sinh tổng hợp interferon và interleukin bằng công nghệ vi sinh

lịch sử phát hiện IFN được phát hiện đầu tiên vào năm 1957, do Alick Isaacs Anh và Jean Lindenman thuy sỹ khi thí nghiệm nuôi cấy các tế bào phôi gà  Hiện nay, người ta biết đến 22

Sinh tổng hợp interferon và interleukin bằng công nghệ vi

sinh

GVHD: T.S TRẦN THANH THUỶ SVTH: PHẠM THỊ THUÝ NGẦN CHUYÊN ĐỀ CÔNG NGHÊ VI SINH

Lí do chọn đề tài

Interleukin và interferon là hai loại thuốc sử dụng trong liệu pháp sinh học để điều trị ung thư Nhờ vào công nghệ vi sinh tái tổ hợp tạo ra nhiều IFN và IL giá thành thấp đáp ứng nhu sử dụng của con người mở ra một tương lai ngày càng tốt đẹp cho loài người trong việc bảo

vệ và nâng cao sức khoẻ cộng đồng

Nội dung

I Khái quát về interferon

1.khái niệm IFN

2 lịch sử phát hiện IFN

3 phân loại IFN

4 tính chất sinh học IFN

5 Cơ chế hoạt động IFN

6 các yếu tố kich thich sinh IFN

2.2 cấu tạo IL-2

2.3 Hoạt tinh sinh học IL-2

2.4 Cơ chế hoạt động IL-2 2.5 Sản xuất IL-2

I Khái quát về interferon

1.Khái niệm

 IFN là protein hoặc glycoprotein có tác dụng

ngăn cản sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm phát triển khối u và có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch thứ nhất.

2 lịch sử phát hiện

 IFN được phát hiện đầu tiên vào năm 1957, do Alick Isaacs

( Anh) và Jean Lindenman (thuy sỹ ) khi thí nghiệm nuôi cấy các tế bào phôi gà

 Hiện nay, người ta biết đến 22 gen ở nhiều loại tế bào khác

nhau của cơ thể có khả năng sản xuất IFN như đại thực bào,tế bào lympho,tế bào NK

Typ 1

Typ 2

3.PH ÂN LOẠI

3.IFN Typ1

nhiễm trùng virut

+ IFN-α có khoảng 20 polypeptit liên quan đến cấu trúc Mỗi polypeptit được mã hóa

bởi các gen riêng rẽ

Nguồn tế bào chính sản xuất IFN-α là bạch cầu đơn nhân

IFN-β là glycoprotein gồm 2 chuỗi giống nhau với khối lượng phân tử 21-24 kDa

được mã hóa bởi các gen khác nhau

 Chức năng sinh học IFN typ1

Cơ chế hoạt động IFN typ I

+ ức chế sự sao chép của virut

+ ức chế sự sinh tổng hợp protein

+ làm tăng khả năng tan của các tế

bào giết tự nhiên

+ điều chỉnh sự biểu hiện của phân

tử MHC1 và ức chế hoàn toàn biểu

hiện của MHC2

IFN-Chức năng sinh học IFN typ II

Cơ chế hoạt động IFN-

+ là chất sinh miễn dịch

+ kích thích hoạt động mạnh của các đại thực bào

+ tăng sự hiện diện của phân tử MHC1

+ kích thích sự hoạt hóa tiêu hủy các tế bào giết tự

nhiên ít hơn IFN typ I

+ tác dụng trực tiếp lên tế bào lympho T và B để

thúc đẩy nhanh quá trình biệt hóa các tế bào CD4

để tạo thành TH1

4 Các tính chất sinh học của IFN

 Rất nhạy cảm với với các enzym phân giải protein

 Bền vững với Ph axit, bền vững với nhiệt độ 56oC vẫn giữ nguyên hoạt tính.

 có tính kháng nguyên yếu

 Có hoạt tính kháng nguyên yếu

 Có tính đặc hiệu loài

 Có tác dụng ức chế không đặc hiệu với các loại virut và nhiều loại tế bào ung thư

 Giữa IFN và cảm ứng nguyên đã sinh ra nó không có tính đặc hiệu cặp

5 Cơ chế hoạt động IFN

Khi một tế bào mô bị nhiễm bởi virus, nó giải

phóng IFN IFN sẽ khuếch tán vào các tế bào xung quanh Khi liên kết với thụ thể trên bề mặt của các

tế bào lân cận, IFN bắt đầu sản xuất một loại protein có thể ngăn chặn sự tổng hợp các protein virus Điều này ngăn cản sự lây lan của virus trong

cơ thể.

 Phim cơ chế hoạt động IFN Click xem bản dịch

chúng ta đều biết rằng da và bạch cầu là tuyến phòng thủ đầu tiên của cơ thể Tuy nhiên, điều gì sẽ xảy ra nếu những loại virut nguy hiểm nào đó tìm thấy 1 kẽ hở trong tuyến phòng thủ đầu tiên ấy và xâm nhập vào cơ thể chúng ta.Vâng, tuyến phòng thủ thứ hai sẽ nhảy vào tương trợ và hôm nay, chúng tôi sẽ nói về một phần của tuyến phòng thủ thứ hai - còn được biết đến với tên gọi interferon - và thảo luận sự sản sinh ra nó.

Hãy bắt đầu với một tế bảo cơ thể bình thường Tế bào này sắp sửa bị một virus tấn công Một khi xâm nhập vào trong tế bào, virus sẽ tự sao chép mình bằng cách sử dụng bộ máy trao đổi chất của tế bào đó và sau cùng rời tế bào đó để xâm nhập các tế bào khác Cũng trong quá trình này, gen interferon được kích hoạt trong hạt nhân của tế bào chủ

Tiếp theo, cá phân tử interferon được sản xuất và phát tán ra khi tế bào chủ chết Tế bào đó có thể không tự cứu được mình nhưng nó sẽ cứu được vô số các tế bào khác nhờ việc sản sinh ra interferon.

Kế đến, interferon sẽ liên kết với các thụ thể trên màng tế bào và kích thích nó khởi động gene sản sinh ra protein kháng thể một cách chính xác để tống khứ virus.

Dù các virus vẫn có thể xâm nhập vào cac tế bào, nó sẽ không thể nhân bản được bởi các protein kháng virus sẽ ngăn chặn quá trình này Và vậy là chúng ta đã có một quá trình nhanh và đơn giản nhất để tạo ra interferon cũng như sử dụng chúng trong cơ thể.

7 sản xuất interferon

1 Tạo gen mã hoá IFN

Thu nhận các loại ARN thông tin mã hoá các loại IFN tương ứng

Ví dụ: thu nhận gen mã hoá

IFN-+ cần tách chiết ARN thông tin mã hoá IFN- từ tế bào bạch cầu người

Công nghệ sản xuất interferon trong tế bào vi khuẩn E.coli gồm:

2 Tạo vectơ tái tổ hợp

+ Bằng kĩ thuật phân tử, gắn gen

mã hoá IFN người vào vectơ biểu

hiện được cải biến từ thực khuẩn

thể phage

+ Tạo các vectơ phage tái tổ hợp

mang gen mã hoá IFN người

tạo dòng vectơ

3 Tạo dòng tế bào E.coli tái tổ hợp mang gen mã hoá IFN

tế bào E.coli, tạo dòng E.coli

tái tổ hợp

ở thể biến nạp

4 lên men thu sinh khối và thu nhận IFN

Thực hiên kĩ thuật lên men trong

các thiết bị lên men ở các điều

kiện môi trường thích hợp để thu

sinh khối tế bào, tách chiết IFN

 Thu nhận và tinh sạch IFN

 Kiểm tra hoạt tính và thêm phụ gia (NaCl,

KH2PO4,dextran…) để có thể giữ hoạt tính và bảo

quản lâu dài.

 thử nghiệm lâm sàng để kiểm tra tính an toàn của

II Ứng dụng

1.Ứng dụng điều trị của Interferon đối với con người

 IFN-và IFN- đã được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh do vi rút gây nên Hiện nay IFN-được sử

dụng hiệu quả trong điều trị viêm gan C cấp và mãn; viêm gan B mãn; HIV….

 IFN-α được sử dụng trong điều trị đa hồng cầu

 IFN - là vũ khí hữu hiệu trong điều trị cúm A/H5N1



M t s thành t u c a Interferon trong đi u tr b nh ộ ố ự ủ ề ị ệ

 IFN đã được sử dụng thành công để điều trị cúm (từ 1972), chống virus Herpes trong ghép thận (1979), ung thư xương, ung thư vú, u tủy và u lympho bào (năm 1979 ở Mỹ với tỷ lệ chữa khỏi đạt 40 -70%) Năm 1989 cũng ở Mỹ, thuốc được dùng cho bệnh nhân ung thư bàng quang, ung thư vú và u hắc tố

 IFN được sử dụng hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B-C mãn tính và có tác dụng loại trừ virus gây nhiễm, chuyển đổi huyết thanh, cải thiện men gan và ngăn ngừa ung thư tiến triển

Một số sản phản của IFN

2 Ứng dụng trong thú y

2.1 Interferon được sử dụng như là tá dược trong vaccine

Interferon alpha và beta được sử dụng kết

hợp với vaccine phòng bệnh lở mồm long

móng, hội chứng PRRS… cho hiệu quả

cao.

Interferon gamma khi được dùng chung với kháng nguyên có tác dụng tăng cường đáp ứng kháng thể thứ cấp duy trì nồng độ cao trong một thời gian dài Hơn nữa, việc kết hợp kháng nguyên với Interferon gamma đã làm giảm liều sử dụng vaccine

2.2 Interferon dùng chẩn đoán bệnh

 IFN - dùng chuẩn đoán: bệnh lao ở bò , John’s disease, Brucellosis (bệnh do vi khuẩn gây ra)…

Ngoài ra còn dùng chẩn đoán bệnh lao, bệnh phong hủi ở người.

 IFN-dùng chẩn đoán bệnh IBR



2.3 Interferon dùng trong phòng, trị bệnh cho gia súc, gia cầm

 Sử dụng IFN- trong việc phòng, trị bệnh cho gia súc, gia cầm là một giải pháp thay thế kháng sinh an

toàn- hiệu quả cao.

 IFN- được dùng để điều trị các bệnh do virus gây ra trên gia súc, gia cầm như: bệnh viêm đường hô hấp,

bệnh viêm vú, PRRS, TGEV, các bệnh cúm, Marek, Gumboro, viêm gan B…; Ngoài ra còn hỗ trợ điều trị với kháng sinh mang lại hiệu quả cao, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc của các vi khuẩn gây bệnh => Tuy nhiên, việc ứng dụng sản phẩm này sang lĩnh vực thú y bị hạn chế vì vấn đề giá thành sản phẩm



III.KHÁI QUÁT VỀ INTERLEUKIN

I n t e r l e u k i n - 2 1

1.Khái niệm:

Interleukin là một họ gồm nhiều protein,

glycoprotein xytokin có vai trò quan trọng trong hệ

thống miễn dịch của tế bào và cơ thể.

 Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hàng chục loại interleukin khác nhau như

IL-1,IL-2…

tương đối kỹ như: IL-1 có vai trò kích thích sự tăng sinh của các tế bào miễn dịch T

và B, IL-4 có vai trò kích thích các tế bào B và hoạt hoá sự tạo thành tương bào,gây hiện tượng tiết kháng thể IgE

2.2 cấu tạo IL-2

 Là một glycoprotein gồm 153 axit amin, khối lượng 15kDa,gồm bốn chuỗi

peptit xoắn kiểu

 Gen mã hoá IL-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 10,gen mã hoá IL-2 được tách

dòng năm 1983



2.3 hoạt tính sinh học

2.4 cơ chế hoạt động IL-2

tế bào lympho T hoạt tính

tế bào phân nhánh

Kích hoạt tế bào lympho T

tế bào lympho T tăng sinh

tế bào lạ chết thụ động

Kích hoạt các tế bào vào quá

trình chết

2.5 sản xuất IL-2 bằng chủng vi sinh vật tái tổ hợp

 Tách chiết ARN từ các tế bào lá lách của người bằng các kĩ thuật sinh học phần tử

 Nhân đoạn cADN mã hoá IL-2 từ ARN thông tin với các cặp mồi đặc hiệu

 thu nhận được đoạn cADN mã hoá IL-2

1 Tạo đoạn gen mã hoá

sử dụng kĩ thuật phân tử để nối đoạn cADN mã

hoá IL-2 vào vectơ tách dòng Có thể sử dụng

vectơ pCR TA, tạo vectơ tái tổ hợp pCR

2.1-IL-2

2 Tạo vectơ tái tổ hợp

 sử dụng kĩ thuật sốc nhiệt hoặc điện xung để tạo dòng vi khuẩn

E.coli DH5 mang gen mã hoá IL-2



3 biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5

 Giải trình tự kiểm tra đoạn gen mã hoá IL-2

tạo được gen mã hoá IL-2 của người đã mất điểm glycosyl hoá

4 Hoàn thiện gen mã hoá IL-2

 Bằng kĩ thuật phân tử thông dụng,chuyển đoạn IL-2 từ vectơ pCR 2.1-TA

sang vectơ biểu hiện pET32a (+) nhờ sử lí với cặp emzym giới hạn Not I và Nco I

khuẩn E.coli BL21

5 Tạo dòng tế bào vi khuẩn E.coli BL 21 có khả năng biểu hiện gen IL-2

 Các chủng vi khuẩn E.coli BL21 mang gen mã hoá IL-2 đươc lên

men trong thiết bị lên men ở môi trường LBA có bổ sung( nồng độ cuối 100mg/l) ở 370oC sau 3 giờ cảm ứng bằng IPTG

protein không tan bằng phương pháp phá tế bào

6 thực hiện quá trình lên men và thu nhận IL-2

 Thu nhận IL-2 từ kết quả lên men

và đóng gói

=> 1/2011 IL-2 đã được sản xuất thành công ở việt nam

Sản xuất IL-2 trong điều kiện GMP tại Công ty Vắc-xin và Sinh phẩm số 1, Bộ Y tế.

1/2011 IL-2 đã được sản xuất thành công ở việt nam

IV ứng dụng interleukin

quan, ung thư thận

cho phép sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư hắc tố (melanoma) và ung thư ác tính.các thử nghiệm sản xuất và sử dụng IL-2 trong điều trị nhiều loại bệnh ung thư khác nhau đang được thực hiện ở nhiều nước

Ứng dụng của IL trong chẩn đoán:

• Định hướng chẩn đoán trong các bệnh nhiễm

• Dự báo thải ghép tạng

• Định hướng chẩn đoán trong các bệnh tự miễn

Một số thành tựu mới IL

interleukin-7 có khả năng đánh bật một số dạng HIV ra khỏi nơi ẩn nấp

Kết luận

và tăng cường hệ miễn dịch

nên hạ giá thành

Tài liệu tham khảo

1.Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng NXB GD VIỆT NAM