Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tỏi, lá sả và thử nghiệm ứng dụng khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi, lá sả để bảo quản thịt heo.

NỘI DUNG Ly tâm thu nhận dịch chiết có tính kháng khuẩn từ củ tỏi, lá sả. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cảu dịch chiết tỏi, lá sả trên các loại vi sinh vật như: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Thử nghiệm khả năng bảo quản thực phẩm của dich chiết tỏi trên thịt heo.

LỜI MỞ ĐẦU

Vào cuối thế kỷ 20, hoạt động kháng khuẩn của các loại thảo dược và gia vị đã được nghiên cứu Có rất nhiều loại thảo dược và gia vị (đinh hương, quế, tỏi, sả, hành,

ớt, tiêu…) đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi

khuẩn như Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella, Shigella… Và một số loại

kháng khuẩn đã được đưa vào để bảo vệ thực phẩm thay thế cho các loại phụ gia

Ngày nay, nhu cầu tiêu dùng của con người ngày càng tăng, nhận thức của con người ngày càng cao Thực phẩm không những phải có chất lượng cao, tuổi thọ dài mà còn phải có nguồn gốc tự nhiên và tươi ngon Các loại vi sinh vật chính là nguyên nhân chính gây nên sự sự hư hỏng và ảnh hưởng xấu đến giá trị cảm quan của các loại sản phẩm thực phẩm cũng như tính mạng con người Để tránh sự tấn công của các loại vi sinh vật trong thực phẩm người sản xuất thường sử dụng chất bảo quản hóa học Những hóa chất này hoạt động như các hợp chất kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của

vi sinh vật không mong muốn Tuy nhiên, về khía cạnh an toàn thì các loại chất bảo quản này không được đảm bảo Chúng được xem là một trong những nguyên nhân gây ung thư do độc tố còn sót lại trong thực phẩm khi sử dụng Chính vì thế, để tìm ra các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ tự nhiên không những bảo quản được thực phẩm mà còn an toàn cho người sử dụng là một vấn đề cấp thiết Các hợp chất kháng khuẩn này phải kiểm soát thậm chí là tiêu diệt các loại vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm

Trong tự nhiên có rất nhiều loại thảo dược cũng như gia vị có hoạt tính kháng rất tốt không những bảo quản mà còn có thể làm tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm Trong đó, tỏi và sả là hai loại gia vị quen thuộc và có nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người

Tỏi không chỉ được sử dụng làm gia vị trong hầu hết các món nấu, xào để tăng cường mùi vị món ăn nhờ vào mùi thơm đặc trưng Tỏi còn được sử dụng như một kháng sinh thiên nhiên có tác dụng chữa trị rất nhiều loại bệnh từ đường tiêu hóa cho đến các loại bệnh như: tim mạch, huyết áp, phòng chống ung thư, giảm viêm khớp, và đặc biệt là tỏi có khả năng kháng khuẩn rất tốt Dung dịch nước chiết xuất từ tỏi có tác dụng kháng khuẩn rất tốt có khả năng chống lại 17 loại vi khuẩn gram dương và gram

âm bao gồm Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus spp, Bacillus subtilis,….(theo Electronic Journal of Biology,

thương; còn giúp chữa trị các bệnh như thương hàn, nhiễm trùng da, ngộ độc thực

phẩm và mùi hôi cơ thể (Theo báo The Times of India) Đặc biệt dịch chiết từ lá sả có

tác dụng kháng khuẩn rất tốt đối với cả vi khuẩn gram dương và gram âm như:

Salmonella sp,Bacillus subtilis, Escherichia coli, Steptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, nấm Aspergillus niger… (theo Isam S.Hamza và cộng sự

2009)

Tuy nhiên, việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tỏi, sả ở Việt Nam chưa được quan tâm nhiều Các nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn của tỏi chủ yếu chỉ được đưa vào trong chăn nuôi để chữa bệnh cho gia cầm, gia súc (chủ yếu ở trường Đại học Nông Lâm – Thành phố Hồ Chí Minh) Riêng về sả, hầu như chưa có nghiên cứu nào về lĩnh vực này được công bố

Do có những công dụng tuyệt vời như thế nên việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ tỏi, lá sả và đưa vào ứng dụng trong ngành thực phẩm là một trong những vấn

đề đáng được quan tâm

Và theo CIRAD (2006), thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam

Chính vì tầm quan trọng của thịt heo đối với đời sống và nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng cũng như những lợi ích của dịch chiết tỏi, lá sả mang lại Được sự cho phép của Trường Đại học Công nghệ Sài Gòn – khoa Công nghệ Thực phẩm dưới sự hướng dẫn của ThS Hoàng Thị Khánh Hồng, chúng tôi xin được phép tiến hành thực hiện đề tài: ” Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tỏi, lá sả” và thử nghiệm ứng dụng khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi, lá sả để bảo quản thịt heo

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi xin tiến hành thực hiện những nội sau:

- Ly tâm thu nhận dịch chiết có tính kháng khuẩn từ củ tỏi, lá sả

- Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cảu dịch chiết tỏi, lá sả trên các loại vi sinh

vật như: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus

- Thử nghiệm khả năng bảo quản thực phẩm của dich chiết tỏi trên thịt heo

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguyên liệu

1.1.1 Tỏi

1 Đặc điểm , phân loại

Tên khoa học: Allium sativum

Tên thường gặp: Ail, ajo, garlic, tỏi, Knoblauchzweibel (Đức), da Suan (Trung

Quốc), taisan, inniku (Nhật Bản), Taesan (Hàn Quốc)…

Thuộc họ hành tỏi Liliaceae, nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây… và cũng được con người sử dụng làm gia vị, thuốc, rau như những loài họ hàng của nó

Phân loại khoa học:

- Giới (regnum): Plantae

- Bộ (ordo): Asparagales

- Họ (familia): Alliaceae

- Phân họ (subfamilia): Allioideae

- Tông (tribus): Allieae

- Chi (genus): Allium

- Loài (species): A Sativum

Phía dưới cây tỏi mang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng hình dải, thẳng, dài 15 - 50cm, rộng 1 - 2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép Tỏi, các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành (giò) của Tỏi

Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi một cái mo dễ rụng tận cùng bằng mũi nhọn dài

Phần hay được sử dụng nhất của cả cây tỏi là củ tỏi Củ tỏi có nhiều tép Từng tép tỏi cũng như cả củ tỏi đều có lớp vỏ mỏng bảo vệ

Vào năm 1858, Pasteur đã chứng minh được tính kháng khuẩn (antibacterial) của tỏi

Hình 1.1 Củ tỏi tươi

2 Điều kiện trồng trọt, phân bố

a Phân bố

Tỏi có nguồn gốc từ Trung Á, hiện được trồng khắp nơi ở Châu Á, Châu Âu

Ở Việt Nam, tỏi được trồng ở khắp mọi miền nhưng tập trung nhiều ở Lý Sơn (Quãng Ngãi), Kim Môn (Hải Dương), Gia Lâm (Hà Nội), Ninh Thuận, Bắc Giang, Hưng Yên

Đảo Phú quý được mang danh “vương quốc tỏi”, tỏi ở đây ngon nhất vì được trồng bằng san hô vụn

Cần thời tiết nóng và ngày dài mới hình thành củ, trời mát và ngày ngắn thì đâm mầm, ra lá mạnh hơn Lúc cây ra rễ cần ẩm, khi củ đã to lại cần khô ráo Ưa đất phì nhiêu nhiều chất hữu cơ, đặc biệt đất hơi kiềm

Thiếu nước cây phát triển kém, củ nhỏ Ngược lại, nếu thừa nước cây dễ bị các loại bệnh như thối ướt, thối nhũn và làm cho củ dễ bị hỏng

Thông thường tỏi tây được gieo bằng hạt, nhổ cây con đem trồng Cây trồng cách nhau 15 cm, các luống cách nhau 20–25 cm

Thu hoạch: Sau trồng từ 120 – 140 ngày, lúc lá đã già gần khô tiến hành thu hoạch Nhổ củ, giũ sạch đất, cắt rễ, chột, lấy củ đem phơi

3 Thành phần hóa học của tỏi

Theo hiệp hội dinh dưỡng Hoa Kỳ (2006), thành phần hóa học trong tỏi gồm:

 Các hợp chất lưu huỳnh

Tỏi có ít nhất 33 hợp chất lưu huỳnh như: aliin, allicin, ajoene, allylpropyl disulfide, trisulfide diallyl, sallylcysteine, vinyldithiines, S-allylmercaptocystein…

 Trong tỏi còn nguyên vẹn có chứa nhiều hợp chất lưu huỳnh không bay hơi:

Các hợp chất chứa lưu huỳnh trong tỏi còn nguyên vẹn là cysteines và s-allyl-l-cysteines sulfoxides (alliin) Trong đó, alliin là chính, alliin là chất không màu, không mùi, có chứa amino acid, là một tiền chất allicin, methiin, cycloalliin

T-glutamyl-s-allyl-l- Trong tỏi bị cắt hoặc nghiền nhỏ có chứa các hợp chất organosulfur:

 Các hợp chất bay hơi organosulfur:

Tỏi được cắt hoặc nghiền có chứa nhiều chất bay hơi thiosulfinates hơn tỏi nguyên tép

Các chất dễ bay hơi thiosulfinates trong dầu tỏi bao gồm: diallyl disulfide (DADS) (66%), diallyl sulfua (DAS), trisulfide diallyl, disulfide methylallyl, ajoenes…

Hơn 20 hợp chất sulfide đã được xác định trong hơi nước chưng cất dầu tỏi và dầu hòa tan chiết xuất của tỏi Các hợp chất sulfide có một nhóm allyl, chịu trách nhiệm cho các mùi đặc trưng và hương vị của tỏi Các hợp chất sulfide chính trong dầu tỏi bao gồm DAS (57%), allylmethyl (37%), và dimethyl (6%) hexasulfides

Diallyl trisulfide là dồi dào nhất trong dầu tỏi tươi, nhưng trong các sản phẩm tinh dầu thương mại thì DADS lại chiếm số lượng lớn

 Các hợp chất organosulfur tan trong nước:

Dịch chiết từ củ tỏi trong dung môi cồn và nước chứa chủ yếu cysteines, trans-s-1-propenyl-l- cysteines và một lượng nhỏ methyl-cysteine-l

s-allyl-l- Các enzyme: allinase, peroxidases, myrosinase,…

 Các vitamin như: A, B1, B2, C, E…

 Các khoáng chất: Selen, germanium, tellurium, canxi, natri, sắt, mangan…

 Ngoài ra, trong tỏi còn chứa 17 loại axit amin, trong đó có 8 loại axit amin không thay thế

4 Công dụng của tỏi

a Đối với sức khỏe con người

Từ hàng ngàn năm nay, tỏi được sử dụng như là 1 kháng sinh thiên nhiên, người

Trung Quốc và người Hy Lạp cổ dùng tỏi điều trị những bệnh liên quan đến hô hấp, bệnh do ký sinh trùng và nhiều bệnh khác Ngày nay, tỏi được xem như dược phẩm “trị

bá bệnh” vì nó có hiệu quả toàn diện đối với hệ thống miễn dịch

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới, các nhà khoa học đã dày công nghiên cứu phát hiện ra trong tỏi có selen và các nguyên tố vi lượng chứa kháng khuẩn alliin làm tăng cường khả năng của hệ thống miễn dịch, làm giảm huyết áp cao và nhiều bệnh nâng cao sức khỏe Các công dụng của tỏi:

- Làm giảm cholesterol để phòng bệnh tim mạch

- Đề phòng tắc nghẽn mạch máu

- Tác dụng giảm đường huyết

- Tác dụng tăng cường hệ miễn dịch

- Tác dụng kháng sinh: kháng khuẩn, kháng virus, diệt ký sinh trùng và nguyên sinh động vật

- Tác dụng diệt giun sán như giun đũa, giun kim, giun móc và trứng của chúng

- Tác dụng xua muỗi và diệt côn trùng

- Tác dụng phòng chống rối loạn tiêu hóa, kích thích tiết dịch vị, tiết mật, phòng tránh các nhiễm khuẩn dạ dày ruột, chống co thắt dạ dày ruột, bảo vệ cơ thể chống nhiễm độc các kim loại nặng

- Phòng chống ung thư dạ dày và ung thư da

- Làm suy giảm viêm đau khớp

- Tác dụng dưỡng nhan ích thọ, làm chậm sự lão hóa

- Ngoài ra, tỏi còn có các tác dụng khác như: chữa các bệnh răng miệng, chữa bệnh mắt, chữa bỏng và lở loét ngoài, chữa màng nhĩ thủng, chữa phong thấp và đau thần kinh, làm cho trẻ bú sữa nhiều hơn

b Tác dụng kháng khuẩn

Một số vi khuẩn, virus, nấm, nấm mốc, và ký sinh trùng bị giết hoặc bị ức chế bởi tỏi hoặc các thành phần của nó như:

- Acinetobacter calcoaceticus - Aspergillus flavus

- Aspergillus fumigatus - Aspergillus parasiticus

- Aspergillus niger - Bacillus cereus

- Candida albicans - Candida lipolytica

- Cryptococcus neoformans - Cryptosporidium

- Debaryomyces hansenii - Escherichia coli

- Hansenula anomala - Herpes simplex loại virus 1

- Herpes simplex loại virus 2 - Histoplasma capsulatum

- Nhân cytomegalovirus (HCMV) - Suy giảm miễn dịch virus HIV

- Nhân rhinovirus type 2 - Cúm B

- Kloeckera apiculata - Lodderomyces elongisporus

- Loại vi-rút parainfluenza 3 - Vaccinia vi rút

- Siêu vi khuÄn mụn nước viêm miệng - Micrococcus luteus

- Mycobacterium phlei - Mycobacterium tuberculosis

- Paracoccidioides brasiliensis - Pneumocystis carinii

- Proteus vulgaris - Pseudomonas aeruginosa

- Rhodotorula rubra - Saccharomyces cerevisiae

- Salmonella typhimurium - Salmonella typhimurium

- Shigella dysenteriae - Shigella flexneri

- Staphylococcus aureus - Streptococcus faecalis

- Torulopsis glabrata - Toxoplasma gondii

- Vibrio parahaemolyticus

5 Độc tính, tác dụng phụ:

Allicin độc với gan nếu dùng liều lượng rất lớn trong thời gian dài (100mg/kg)

Hoạt lực của một số enzyme gan giảm, hàm lượng glycogen và RNA thấp hơn, hàm

lượng chất béo cao hơn

Ăn tỏi tươi khi đói kích thích niêm mạc gây cảm giác ợ nóng và đau bụng kéo

dài

Dầu tỏi gây viêm cục bộ dùng lượng lớn, tiếp xúc kéo dài dẫn tới hoại tử mô

Gây eczema dị ứng nếu tiếp xúc thường xuyên…

6 Hợp chất kháng khuẩn của tỏi

Hoạt tính kháng khuẩn của tỏi chủ yếu do các hợp chất lưu huỳnh quyết định

như: allicin, diallyl sulfide, ajoene

i Allicin:

Allicin được gọi là 2-propene-1-sulfinothioc axit S-2-propenyl ester;

Thio-2-propene-1-sulfinic axit S-allyl ester

Allicin là chất lỏng không màu, có mùi mạnh đặc trưng cho củ tỏi Allicin dễ tan

trong nước, benzen, ether và nhiều dung môi khác nhau

Allicin là hoạt chất mạnh nhất và quan trọng nhất của tỏi Allcilin lần đầu tiên được phân lập năm 1944 bởi Chester J Cavallito và John Hays Bailey

Allicin không hiện diện trong tỏi Tuy nhiên, khi được cắt mỏng hoặc đập dập

và dưới sự xúc tác của phân hoá tố allicinase, chất aliin có sẵn trong tỏi biến thành allicin Do đó, càng cắt nhỏ hoặc càng đập nát, hoạt tính càng cao Một ký tỏi có thể cho ra từ 1 đến 2 gam allicin

Allicin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin và 1/10 thuốc tetracycline Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại vi trùng gram âm và gram dương như saphylococcus, streptococcus, samonella, V.cholerae, B.dysenteriae, mycobacterium tuberculosis Allicin còn có khả năng kháng nấm, tiêu diệt giun kim,

sán, làm giảm hoạt tính của vi rút gây cảm lạnh và cúm… nhờ ức chế quá trình tổng hợp protein, DNA và RNA làm chậm quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

Allicin dễ biến chất sau khi được sản xuất ra Càng để lâu, càng mất bớt hoạt tính Allicin bị mất đi hoàn toàn rong vòng một vài phút và hình thành DAS, allylmercaptan. Allicin để ở 20°C trong 20 sẽ bị phân hủy thành diallyl disulfide (DADS) (66%), diallyl sulfua (DAS) (14%), diallyl trisulfide (9%), và dioxide lưu huỳnh do các liên kết hydro hoặc liên kết hóa trị không ổn định

Ngoài ra, một số nghiên cứu công bố gần đây chỉ ra rằng alllicin có thể: giảm xơ vữa động mạch và lắng đọng chất béo, bình thường hóa sự cân bằng lipoprotein và giảm huyết áp.Nó cũng có đặc tính chống huyết khối và chống viêm, và các chức năng như chất chống oxy hóa

Cơ chế kháng khuẩn của allicin:

Allicin – kháng sinh thảo mộc rất mạnh do trong công thức phân tử có chứa: nguyên tố oxy hoạt động Ngoài ra, allicin cạnh tranh với acid amin cystein – yếu tố sinh trưởng và phát triển của hầu hết các VK gây bệnh ở người và gia súc Phản ứng cạnh tranh kết hợp với cystein nên VK bị mất yếu tố sinh trưởng nên không phát triển được

ii Diallyl sulfide

Diallyl sulphide là sản phẩm của allincin phản ứng với nước nhưng hoạt tính không mạnh bằng allincin Tuy nhiên, sulfide không hư hoại nhanh như allicin và vẫn giữ được dược tính khi nấu Giống như allicin, càng giã nhỏ càng sinh ra nhiều sulfide,

nếu nấu nguyên củ tỏi sẽ không có hiệu lực

Các nhà khoa học thuộc Đại học Washington đã phát hiện ra chất diallyl sulphide trong tỏi có thể dễ dàng phá hủy lớp màng bảo vệ của các loại vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể Thậm chí, chất hóa học này còn có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn gấp

100 lần so với hai loại kháng sinh thông dụng là erythromycin và ciprofloxacin

Tiến sĩ Michael Konkel, người đứng đầu nghiên cứu cho biết: “Kết quả nghiên cứu cho thấy chất diallyl sulpide trong tỏi có khả năng giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn trong môi trường và nguồn cung cấp thực phẩm”

Theo Daily Mail, khả năng kháng khuẩn của chất diallyl sulphide trong tỏi có

thể mở ra những phương pháp xử lý mới đối với thịt tươi sống và chế biến, nhằm giảm

nguy cơ nhiễm vi khuẩn Capylobacter Capylobacter tiết ra độc tố Campylobacteriosis

là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng thông qua đường ăn uống do thực phẩm, nguồn nước bị ô nhiễm hoặc thịt sống

Theo những nghiên cứu của Trung Quốc và Ý được phổ biến trong tạp chí British Journal of Cancer số tháng 3/1993 cũng cho biết tỏi có nhiều hoạt chất có thể ngăn chận sự phát triển của nhiều loại khối u ung thư Theo các nhà khoa học trường Đại học Pensylvania khả năng ngăn chận khối u ung thư của tỏi liên quan đến các hợp chất S-allyl cysteine, diallyl disulfide và diallyl trisulfide

iii Ajoene:

Các nhà khoa học Đan Mạch đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên trong tỏi là ajoene, nó có thể ngăn chặn vi khuẩn tiếp xúc và kết hợp với nhau làm cho quá trình tiêu diệt vi khuẩn dễ dàng hơn

Ajoene có khả năng ức chế sự biểu hiện của 11 gen trong vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa, đây là nhân tố quyết định độc tố của Pseudomonas aeruginosa Đây là nguyên nhân chính gây nên bệnh nhiễm trùng mãn tính ở những

bệnh nhân bị xơ nang (theo Tim Holm Jakobsen)

Ajoene cũng ngăn ngừa vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tiết độc tố rhamnolipid để phá hủy các tế bào bạch cầu của cơ thể Đây là tác nhân để tiêu diệt vi

khuẩn và ngăn ngừa nhiễm trùng

Ajoene không trực tiếp giết chết vi khuẩn Ajoene kết hợp với kháng sinh

tobramycin có thể giết chết hơn 90% vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong màng

sinh học (theo Jakobsen) Thuốc kháng sinh thông thường một mình không có hiệu lực trên màng sinh học Nhưng khi phối hợp với ajoene một số cấu trúc bảo vệ của màng sinh học biến mất, cho việc tiếp cận thuốc kháng sinh dễ dàng hơn với vi khuẩn

Không chỉ góp phần tiêu diệt được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Ajoene

cũng có tác dụng làm giảm độ dính của máu, làm giảm nồng độ fibrinogen trong máu giúp giảm nguy cơ nghẽn mạch

iv Selen:

Ngoài các hợp chất trên, trong tỏi còn có hàm lượng khoáng chất selen, một chất chống oxy hoá mạnh làm tăng khả năng bảo vệ màng tế bào, phòng chống ung thư và bệnh tim mạch của tỏi

Selen có khả năng chống lại các loại vi khuẩn như: E coli B subtilis, S aureus, Salmonella typhimurium…

Selen giúp tăng cường hoạt động chống gây đột biến của vi khuẩn probiotic

Enterococcus faecium

Selen đã được xác định để biểu hiện tính kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm chống ký sinh trùng, kháng histamin, và các thuộc tính chống ung thư

1 Đặc điểm và phân loại

Sả còn có tên gọi: Cỏ sả, lá sả, sả chanh, hương mao

Tên khoa học: Cymbopogon Citratus Stapf, thuộc họ lúa - Poaceae

Chi sả (danh pháp khoa học: Cymbopogon) là một chi chứa khoảng 55 loài

Sả chanh (Cymbopogon flexuosus) là loài thực vật thuộc sả

- Giới (regnum): Plantae

- Ngành (divisio): Magnoliophyta

- Lớp (class): Liliopsida

- Bộ (ordo): Poales

- Họ (familia): Poaceae

- Chi (genus): Cymbopogon

- Loài (species): C flexuosus

Thân rễ có màu trắng hoặc hơi tím, có nhiều đốt, lá hẹp dài, kích thước 50 –

100 x 0,5 – 2 cm mép lá hơi nhám Bẹ lá ôm chặt với nhau rất chắc, tạo thành một thân giả (mà ta thường gọi là củ) Sả đẻ chồi ở nách lá tạo thành nhánh như nhánh lúa Với cách sinh sản này từ một nhánh trồng ban đầu về sau chúng sẽ sinh sôi ra nhiều nhánh tạo thành một bụi sả (giống như bụi lúa), mỗi bụi có thể gồm 50 – 200 tép Cây cao 0,8 – 1,5m Cụm hoa to dài đến 60cm, có 4 – 9 đốt, gồm nhiều bông nhỏ

Sả có thể được sử dụng ở dạng khô, bột hoặc tươi tùy theo mục đích sử dụng

Hình 1.3 Sả tươi

Sả là một loại cây hương liệu được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực Ấn Độ, Việt Nam, Malaysia và Thái Lan Sả cũng thường được sử dụng như một thành phần trong các loại trà thảo dược và tao hương thơm cho các loại xà phồng…

2 Điều kiện trồng trọt, phân bố

a Phân bố

Sả chanh được trồng nhiều ở các nước Nam Mỹ như Achentina, Braxin, Hoduras, Guatemala, Liên Bang Nga, Bắc Australia, ẤnĐộ, Banglades, Việt Nam và các nước Đông Nam Á khác

Ở Việt Nam, sả được trồng khá phổ biến ở nông thôn, nhất là trong các vườn thuốc gia đình và trạm y tế xã, từ đồng bằng đến miền núi

Hiện nay, sả còn được phát triển ở quy mô nông trường tại Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Đăk Lăk, Tây Ninh, An Giang… để cất tinh dầu sử dụng trong nước và xuất khẩu

b Điều kiện trồng trọt

Sả dễ trồng, không kén đất, thích nghi rộng với mọi vùng khí hậu

Sả phát triển tốt ở nơi đất xốp, thô, có độ ẩm cao, chịu mát và ít nước, mỗi tháng chỉ 2-3 lần tưới

Trồng sả quy mô lớn phải đúng kỹ thuật, nếu trồng dày sẽ gây thiếu ánh sáng quang hợp, trồng thưa sẽ bị cỏ xâm lấn, hút hết “đạm” trong lòng đất, lá sả sẽ khô, còi, sâu, vàng úa

Cách trồng đem lại hiệu quả cao nhất là nên trồng hàng cách hàng 0,8m cây cách cây 0,7m

Sau khi trồng 3 – 4 tháng đã có thể thu hoạch sả để ăn, làm thuốc…

Hình 1.4 Cây sả

3 Thành phần hóa học và dược chất của cây sả

Các loại sả khác nhau sẽ có thành phần hóa học khác nhau và hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau Nhưng hàm lượng tinh dầu luôn dao động khoảng từ 0,46 – 0,55%

Tinh dầu sả chanh là chất lỏng màu vàng nhạt, mùi thơm của sả Thành phần chính của tinh dầu là citral (bao gồm geranial và neral) chiếm từ 65 – 86% Citral tạo mùi thơm chính và đặc tính mạnh chống vi khuẩn và chống nấm cho sả

Ngoài citral, trong tinh dầu cây sả còn chứa geraniol, myrcene, limonene, isopulegol, citronellal, linalool, acid cuea geranium, alpha-pinen, beta-sitosterol, coumarin, tannin, acid ursolic…

Một điểm đặc trưng cho tất cả các loại sả là trong tinh dầu có chứa Methytheptenon với hàm lượng 1 - 2% làm cho tinh dầu có mùi đặc trưng của sả

Thành phần chính trong lá sả thay đổi tùy địa phương Ở Việt Nam, thành phần chính trong sả chanh bao gồm:

Phần lá mỏng sả chanh rất giàu một số nhiều vitamine, vitamine cần thiết như : B5, B6, B1, Những vitamin này cần thiết trong chiều hướng là cơ thề cần lấy từ bên ngoài để tái tạo lại

Sả tươi cũng chứa những vitamin với lượng nhỏ chống sự oxy hóa như là vitamine C và vitamin A

Sả cũng bao gồm một số khoáng chất như canxi, sắt, magiê, mangan, phốt pho, kali, selen và kẽm

4 Công dụng của sả

a Đối với sức khỏe con người:

Trong thực phẩm, sả là một gia vị quen thuộc được dùng để ăn sống hoặc tẩm ướp để tăng thêm mùi vị cho các món ăn Trong y học, sả còn có tác dụng phòng và chữa được nhiều bệnh như sau:

- Ngăn ung thư

- Hỗ trợ tiêu hóa: hạn chế đau dạ dày, ợ chua, đầy bụng, tiêu chảy

- Hỗ trợ tiêu hóa

- Giải độc hiệu quả

- Tăng cường sức khỏe hệ thần kinh

b Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm:

Mặc dù ở Việt Nam sả chanh ít được nghiên cứu nhưng trên thế giới tinh dầu sả chanh có rất nhiều tác dụng và đã được đưa vào để ứng dụng bảo vệ thực phẩm như:

 Dạng sả bột hay được dùng trộn chung với bột cà ri thành một khối nhão có tên gọi là Sejeh Mục đích để kéo dài thời gin bảo quản của cà ri nhờ tiêu diệt các loại vi

sinh vật gây hại Không những có tác dụng bảo quản mà sả còn có tác dụng nâng cao cao hương vị cho bột cà ri

 Theo sở Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Khoa học Bangkok, Thái Lan Dịch chiết từ lá sả đã được đưa vào bảo quản nhằm kéo dài thời gian sử dụng kem dừa của Thái Lan ở nhiệt độ bảo quản 4 ± 20C Trong thời gian bảo quản, các chỉ tiêu coliform và hiếu khí được kiểm tra 3 ngày 1 lần và định mức CFU luôn ở mức cho phép và thời gian bảo quản cũng như các chỉ tiêu màu sắc, hình thái, cấu trúc đều tốt hơn kem dừa không có dịch chiết

 Ngoài ra, tinh dầu sả còn được ứng dụng trong bảo quản sữa chua để tiêu diệt một số nấm mốc như: : Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus ochraceus để kéo dài thời gian bảo quản của sữa chua (theo Tạp chí khoa học Mỹ

2010)

5 Khả năng kháng khuẩn của sả

Trong lá sả thành phần kháng khuẩn tập trung chủ yếu trong tinh dầu Các thành phần kháng khuẩn chủ yếu như:

a Citral:

Là thành phần chính trong tinh dầu lá sả Gồm 2 đồng phân cis – cistral (neral)

và trans – citral (geranial)

Citral có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể tiêu diệt được cả vi khuẩn hiếu

khí và kị khí như Staphyloccus aureus, Salmonella paratyphi, Shigella flexnerii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis và Pseudomonas aeruginosa Ngoài ra, citral còn có khả năng tiêu một số loại nấm mốc như nấm Stolonifer rhizopus, Penicillium italicum,

Geranial có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với đồng phân neral nhưng neral là nhân tố tạo nên mùi chanh đặc trưng cho lá sả Geranial có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh gần bằng ampicillin và tương đương với kháng sinh nitrofurantoin khi làm đối chứng Tuy nhiên, geranial rất nhạy cảm với oxy nên dễ bị oxy hóa và mất đi hoạt tính

Citral khi áp dụng bên ngoài đã được tìm thấy tác dụng chống viêm, chống nhiễm khuẩn, chống bệnh thấp khớp, chất khử mùi (Carbajal 1989), chống viêm, thuốc

lợi tiểu, an thần (Carbajal, 1989 và Carlini, 1986)

Không chỉ kháng khuẩn, citral còn có tác dụng điều trị ung thư Các nhà nghiên cứu đã kiểm chứng tác dụng của citral lên tế bào ung thư bẳng cách cho thêm chất này vào các tế bào ung thư và tế bào lành mạnh cấy trong một đĩa thử nghiệm Lượng citral

sử dụng tương đương với lượng citral có trong một ly bình thường trong đó 1 gram sả đươc chế trong nước sôi Kết quả cho thấy là citral đã làm chết các tế bào ung thư nhưng không làm hại tới các tế bào lành mạnh Theo bác sĩ Ofir thì chất citral

có khả năng đẩy được các tế bào ung thư vào chỗ “ tự huỷ diệt” nhờ vào một cơ chế gọi là apoptosis (một cơ chế đã được chương trình hoá sẵn theo đó các tế bào sẽ tự động tìm cái chết)

Nếu citral trong tinh dầu sả có thể kháng lại các vi khuẩn gram dương, gram âm

và các loại nấm mốc thì myrcene không có khả năng kháng khuẩn Tuy nhiên, myrcene lại là tác nhân có tác dụng tăng cường hoạt động kháng khuẩn của citral khi phối trộn lại với nhau

Khi kết hợp myrcene với terpinenol thì hoạt tính rất mạnh Hỗn hợp sau khi phối

trộn có khả năng chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus rất tốt Hỗn hợp trên đã ức chế khả năng tăng trưởng và tiêu diệt các tế bào của Staphylococcus aureus

c Các hoạt chất khác:

Ngoài ra, trong tinh dầu cây sả còn chứa geraniol, limonene, isopulegol, citronellal, linalool, acid cuea geranium, alpha-pinen, beta-sitosterol, coumarin, tannin, acid ursolic…đây cũng là những thành phần rất quan trọng góp phần tạo mùi thơm đặc trưng của tinh dầu sả, cũng như khả năng kháng một số vi khuẩn, nấm mốc và có khả năng chữa một số bệnh

1.2 Chất kháng khuẩn từ thực vật

1.2.1 Lịch sử phát triển của chất kháng khuẩn từ thực vật

Vào cuối thế kỷ trước, hoạt động kháng khuẩn của cây thuốc và gia vị đã được kiểm tra Mù tạt, cây đinh hương, quế và các loại dầu thiết yếu đã được biết đến để làm chậm sự hư hỏng của vi sinh vật trong thực phẩm (theo Nakatani, năm 1994)

Vào thế kỷ 20, nhiều báo cáo đã được công bố về hoạt động ức chế của các loại gia vị chống lại các sinh vật gây bệnh do thực phẩm

Năm 1949, Dold và Knapp đã kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của 27 chất chiết

xuất từ thực vật chống lại 8 chủng sinh vật thử nghiệm như: E coli, B subtilis, Salmonella Typhosa, Shigella paradysenteria… và cho thấy tỏi có hoạt động chống lại

tất cả các sinh vật được kiểm tra Hành tây, hạt nhục đậu khấu, đinh hương ức chế sự

tăng trưởng của tất cả các sinh vật thử nghiệm, ngoại trừ vi khuẩn B subtilis

Năm 1982, Ueda cũng đã thử nghiệm chất chiết xuất từ cây thuốc và gia vị bằng dung môi là ethanol để ức chế vi khuẩn và nấm trong môi trường nuôi cấy tại pH khác nhau Đinh hương được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn có thể chống lại tất cả các

sinh vật thử nghiệm bao gồm cả vi khuẩn B subtilis PCI, S aureus 209P, E coli, Salmonella Typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus morganii

Năm 1985, Galli phát hiện dầu mù tạt có thể chống lại cả vi khuẩn Gram dương

và âm Quế, kinh giới, rau oregano và thyme đều có tính kháng khuẩn tốt

Năm 1984, Shelef nghiên cứu cây xô thơm, hương thảo và allspice cũng có tính kháng khuẩn

Năm 1983, Shelef nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn thảo dược và chiết xuất dược liệu của chúng trong ống nghiệm

Năm 1989, Bahk phát hiện khả năng kháng Listeria monocytogenes trong nước

dùng thịt của các loại gia vị như: tỏi, hành tây, quế… ở các nồng độ khác nhau

Năm 1992, Ting và Deibel báo cáo về một cuộc khảo sát tính kháng khuẩn của tiêu đen, ớt hạt tiêu, quế, tỏi, mù tạt, ớt bột, rau mùi tây… với 14 loại sinh vật khác

nhau như Listeria monocytogenes…

Năm 2001, Elgayyar chứng minh rằng dầu của rau oregano hoàn toàn ức chế sự

tăng trưởng của vi khuẩn Salmonella Typhimurium và ức chế Listeria monocytogenes

mạnh mẽ nhất Ngoài ra, bạch chỉ, rau mùi, cần tây, mùi tây có hoạt động kháng Listerial vừa phải

Năm 2002, Friedman sử dụng một khảo nghiệm microplate để đánh giá mức độ hoạt động diệt khuẩn của các loại tinh dầu và các thành phần dầu chống lại các vi khuẩn gây bệnh của gỗ, lá nguyệt quế, nụ đinh hương, rau oregano, quế, allspice, cỏ xạ hương, và dầu hoắc hương Cỏ xạ hương, rau oregano, quế, nụ đinh hương, các loại

dầu majoran… chống lại vi khuẩn Salmonella enterica mạnh mẽ nhất

Năm 1999, Arora và Kaur đã khám phá ra tác dụng diệt khuẩn của tỏi đối với S aureus và Salmonella Typhi…

1.2.2 Công dụng của các chất kháng khuẩn từ thực vật

Ngày nay, có rất nhiều loại thảo dược cũng như gia vị đã được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn như: tỏi, hành, gừng, nghệ, quế, sả, hẹ, đinh hương…

Một số loại không chỉ được sử dụng như một loại gia vị nhằm làm tăng hương

vị trong các món ăn mà nó còn có rất nhiều tác dụng đối với con người như: làm giảm cholesterol, hạ huyết áp, phòng chống một số loại ung thư…

Đặc biệt các hợp chất thu được trong dịch chiết của các loại thực vật trên còn có tác dụng kháng khuẩn rất lớn Các hợp chất kháng khuẩn thu được trong các loại thực vật có khả năng kháng lại rất nhiều loại vi khuẩn, nấm mốc, tiêu diệt các loại giun sán,

kí sinh trùng…

Và có một số hợp chất kháng khuẩn cũng đã được đưa vào để bảo quản thực phẩm thay thế cho một số hóa chất độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người

1.3 Hệ vi sinh vật trên thịt

1.3.1 Escherichia coli

1 Giới thiệu về vi khuẩn Escherichia coli:

a Nguồn gốc tên gọi

Năm 1885, tại München bác sĩ nhi khoa Theodor Escherich đã tìm ra một loại vi khuẩn mới trong tã lót trẻ em và được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên

thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, nó được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli hay E coli

E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học Mặc dù E.coli là

tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype)

b Phân loại E coli

Theo Migula (1895), Castellani và Chalmers (1919) E coli thuộc:

- Vực (domain): Bacteria

- Ngành (phylum): Proteobacteria

- Bộ (ordo): Entemrobacteriales

- Họ (familia): Enterobacteriaceae

- Chi (genus): Escherichia

- Loài (species): E Coli

2 Đặc điểm của E coli

a Đặc điểm phân bố

Escherichia coli (E coli) là một nhóm vi khuẩn đa dạng trong số các loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động

vật có vú)

E.Coli là một loại trực khuẩn sống thường xuyên trong ruột người và một số

động vật Chúng chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí sống ở ruột

Gia súc là ổ chứa vi khuẩn quan trọng nhất, đặc biệt là loài ăn cỏ nhai lại như trâu, bò, dê, cừu Vi khuẩn cư ngụ trong đường ruột của những loài vật này và được đào thải ra môi trường qua phân của chúng Người cũng có thể coi là ổ chứa vi khuẩn

do đóng vai trò trong việc lây truyền người - người

b Đặc điểm hình thái

E coli có hình que, hai đầu tròn, kích thước dài ngắn khác nhau, thường từ

2 - 3 micromet x 0,5 micromet Thường đứng riêng rẽ từng tế bào, cũng có khi ghép từng đôi một, có khi kết với nhau thành từng đám hoặc 1 chuỗi ngắn Thường có tiêm mao mọc khắp bề mặt, có khả năng di động Không có khả năng hình thành bào tử, có khả năng hình thành giáp mạc (vỏ nhày) khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt Nhuộm gram âm

Hình dạng của vi khuẩn trên môi trường thạch NB là khuẩn lạc dạng tròn, đường kính 2 – 4 mm, màu trắng đục Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngã vàng

Hình 1.5 Vi khẩn E coli

3 Tính chất sinh vật hóa học

Lên men các đường glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose, manit kèm theo sinh hơi

Không lên men đường adonit và inozit

Nghiệm pháp IMVIC: Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, gồm có các phản ứng

Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+)

Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+)

Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh

ra acetyl - metyl cacbinol E.coli có phản ứng Voges Proskauer âm tính

Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm

Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (c) E.coli phản ứng citrat âm

tính

Ngoài ra, E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ

4 Tính chất nuôi cấy

Dễ nuôi cấy, có thể mọc được trên môi trường hiếu khí cũng như kỵ khí

Mọc được ở nhiệt độ từ 5 – 40oC, thích hợp nhất ở 37oC Có thể sống được ở

pH 5,5 - 8,0, thích hợp nhất ở pH 7 - 7,2 Trên môi trường thạch thường có khuẩn lạc dạng S (nhắn bóng, bờ đều) Đôi khi hình thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hoặc dạng M (nhày) Khuẩn lạc có màu xám, đục

Trong môi trường lỏng, sau 1 - 2 ngày nuôi cấy thường làm đục môi trường, có váng trên bề mặt hoặc dính quanh thành ống, tạo thành cặn lắng xuống đáy

Có khả năng lên men đường lactoza khác với một số nhóm gây bệnh đường ruột khác thường không có khả năng lên men đường Lactoza

Ngoài ra còn có khả năng lên men một số đường khác như Glucoza, Galactoza v.v Khi lên men có sinh khí làm sủi bọt môi trường

5 Lợi ích của E.Coli

Không lâu sau khi chào đời, các loại vi khuẩn bắt đầu xuất hiện trong hệ tiêu hóa của trẻ em, rồi dần dần phát triển thành một hệ vi khuẩn hoàn chỉnh gọi là “vi khuẩn chí” đường ruột Hệ vi khuẩn này gồm có hai nhóm chính: nhóm chiếm phần lớn

là các vi khuẩn yếm khí (sống trong môi trường ít dưỡng khí); nhóm kia là các vi khuẩn ái khí (phát triển trong môi trường có đủ dưỡng khí)

E coli là vi khuẩn chiếm đến 80% trong nhóm vi khuẩn ái khí này E Coli cùng

các vi khuẩn khác trong hệ vi khuẩn chí đường ruột góp phần vào nhiều chức năng quan trọng trong sự sống của con người Những chức năng đó bao gồm:

- Ngăn chặn sự tấn công của các vi khuẩn xâm nhập vào hệ tiêu hóa

- Kích thích hệ miễn dịch của cơ thể

- Sản xuất các chất có lợi cho cơ thể, ví dụ vitamin K, biotin, folate

- Giúp chuyển hóa các chất đường

Như vậy, nói chung E coli là loại vi khuẩn không có hại, chúng sống thường trú

trong hệ tiêu hóa con người, góp phần giúp ích cho con người Tuy vậy, một khi vì lý

do gì đó chúng bị lạc vào chỗ khác ngoài hệ tiêu hóa thì chúng có thể gây bệnh Ví

dụ E coli gây bệnh nhiễm trùng tiểu, bệnh viêm màng não…

Do chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí trong ruột và luôn giữ thế cân bằng sinh

thái nên E coli được chọn làm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm Có nghĩa là ở đâu có E

coli chứng tỏ có ô nhiễm phân và có ô nhiễm các loại vi sinh vật gây bệnh khác

Ở trong ruột E coli sống đối kháng với một số vi khuẩn khác như Salmonella

và Shigella (thương hàn và lỵ) nhờ có khả năng tạo ra một loại chất ức chế có tên là

Colixin Chúng còn có khả năng tổng hợp một số vitamin thuộc nhóm B, E và K

Vì thế khi không gây bệnh chúng có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế được một số vi khuẩn gây bệnh khác, giữ thế cân bằng sinh thái trong ruột và sinh tổng hợp một số vitamin

6 Đặc điểm kháng nguyên và khả năng gây bệnh của E.Coli

a Đặc điểm kháng nguyên

Có kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên bề mặt K

- Kháng nguyên O: Có chừng 157 quyết định kháng nguyên O được đánh số 1, 2,3,4

- Kháng nguyên H: Có tới 52 quyết định kháng nguyên H

- Kháng nguyên K: Gồm có kháng nguyên L và B không chịu nhiệt và kháng nguyên А, M chịu nhiệt, Kháng nguyên bề mặt K thường ngăn cản hiện tượng ngưng kết О của vi khuẩn sống Nếu đun sôi 1 giờ huỷ kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết О lại xuất hiện Có khoảng 100 kháng nguyên K

b Khả năng gây bệnh

Tuy là vi khuẩn cộng sinh ở đường tiêu hoá, nhưng E coli có thể gây viêm dạ

dày, ruột thường gặp ở trẻ nhỏ, trẻ đang bú

E coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng đường gan,

mật, nhiễm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mù ỏ trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết

1.3.2 Bacillus subtilis

1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus Subtilis (B subtilis)

a Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức

y học Nazi của Đức Ban đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh

sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Đến những năm 1949 – 1957, khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các

chủng B subtilis thuần khiết thì ứng dụng của vi khuẩn này mới trở nên rộng rãi Từ

đó, thuật ngữ “subtilis therapy” ra đời

b Phân loại Bacillus subtilis

Theo phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:

- Loài: Bacillus subtilis

2 Đặc điểm của Bacillus subtilis

a Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng

được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước không khí, xác và bã thực vật bị thối rửa

B subtilis hiện diện trong đất với một số lượng phổ biến là 106– 107 CFU/g Vi khuẩn này có khả năng sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trường sống Thông thường có khoảng 60%

số lượng B subtilis trong đất tồn tại ở trạng thái này (Alexander, 1977) Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm

Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào

sinh dưỡng Bacillus subtilis

Hình 1.6 Vi khẩn B subtilis

b Đặc điểm hình thái

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kích thước

0.5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả

năng di động, có 8 – 12 tiêm mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và

nằm giữa tế bào

Bào tử B subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng

acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000) Hình dạng của vi khuẩn trên môi trường thạch LB ( Luria-Bertani ) là khuẩn lạc

dạng tròn, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 5 mm, màu vàng xám, tâm sẫm

màu Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngã nâu

Trên môi trường canh LB (Luria-Bertani) B subtilis phát triển làm đục môi

trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều

c Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua

những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích

hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi …

Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ

nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng

3 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu

đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột Chúng còn có khả

năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột

 Với vi sinh vật gây bệnh

Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số

lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi

khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn

các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh

trưởng của nấm bị ức chế

 Với đồng loại

Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất

kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này nhằm

tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ

trước khi tạo bào tử

4 Lợi ích của vi khuẩn Bacillus subtilis

Tạo ra các chuyển hóa giúp cải tạo đất

Phân giải các protid động vật, thực vật trong đất, nước rất mạnh

Sản xuất protein vi sinh vật từ dầu mỏ và khí đốt

Ngoài ra, B subtilis có khả năng tổng hợp nhiều loại acid amin không thay thế

như: lyzin, valin, treonin, izoleuxin và các acid amin khác như xitrulin, thyroxin,

prolin, aspartic Một số loại vitamin cũng được B subtilis sản sinh, đặc biệt là vitamin

B2 vì trong mỗi gam chất khô của nó có thể có đến 7,8 µg vitamin B2

Theo công trình nghiên cứu của Work và các cộng sự thì B subtilis là vi khuẩn

có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme như amylase, protease, diastase, lexithinase,

phân giải gelatin và làm tiêu fibrin…Tuy nhiên B subtilis hoạt động mạnh mẽ nhờ vào

hai loại enzyme tiêu hóa là amylase và protease

Ngoài ra B subtilis còn có khả năng tổng hợp một số loại kháng sinh có tác

dụng ức chế sinh trưởng hay tiêu diệt một số vi sinh vật khác, phổ tác dụng là tương đối rộng: các vi khuẩn Gram âm, Gram dương, vi nấm, Mycobacterum và một số vi khuẩn khác

Nhờ có các kháng sinh này mà B subtilis có khả năng cạnh tranh với các loài vi

sinh vật khác và người ta đã ứng dụng chúng để tái tạo sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột, ứng dụng làm các chế phẩm probiotic cho người và vật nuôi

5 Độc tính của Bacillus subtilis

 Đối với con người

Một số chủng Bacillus subtilis cũng như những họ hàng gần của nó là B licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme

có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người

Một số nghiên cứu cho thấy B subtilis cũng liên quan đến vài trường hợp ngộ

độc thực phẩm

B subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có độc tính

thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường hô hấp

B.subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme ngoại bào và

các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người Ngoại trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của người đang quá suy

yếu Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện B subtilis ở những bệnh nhân bị

ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả… Tuy nhiên, tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm Bacillus (trong 1034 ca

nhiễm khuẩn) là do B subtilis

 Đối với động vật

B.subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai Tuy nhiên, B subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh B subtilis nhiễm vào

và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây sốt rét ở Ấn Độ (Gupta and Vyas,

1989) và được sử dụng như 1 tác nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu về bệnh này

 Đối với thực vật

B subtilis không được coi là tác nhân gây bệnh cho thực vật (7 CFR 330, et

seq.; Claus and Berkeley, 1986)

Tuy nhiên, có 1 số báo cáo trong các tài liệu liên kết B subtilis với các bệnh thực vật xác định (Kararah et al 1985) B subtilis gây phân hủy pectin và

polysaccharides của mô thự vật dẫn đến thối củ ở khoai tây Gây những vết viêm loét trên một số cây rừng

1.3.3 Staphylococcus aureus

1 Giới thiệu về vi khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus)

a Nguồn gốc tên gọi

Tụ cầu khuẩn (staphylococci) được mô tả lần đầu tiên bởi nhà phẫu thuật người

Scotland, ông Alexander Ogston vì nguyên nhân của một số hiện tượng sinh mủ (hình

thành mủ) truyền nhiễm ở người Năm 1882, ông đặt tên cho chúng là staphylococcus

(tiếng Hy Lạp: straphyle, chùm nho; coccus, hạt lúa hay trứng cá) vì hình dạng chúng xuất hiện dưới kính hiển vi

- Chi (genus): Staphylococcus

- Loài (species): S Aureus

Hiện nay có 27 loài và 7 phân loài của thế hệ Staphylococcus, sự sản xuất enterotoxin chủ yếu được đi liền với loài S aureus, mặc dù nó cũng được sản xuất bởi các loài khác bao gồm S intermedius và S hyicus

Hình 1.7 Vi khẩn S aureus

2 Đặc điểm của S aureus

a Đặc điểm hình thái

S aureus là một khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu những tế bào

dạng trứng có đường kính khoảng 1µm Sự phân chia tế bào ở một mặt phẳng để tạo thành những khối tế bào không đồng đều giống như chùm nho

b Đặc điểm nuôi cấy

Phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, mọc tốt ở 370

C nhưng tạo sắc tố tốt ở 200C

Ở môi trường canh LB 5-6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì đục hẳn

Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng, óng ánh, màu vàng, màu cam, màu trắng, to dần sau 24 giờ

3 Tính chất sinh hóa và đề kháng

Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú, những enzyem được dùng trong chẩn đoán là:

- Catalase (khác liên cầu)

- Coagulase (tiêu chuẩn để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác)

- Lên men đường Mannit: lên men chậm nhiều loại đường

- Tạo acide nhưng không sinh hơi

Tụ cầu tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu

độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao, nhạy cảm thay đổi với kháng sinh, nhiều chủng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác

Các nhiễm trùng da và nung mủ sâu là một hình thức đặc biệt, như đinh râu, chốc lỡ, viêm tủy xương, viêm phổi màng phổi, viêm màng ngoài tim, viêm màng não…

Ngoài ra, còn gây ra các bệnh như: nhiễm trùng huyết, viêm ruột cấp tính, ngộ độc thức ăn, hội chứng da phồng rộp…

đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884

b Phân loại khoa học

- Vực (domain): Bacteria

- Liên giới(superregnum): Bacteria

- Giới (regnum): Bacteria

- Ngành (phylum): Proteobacteria

- Lớp (class): Gammaproteobacteria

- Bộ (ordo): Enterobacteriales

- Họ (familia): Enterobacteriaceae

- Chi (genus): Salmonella

2 Đặc điểm của salmonella

a Đặc điểm phân bố

Bất kỳ thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm sữa, trứng, hải sản cùng với một số rau, quả có thể chứa vi khuẩn salmonella Ngoài ra, còn có thức ăn tự làm có chứa trứng tươi như kem, bột làm bánh…

Động vật nuôi trong nhà cũng có thể mang vi khuẩn salmonella như

gà, vịt, lợn…

b Đặc điểm hình thái

Salmonella là một giống vi khuẩn gram âm, hình que, không tạo bào tử, di động, sinh sống trong đường ruột, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua

Hình 1.8 Vi khẩn Salmonella

3 Tính chất nuôi cấy

Nuôi cấy được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí, thích hợp ở 370C nhưng

có thể phát triển được từ 6 - 42oC; pH thích hợp là 7,6; phát triển được ở pH từ 6 - 9 Trên môi trường lỏng: sau 5 - 6h nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục nhẹ môi trường, sau 18h, môi trường đục đều

Trên MT thạch thường cho khuẩn lạc dạng S đôi khi có dạng R, kích thước khuẩn lạc thường lớn (2-4mm) có màu trắng đục Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng; trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh

Có khả năng lên men đường glucose sinh hơi (trừ Sal.typhi) Đa số có khả năng lên men đường lactose, saccarose Salmonella không sinh indol, không làm lỏng

gelatin, sinh H2S.có khả năng khử nitrat thành nitrit, mọc ở môi trường có nguồn C duy nhất xitrat natri

4 Tính chất đối kháng

 Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O):

Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp

Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất

và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết địnhđộc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặchiệu Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide(LPS)

 Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K – kapsule) :

Bản chất hóa học của vỏ vi khuẩn là polypeptid hoặc polysaccharide Vỏ của vi khuẩn gây miễn dịch không mạnh nhưng khi gắn với tế bào vi khuẩn vỏ vẫn gây được

miễn dịch Kháng nguyên vỏ được dùng để phân loại các chủng Salmonella

 Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) :

Được tổng hợp từ cácacid amin dạng D (dạng ít gặp trong tự nhiên) Do đó việc

xử lý kháng nguyêncủa các tế bào miễn dịch không thuận lợi và đáp ứng kháng thể không mạnh.Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các kháng thể đặc hiệu, lông sẽ bị bất động, vi khuẩn không thể di chuyển được Kháng nguyên lông được dùng đễ phân loại một số chủng Salmonella

5 Khả năng gây bệnh

Khu trú ở niêm mạc đại tràng, gây ra bệnh lỵ trực khuẩn ở người, rất dễ tái phát

và có thể trở thành bệnh mãn tính Sinh nội độc tố, một số loài có khả năng sinh ngoại

độc tố tác động lên hệ thần kinh, trên lâm sàng thường biểu hiện các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu

1.3.5 Clostridium

1 Giới thiệu về Clostridium

a Nguồn gốc tên gọi

Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây

là những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi Tên của chúng bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp kloster (κλωστήρ) có nghĩa trục quay

Từ những đặc điểm điển hình trên, người ta xếp các vi khuẩn vào giống Clostridium, tuy nhiên gần đây nhiều chủng đã được phân loại vào các giống khác

b Phân loại: Theo Prazmowski 1880

2 Đặc điểm của clotridium

Clostridium là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí hoặc kỵ khí tùy ý Tạo bào tử chịu nhiệt rất cao, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 43 – 47oC, pH: 5 – 9 Bị

ức chế bởi NaCl 5% hoặc NaNO3 2,5%

Giống Clostridium bao gồm khoảng 100 loài có những chủng sống tự do trong môi trường và một số hiện diện như những mầm bệnh tiềm ẩn với con người Trong nhóm này có bốn vi khuẩn chủ yếu gây bệnh cho con người:

 C botulinum có khả năng sinh độc tố trong thức ăn, vết thương gây ra bệnh độc

thịt

 C difficile tồn tại như là mầm bệnh cơ hội thuộc hệ vi sinh vật ở ruột và phát triển

khi có điều kiện nhất là trong liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh và gây ra chứng viêm đại tràng màng giả

 C perfringens ban đầu có tên C welchii, là nguyên nhân gây ra một loạt các hội

chứng khác nhau, từ ngộ độc thức ăn cho đến bệnh hoại thư sinh hơi Loài này

Hình 1.9 Vi khẩn Clostridium botulinum

cũng sản sinh ra độc tố ruột huyết gây ra bệnh nhuyễn thận ở cừu và dê Lợi ích

của C perfringens là thay thế nấm mentrong phương pháp bánh mì muối

 C tetani gây ra bệnh uốn ván

3 Khả năng gây bệnh của clostridium

Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống C botulinum là có khả năng

sản sinh độc tố thần kinh

Các loài Clostridium đã được xác định gây ra các trường hợp ngộ độc trên thịt chưa chế biến và cả đồ hợp thịt, rau quả…

1.4 Chất bảo quản thực phẩm

1.4.1 Định nghĩa chất bảo quản thực phẩm

Chất bảo quản thực phẩm là các hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào thực phẩm để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học Chúng

có thể sử dụng như là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác

Các chất kháng khuẩn thông dụng trong chế biến thực phẩm là nitrate natri, nitrite natri, các muối sulfit (dioxid lưu huỳnh, bisulfat natri, sulfat hydro kali v.v) và EDTA dinatri (etylendiamintetra acetic)

Các chất chống oxy hóa bao gồm BHA (2-tert-butyl-4-hydroxyanisol hay butyl-4-hydroxyanisol) và BHT (2,6-di-tert-butyl-4-metylphenol)

Các chất bảo quản khác còn bao gồm cả formaldehit (thông thường trong dung dịch và chủ yếu để bảo quản các mẫu sinh học), glutaraldehit, diatomit (giết côn trùng), etanol và metylcloroisothiazolinon

Một số phương pháp bảo quản thực phẩm sử dụng muối ăn, đường hay dấm Các loại hóa chất này được coi là thực phẩm nhiều hơn là phụ gia thực phẩm

1.4.3 Hiện trạng sử dụng chất bảo quản hiện nay

Theo khảo sát của các chuyên gia, tại các đại lý, siêu thị trên địa bàn Hà Nội, Thành Phố Hồ Chí Minh nhiều loại thực phẩm như thịt xông khói, xúc xích, mỳ tôm, bim bim, nước mắm, bột nêm… được bày bán hầu hết đều sử dụng các chất phụ gia, chất bảo quản được đánh số quốc tế (ký hiệu là INS) như E129, E211, E415, E626, E627, E631… mà không hề ghi hàm lượng cụ thể của các chất này Thậm chí hai chất E627, E631 được nhiều doanh nghiệp sử dụng và bán rộng rãi trên thị trường hiện nay

Bộ Y tế đã ban hành theo Quyết định số 3742 /2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001 Các chất Natri Benzoat (E211), Kali benzoate (E212) và Đỏ Allura AC (E129) là các chất nguy hiểm gây độc hại cho người sử dụng nhưng không ghi hàm lượng cụ thể trên nhãn sản phẩm

Tính độc hại của các loại phụ gia, hoá chất được phép sử dụng trong thực phẩm

đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và chứng minh cụ thể Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO), Natri Benzoat nếu dùng quá liều lượng 1g/kg sẽ gây nguy hại cho sức khỏe

1.5 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết

tỏi, lá sả

1.5.1 Tình hình trên thế giới

Trên thế giới, hoạt tính kháng khuẩn của các loại thực vật đã được nghiên cứu từ rất lâu Vào thế kỷ 20, nhiều nghiên cứu về lĩnh vực trên đã được công bố

Ngày nay, tầm quan trọng và khả năng ứng dụng của các hợp chất kháng khuẩn

từ tỏi và lá sả ngày càng được quan tâm Có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn trên đã được nghiên cứu và đạt được nhiều kết quả rất tốt

Hoạt tính kháng khuẩn trên không chỉ được nghiên cứu trong lĩnh vực y học mà

nó còn được nghiên cứu rất rộng rãi trong thực phẩm và đã có được những thành tựu rất đáng quan tâm và được ứng dụng để bảo quản thực phẩm

Các hợp chất trên không những được biết đến với vai trò như một loại thuốc thiên nhiên có thể điều trị một số bệnh như: tim mạch, huyết áp, chống ung thư, chất sát trùng, trị ho, cảm cúm… mà nó còn có tác dung tuyệt vời chống lại được rất nhiều

loại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như: E coli, B subtiltis, S aureus, Salmonella, Clostridium, Streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae… một số loại nấm như: Stolonifer rhizopus, Penicillium italicum và

một số loại giun, sán, kí sinh trùng

1.5.2 Tình hình trong nước

Hoạt tính kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật nói chung, từ tỏi, lá sả nói riêng ngày càng được quan tâm Nếu như trước đây tỏi và sả chỉ được dùng như một loại gia vị để làm tăng hương vị cho các món ăn và dùng trị một số bệnh trong dân gian, thì hôm nay công dụng của nó đã được nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực khác nhau

Trong y tế, nó như một loại thuốc quý từ thiên nhiên, nó có thể trị được nhiều loại bệnh như: tim mạch, huyết áp, ung thư…

Trong thực phẩm, nó cũng có tác dụng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, các loại nấm mốc, kí sinh trùng, giun, sán…cũng bị tiêu diệt đáng kể

Mặc dù biết được tầm quan trọng cũng như lợi ích mà dịch chiết từ tỏi, lá sả mang lại nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về hai loại dịch chiết trên

Dịch chiết tỏi đa số được nghiên cứu ở các trường Đại học như: Đại học Nông Lâm – thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp Hà Nội… Tuy có nghiên cứu

hoạt tính kháng khuẩn trên một số loại vi khuẩn như: E coli, B subtilis, S.aureus…

nhưng chỉ được ứng dụng để chữa bệnh thú y như: bệnh lợn con phân trắng, bệnh liệt dại của trâu bò, bệnh lợn đóng dấu, bệnh giun chỉ vit…

Dịch chiết lá sả thì hầu như rất ít được quan tâm chỉ có một vài nghiên cứu được công bố như: nghiên cứu hoạt tính của citral trong tinh dầu sả của trường đại học Đà Lạt… và cũng chưa có nghiên cứu nào được áp dụng trong thự phẩm

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm

- Tủ sấy - Máy hấp tiệt trùng

- Cân điện tử (2 số lẻ) - Máy xay sinh tố

- Cân điện tử (4 số lẻ) - Lò vi sóng…

- Cốc thủy tinh

Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật và đầu tuýp xanh đều được xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C/15ph và sấy khô

2.2.5 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển và sản sinh các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu vi sinh vật và trong quá trình sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng

trong công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật

Sử dụng các môi trường nuôi cấy sau:

c Môi trường LST ( Lauryl Sufate Broth/Lauryl Tryptose Broth ):

Môi trường LST được dùng để định lượng Coliform có trong thịt khi bảo quản

d Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth)

Môi trường TSB dùng để định lượng vi khuẩn hiếu khí có trong thịt khi bảo quản

e Môi trường BGBL (Brilliant Green Bilr Broth)

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nuôi cấy và giữ giống các loại vi khuẩn chỉ thị để ổn định nguồn giống

- Ly tâm và thu nhận dịch chiết từ tỏi, lá sả

- Tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ tỏi, lá sả bằng phương pháp “khuếch tán trên giếng thạch” trên môi trường NB (Nutrient

Broth) với các loại vi khuẩn chỉ thị như: E coli, B subtilis, S aureus

- Khảo sát khả năng bảo quản thịt heo bằng dịch chiết tỏi

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nuôi cấy và hoạt hóa giống

a Cấy giữ giống:

Sau khi có môi trường NB thạch tiến hành đổ đĩa trong điều kiện vô trùng

Khi đĩa môi trường nguội ta ria các chủng vi sinh vật chỉ thị: B Subtilis, E Coli

và S Aureus (do phòng thí nghiệm bộ môn vi sinh – trường Đại học Khoa học tự nhiên

cung cấp) lên trên đĩa, ria chủng theo đường zit zăt sau đó ủ trong tủ ấm ở 37oC trong

24 giờ Tiến hành cấy trong điều kiện vô trùng trong phòng cấy trên ngọn đèn cồn

b Hoạt hóa giống:

Khi đĩa đã mọc khuẩn lạc tiến hành hoạt hóa giống

Dùng que cấy lấy sinh khối từ đĩa môi trường cho vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB lỏng hoạt hóa 24 giờ trong tủ lắc ở 37o

C (tiến hành cấy trong điều kiện

vô trùng)

Để giống có hoạt tính mạnh ta tiến hành hoạt hóa vài lần Dùng que cấy, cấy giống đã hoạt hóa rồi vào ống nghiệm có chứa môi trường hoạt hóa khác và tiếp tục lắc qua đêm trong tủ lắc Các lần lắc sau cũng thực hiện tương tự như trên

2.4.2 Ly tâm thu nhận dịch chiết từ tỏi, lá sả

Dịch chiết tỏi

Tỉ lệ: 1:10

 Thuyết minh:

 Tỏi tươi: chọn tỏi tươi còn nguyên tép không bị dập nát, không vỡ vụn vì khi tỏi

bị dập nát thì aliin trong tinh dầu sả sẽ bị chuyển hóa thành allicin – là hợp chất lưu huỳnh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất của tinh dầu tỏi Tuy nhiên hợp chất này rất

dễ bị phân hủy (dù ở điều kiện thường) và tạo thành vinyldithiines có hoạt tính yếu hơn allicin Khi xay tỏi thành dạng bột mịn thì hoạt tính kháng khuẩn bị giảm do hàm lượng allin giảm xuống ở mức rất thấp (khoảng 1%) nên lượng allicin tao thành ít làm giảm hoạt tính kháng khuẩn

 Bóc vỏ: loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, tạo điều kiện cho việc nghiền nhỏ được dễ dàng hơn

 Nghiền nhỏ: tỏi được nghiền nhỏ tạo điều kiện cho các aliin chuyển hóa thành allicin dưới tác dụng của enzyme allicinesa Nghiền tỏi tạo điều kiện cho các hợp chất lưu huỳnh được hình thành giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Tuy nhiên, sau khi nghiền nhỏ nên sử dụng ngay trong thời gian ngắn tránh mất đi hoạt tính của dịch chiết

Hình 2.1 Tỏi tươi bóc vỏ

Hình 2.2 Tỏi tươi nghiền

 Định lượng: sau khi đã nghiền nhỏ, tỏi được cân định lượng theo tỉ lệ thích hợp với hàm lượng dung môi sử dụng Theo Toye J Ekunsanmi Department of Biology University of Wisconsin, tỏi sau khi nghiền nhỏ được phối trộn với nước cất vô trùng

 Lọc vô trùng: sau khi đã loại bỏ phần bã của tỏi, tiến hành lọc vô trùng Quá trình lọc vô trùng được tiến hành trong điều kiện vô trùng Sử dụng ống tiêm vô trùng hút dịch đã qua lọc sơ bộ bơm qua màng lọc vô trùng đường kính 0,2nm Dịch lọc qua màng lọc vô trùng được bơm vào bình tam giác đã vô trùng từ trước thu được dịch chiết tỏi

b Dịch chiết từ lá sả

Methanol (10ml)

Cồn thực phẩm (10ml)

Ly tâm

Tủa

Cồn thực phẩm Methanol Acetone Nước sôi

t: 15 phút

to: 4o v: 8000 rpm/phút

Nhiệt độ phòng

%

 Thuyết minh:

 Sả tươi: không nên chọn sả quá khô, héo vì tinh dầu trong sả có thể bị bay hơi làm cho khả năng kháng khuẩn mất đi hoạt tính Chọn phần gần gốc và lấy lên trên đến 1/2 cây sả

 Rửa sạch: sả được rửa bằng nước sạch nhằm loại bỏ tạp chất, đất, cát và một số

vi sinh vật bám trên bề mặt sả

 Sau khi rửa sạch, để sả khô ráo tự nhiên ở nhiệt độ phòng Không nên sấy sả ở nhiệt độ cao vì có thể làm cho tinh dầu trong sả bị bốc hơi Vì sả còn nguyên chưa bị băm nhỏ nên quá trình oxy hóa ít xảy ra trong quá trình đợi sả khô ráo

 Thái mỏng: cấu trúc sả có nhiều xơ nên rất dai khó xay nhuyễn như tỏi nên trước khi xay nhỏ ta tiến hành thái mỏng nhằm phá vỡ cấu trúc chất xơ giúp quá trình xay nhỏ được dễ dàng hơn

 Xay nhỏ: sả được xay nhỏ bằng máy xay tiêu, xay nhỏ sả nhằm góp phần tăng hiệu suất trích ly tinh dầu có trong sả Ngoài ra, quá trình xay nhỏ cũng góp phần cho việc định lượng được dễ dàng hơn Sau khi xay nhỏ không nên để sả quá lâu ngoài không khí để tránh hiện tượng oxy hóa các chất có trong tinh dầu

Hình 2.4 Sả thái mỏng Hình 2.3 Sả tươi nhỏ

 Định lượng: sau khi đã xay nhỏ, sả được cân định lượng theo tỉ lệ thích hợp với từng loại dung môi sử dụng Theo Isam S Hamza, Sundus H Ahmed, Hussaine Aoda - Ministry of science & Technology, sả sau khi xay nhỏ được phối trộn với các dung môi như: metahnol, acetone, cồn (thực phẩm), nước sôi với tỉ lệ 1:1

 Ngâm: sau khi định lượng, ngâm sả trong khoảng thời 15 – 30 phút cho các hợp chất trong sả được trích ly Các dung môi như: cồn (thực phẩm), methanol, acetone được ngâm trong cồn ở các nồng độ khác nhau lần lược là: 70%, 75%, 80%, 85%, 90%

để khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ở các nồng độ khác nhau Riêng nước sôi cũng ngâm với thời gian tương tự như các dung môi trên

 Ly tâm lạnh: sau khi sả được ngâm với các dung môi khác nhau ở các nồng độ khác nhau như trên, ta tiến hành ly tâm lạnh Cho hỗn hợp sả và dung môi trên vào ống appendorf (2ml) đã vô trùng tiến hành ly tâm trên máy ly tâm lạnh với công suất 13000 rpm/phút Điều kiện ly tâm: