Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhị giá đông khô phòng bệnh dịch tả vịt và viêm gan do virus ở vịt năm 2012

3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CHỦNG VIRUS MASTER SEED NHƯỢC ðỘC VIÊM 3.1.1 Kết quả kiểm tra khả năng thích ứng của chủng virus nhược ñộc 3.1.2 Kết quả xác ñịnh ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

TRẦN VIẾT TẬP

“NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN NHỊ GIÁ ðÔNG KHÔ PHÒNG BỆNH DỊCH TẢ VỊT

VÀ VIÊM GAN DO VIRUS Ở VỊT”

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN BÁ HIÊN

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu,

có sự giúp ñỡ của các ñồng nghiệp trong cơ quan và chưa từng ñược sử dụng công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào

Tôi xin cam ñoan, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trần Viết Tập

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám ựốc Xắ nghiệp thuốc thú y Trung Ương

- Tập thể cán bộ công nhân viên trong phân xưởng vacxin virus, ban kiểm nghiệm vacxin virus Ờ Xắ nghiệp thuốc thú y Trung Ương

- Viện sau ựại học Ờ Trường ựại học Nông Nghiệp Hà Nội

đã tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ựình, người thân, bạn bè, ựồng nghiệp - Những người luôn tạo ựiều kiện, ựộng viên, giúp

ựỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày Ầ tháng Ầ năm 2012

Tác giả luận văn

Trần Viết Tập

1.1.1 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả vịt trên thế giới và Việt Nam 3

1.2.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt 19

1.3.3 Tính ưu việt của sản phẩm ñông khô 34

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh học của các chủng Master seed

2.5.1 Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh học của giống virus vacxin trước

2.5.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhị giá 41

2.5.4 Phương pháp kiểm tra ñộ ẩm, ñộ chân không của vacxin ñông

3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

HAI CHỦNG VIRUS MASTER SEED NHƯỢC ðỘC VIÊM

3.1.1 Kết quả kiểm tra khả năng thích ứng của chủng virus nhược ñộc

3.1.2 Kết quả xác ñịnh chỉ số ELD50, EID50 của giống virus viêm gan

3.2 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN NHỊ GIÁ

TỪ CHỦNG VIRUS VACXIN NHƯỢC ðỘC VIÊM GAN VỊT TYPE I, VIRUS NHƯỢC ðỘC DỊCH TẢ VỊT CHỦNG C,

3.2.1 Quy trình sản xuất và kiểm tra chất lượng các lô nguyên dịch

3.2.2 Quy trình kiểm tra chất lượng các lô vacxin nhị giá 71 3.2.1 Kết quả ñược chúng tôi trình bày ở bảng 3.14 73

ðHNN HN : ðại học Nông nghiệp Hà Nội

ELD50 : Embryo Lethal Dose 50 percent

EID50 : Embryo Infective Dose 50 percent

OIE : Office International des Epizooties

3.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể trên phôi sau khi gây nhiễm

3.3 Kết quả cấy truyền virus nhược ñộc dịch tả vịt chủng C trên

3.14 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhị giá 743.15 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin nhị giá 763.16 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin nhị giá bằng phương pháp

công cường ñộc với virus viêm gan vịt cường ñộc 783.17 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin nhị giá bằng phương pháp

công cường ñộc với chủng virus dịch tả vịt cường ñộc 81

DANH MỤC HÌNH

2.1 Tóm tắt quy trình sản xuất nguyên dịch vacxin nhược ñộc dịch tả

3.2 Kích thước phôi gà ñối chứng và phôi gây nhiễm virus VGV

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Chăn nuôi gia cầm nói chung và chăn nuôi vịt nói riêng hiện nay là một trong những ngành sản xuất quan trọng, có ñóng góp ñáng kể trong nền kinh

tế của các quốc gia Trên thế giới hàng năm có khoảng 550 ñến 600 triệu vịt ñược chăn nuôi, trong ñó ở châu Á chiếm tới 80 - 86% tổng ñàn vịt ðặc biệt ở Việt Nam, ngành chăn nuôi thủy cầm ñã và ñang ñược chú trọng phát triển với hàng ngàn trang trại ñủ các quy mô và hàng trăm triệu con, thủy cầm các loại ðây là ngành phục vụ tiêu dùng có thế mạnh ở nước ta, ñem lại lợi nhuận cao cho ngành chăn nuôi Ngành cung cấp một số lượng lớn các sản phẩm thịt, trứng phục vụ cho nhu cầu thực phẩm của nhân dân, hàng năm ñàn vịt sản xuất khoảng 30.000 ñến 40.000 tấn thịt hơi; 0,8 ñến 1 tỷ quả trứng và khoảng 1000 ñến 1500 tấn lông (Trịnh Quang Khuê, 2003) [17] Theo số liệu thống kê của FAO, 2006 [31] tổng số vịt của Việt Nam là 60 triệu con, ñến năm 2010 là 84 triệu con, ñứng thứ 2 thế giới, sau Trung Quốc

Cùng với sự phát triển của ñàn vịt qua từng năm thì tình hình dịch bệnh trên ñàn vịt cũng diễn biến ngày càng phức tạp và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Trong ñó có bệnh Dịch tả vịt (DTV) và Viêm gan vịt (VGV) Biện pháp tốt nhất, an toàn và hiệu quả kinh tế nhất ñể tránh ñược hai bệnh truyền nhiễm trên là tiêm phòng bằng vacxin

Hiện tại, loại vacxin ñơn giá phòng hai bệnh trên ñã và ñang ñược sử dụng rất rộng rãi, và rất có hiệu quả Những sản phẩm này, là những mặt hàng truyền thống của các cơ sở sản xuất vacxin trong nước có giá thành hạ và hiệu quả cao

Mỗi năm xí nghiệp Thuốc Thu y TW sản xuất và cung ứng khoảng trên

40 triệu liều vacxin dịch tả vịt và viêm gan vịt Tuy nhiên, nếu sử dụng vacxin ñơn giá ñể phòng các bệnh cho vịt, thì người chăn nuôi phải chi phí rất nhiều lao ñộng, ảnh hưởng stress cho vật nuôi, dẫn tới giảm hiệu quả kinh tế Vì vậy

yêu cầu ñặt ra là cần có một vacxin nhị giá phòng ñược cả hai bệnh trên trong cùng một liều tiêm chủng

ðể có thể cung cấp một lượng lớn vacxin như vậy, cần phải có một nghiên cứu với quy mô sản xuất công nghiệp thì mới ñáp ứng ñược nhu cầu cấp thiết của thị trường, giảm giá thành cho người chăn nuôi, làm sao tạo ñược một sản phẩm vacxin ña giá nội ñịa vừa an toàn vừa có chất lượng cao Xuất phát từ tình hình thực tế trên, do yêu cầu, ñòi hỏi của thực tiễn sản xuất và ñể cung ứng sản phẩm mới ra thị trường, tạo cơ sở cho việc phòng trị bệnh thích hợp cho ñàn vịt ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhị giá ñông khô phòng bệnh Dịch

tả vịt và Viêm gan do virus ở vịt”

2 Mục ñích nghiên cứu ñề tài

- Xây dựng qui trình sản xuất vacxin nhị giá nhược ñộc ñông khô với qui mô lớn, sản xuất công nghiệp

- Xây dựng một số chỉ tiêu kỹ thuật cơ bản trong qui trình sản xuất và kiểm nghiệm vacxin nhị giá nhược ñộc ñông khô

ðề tài thành công, sẽ tạo ra ñược một sản phẩm vacxin nhị giá phòng một lúc hai bệnh cho Vịt là bệnh Dịch tả vịt và Viêm gan do virus ở vịt

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH DỊCH TẢ VỊT

1.1.1 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả vịt trên thế giới và Việt Nam

Bệnh xuất hiện lần ñầu trên thế giới vào năm 1923 ở Hà Lan Sau ñó, bệnh cũng ñã xuất hiện ở nhiều nước như Pháp, Trung Quốc, Bỉ, Ấn ðộ, Mỹ… Bệnh dịch tả vịt là một bệnh lây lan mạnh, gây tử vong ñến 60% các ñàn thủy cầm mẫn cảm ðối với các ñàn vịt ñẻ, sản lượng trứng có thể giảm

từ 25- 40%

Năm 1930, tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một trường hợp bệnh tương tự xảy ra ở một ñàn vịt 150 con Năm 1942, dịch tái phát ở ñất nước này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm bạch hầu ở cuống họng và

lỗ huyệt Lần này, Boss (1943) [23] ñã phân lập ra virus và cấy truyền 18 ñời trên vịt

Năm 1949, tại Hội nghị thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss (1943) phân lập ñược, Jansen và Kunst ñã ñề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) [44] Bệnh dịch tả vịt còn có những tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà Lan), Pets du canard (Pháp), Enteupest (ðức)

Vào tháng giêng và tháng hai năm 1973, tại Mỹ, bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần ñầu ở ñàn vịt hoang dại, thuộc vùng lân cận hồ Andes, miền nam Dakota Từ hồ Andes, dịch bệnh lan mạnh và nhanh chóng phá hủy ñàn vịt Khoảng 40% trong tổng số 100.000 vịt hoang dại, phần lớn là vịt trời ñã bị chết trong ñợt dịch này Cao ñiểm của ñợt dịch, mỗi ngày ñã làm chết hơn

1000 chim, Brand, C J [24]

Tại Việt Nam, năm 1963, bệnh ñược phát hiện ở Cao Bằng làm chết

3000 vịt (ðặng Trần Dũng - 1963), sau ñó bệnh lây lan và có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước

Vào năm 1969, bệnh ñược phát hiện trên các ñàn vịt nuôi ở Hà Nội,

từ ñó xuất hiện rộng rãi ở nhiều tỉnh thuộc ñồng bằng Bắc bộ và các tỉnh Nam bộ

Năm 1971, dịch lại phát ra ồ ạt ở các tỉnh Ninh Bình, Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc (cũ) và thành phố Hải Phòng

ðến năm 1980, dịch phát ra mạnh mẽ ở Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hóa

và ðồng bằng sông Cửu Long Từ ñó dịch lan ra tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang, Hậu Giang, ðồng Tháp

Theo thống kê của OIE (2006) [45]; Việt Nam là một trong những nước bị bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất Năm 1999, bệnh ñã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt Năm 2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết 15.680 con và năm 2004 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (xem bảng 1.1)

Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2001) [12] thì bệnh dịch tả vịt (Pestis Anatum) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây tử vong cao cho vịt, ngỗng và thiên nga do một loại Herpesvirus thuộc bộ Alpha herpesvirus gây nên Bệnh

có triệu chứng chủ yếu là sốt cao, chảy nước mắt, sưng ñầu, chân mềm yếu, bại liệt, phân xanh và có biến ñổi bệnh lý xuất huyết nội tạng

Như vậy, bệnh dịch tả vịt là một bệnh cần ñược quan tâm, nghiên cứu sâu nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi

1.1.2 Virus dịch tả vịt

1.1.2.1 Phân loại

Là loại ADN virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpes Virus chỉ có một serotyp ñược biết ñến nhưng có nhiều chủng có ñộc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên Virus không có ñặc tính gây ngưng kết hồng cầu

1.1.2.2 Hình thái, cấu trúc virus dịch tả vịt

Nhìn qua kính hiển vi ñiện tử thấy: Virus hoàn chỉnh có hình thái gần tròn, bên ngoài là một lớp vỏ bọc và có một lõi ở giữa Ở những tế bào ñược gây nhiễm virus, sau 24 giờ có thể thấy các hạt virus trong nhân và nguyên sinh chất Thể vùi trong nhân là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi Trong nhân của những tế bào có hoặc không có thể vùi xuất hiện những khoảng trống, ở ñó có những virus hoặc tập hợp virus có capxit hình cầu hoặc sáu cạnh Nucleocapxit có ñường kính 93,5 nm, sau khi ñi qua màng nhân vào nguyên sinh chất, ñường kính của hạt virus tăng lên có thể ño ñược 136 nm Khi vào không bào thì virus thành thục và có ñường kính khoảng 250 nm

Virus qua ñược lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua ñược màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc Hessdardiri (1968) ñã nhận xét, virus nhược ñộc dịch tả vịt chủng Jensen và virus cường ñộc có kích thước từ

150 – 250 nm Như vậy chúng thuộc nhóm virus có kích thước trung bình

1.1.2.3 ðặc tính nuôi cấy của virus dịch tả vịt

+ Nuôi cấy virus trên phôi trứng

Theo Jansen (1968) [42] virus dịch tả vịt sau khi ñã tiêm truyền trên phôi vịt sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi gà

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy vào phôi trứng vịt Bắc Kinh [29] ñược

ấp ở nhiệt ñộ 39,5 – 41,5oC [32], hay tế bào xơ phôi gan hoặc thận vịt[33] và trên màng niệu ñệm của phôi vịt ấp 9 – 14 ngày tuổi [34]

Theo tác giả Trần Minh Châu (1980) [5] cho rằng màng nhung niệu là

ñường tiêm truyền tốt nhất Nguyễn Như Thanh (2001) [19], có thể nuôi cấy virus trên màng niệu ñệm hoặc xoang niệu mô (alantoid) của phôi vịt ấp 12 ngày tuổi Sau 4 – 6 ngày phôi chết với các bệnh tích: xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, ñầu, gan, quả tối có ñiểm xuất huyết và hoại tử, màng nhung niệu sưng dày lên Nếu tiếp truyền 12 ñời liên tiếp trên phôi gà, virus có thể thích nghi, từ ñời truyền thứ ba phôi gà chết sau 4 – 5 ngày khi tiêm vào màng niệu ñệm và chết sau 6 – 7 ngày khi tiêm vào xoang niệu mô

Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt và phôi gà, ñộc lực của virus giảm dần ñối với vịt Từ ñó, người ta sử dụng chủng virus nhược ñộc qua phôi vịt, phôi gà ñể chế vacxin

+ Nuôi cấy virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào xơ phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến ñổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) [42] Burgess (1981) [25] ñã công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến ñổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15, tế bào WI – 38, RD Hela, Hep – 2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987) [7]

Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [19], có thể nuôi cấy virus dịch tả vịt trên môi trường tế bào xơ phôi gà và phôi vịt một lớp Virus gây hủy hoại tế bào sau 48 giờ gây nhiễm Quan sát Plague của virus dịch tả vịt, người ta nhận thấy: sau 48 giờ gây nhiễm các Plague bắt ñầu hình thành và phát triển tối ña sau 6 ngày Với các chủng virus nhược ñộc, Plaque ñều gọn và sáng rõ,

ở ngày thứ 3 có ñường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4 – 7 mm và sau 14 ngày là

10 mm Theo Dardini và Hess (1968) [20], Plague của virus dịch tả vịt cường ñộc hình tròn, to nhỏ không ñều, có ñường kính từ 1 – 8 mm Plaque của virus dịch tả vịt nhược ñộc thì ñều hơn, có bờ gọn và sáng, ñường kính là 3 – 4 mm Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1972) [11], sau 36 giờ gây nhiễm virus

cường ñộc trên tế bào xơ phôi vịt ñã xuất hiện bệnh tích tế bào: tế bào co tròn lại, thoái hóa và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những sợi bào (synciticum) như những dải ñăng ten Lớp tế bào này sẽ bị phá hủy hoàn toàn vào ngày thứ 4 Trong các bình nuôi cấy ở các nồng ñộ pha loãng, có thể phát hiện ñược Plague

Trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, sự xuất hiện của Plague cũng khác nhau Sự nhân lên và hình thành các Plague của virus cường ñộc ñẹp nhất ở môi trường tế bào xơ phôi ngan, sau ñó ñến xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt ñen và vịt ñầu ñỏ, còn Plague trên tế bào xơ phôi vịt mốc và vịt bãi là kém nhất Virus dịch tả vịt nhược ñộc của Hà Lan lại có thứ tự các môi trường thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi gà, trĩ Mông Cổ, cun cút (Trần Minh Châu, 1987) [7]

ðối với virus dịch tả vịt nhược ñộc chủng Jansen, theo nghiên cứu của

bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Bệnh lý, trường ðHNNHN nhận thấy virus rất thích ứng trên môi trường nuôi tế bào xơ phôi gà Chỉ sau 24 giờ cấy virus, tế bào ñã bắt ñầu có hiện tượng hủy hoại, bệnh tích tế bào chủ yếu thể hiện là hiện tượng tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng ñám, có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học

ðối với virus dịch tả vịt nhược ñộc chủng C, theo nghiên cứu của Trần Thị Thanh Xuân [21] thì virus dịch tả vịt chủng C thích ứng cao trên môi trường tế bào xơ phôi gà Tính thích ứng biểu hiện ở sự nhân lên của virus trong tế bào xơ phôi gà, gây bệnh tích tế bào 100% ở khoảng thời gian từ 48 –

72 giờ sau gây nhiễm

+ Nuôi cấy trên ñộng vật cảm thụ

Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi ñể nuôi cấy virus Sau 3 – 12 ngày gây nhiễm, vịt chết với triệu chứng, bệnh tích ñiển hình của bệnh dịch tả vịt Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở ñể gây bệnh

1.1.2.4 độc lực của virus dịch tả vịt

đã xác ựịnh ựược một số chủng virus dịch tả vịt có ựộc lực khác nhau:

Hà Lan có chủng O ựộc lực mạnh nhất, sau ựó ựến các chủng W59, W60, N (Jansen, 1968) [42]

Ở Việt Nam có chủng 769, 880 có ựộc lực mạnh nhất, sau ựó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987) [7]

Theo Nguyễn đức Hiền (2005) [15] ựã phân lập một chủng virus gây bệnh dịch tả vịt ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có ựộc lực cao, có khả năng gây bệnh và gây chết vịt ở phòng thắ nghiệm khi tiêm bắp với liều

103ELD50/ ml

Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc điểm (2005) [9] cũng ựã phân lập thành công chủng virus cường ựộc dịch tả vịt VG Ờ 2004 Qua bước ựầu khảo sát ựặc tắnh sinh học của chủng virus này, tác giả cho biết virus dịch tả vịt VG Ờ 2004 có ựộc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập

1.1.2.5 Sức ựề kháng

Virus nhạy cảm với ête và chloroform (Hess, 1968) [39] Với tác ựộng của trypsin, chymotrypsin và dịch tụy ở 37oC thì sau 18 giờ virus trần mất hoạt tắnh, còn papain, lysozyme, vỏ virus, DNA và RNA không bị tác dụng Cồn 75oC diệt virus trong 5 Ờ 30 phút, axit phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút Ở 22oC NaOH 2%, NH4OH 0,5% cũng giết chết virus sau 30 phút Với nhiệt ựộ: virus mất khả năng gây nhiễm ở nhiệt ựộ 56oC sau 10 phút hoặc 50oC sau 90 Ờ 120 phút Ở nhiệt ựộ phòng (22oC) virus có thể tồn tại 30 ngày (Hess, 1968) [39] Trong ựiều kiện lạnh -10oC ựến -20oC virus có thể tồn tại hàng năm Làm ựông khô các chất chứa virus như máu, tim, gan, màng nhung niệu của phôi trứng vịt có thể giữ virus nhiều năm mà không mất ựộc lực

Virus ổn ựịnh ở ựộ pH từ 5 Ờ 10 và bị bất hoạt khi pH < 3 và pH > 10

1.1.3 Bệnh dịch tả vịt

1.1.3.1 Loài mắc bệnh

Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt ñầu

ñỏ, Các loài thủy cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Friend, 1973) [33], (Docherty,1992) [29] Vịt là loài cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi ñều có thể mắc bệnh

Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết trong khoảng 5 – 100% Mức ñộ cảm nhiễm có thể khác nhau tùy theo giống vịt Loài vịt nhọn ñuôi ñược coi là ít cảm nhiễm nhất ñối với bệnh (Sandhu, 2003) [48] Các ñộng vật khác như bồ câu, công, ñộng vật có vú và con người không cảm thụ với bệnh

Theo Friend (1973) [33], trong một báo cáo về bệnh dịch tả vịt xảy ra ở

hồ Andes, miền nam Dakota vào năm 1973, ước tính có 43,000 vịt và ngỗng trong tổng số 100,000 con ñã bị chết

1.1.3.4 ðường xâm nhập và cách lây lan

Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi

Trong tự nhiên, ñường xâm nhập chủ yếu của virus dịch tả vịt là ñường tiêu hóa Những vịt mắc bệnh Dịch tả vịt sẽ thải virus qua phân, chúng sống trong những ao hồ ô nhiễm và tù ñọng Vịt mắc bệnh khi bơi lội, uống nước ở những hồ ao ô nhiễm hoặc do ăn phải thức ăn nhiễm khuẩn Virus thâm nhập vào các vịt mẫn cảm qua ñường miệng, mũi, da và hậu môn Trong ñiều kiện

tự nhiên vịt là loài cảm nhiễm nhất với virus dịch tả vịt ở tất cả các lứa tuổi và các giống vịt [30] Jansen (1964) [41] cho biết, nguồn nước và các ñộng vật thủy sinh trong ñó cũng ñóng vai trò nhất ñịnh trong việc truyền lây căn bệnh

1.1.3.5 Triệu chứng lâm sàng

Thời gian nung bệnh từ 3 – 4 ngày

Ở ñàn vịt con bệnh thường bắt ñầu bằng những dấu hiệu: nhiều con tự nhiên lờ ñờ, không thích vận ñộng, không muốn xuống nước Ở vịt lớn khi lùa

ñi ăn một số con rớt lại sau ñàn Bắt xem thấy chân liệt, thân nhiệt lên tới 43 –

44oC Ở ñàn vịt ñẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống, có khi ngừng ñẻ hẳn

Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, ñứng một chân, ñầu rúc vào cánh Trong ñàn vịt, nhiều con có tiếng kêu khản ñặc Vịt thường sưng mí mắt, niêm mạc mắt ñỏ Lúc ñầu chảy nhiều nước mắt trong làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt Sau nước mắt ñặc lại có màu vàng như mủ ñóng ñầy khóe mắt và có khi làm hai mí mắt dính lại với nhau Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè,

từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc ñầu trong, sau ñặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khóe mũi Nhiều con ñầu sưng to, sờ nắn có cảm giác mềm như quả chuối Hầu, cổ cũng có thể bị sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù

thũng Lúc mới bị bệnh vịt khát nên uống nhiều nước Sau một vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết ñầy phân

Sau khi xuất hiện triệu chứng ñược 5 – 6 ngày, con bệnh gầy rạc, từ chỉ liệt, nằm một chỗ, rũ cánh Thân nhiệt giảm dần, vịt kiệt sức mà chết

1.1.3.6 Bệnh tích

Xác chết gầy, cổ sưng tụ máu, tím bầm Tổ chức liên kết dưới da thấm nước và keo nhầy, trong, màu hồng nhạt hay hồng thẫm Da vùng cổ, ngực, bụng, ñùi bị xuất huyết lấm tấm thành những ñiểm bằng ñầu tăm trông như bị muỗi ñốt Niêm mạc hầu họng xuất huyết, ñôi chỗ có loét hoặc phủ màng giả màu vàng xám Niêm mạc thực quản viêm, xuất huyết, trên mặt có màng giả màu vàng do thượng bì niêm mạc tróc ra Dạ dày tuyến phủ nhiều dịch nhớt màu trắng xám, gạt lớp niêm dịch thấy niêm mạc xuất huyết Dạ dày cơ cũng xuất huyết nặng, bóc bỏ lớp sừng sẽ lộ ra những vệt máu màu ñỏ sẫm Niêm mạc ruột tụ máu hoặc chảy máu thành vệt màu ñỏ, trên phủ lớp dịch xuất mỏng Bệnh nặng có thể thấy một số vết loét hình tròn, hình bầu dục ở tá tràng Niêm mạc hậu môn và trực tràng thưởng xuyên xuất huyết thành những vệt màu ñỏ xen kẽ những vết loét màu vàng nâu

Ngoài ñường tiêu hóa, các cơ quan phủ tạng khác cũng bị xuất huyết Gan hơi sưng, tụ máu, có ñiểm hoại tử trắng to bằng ñầu ñinh ghim, túi mật căng to Lách cũng bị tụ máu có khi xuất huyết Bao tim viêm, xoang bao tim tích nước vàng Ngoại tâm mạc xuất huyết thành ñiểm, thành vệt Niêm mạc khí quản xuất huyết ñỏ chứa nhiều dịch nhớt lẫn bọt Phổi tụ máu, viêm Mặt trong xương ức xuất huyết Màng não viêm, xuất huyết

Ở vịt ñẻ, mạch máu buồng trứng căng phồng, có khi xuất huyết Trứng non, méo mó Xoang bụng chứa ñầy lòng ñỏ do trứng non bị vỡ

Phạm Quang Hùng (2003) cho biết ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những đặc trưng riêng: bệnh tích xảy ra với vịt bố mẹ chủ yếu ở tuyến ức, xuất huyết mơ và tổn thương bộ máy sinh sản Cịn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các Lymphoid

1.1.3.7 Chẩn đốn

Cần chẩn đốn phân biệt bệnh DTV với các bệnh tụ huyết trùng gia cầm, bệnh viêm gan do virus ở vịt, bệnh Newcastle và bệnh cúm gia cầm Ở vịt trưởng thành , bệnh tụ huyết trùng thể cấp tính qua mổ khám đơi khi cĩ bệnh tích rất giống dịch tả vịt

Bệnh viêm gan vịt do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1 – 3 tuần tuổi Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt, ít cĩ hiện tượng hoại tử

Bệnh tụ huyết trùng và phĩ thương hàn: Do Pasteurella và Salmonella gây nên ðây là những vi khuẩn thường trú trong cơ thể vịt, ngay cả trong cơ thể vịt khỏe Cho nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khĩ khăn cho cơng việc chẩn đốn bệnh Tuy nhiên, nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phĩ thương hàn đơn thuần thì khi điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu cĩ thể nhanh chĩng dập tắt dịch

- Phân lập trên trứng vịt cĩ phơi: Tiêm 0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử

lý vào xoang niệu mơ hoặc màng nhung niệu của phơi vịt ấp 11 – 12 ngày

tuổi Virus dịch tả vịt gây chết phơi sau 4 – 10 ngày với bệnh tích đặc trưng: xuất huyết lan rộng

- Phân lập trên tế bào xơ phơi vịt: Gây nhiễm bệnh phẩm vào các chai tế bào đã được nuơi cấy Quan sát bệnh tích tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm: Hình thành các đám tế bào to, trịn và trở nên hoại tử sau 2 – 4 ngày

Phương pháp PCR hay phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp tạo dịng invitro, khơng cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng sinh hĩa phụ thuộc nhiệt độ, dựa trên nguyên tắc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt để tổng hợp nên một mạch AND mới bổ sung với đoạn AND khuơn mẫu Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của AND polymerase trong quá trình tổng hợp AND mới từ mạch khuơn Tất cả những AND polymerase đều cần những đoạn mồi, là những đoạn AND ngắn cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn ðoạn mồi này sau đĩ sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của AND polymerase để hình thành một mạch mới hồn chỉnh (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) [8], (Võ Thị Thương Lan, 2002) [18]

Theo Hansen (1999) [38] phản ứng PCR rất đặc hiệu cho AND của virus dịch tả vịt Với hai đoạn mồi sẽ cĩ khả năng phát hiện 1 fg của AND từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đốn bệnh dịch tả vịt bằng nuơi cấy tế bào

SƠ đỒ CHẨN đOÁN BỆNH DỊCH TẢ VỊT

1.1.4 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt

1.1.4.1 đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu

Khả năng ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của vịt ựối với virus dịch

tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không ựặc hiệu nhằm

chống lại sự xâm nhập và nhân lên của virus Các chất ựó bao gồm:

* Interferon: Là họ protein, một chất do tế bào sinh ra, là nguồn thông

tin ngoại lai, có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus bằng cách giải thoát khống chế sự tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống

chế sự phiên dịch các thông ñiệp của virus ở Ribosome của tế bào (Nguyễn ðường và cs, 1990) [10]

Khi nghiên cứu về vai trò Interferon và hiện tượng cản nhiễm, Jansen

(1968) [42] ñã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt ñã

nhiễm virus cường ñộc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường ñộc dịch tả vịt trước 4 giờ can thiệp bằng vacxin thì trong 10 vịt sẽ cứu sống ñược 8 con, nếu trước 8 giờ thì trong 15 vịt phát bệnh chỉ có 3 vịt ñược cứu sống Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù tiêm vacxin vịt vẫn không ñược bảo hộ

Như vậy, interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus và hiện tượng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch ñể nhanh chóng dập tắt dịch

* Tế bào NK: tăng cường hoạt ñộng diệt những tế bào ñã bị nhiễm virus

do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào ñích (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tín hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào ñích (Vũ Triệu An, 1997) [1]

* Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh Từ ñó tạo ñiều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên

làm thành nốt rộp mới Tác giả ñã ñề xuất phương pháp kiểm tra bệnh tích dịch

tả vịt ẩn tính bằng cách khám nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi (Trần Minh Châu, 1987) [7]

*Miễn dịch chủ ñộng nhân tạo:

Vịt có ñược khả năng miễn dịch này nhờ ñược tiêm vacxin Hiệu lực và

ñộ dài ñáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại vacxin, ñường ñưa vacxin vào cơ thể, Trên thực tế, khả năng ñáp ứng miễn dịch của ñàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược ñộc Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn (Fenner & cs, 1974) [32]

Về ñường ñưa vacxin, Shawky S.A và Shandhu T.S (1997) [49] cho

rằng: ñường ñưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da; phương pháp nhỏ mắt, nhỏ mũi ñòi hỏi nhiều thời gian mà hầu như không gây ñược miễn dịch Tuy nhiên tại Việt Nam, nghiên cứu về hiệu lực phòng bệnh của vacxin dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong sản

xuất, Nguyễn ðức Hiền (1999) [14] cho biết với phương pháp nhỏ mắt hay

tiêm bắp hoặc phối hợp cả hai phương pháp trên ñều ñáp ứng miễn dịch không khác nhau nhiều Tuổi tiêm chủng ñầu tiên là 14 ngày tuổi thì có ảnh hưởng tốt ñến hiệu quả sử dụng vacxin

* Miễn dịch bị ñộng tự nhiên:

Kháng thể của vịt mẹ ñược truyền cho vịt con qua lòng ñỏ trứng Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng ñỏ Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối ña là tới ngày 21 Dù vịt con có ñược hưởng kháng thể từ vịt mẹ, nhưng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh dịch tả vịt Như vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ bảo vệ ñược vịt con trong những ngày ñầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một lượng virus rất ít (Fenner & cs, 1974) [32]

* Miễn dịch bị ñộng nhân tạo:

Là trường hợp can thiệp vào ñàn vịt (ñã bị mắc bệnh dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể dịch tả vịt Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều ý nghĩa trong thực tiễn

b Các loại kháng thể chống virus dịch tả vịt

ðể chống virus dịch tả vịt, có 2 loại kháng thể ñược sản sinh ra là kháng thể dịch thể và kháng thể tế bào

* Kháng thể dịch thể: là các globulin miễn dịch hoạt ñộng chủ yếu khi

virus còn trong máu Chúng phong bế sự hấp thụ virus lên bề mặt tế bào, ngăn cản sự hoà màng vỏ virus vào màng tế bào, ngăn cản virus phá vỡ màng của hốc thực bào hoặc phá màng phân tử vỏ của virus, ngăn cản sự tái sao của chúng (Vũ Triệu An, 1997) [1]

Trong miễn dịch dịch thể, hàm lượng kháng thể sinh ra nhiều hay ít phụ thuộc vào loại kháng nguyên ñược sử dụng, số loại kháng nguyên, số lần ñược kích thích và khả năng ñáp ứng miễn dịch của con vật ðối với bệnh dịch tả vịt, lượng kháng thể dịch thể ñược sinh ra trong những trường hợp vịt

bị nhiễm bệnh tự nhiên thường thấp và chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn (Trần Minh Châu, 1987) [7]

*Kháng thể tế bào: ñáp ứng miễn dịch tế bào là phương thức bảo vệ

chính của cơ thể chống lại virus thông qua những tế bào lympho ñộc Tc (hay CTL: Cytotoxic T Lymphocite) ða số các tế bào này mang dấu ấn CD8+ (Cluster of Differenciation 8+: glucoprotein bề mặt tế bào thường có trên tế bào Tc nhận biết phân tử MHC lớp I trên tế bào ñích) và hoạt ñộng theo cơ chế có hạn bởi MHC (Major Histocompatibility Complex: phức hợp mô – những phân tử có mặt trên tế bào làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên) nghĩa là chúng chỉ có tác dụng khi tế bào bị nhiễm mang cùng phân tử MHC

I Hầu hết các tế bào trong cơ thể ñều có MHC I nghĩa là có thể bị Tc tấn công

khi bị nhiễm virus Cơ chế hoạt ựộng của CTL là gây chết tế bào bị nhiễm theo chương trình (apoptosis) ựồng thời tiết cytokin như IFN (Interferon), TNF (tumoz necrosin factor: yếu tố hoại tử u) ựể ức chế virus tái sao và hoạt hoá những tế bào khác tăng biểu lộ các phân tử MHC Nhưng chắnh cơ chế này trong một số trường hợp lại gây ra sự phá huỷ tế bào rộng lớn hơn Trong nhiều trường hợp, sự phối hợp của cả hai ựáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào là nguyên nhân của trạng thái bệnh lý nặng nề Guiping Y & cs

(2007) [35], bước ựầu nghiên cứu về khả năng chết theo chương trình

(apoptosis) của tế bào lympho ở vịt ựã gây ra bởi sự tiêm truyền virus dịch tả vịt dẫn ựến sự phân huỷ tế bào lympho Sự chết theo chương trình của tế bào lympho có thể ựóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh dịch tả vịt đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch của cơ thể với virus dịch tả vịt (Dardini, A.H., and W R Hess, 1968) [27] Qua kết quả nghiên cứu của Jansen thấy rằng: một số vịt sau khi ựược tiêm vacxin có hàm lượng kháng thể dịch thể rất thấp nhưng khi ựem thử thách với virus dịch

tả vịt cường ựộc thì vẫn ựược bảo hộ Jansen cho rằng trường hợp này có vai trò ựáng kể của kháng thể tế bào và nhấn mạnh ựến tầm quan trọng của việc dùng virus cường ựộc ựể thử hiệu lực vacxin

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH VIÊM GAN VỊT

1.2.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt

Bệnh viêm gan do virus của vịt ựược phát hiện vào năm 1945 ở Mỹ , Levine và Hofstand[43] quan sát thấy một bệnh lạ xảy ra trên ựàn vịt con một tuần tuổi, vịt con chết nhanh ngay sau khi có biểu hiện triệu chứng, bệnh tắch ựặc trưng là gan sưng lốm ựốm xuất huyết

Vào mùa xuân năm 1949 Levine và Fabricant theo dõi 750.000 con vịt

ở ựảo Long ở Mỹ thấy một bệnh tương tự sảy ra trên các ựàn vịt con trắng Bắc Kinh,bệnh xuất hiện ựầu tiên ở những vịt 2-3 tuần tuổi, bệnh lây lan từ trại vịt này sang trại vịt khác, có tới 70 trại bị thiệt hại nghiêm trọng, có trại tỷ

lệ chết lên tới 95% Cuối dịch chỉ còn sót một vài trại khi bị nhiễm bệnh tỷ lệ chết thấp khoảng 15% Năm 1950 cũng là Levine và Fabricant ựã phân lập ựược virus viêm gan vịt typ I bằng cách nuôi cấy mầm bệnh trên tế bào xơ phôi gà 1 lớp

Năm 1953 người ta phát hiện bệnh ở các bang khác của nước Mỹ, năm

1965 tại Norfolk của Anh, trên những ựàn vịt con ựã ựược tiêm phòng vắc xin nhược ựộc viêm gan vịt typ I, bệnh viêm gan vịt vẫn sảy ra Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên vịt con, người ta phân lập ựược virus viêm gan vịt typ II(Asplin, 1953) Một thời gian sau, trên các ựàn vịt không thấy bệnh xuất hiện nhưng vào năm 1983, bệnh lại sảy ra trên 3 ựàn vịt ở Norfolk (Anh), tỷ lệ chết ựến 50% ở vịt 6-14 ngày tuổi, 10-25% ở vịt 3-6 tuần tuổi Bệnh sảy ra lẻ

tẻ, trong ựàn vịt chỉ có một số bị nhiễm bệnh

đến thời ựiểm này bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt typ II chỉ thấy xảy ra ở nước Anh, chưa có báo cáo nào về tình hình bệnh ở các nước khác

Năm 1969 Toth cho biết ở ựảo Long của Mỹ, bệnh viêm gan vịt vẫn sảy ra trên ựàn vịt con ựã ựược tiêm phòng bằng vắc xin nhược ựôc typ I Bệnh sảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt typ I, tỷ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30% Haider và Cs (1979) [37] ựã ựặt tên virus này là virus viêm gan vịt typ III Cho ựến nay virus viêm gan vịt typ III mới chỉ ựược công

bố ở Mỹ

Ở Việt Nam, từ năm 1978 Trần Minh Châu ựã nghi có bệnh viêm gan vịt, nhưng lúc ựó chưa phân lập ựược mầm bệnh (Trần Minh Châu, Nguyễn Thu Hồng, 1985) Năm 1979-1983, bệnh sảy ra ở nhiều ựịa phương làm chết rất nhiều vịt, ựặc biệt vụ dịch lớn sảy ra ở đông Anh, Hà Nội năm1979-1980 (Trần Minh Châu, Nguyễn Thu Hồng, 1985)[6] Theo Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984) [16] cho biết : ở Gia Lâm, Hà Nội năm

1983 bệnh viêm gan do virus của vịt ựã xảy ra làm chết hàng nghìn vịt con

Năm 1985, Trần Minh Châu và Nguyễn Thu Hồng nghiên cứu thăm dò chế tạo chủng virus nhược ñộc viêm gan vịt bằng chủng virus phân lập tại ñịa phương các tác giả cho biết qua nhiều ñời tiếp truyền phôi gà, chủng virus ñã giảm ñộc với vịt con và cho miễn dịch tốt

Theo Nguyễn Văn Cảm và cộng sự (2001)[3], từ tháng 1 ñến tháng

6 năm 2001 qua ñiều tra 12 ổ dịch tại các ñịa phương: Hưng Yên, Hà Tây,

Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang ñã cho kết luận ñó chính là bệnh viêm gan do virus của vịt với tỷ lệ nhiễm trong ñàn tới 100%, tỷ lệ chết từ 48,57% ñến 90%

Theo Nguyễn Hữu Vũ và cộng sự (2001) [20], sáu tháng ñầu năm 2001

số vịt, ngan con chết vì bệnh viêm gan do virus của vịt ở các tỉnh Hà Nam, Hà Tây, Hưng Yên, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hà Nội lên tới hàng nghìn con Tại Nam ðịnh xảy ra một ổ dịch viêm gan do virus làm 10.000 con vịt con bị bệnh, trong ñó vịt chết và sử lý là 7.000 con (Cục thú y 2002)

1.2.2 Virus học bệnh viêm gan vịt

1.2.2.1 Phân loại

Virus viêm gan vịt nằm trong họ Picornaviridae, họ này chứa hầu hết các loại virus gây hại cho ñộng vật cách ñặt tên xuất phát từ tính chất nhỏ bé của virus (Pico)

Virus viêm gan vịt có 3 type:

Type I: là một Enterovirus

Type II: là một Astrovirus

Type III: là một Picornavirus

1.2.2.2 Hình thái

Virus viêm gan vịt là một ARN virus rất nhỏ, xuyên qua màng lọc Beckefeld và Seitz Theo Reuss 1959[5], dưới kính hiển vi ñiện tử virus là những hạt tròn bề mặt sù sì, kích thước từ 20-40nm Virus thuộc loại không

có vỏ bọc nên không mẫn cảm với Ete và Chloroform, do ñó người ta thường

dùng các chất sát trùng Formol 3%, NaOH 3%, nước vôi ñể diệt virus Capxit của virus gồm 32 capsome hợp thành cấu trúc hình khối bao bọc lấy sợi ARN nằm cuộn tròn ở giữa ñây là vật liệu di truyền và gây nhiễm của virus Khi virus xâm nhập vào tế bào, virus thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào bị nhiễm chính ARN ñó lập tức tạo thành ARNm ñiều khiển sinh tổng hợp axit nucleic và protein của virus

Virus có sức ñề kháng rất lớn với ñiều kiện ngoại cảnh, có khả năng tồn tại 10 tuần trong ñàn vịt bị nhiễm, hơn 37 ngày trong phân ẩm (Asplin, 1961) Trong ñiều kiện lạnh virus tồn tại rất lâu ở 2-40C, virus tồn tại ñược 700 ngày Theo Schyusn 1957 khi làm lạnh ñến -380C thì giữ ñược từ 8 tháng trở lên Virus bị vô hoạt bởi Formalin 1% và NaOH 2% ,vì vậy người ta thường dùng

2 chất sát trùng này ñể tiêu ñộc chuồng trại

1.2.2.3 ðặc tính gây bệnh và ñộc lực của virus

Trong tự nhiên virus viêm gan vịt gây bệnh cho vịt từ 1-3 tuần tuổi cũng có trường hợp phát ra từ vịt mới nở 12 giờ hoặc vịt lớn 5-6 tuần (Krivinka, Kozushik, 1962) Ngoài ra ngan cũng mắc bệnh viêm gan vịt ñặc biệt là ngan pháp, ngỗng và một số loài chim nước như vịt trời vịt trưởng thành và một số gia cầm khác không mắc

Về tính mẫn cảm theo ñộ tuổi với vịt con ñược Kapp và cộng sự năm

1967 ñã giải thích như sau: ngay sau khi nở trong gan của vịt con có nhiều tế bào gan gọi là tế bào sáng (Light- Cell) và virus trước tiên tấn công vào tế bào gan tối (Dark- Cell) Số lượng các tế bào này ngày càng thay thế cho tế bào gan sáng thì tính mẫn cảm của virus ñối với vịt ngày càng giảm dần thời gian chuyển hóa cấu trúc gan này khoảng 4-6 tuần hoàn toàn phù hợp với giới hạn tuổi mắc bệnh viêm gan vịt còn những vịt từ 5-6 tuần tuổi hoặc lớn hơn vẫn

bị mắc bệnh nặng ñược giải thích: các tế bào gan bị tổn thất và các tế bào gan sáng lại chiếm ưu thế một lần nữa

Trong phòng thí nghiệm dùng vịt con từ 1-7 ngày tuổi làm ñộng vật thí nghiệm các ñộng vật khác như thỏ, chuột lang, chuột bạch… ñều không mẫn cảm với bệnh Ngoài ra virus còn gây nhiễm cho phôi vịt 10-14 ngày tuổi hoặc phôi gà 8-10 ngày tuổi, ở các hiệu giá khác nhau tuỳ thuộc vào ñộc lực của virus

Virus viêm gan vịt cường ñộc khi cấy truyền trên vịt con thì ñộc lực tăng lên Nhưng nếu cấy truyền nhiều ñời trên phôi gà, phôi vịt thì ñộc lực giảm ñi không còn khả năng gây bệnh trở thành giống virus nhược ñộc cụ thể

là virus Type I và Type II cấy truyền nhiều ñời qua phôi gà, virus Type III cấy truyền nhiều ñời qua phôi vịt trong thiên nhiên có một số chủng virus viêm gan vịt có ñộc lực yếu, nó có thể không gây chết phôi ở những lần cấy truyền ñầu tiên (Asplin, 1965) [22]

1.2.2.4 ðặc tính nuôi cấy

Virus cường ñộc viêm gan vịt có trong tất cả các cơ quan, mô của vịt con mắc bệnh, tập trung nhiều nhất ở gan, lách, ñại não

- Nuôi cấy trên ñộng vật cảm thụ

Virus viêm gan vịt cường ñộc phát triển tốt trên cơ thể vịt 1-7 ngày tuổi.Thỏ, chuột lang, chuột bạch, người…không mẫn cảm với virus viêm gan vịt (Reuss, 1959)[50] Người ta dùng huyễn dịch chứa virus viêm gan vịt ñem tiêm dưới da, bắp thịt, cho uống, nhỏ mắt, nhỏ mũi, sau 2-4 ngày vịt có triệu chứng ñặc trưng Mổ khám bệnh tích ñiển hình ở gan, gan sưng nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ, trên bề mặt có nhiều ñiểm xuất huyết, ñôi khi có ñiểm hoại tử vàng xen kẽ, lách sưng, có ñiểm hoại tử chấm trắng, thận bị xung huyết Quan sát bệnh tích vi thể thấy chủ yếu có biến ñổi ở gan Trong tế bào gan có nhiều ñiểm hoại tử, tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích

mỡ một số trường hợp nguyên sinh chất tế bào gan xuất hiện thể bao hàm

- Nuôi cấy trên phôi trứng

Virus viêm gan vịt thích ứng trên phôi vịt 10-14 ngày tuổi, phôi gà 8-10 ngày tuổi nhiều tác giả ñã ứng dụng phương pháp này trong quá trình phân lập virus Năm 1950 Levine và Fabricant, sau ñó Asplin, Lauchlan (1954), Rotr, Pini (1957), Reuss (1959)…ñã sử dụng phương pháp này ñể phân lập virus dùng huyễn dịch các cơ quan, ñặc biệt là gan (sử lý bằng kháng sinh) rồi ñem tiêm vào xoang niệu môi của phôi gà từ 8-10 ngày tuổi hoặc phôi vịt 10-

14 ngày tuổi, ñể tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C

Phần lớn phôi gà chết sau 5-8 ngày còn phôi vịt sau 24-72 giờ Phôi chết ñể nhiệt ñộ 40C sau 24 giờ ñem mổ và quan sát thấy bệnh tích như sau:

* Xuất huyêt nặng dưới da, ñặc biệt là ở ñầu và tứ chi

* Phôi phù toàn thân nhất là cổ và ñầu

* Gan sưng có nhiều ñiểm xuất huyết, trên bề mặt gan có những ñiểm hoại tử vàng

* Nước trứng chuyển sang màu xanh nhạt

Với những phôi có thời gian chết kéo dài thì nước trứng có màu xanh, gan tổn thương, phôi còi cọc biểu hiện rõ rệt hơn

- Nuôi cấy trên môi trường tế bào

Nhiều thí nghiệm nuôi cấy virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào tổ chức ñã xác ñịnh virus nhân lên tốt trên môi trường tổ chức xơ phôi gà, xơ phôi vịt, thận phôi, gan phôi vịt…sau khi gây nhiễm hàm lượng virus tăng lên

và sau một vài lần cấy truyền trên môi trường tế bào virus cho CPE (Cytophatogen effect) nhất ñịnh Biểu hiện của CPE là nhân bị co tròn, nguyên sinh chất ñông ñặc, không bào và nhân co lại, tế bào bị vỡ ra rồi chết, căn cứ vào ñó ta có thể ñánh giá hiệu giá virus

1.2.3 Bệnh Viêm gan Vịt

1.2.3.1 Dịch tễ bệnh viêm gan vịt

Bệnh viêm gan vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh do virus viêm gan vịt (Duck virus Hepatitis) gây ra Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt

con từ mới nở ñến 6 tuần tuổi nhưng mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi, vịt trưởng thành và các loại gia cầm khác không bị bệnh Cá biệt có trường hợp theo Rispens (Hà Lan), vịt 2 tháng tuổi cũng bị mắc bệnh Bệnh sảy ra ác liệt ở các ñàn vịt bị mắc lần ñầu tỷ lệ chết cao 95- 100% Ở những vùng dịch sảy ra thường xuyên thì tỷ lệ chết với mức ñộ thấp (Pelathot, 1981; Levine và Fabricant, 1967), trường hợp kế phát bệnh phó thương hàn (Paratyphus) do Salmonella typhimurium tỷ lệ chết thường cao và kéo dài trong nhiều ngày

Virus gây bệnh viêm gan vịt có sức ñề kháng cao với ngoại cảnh Trong ñiều kiện lạnh và khô, ñộc lực của virus tồn tại lâu Virus do vịt bị bệnh và vịt mang trùng bài xuất theo phân, dịch thẩm xuất, xâm nhập vào thức ăn, nước uống, dụng cụ,chất ñộn chuồng, không khí…rồi từ ñó căn bệnh theo ñường tiêu hoá xâm nhập vào vịt lành (Levine, 1956; Fabricant, 1959; Smits, 1957…) Theo Daugerti 1953 ñã phát hiện về khả năng nhiễm bệnh qua không khí

1.2.3.2 Cơ chế sinh bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc ñường tiêu hoá hoặc các vết thương vào máu Virus theo máu ñến các cơ quan phủ tạng, ñặc biệt là cơ quan mà virus thích ứng nhất là gan Ở giai ñoạn ñầu, do tác dụng của virus, trao ñổi chất ở gan bị rối loạn kiểm tra tổ chức học thấy glycogen trong gan

bị giảm sút nhưng ngược lại lipit tăng cao do rối loạn trao ñổi mỡ ở gan, ñặc biệt trao ñổi cholesteron bị ñình trệ Vì vậy vịt con ở thời gian sau bào thai thiếu năng lượng nên sức ñề kháng bị giảm sút Giai ñoạn sau, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản gan bị phá hoại gây xuất huyết ñặc hiệu virus sản sinh trong tế bào gan làm gan bị phá huỷ, cơ thể không giải ñộc ñược nên chết do ngộ ñộc

1.2.3.3 Triệu chứng bệnh

Thời gian nung bệnh từ 24 – 72 giờ, ở những nơi vịt ñã mắc bệnh nhiều lần thời gian nung bệnh có thể biến ñộng từ 1 – 5 ngày Quan sát lúc ñầu thấy

một số con mệt mỏi, lười vận ñộng, bỏ ăn, sã cánh, rớt sau ñàn một thời gian vịt nằm một chỗ ngoẹo ñầu về phía sau lưng, chân duỗi thẳng như bơi chèo, sau một vài phút con vật chết ở tư thế này, ñây là dấu hiệu ñặc trưng của bệnh Ngoài ra còn có trường hợp vịt chết hàng loạt không có triệu chứng trường hợp bệnh kéo dài thường kế phát Salmonella, trong thể bệnh này ngoài hiện tượng ủ rũ cao ñộ còn kèm theo triệu chứng bệnh ỉa chảy

Bệnh viêm gan vịt do virus có tỷ lệ chết biến ñộng, vịt dưới 1 tuần tuổi

tỷ lệ chết tới 95%, vịt con 1-3 tuần tuổi tỷ lệ chết khoảng 50%, còn ở vịt 4-5 tuần tuổi thì tỷ lệ chết thấp không ñáng kể

Nguyễn Văn Cảm và cs [3] mổ khám 751 cá thể chết trong các ổ dịch

tự nhiên thấy bệnh tích ở gan biểu hiện ở trong 691 con (92,01%), ở thận 141 con (20,77%), ở lách 97 con (12,91%)

Bệnh tích trong não vịt chết do viêm gan giống viêm não thanh dịch

Trong các tế bào gan cũng như các tế bào của hệ thống lưới nội mơ cĩ thể chứa các tiểu thể hạt nhân do Shehata (1958) đã phát hiện với phương pháp nhuộm giemsa, hematoxylin-eosin các thể bao hàm cĩ kích thước từ 1-3µm, hình trịn hoặc hình bầu dục

Nguyễn Khánh Ly và cộng sự khi nghiên cứu bệnh tích vi thể của 180 cá thể phát hiện thấy tất cả đều bị viêm, xuất huyết hoại tử gan ở các mức độ khác nhau Gan thối hố mỡ 84 con (46,66%), tăng sinh tế bào biểu mơ ống mật gặp nhiều bạch cầu đơn nhân ở quanh ống mật hoặc tập trung từng đám trong nhu mơ gan, hồng cầu thốt ra ngồi mạch quản lan tràn, tỷ lệ đến 100%

1.2.3.5 Các kỹ thuật chuẩn đốn

a Chuẩn đốn phân biệt

ðể chuẩn đốn phân biệt với các bệnh khác cần dựa vào các đặc điểm: dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích và kiểm tra virus

* Bệnh phĩ thương hàn vịt (Patatyphus aratum): cĩ thể chữa khỏi bằng

kháng huyết thanh hoặc kháng sinh Trái lại bệnh viêm gan vịt do virus thì khơng cĩ kết quả

* Bệnh dịch tả vịt: hiện tượng xuất huyết khơng chỉ thấy ở gan mà cịn

ở các tổ chức khác: da, bao tim màng ngực, niêm mạc dạ dày, ruột… bệnh cịn xảy ra ở mọi lứa tuổi

* Bệnh ngộ độc Aflatoxin: cĩ triệu chứng gần giống với bệnh viêm gan

vịt nhưng kiểm tra tổ chức học thấy tế bào gan bị phá huỷ rất nghiêm trọng

b Chuẩn đốn virus học

ðây là phương pháp hữu hiệu nhất, lấy bệnh phẩm là gan, lách, não nghiền thành huyễn dịch 10 -20% rồi tiêm cho phơi vịt 10 -14 ngày tuổi, phơi

gà 8-10 ngày tuổi hoặc cĩ thể dùng huyễn dịch tiêm cho vịt 1 -7 ngày tuổi, mỗi bệnh phẩm tiêm từ 6- 10 vịt, mỗi con 0,2ml tiêm dưới da hoặc nhỏ mũi

Sau thời gian nung bệnh ngắn vịt sẽ phát bệnh với triệu chứng, bệnh tích giống như bệnh trong tự nhiên Mổ khám vịt sẽ thấy cĩ điểm xuất huyết đặc trưng ở gan

c Chuẩn đốn huyết thanh học

Trong chuẩn đốn huyết thanh học cĩ nhiều phương pháp: phương pháp làm phản ứng trung hồ, phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch Nhưng trong chuẩn đốn bệnh viêm gan vịt người ta thường sử dụng phản ứng trung hồ Nguyên tắc của phản ứng trung hồ dựa trên nguyên tắc chung của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, phản ứng trung hồ cĩ thể thực hiện trên phơi gà hoặc phơi vịt hay trên vịt con

1.2.4 Miễn dịch chống bệnh viêm gan vịt

1.2.4.1 Miễn dịch bị động

Ở động vật non, hệ thống miễn dịch chưa phát triển hồn thiện, vì vậy ngay từ lúc sơ sinh, cơ thể của chúng hồn tồn khơng cĩ khả năng chống lại tác nhân gây bệnh một cách chủ động và đặc hiệu Trạng thái miễn dịch đặc hiệu cĩ thể cĩ được khi cơ thể mẹ cĩ miễn dịch và truyền kháng thể đặc hiệu cho con

Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch bị động ở vịt con nhận được từ mẹ được nhiều tác giả nghiên cứu Asplin (1958) dùng virus viêm gan vịt type I nhược độc qua phơi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thưịi điểm 2- 4 tuần trước khi lấy trứng đem ấp đã tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con Reuss (1959) đã cho biết : tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động(bị động) cho đàn vịt con [50] Rispens (1969) khuyến cáo người chăn nuơi nên tiêm cho đàn vịt giống 2 liều vacxin cách nhau ít nhất 6 tuần[51] Vịt mẹ cĩ khả năng truyền kháng thể thụ động cho vịt con trong khoảng thời gian 9 tháng sau lần tiêm vacxin thứ hai

Theo Hwang (1973) [40], dùng 2-3 lần vacxin nhược độc cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động đủ bảo hộ cho vịt con, dùng virus viêm gan vịt nhược độc qua phơi vịt tiêm cho vịt giống, sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con

Golubnichi (1984) [36]chi biết: hàm lượng kháng thể ở vịt mẹ phải ñạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ ñộng hoặc 1/32 trong phản ứng trung hoà mới có thể bảo hộ cho vịt con với bệnh

Theo OIE (2000) [44] nếu dùng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc type I:

2 -3 lần vào các thời ñiểm 12-8-4 tuần trước khi ñẻ sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con trong suốt thời kỳ ñẻ trứng Vịt giống sẽ tạo ñược miễn dịch

cơ sở bằng vacxin nhược ñộc type I, sau ñó tiêm bắp vacxin vô hoạt sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con (Woolcock, 1991)[52] Ở vịt con hàm lượng kháng thể thụ ñộng giảm dần trong 2 tuần ñầu (Tripathy, 1986)

Miễn dịch thụ ñộng ở vịt con với bện viêm gan vịt còn ñược tạo ra bằng cách dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh hoặc kháng thể từ lòng ñỏ tiêm cho vịt con Rispens (1969) [51] cho biết có thể tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con bằng cách tiêm kháng thể thụ ñộng chế từ lòng ñỏ trứng của vịt ñã ñược gây miễn dịch Quy trình này sau khi ñược cải tiến dùng virus cường ñộc viêm gan vịt type I gây miễn dịch cho gà thu trứng, chế kháng thể từ lòng

Với vacxin viêm gan vịt type II, chưa có một tài liệu nào nói về sử dụng vacxin cho ñàn vịt giống hiệu quả

1.2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng

Những vịt sống sót sau khi bị nhiễm bệnh viêm gan vịt ñều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh Asplin (1961) cho biết vịt ñược dùng vacxin có thể tạo ñược miễn dịch chủ ñộng chống lại bệnh

ðể tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn vịt, người ta sử dụng các loại

vacxin nhược ñộc và vô hoạt vacxin sau khi vào cơ thể ñược ñưa ñến các cơ quan miễn dịch như: hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc, kích thích cơ thể sinh ra kháng thể ñặc hiệu (Vũ Triệu An, 1997) [1] Trong ñó kháng thể dịch thể ñóng vai trò quan trọng theo Asplin (1961), trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có kháng thể trung hoà Davis (1987)[30] cho biết ở vịt con hai ngày tuổi kháng thể trung hoà xuất hiện 4 ngày saukhi tiêm vacxin nhược ñộc viêm gan vịt type I Malinovskaya (1982), bằng phản ứng miễn dịch với virus viêm gan vịt type I của vịt giống và vịt con 7 ngày tuổi, cho biết : trong kháng thể dịch thể, kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S (7S mẫn cảm với Cystein, 19S kháng Cystein)

Theo Gough và Spackman (1981) có thể tạo ñược miễn dịch ở vịt con sau khi dùng cho ñàn vịt giống 3 lần vacxin vô hoạt nhũ dầu

1.2.5 Vacxin và vấn ñề phòng bệnh

1.2.5.1.Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt

Trên thế giới virus viêm gan vịt type I có mặt ở khắp mọi nơi, type II

có ở Anh, type III có ở Mỹ, bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi vịt biện pháp quan trọng nhất ñể khống chế, thanh toán dịch bệnh là dùng vacxin tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn vịt Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại

là vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt

a Vacxin nhược ñộc

Virus cường ñộc dưới tác ñộng của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua ñộng vật ít cảm thụ, qua phôi, ñộc lực của virus giảm ñi, virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh Virus này ñược dùng làm vacxin Virus viêm gan vịt cường ñộc ñược làm giảm ñộc bằng phương pháp tiếp truyền nhiều lần trên phôi Asplin (1965) ñã nghiêm cứu giống virus viêm gan vịt giảm ñộc trên phôi gà ñể làm vacxin Vacxin nhược ñộc gồm có 3 loại: