công nghệ sản xuất enzym và ứng dụng trong trị liệu

Lời mở đầu• Từ lâu con người đã ứng dụng sữ dụng vi sinh vật vào quy trình công nghệ lên men Nhưng con người chưa biết được bản chất quá trình chuyển hóa trong quy trình lên men... Cơ c

CÔNG NGHỆ SẢN SuẤT ENZYM VÀ Ứng dụng trong

trị liệu

Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thanh Thủy

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hiếu

Trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh

Khoa Sinh Học

Thành phố Hồ Chí Minh

2011

Lời mở đầu

• Từ lâu con người đã ứng dụng sữ dụng vi sinh vật vào quy trình công nghệ lên

men

Nhưng con người chưa biết được bản chất quá trình chuyển hóa trong quy trình lên men

Từ những công trình nghiên cứu cuối thế kỉ 17 về vi sinh vật - về enzyme

Enzym có thể thu từ nhiều nguồn

Dứa

Nhưng: vì sao vi sinh vật lại là đối tượng chủ yếu để sản xuất enzym?

quy trình sản enzym như thế nào?

I CƠ SỞ QUY TRÌNH SẢN XuẤT

ENZYM

1.khái quát về enzym

2 Vì sao vsv được lựa chọn để

II.QUY TRÌNH SẢN XuẤT ENZYM

– II.1 Giai đoạn chuẩn bị

– II.2 Giai đoạn lên men

– II.3 Giai đoạn tinh sạch

III ƯNG DỤNG ENZYM TRONG TRỊ LiÊU.

KẾT LuẬN

Tài liệu tham khảo

A + B

C enzyme

pH

Chất xúc tác sinh học

Đặc hiệu protein

I.CƠ SỞ QUY TRÌNH

1 Khái quát về enzym

ảnh hưởng của PH lên hoạt tính enzyn

enzyme enzyme

Phức hợp enzym-sản phẩm

Cơ chất Sản phẩm

Phức hợp enzym-cơ chất

Hoạt động của enzym: phân giải

Những điểm đặc biệt của enzyme

Các nhóm enzym chính

Dễ nuôi cấy; chủ động nguyên liệu, giống

3.Điều hoà sinh tổng hợp E ở vi sinh vật

Điều hoà bằng sản phẩm cuối cùng

www.themegallery.com Company Logo

Không có sự truyền thông tin

www.themegallery.com Company Logo

Cơ chất kích thích

quá trình hình thành Enzyme Cảm ứng được gọi là

chất cảm ứng

.

Cơ chế cảm ứng và ức chế

3.Nguyên tắc điều hoà trong trao đổi chất ở vi sinh vật

•Khi môi trường có chất Khó

đồng hóa vi sinh vật tiết

enzym để phân hủy cơchất E

đó gọi là E cảm ứng

Điều hòa tổng hợp nhờ sự kìm chế dị hóa 3.Nguyên tắc điều hoà trong trao đổi chất ở vi sinh vật

Môi trường có nhiều cơ

chất

Ưu tiên sử dụng cơ chất dễ

sử dụng nhất

môi trường có đồng thời cả lactose và glucose

VSV tiết enzym phân giải glucose

Sự cảm ứng hình thành E β galactosidase phân giải lactose bị ức chế

4.Các phương pháp lên men

Trên môi trường dịch thể:

+nguyên liệu: các loại hạt;

(đậu, thóc) mảnh sắn, ngô.

+dùng khá phổ biến

-Dùng cho cả vsv hiếu và kị khí -VSV được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, phát triển theo chiều đứng của môi trường.

-Cần theo dõi liên tục -sữ dụng phổ biến trong công nghiệp

-Dùng cho cả vsv hiếu và kị khí

-VSV được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, phát triển theo chiều đứng của môi trường.

-Cần theo dõi liên tục -sữ dụng phổ biến trong công nghiệp

Lên men bề mặc

Lên men chìm

5.Nguyên lý sản xuất

• Là quá trình sinh tổng hợp các hợp chất sinh học bằng kĩ thuật lên men nhờ vi

sinh vật trong các bình phản ứng sinh học.

• Là quá trình sinh tổng hợp các hợp chất sinh học bằng kĩ thuật lên men nhờ vi

sinh vật trong các bình phản ứng sinh học.

Môi trường dinh dưỡng

Vi sinh vật

Sản phẩm

Cơ chất sót lại Sản phẩm phụ Nhiệt năng

Sản phẩm

Cơ chất sót lại Sản phẩm phụ Nhiệt năng

Lên men

II QUY TRÌNH SẢN XuẤT ENZYM TỪ VSV

3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm enzym

Những yếu tố quyết định đến năng xuất sản xuất E công

nghiệp

• Giống vi sinh vật

• Tối ưu hóa quá trình lên men

• Áp dụng những thiết bị lên men hiện đại

– Áp dụng các phương pháp tách chiết tinh chế hợp lý

– Áp dụng công nghệ cố định để dùng được nhiều lần

• II.1 Giai đoạn chuẩn bị lên men

Giống vsv

II.1 Giai đoạn chuẩn bị lên men

1.1 chủng vi sinh vật

Tuỳ vào loại enzym cần sản xuất.

Nguồn nguyên liệu được sữ dụng.

Đối tượng ứng dụng chế phẩm enzym thu được.

Điều kiện công nghệ…

Tiêu chuẩn cơ bản

Tổng hợp E riêng biệt hay hỗn hợp E cần thiết cao

Khả năng đồng hóa nguyên liệu dễ tìm và dễ tách chế sau này

Dễ tách E ra khỏi sinh khối và môi trường

Tính ổn định của hệ gen

Tính thuần nhất của giống vi sinh vật

1.1.1Các vsv sinh enzym được sữ dụng chủ yếu: sản xuất amylase

Aspergillus oryzae

Bacillus cereus Bacillus subtilis

Vi khuẩn

Nấm mốc

B Amyloliquefaciens Micrococcus

Pseudomonas Proteus

Rhizopus nivius Penicilium Mucor Candida

Aspergillus flavus

1.1.1Các vsv sinh enzym được sữ dụng chủ yếu: sản xuất protease

Bacillus megaterium

Aspergillus niger Aspergillus sp

• Từ nấm mốc : A niger, A oryzae, A terreus

• Từ vi khuẩn: Pseudomonas fluorenscons, Clostrodium sp.

Các vsv sinh enzym được sữ dụng chủ yếu: sản xuất: xenlulase

1.1.2Các phương pháp chọn – cải tạo giống vsv

Sữ dụng công nghệ gen ( AD N tái tổ hợp )

Cải tạo chủng vsv bằng đột biến

Gây đột biến (uv, x, hoá chất)

Tạo dòng vsv bằng ADN tái tổ hợp

1.2 nhân giống và bảo quản vsv

Tạo ra và duy trì nguồn giống thuần chủng mang đầy đủ các ưu thế của giống gốc

Vi sinh vật sinh trưởng , phát triển

trình lên men

Tạo ra và duy trì nguồn giống

thế của giống gốc

Sơ đồ quá trình chuẩn bị giống lên men

nhân giống cấp 1 trong 10ml môi trường

1.2 nhân giống và bảo quản vsv

Khả năng sống xót.

Số lượng bảo quản

Tính ổn định của di truyền Tính thuần nhất của giống Kinh phí bảo quản

Cần chú ý

1.3 môi trường nuôi cấy

Nguồn cacbon Cám gạo, cám mì, khô dầu, bã rượu, nước ép trái cây, rỉ đường…

Chất phụ gia Chất phá bọt, chất chỉ thị…

Vitamin và chất điều hoà tăng trưởng Chất cảm ứng, chất ức chế…

Khoáng chất Mg, Ca, P, Fe, K…

Nguồn nitơ Muối amino, nitrat, bột đậu nành, dịch thuỷ phân casein…

Thành phần dinh dưỡng phù hợp cho sinh trưởng vi sinh vật không đồng nhất điều kiện tổng hợp và tích tụ nhiều enzym

1.4 Khử trùng môi trường nuôi cấy

Tác nhân khử trùng:

Vật lý: tia x, cực tím, sóng siêu âm,

nhiệt, hơi nước

Hóa học: các hợp chất của phenol…

Tác nhân khử trùng:

Vật lý: tia x, cực tím, sóng siêu âm,

nhiệt, hơi nước

Hóa học: các hợp chất của phenol…

Khử trùng trực tiếp bằng nhiệt Gây biến tính một số

protein,vitamin, tạo ra một số chất độc đối với vsv…

Khử trùng trực tiếp bằng nhiệt

protein,vitamin, tạo ra một số chất độc đối với vsv…

Khử trùng liên tục bằng hơi nước

quá nhiệt Không biến tính môi trường vì thời

• Áp dụng khi: nguyên liệu dạng rắn

Các vấn đề cần lưu ý

Thu amylase từ nấm mốc trên cám thì hàm lượng cám >

20%.

Nấm A.oryzae phát triển triển tốt ở 30 độ c, nhưng không bị

ảnh hưởng khi canh trường 40-45 C

Các loài nấm cho nhiều enzym ở độ ẩm 65-68%( trong công

nghiệp là: 58-60)

Sơ đồ quy trình công nghệ

XXXXXXXXXXXX

14

16

15 13

12 7

11

• Giai đoạn 1 :10-14 h đầu

Bào tương trương nở, mảy mầm

Không hình enzym

Không tiêu hao nhiều không khí

Cần làm thoáng không khí 2-3 lần/thể tích nuôi/ giờ

Các giai đoạn chính:

• Giai đoạn 3: 10-20h

Trao đổi chất yếu.

Nhiệt sinh giảm.

Enzym tiếp tục được sinh ra

Thông khí 20-25 thể tích không khí/ thể tích phòng/h Giữ nhiệt độ phòng nuôi ở 30 độ

Các giai đoạn chính:

• Có sự thay đổi Ph trong lên men

2.2 lên men bề sâu

• Ph sinh trưởng không trùng Ph tổng hợp enzym Cần theo dõi và diều chỉnh Ph hợp lý

năng tạo enzym

Sơ đồ quy trình công nghệ

6

1: thùng trộn môi trường 4: thùng chứa dịch nuôi cây 9:thùng chứa dịch lên men 3:thiết bị thanh trùng 7: thùng dịch lên men 6: thiết bị điều nhiệt 2:bơm li tâm 8: thùng lên men 5: van xả

Quá trình sản xuất tương tự như sản xuất các chế phẩm sinh học khác

2

1

2

2 3

4

9 8

7 6

5

8

Nồi lên men

II.3 tách chiết và tinh chế enzym

Phức tạp, tốn chi phí nhất Tiến hành thu sớm để tránh thất thoát

Tách chiết enzym

• Dựa vào tính hoà tan

 Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính: NaCl, Na2SO4…

 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: axeton, etanol, isopropinol

 Kết tủa đẵng điện: mỗi E hoà tan ít nhất ở một điểm đẳng điện

• Dựa vào tính hoà tan

 Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính: NaCl, Na2SO4…

 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: axeton, etanol, isopropinol

Kết tủa đẵng điện: mỗi E hoà tan ít nhất ở một điểm đẳng điện

Tách chiết Enzym

• Dựa vào khối lượng phân tử: sắc kí lọc gel

• Dựa vào điện tích: sắc kí trao đổi ion

Tách chiết enzym

sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography

• Dựa vào điện tích:

Tách chiết enzym

Máy điện di

• Dựa vào vị trí liên kết đặc biệt : sắc kí ái lực

III ứng dụng enzym trong trị liệu

Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) : Xác định

một số tác nhân gây bệnh.

Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) : Xác định

một số tác nhân gây bệnh.

T solium một tác nhân gây nên tình trạng động kinh.

Theo dõi các bệnh lý ấu trùng sán lợn trên hệ thần kinh (neurocysticercosis)

Sản xuất kháng sinh penicillin

Benzylpenicillin + H 2 O 6-APA + Phenylacetic Acid

Penicillin Amidase

6-APA = 6-Aminopenicillanate

Nguyên liệu sản xuất penicillin

Sữ dụng enzym glucooxydase xác định glucose trong máu

• Do giáo sư Leland Clark tìm ra 1956

• 1975 điên cực thương mại đầu tiên ra đời

GOD

Máy thử glucose

Trích ly đông dược: pectinase

Tạo các chế phẩm sinh học hỗ trợ sức khoẻ

dựa trên khả năng hỗ trợ xúc tác của các enzym với các phản ứng sinh hóa trong cơ thể

Urease gắn trong vi tiểu cầu sữ dụng có hiệu quả để loại bỏ ure của máu trong thận nhân tạo

tính

Vi tiểu cầu chứa catalase đã thay thế cho lượng catalase thiếu trong cơ

Sữ dụng streptokinase làm tan cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu

Sữ dụng các enzym để làm các nội quan giả: bàng quan, thận…

Kết luận

• Ngày nay với sự phát triển của khoa học công nghệ đặc biệt là công nghệ sinh học thì việc sản xuất enzym từ vi

sinh vật ngày càng tăng

• Đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người

Tài liệu tham khảo

• 1.Công nghệ vi sinh –Trần Thị Thanh

• 2.Nhập môn công nghệ sinh học.

• 3.công nghệ sinh học tập II

• 4 Công nghệ sinh học –Nguyễn Đức Lượng

• 5 Mai Xuân Lương-giáo trình enzym- Đại Học Đà Lạt 2005

Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa – Công nghệ sinh học Tập 3 Nhà xuất bản giáo dục 2007.

2.

Từ Minh Kóong – Kỷ thuật sản xuất dược phẩm Tập 2 Nhà xuất bản yhọc 2004.3.Mai Xuân Lương - Giáo trình enzyme Đại Học Đà Lạt 2005.4.Đỗ Đức Lượng – Công nghệ enzyme Tập 3 Nhà xuất bản