A.105 bị phân giải rất nhanh trong vòng 30 giây trong dịch dạ dày mô phỏng Kết quả này cho phép kết luận không tồn tại nguy cơ rủi ro của protein Cry2Ab2 đối với sức khỏe con người và động vật khi sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

 Protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 không tồn tại nguy cơ gây độc đối với con người và động vật.

c Đánh giá khả năng gây dị ứng của sự kiện MON 89034

- Trình tự axit amin Cry1A.105 và Cry2Ab2 có sự tương đồng rất cao với 2 loại pr có lịch sử sử dụng an toàn lâu dài (Cry1A và Cry2A)

- Không tìm thấy sự tương đồng giữa Protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 với các chất dị ứng đã biết ( gliadins và glutenins)

- Protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 chiếm một tỷ lệ rất nhỏ (0.005% và 0.001% trong tổng lượng protein có trong hạt ngô MON 89034)

- Protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 bị phân hủy nhanh chóng trong các thành phần của hệ tiêu hóa mô phỏng: