Nghiên cứu đa dạng di truyền cây khoai môn - sọ bằng chỉ thị ADN

ðể ñánh giá mức ñộ ña dạng di truyền của các giống khoai môn - sọ, việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA cho ñến nay ñược coi là phương pháp rất hữu hiệu.. Li Maolin 2000 ñã tiến hành nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
   -

NGUYỄN VĂN NGHIỄM

NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI TRUYỀN CÂY KHOAI MÔN – SỌ BẰNG CHỈ THỊ ADN

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một hoạc vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Văn Nghiễm

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới KS Tống Văn Hải cùng các thầy,

cô và cán bộ trong bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ sinh học ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành

ñề tài thực tập tốt nghiệp của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này

Tác giả

Nguyễn Văn Nghiễm

2.4.1 Tình hình sản xuất cây khoai môn- sọ trên thế giới 11

2.5 Tình hình nghiên cứu bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen

khoai Môn – Sọ (Colocasia esculenta(L.) Schott) 14

2 ða dạng di truyền 18

2.6.4 Ý nghĩa việc nghiên cứu ña dạng di truyền sinh vật 18

2.7.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền 19

2.7.4 Ưu ñiểm của việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bộ

2.7.6 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái( kiểu hình) 23

2.7.8 Phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền dựa vào chỉ thị

3.2.2 Áp dụng chỉ thị SSR và RAPD ñể ñánh giá sự ña dạng của các

4.1 Nghiên cứu sự ña dạng về các ñặc ñiểm nông sinh học 37

4.1 Phân loại mẫu giống theo ñiều kiện sinh thái ( Số thứ tự cũng là

4.1.2 Phân loại nguồn gen môn sọ theo ñặc ñiểm hình thái 39 4.1.3 Phân loại mẫu giống theo hình dạng củ và thời gian sinh trưởng 44

4.2.2 Kết quả phân tích ña hình DNA bằng kỹ thuật PCR-RAPD 50 4.2.3 Kết quả phân tích ña hình DNA bằng kỹ thuật PCR-SSR 53 4.2.4 Phân tích kết quả phần PCR-RAPD bằng phần mềm Ntsyspc2.1 56

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP : Restriction Fragment Length polymorphism

SSR : Simple sequency repeat

TGST : Thời gian sinh trưởng

DANH MỤC BẢNG

4.3 ðặc ñiểm nông sinh học chính của các mẫu khoai môn - sọ 40 4.3 ðặc ñiểm nông sinh học chính của các mẫu khoai môn - sọ 41 4.4 Tỷ lệ phân loại nguồn gen môn sọ theo ñặc ñiểm hình thái 42

4.6 Tỷ lệ phân loại mẫu giống theo hình dạng củ và TG sinh trưởng 47

PHẦN I MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây khoai môn - sọ (Colocasia esculenta), thuộc họ Ráy (Araceae), có

chất lượng củ ngon, cung cấp nhiều vitamin và dinh dưỡng Khoai môn - sọ

có ưu ñiểm vừa là cây lương thực, cây thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, làm thuốc chữa bệnh, vừa có tiềm năng chế biến cao Việt Nam có nguồn gen cây

họ Ráy rất ña dạng và là quê hương của một số loài cây môn - sọ quan trọng (TANSAO project report, 2002) Trong thời gian vừa qua chúng tôi ñã thu thập ñược 60 mẫu giống khoai môn - sọ ở các ñịa phương khác nhau Tuy nhiên ở các ñịa phương này, tên gọi của các giống khoai môn - sọ không thống nhất Việc phân biệt các giống khoai môn - sọ chủ yếu dựa vào hình thái, ñiều này gặp không ít khó khăn trong việc chọn giống cũng như bảo tồn nguồn gen cây khoai môn - sọ Chính vì vậy, việc mô tả và ñánh giá ña dạng

di truyền nguồn gen cây khoai môn - sọ sẽ cung cấp một số thông tin cần thiết

về sự biến dị di truyền có ở các vật liệu nghiên cứu Những thông tin này sẽ ñược sử dụng hữu ích trong công tác chọn tạo giống cũng như bảo tồn cây khoai môn - sọ ðể ñánh giá mức ñộ ña dạng di truyền của các giống khoai môn - sọ, việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA cho ñến nay ñược coi là phương pháp rất hữu hiệu Bất kỳ ñoạn DNA nào ñược dùng ñể phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, ñều có thể ñược xem là chỉ thị phân tử DNA Hiện nay có rất nhiều chỉ thị DNA ñược sử dụng ñể nghiên của ña dạng

di truyền, tuy nhiên hai chỉ thị RAPD và SSR là hai chỉ thị ñược dùng phổ biến nhất Li Maolin (2000) ñã tiến hành nghiên cứu lựa chọn ñược bộ gồm

32 chỉ thị RAPD phù hợp cho khoai môn - sọ, các chỉ thị này ñã ñược nhiều nhà khoa học sử dụng trong nghiên cứu của mình Theo Emma S Mace và Ian D Godwin,(2002) sử dụng 43 cặp mồi SSR nghiên cứu ña dạng di truyền

ở cây khoai môn – sọ và chọn ñược 41 cặp mồi cho cho những vệt băng mong

ựợi, trung bình 3,2 băng/locus và 39% vệt băng ựa hình ở Việt Nam những nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử ựể ựánh giá ựa dạng di truyền các giống khoai môn - sọ còn chưa nhiều, mới chỉ có một dự án hợp tác với CIRAP của Trung tâm Tài nguyên thực vật để nghiên cứu ựa dạng tập ựoàn khoai môn -

sọ Việt Nam, phục vụ ựắc lực cho công tác chọn tạo giống cũng như bảo tồn

nguồn gen cây khoai môn-sọ, chúng tôi tiến hành ựề tài "Nghiên cứu ựa dạng

di truyền cây khoai môn - sọ bằng chỉ thị phân tử DNAỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

Muc ựắch

đánh giá ựược sự ựa dạng di truyền giữa các dòng giống khoai môn- sọ bằng chỉ thị phân tử SSR, RAPD kết hợp phân tắch một số ựặc ựiểm nông sinh học của 60 mẫu giống khoai môm- sọ thu thập

PHẦN II TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu về cây khoai môn sọ

100 năm trước công nguyên khoai môn sọ ñã ñược trồng ở Trung Quốc, Ai Cập Trong thời tiền sử, sự trồng trọt ñược mở rộng tới các quần ñảo Thái Bình Dương, sau ñó ñược ñưa ñến vùng ðịa Trung Hải rồi tới Tây Phi Từ Tây Phi, cây này ñược mở rộng tới Tây Ấn và tới các vùng nhiệt ñới Châu

Mỹ Ngày nay, khoai môn sọ ñược trồng phổ biến ở khắp các vùng nhiệt ñới cũng như ôn ñới ấm áp [2]

2.1.2 Phân loại

Khoai môn sọ thuộc chi Colocasia là một trong những chi quan trọng nhất trong họ ráy (Araceae) Do có lịch sử dài lâu nhân giống vô tính nên hiện

nay vấn ñề phân loại thực vật còn có nhiều ñiểm chưa rõ ràng Các giống

khoai môn sọ ñược phân loại như loài Colocasia esculenta, một loài ña hình

[2] Các loài trong chi này ñược sử dụng làm nguồn lương thực, thực phẩm

cho người và thức ăn cho gia súc Chi Colocasia ñược xác ñịnh bởi Schott

năm 1832 trên cơ sở hai loài ñã ñược Linnacus mô tả lần ñầu tiên vào năm

1753 là Arum colocasia và Arum esculentum Schott cũng ñã ñặt lại tên hai loài này là Colocasia esculenta và Colocasia antiquorum Hiện nay trong

nghiên cứu phân loại chi Colocasia vẫn còn nhiều tranh cãi chưa ngã ngũ Một số nhà phân loại thực vật học cho rằng chi Colocasia có loài ña hình với hai loài phụ là C esculenta var esculenta và C colocasia esculenta var antiquorum Một số khác lại cho rằng chi Colocasia có một loài ña hình là C antiquorum và ở mức ñộ dưới loài là C antiquarum var typica, C antiquorrum var antiquorum, C antiquorum var esculenta…Tuy nhiên có trường phái lại cho rằng, chắc chắn có hai loài là C esculenta và C antiquorum ñược phân biệt dựa vào hình thái hoa Theo quan ñiểm này thì loài Colocasia esculenta có phần

phụ vô tính ở ñỉnh bông mo thò ra khỏi mo hoa, ngắn hơn cụm hoa ñực Còn loài

Colocasia antiquorum có phần phụ vô tính ở ñỉnh bông mo không thò ra khỏi

mo hoa, dài hơn cụm hoa ñực Hiện nay có hàng nghìn giống khoai môn sọ ñang ñược trồng trên toàn thế giới Các giống ñược phân biệt chủ yếu nhờ vào các ñặc ñiểm của củ cái, củ con hoặc các ñặc ñiểm của chồi trên cơ sở các ñặc ñiểm nông học hoặc chất lượng ăn nấu

2.1.3 Phân bố

Nguồn gen môn sọ phân bố trong ñiều kiện tự nhiên rất ña dạng: ñược tìm thấy ở ñộ cao từ 1m ñến 1500m so với mực nước biển, có giống sống trong ñiều kiện bão hoà nước, trong ñiều kiện ẩm hoặc trong ñiều kiện khô hạn [15] Có giống sinh trưởng nơi dãi nắng nhưng cũng có giống mọc trong rừng sâu cớm nắng… Sự tồn tại và phát triển của chúng chủ yếu do nhu cầu tất yếu của sinh tồn và giá trị kinh tế mà chúng mang lại cho người dân bản ñịa Việc trồng và lưu giữ các giống môn sọ ñịa phương ở cấp hộ gia ñình chịu ảnh hưởng của các nhân tố kinh tế xã hội như: tình trạng kinh tế, tình trạng văn hoá, phong tục tập quán… Những vùng có sự phân bố lớn của khoai môn sọ là: Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Quảng Ninh và Quảng Trị

Kết quả ñiều tra của Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật, Viện KHNN Việt Nam cho thấy tuy diện tích trồng môn sọ có xu hướng giảm trong những năm gần ñây nhưng vẫn còn nhiều giống ñịa phương ñược người

nông dân trồng phổ biến cả trong vườn nhà cũng như ngoài ruộng, trên nương, ở mọi vùng sinh thái từ ựồng bằng tới cao nguyên [2]

Cụ thể, tại đà Bắc tỉnh Hoà Bình, giống khoai môn ruột vàng Hậu Doàng ựược trồng với diện tắch lớn, bởi vì giống này thắch nghi tốt với ựiều kiện ựất ựai trong vùng và có chất lượng ngon ựáp ứng ựược nhu cầu của thị trường Một số giống môn sọ như khoai Lúi dọc xanh, khoai sọ dọc tắm có chất lượng tốt, kắch thước vừa phải ựược thị trường rất ưa chuộng, ựang ựược trồng hàng hoá với diện tắch lớn, tập trung ở huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình Tại thôn đồng Lạc, Nghĩa Hưng, Nam định có hai giống khoai Tắa Riềng và môn nước cũng ựược hầu hết các nông hộ trồng với mục ựắch sử dụng thân,

lá, củ làm thức ăn chăn nuôi Ở Trà Cú tỉnh Trà Vinh, khoai môn là cây trồng phụ nhưng nó là nguồn thu quan trọng ựóng góp vào thu nhập của nông hộ, ựứng hàng thứ hai sau cây lúa Tại huyện Phú Vang tỉnh Thừa Thiên Huế, khoai môn sọ thắch nghi tốt với ựất cát và có vai trò quan trọng trong chăn nuôi lợn, tăng thu nhập và là giảm sự thiếu lương thực Trồng môn sọ là một phần trong hệ thống canh tác trong nông hộ của vùng này, do ựó ựa dạng khoai môn sọ ựược duy trì cho nhiều nhu cầu khác nhau của nông hộ Tại Lạng Sơn khoai môn sọ ựược trồng khá phổ biến và là cây mang tắnh ựặc sản,

là nguồn thu nhập của nhiều hộ nông dân Khoai môn sọ ở ựây ựã tiếp cận ựược với thị trường của Hà Nội và Trung Quốc

Theo Nguyễn Thị Ngọc Huệ ( 2004), trong tương lai gần khoai môn sọ

sẽ ựược phát triển trong ựiều kiện sinh thái mà những cây trồng khác rất khó tìm ựược chỗ ựứng Trong sản xuất ắt nhất khoai môn sọ có thể phát triển ựược trên các chân ựất sau:

Ớ đất ngập và ựất hẩu cùng với cây lúa của vùng trũng

Ớ Một số giống môn sọ có thể chống chịu tốt với ựất mặn

Ớ Khoai môn sọ là loại cây có thể phát triển trong ựiều kiện bị che bóng,

vì thế nó là cây trồng lý tưởng ựể trồng xen với các cây trồng thân gỗ như dừa, cây ăn quảẦ

Ngoài ra cây môn sọ còn là loại cây mang ựặc tắnh văn hoá truyền thống, ựặc biệt là trong văn hoá ẩm thực truyền thống của người Việt Nam Nhiều kết quả nghiên cứu ựã cho thấy, nguồn gen môn sọ ựược bảo tồn khá tốt trong các vườn gia ựình và một số vùng có truyền thống sản xuất khoai môn sọ như huyện Yên Thuỷ và đà Bắc của tỉnh Hoà Bình, huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng định tỉnh Lạng Sơn và huyện Thạch An tỉnh Cao BằngẦ( Nguỹên Thị ngọc Huệ 2004)

2.2 đặc tắnh thực vật

Khoai môn - sọ là cây có khả năng thắch nghi cao với ựiều kiện ngoại cảnh và có khả năng chống chịu ựược với ựiều kiện bất thuận lợi như : khả năng chịu bóng râm, chịu mặn, ựất có ựộ ẩm cao Ầ vì vậy chúng ựược phân

rễ có chiều dài rễ phụ thuộc vào từng giống và ựất trồng Một lớp rễ trung bình có từ 25 Ờ 30 rễ

b Thân củ (củ )

Khoai môn - sọ có gốc phình to thành củ hoặc thân củ chứa tinh bột

Củ chắnh ựược coi là cấu trúc thân chắnh của cây nằm trong ựất Trên thân củ

có nhiều ñốt, mỗi ñốt có mầm phát triển thành nhánh Sau khi dọc lá lụi ñi thì trên thân củ mọc một số ñốt và thân củ dài ra Bề mặt củ ñược ñánh dấu bởi vòng tròn ñược gọi là chân dọc củ, ñó là ñiểm nối của lá cây hoặc lá già Nhiều mầm bên phân bố trên những ñốt củ, ñỉnh của củ cái chính là ñiểm sinh trưởng của cây, sự mọc lên của cây bắt ñầu từ ñỉnh của củ cái, toàn bộ phần dọc lá trên mặt ñất tạo lên thân giả của cây khoai Củ cây khoai môn - sọ rất khác nhau về kích thước và hình dạng tùy thuộc vào kiểu gen, loại củ giống

và các yếu tố sinh thái ñặc biệt là các yếu tố ảnh hưởng ñến thân củ như cấu trúc và kết cấu của ñất, sự có mặt của sỏi ñá Củ cái của những giống ñại diện trồng trên ñất cao thường tròn hơn hoặc dài hơn, còn những củ cực dài thường

là những củ trồng ở ruộng nước và ñầm lầy, ( bờ mương, hoặc bờ ao ) Tất cả

củ cái, củ con và củ nách có cấu tạo bên ngoài gần như nhau, ñều có một mầm

ở ñỉnh và nhiều mầm ở nách, vô số các lá vẩy trên thân củ

Củ cái và củ con ñều gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ áo và lõi củ ( thịt củ )

Vỏ ngoài có thể nhẵn, sần sùi Lớp vỏ áo bằng là lớp vảy thường có màu nâu

ñậm Vỏ áo và lõi củ bao gồm chủ yếu là các nhu mô ( parenchyma ) Trong

lõi củ ngoài tế bào chứa nhiều hạt tinh bột còn có chất xơ củ Lượng xơ củ rất khác nhau về kiểu gen và chịu ảnh hưởng lớn của môi trường Sắc tố trong củ biến ñộng từ trắng, vàng nhạt, vàng ñậm, da cam, hồng, ñỏ và tím ñỏ Ngoài

ra, ở một số giống thịt củ có mầu xen kẽ giữa trắng và tím ñỏ hoặc tím hoặc nhu mô trắng cùng với xơ có màu ñậm hơn ( Nguyễn Thị Ngọc Huệ và ðinh Thế Lộc)

c Lá

Lá chính là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt ñất quyết ñịnh chiều cao của cây khoai môn - sọ mỗi lá ñược cấu tạo bởi một cuống lá thẳng và một phiến lá

Phiến lá của hầu hết kiểu gen có hình khiên, gốc hình tim, có rốn ở phần giữa, là ñiểm nối giữa cuống và phiến lá Phiến lá nhẵn, chiều dài có thể

biến ñộng từ 20 cm - 70 cm và bề rộng từ 15 cm - 50 cm kích thước của lá chịu ảnh hưởng rất lớn của ñiều kiện ngoại cảnh Lá có thể có màu xanh, xanh ñốm Lá khoai cũng có thể biến ñổi khi bị bệnh, ñặc biệt là bị nhiễm vi rút Trên phiến lá có 3 phần chính: một gân chạy thẳng từ ñiểm nối dọc lá tới phiến lá tới ñỉnh phiến lá Hai vân còn lại chạy ngang về hai ñỉnh của thùy lá

Cuống lá: thường gọi là dọc lá Trong nhu mô của dọc lá có nhiều khoảng trống nên dọc lá thường xốp Dọc lá mập có bẹ ôm chặt ở phía gốc tạo nên thân giả Chiều dài của dọc lá biến ñộng phụ thuộc vào kiểu gen 25 cm -

160 cm màu của dọc lá biến ñộng từ xanh vàng tới tím ñậm, có khi sọc tím hay xanh ñậm Bẹ của dọc thường có dạng ôm có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc lá Gần lúc thu hoạch củ, dọc lá càng ngày càng ngắn lại và phiến

lá cũng nhỏ ñi

d Hoa, quả, hạt

Hoa thuộc loại ñơn tính ñồng chu, hoa ñực và hoa cái cùng mọc trên một trục Cụm hoa có dạng bông mo, mọc từ thân củ, ngắn hơn cuống lá Mỗi cây có từ một cụm hoa trở lên

Quả: mọng có ñường kính khoảng 3 cm – 5 cm và chứa nhiều hạt Mỗi hạt ngoài còn có nội nhũ

2.3 Một số yêu cầu sinh thái của cây khoai sọ

* Nhiệt ñộ

Cây khoai sọ yêu cầu nhiệt ñộ trung bình ngày trên 210C ñể sinh trưởng phát triển bình thường Cây không thể sinh trưởng phát triển tốt trong ñiều kiện sương mù bởi lẽ cây khoai sọ là cây có nguồn gốc từ vùng ñất thấp mẫn cảm với ñiều kiện nhiệt ñộ Năng suất sẽ giảm khi nơi trồng có nhiệt ñộ cao Nhiệt ñộ thấp làm cây giảm sinh trưởng và cho năng suất thấp ở miền Bắc do có mùa ñông lạnh nên khoai sọ trồng chính vụ ở ñồng bằng sông Hồng thường bị ảnh hưởng của ñiều kiện nhiệt ñộ thấp trong giai ñoạn ban ñầu phát triển bộ lá

* Nước

Do có bề mặt thoát hơi nước lớn nên cây khoai sọ có yêu cầu về ñộ

ẩm cao ñể phát triển Cây cần lượng mưa hoặc tưới khoảng 1.500 – 2.000 mm

ñể cho năng suất tối ưu Cây phát triển tốt nhất trong ñất ướt hoặc ñiều kiện ngập úng Trong ñiều kiện khô hạn cây giảm năng suất rõ rệt Củ phát triển trong ñiều kiện khô hạn thường có dạng quả tạ

* Ánh sáng

Cây khoai môn - sọ ñạt năng suất cao nhất trong ñiều kiện cường ñộ ánh sáng cao, tuy nhiên nó là loại cây chịu ñược bóng râm hơn hầu hết các cây khác ðiều này có nghĩa là nó có thể cho năng suất hợp lý thậm chí trong ñiều kiện che bóng nơi những cây trồng khác không phát triển ñược

* ðất ñai

Cây có thể thích ứng ñược nhiều loại ñất khác nhau và trồng nhiều ở loại ñất tương ñối chua, thành phần tương ñối nhẹ và nhiều bùn Năng suất cao hay thấp phụ thuộc vào giống và phân bón

*Chất dinh dưỡng

Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, cây khoai môn- sọ yêu cầu ñất tốt, ñầy ñủ NPK và các yếu tố vi lượng ñể cho năng suất cao Những nơi ñất quá cằn cỗi cần bón nhiều phân hữu cơ

Cây khoai môn- sọ phát triển tôt nhất trên ñất có ñộ pH khoảng 5,5 - 6,5 Một ñặc tính quý của cây khoai môn - sọ là giống có tính chịu mặn cao Chính vì vậy, ở Nhật Bản và Ai Cập cây khoai môn - sọ ñược sử dụng như cây trồng ñầu tiên ñế khai hoang ñất ngập mặn

2.4 Giá trị kinh tế và sử dụng

* Thành phần dinh dưỡng

Phần có giá trị kinh tế chính của khoai môn – sọ là củ cái, củ con và một số giống là dọc lá

Bảng 2.1 Thành phần các chất trong củ khoai môn – sọ

là cây làm tăng nguồn thu nhập cho nguồn thu nhập cho nông dân và nhà nước nhờ nguồn tiêu thụ trên thị trường ngày lớn trong nước và quốc tế

Ở Việt Nam, trước ñây cây khoai môn - sọ là cây có củ trồng nhiều ở hầu hết các vùng sinh thái và ñã là một ñặc sản quý của một số ñịa phương Trồng khoai môn - sọ lại hơn trồng lúa gấp nhiều lần nếu chăm sóc ñúng kỹ thuật Sản phẩm của cây khoai môn – sọ ñược sử dụng với nhiều mục ñích (

củ cái và củ con dùng ñể nấu ăn, luộc ăn; lá và dọc cũng ñược người dân ở

nhiều nơi làm rau cho người hay thức ăn cho chăn nuôi ).( Nguyễn Thị Ngọc Huệ và ðinh Thế Lộc)

2.4 Tình hình sản xuất cây khoai môn - sọ

2.4.1 Tình hình sản xuất cây khoai môn- sọ trên thế giới

Trong số liệu thống kê của tổ chức lương thực và nông nghiệp thế giới ( FAO ) tính ñến năm 2001, diện tích trồng cây khoai môn- sọ trên khắp thế giới ñạt 1,463 triệu ha, năng suất bình quân 6,13 tấn/ha và tổng sản lượng 8,974 triệu tấn

Bảng 2.2 Phân bố khoai môn – sọ trên thế giới

Châu lục Năm

Toàn thế giới

Châu Phi

Bắc – Trung

Bảng 2.3 Diện tích và năng suất của các nước

Nước có diện tích ( ha ) Nước có năng suất (

tấn/ha ) Châu lục

Số nước trồng Cao nhất Thấp nhất Cao nhất Thấp nhất

Châu Phi 19 Nigeroa

Mỹ 16,1

Antigua and Barbuda: 3,75

Franch Guian

Turkey (TNK) 5,0 Châu ðại

Papua Newgiunea 32.000

Wallis and Futunas

120

Solonon Island 20,0

American Sarria 3,3

Nguồn FAO 2001

2.4.2 Tình hình sản xuất khoai môn - sọ ở Việt Nam

Khoai môn – sọ là cây trồng quan trọng trong lịch sử nông nghiệp ở Châu Á bao gồm cả Việt Nam Ở nước ta khoai môn – sọ, ñặc biệt là khoai sọ nước ñược thuần hóa sớm, trước cả cây lúa nước cách ñây khoảng 10.000 –

15000 năm Nó ñược sử dụng trong các bữa ăn của người dân Việt Nam từ ngàn ñời nay góp phần quan trọng vào cơ cấu thành phần lương thực của sản xuất nông nghiệp

Những vùng có sự phân bố lớn của khoai môn – sọ là: Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình, Sơn La, Lai Châu, Quảng Ninh và Quảng Trị Những vùng này rất ña dạng về hệ sinh thái nông nghiệp và ña dạng về văn hóa dân tộc

Một số giống khoai môn – sọ như khoai môn – sọ dọc tím có chất lượng tốt, kích thước vừa phải ñược thị trường ưa chuộng ñang ñược trồng làm hàng hóa với diện tích lớn, tập trung ở huyện Nho Quan – tỉnh Ninh Bình; tại thôn ðồng Lạc, Nghĩa Hưng, Nam ðịnh có hai giống khoai tía Riềng và khoai nước cũng ñược hầu hết các nông hộ trồng với mục ñích sử dụng thân, lá, củ làm thức ăn chăn nuôi Ở Trà Cú, tỉnh Trà Vinh, khoai môn – sọ là cây trồng phụ nhưng nó là nguồn quan trọng ñóng góp vào thu nhập của nông hộ, ñứng hàng thứ hai sau cây lúa ( Nguyễn Ngọc ðế và Nguyễn Minh Hải, 2003 ) Tại huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế, khoai môn – sọ

là một phần cho sự phát triển hệ thống canh tác trong nông hộ của vùng này,

do ñó ña dạng khoai sọ thích nghi với ñất cát và có vai trò quan trọng trong chăn nuôi làm tănng thu nhập, giảm bớt sự thiếu lương thực Trồng khoai môn – sọ là một phần của sự phát triển hệ canh tác trong nông hộ của vùng nầy, do ñó ña dạng khoai sọ ñược duy trì cho nhiều nhu cầu khác nhau của nông hộ tại Lạng Sơn, khoai môn – sọ ñược trồng khá phổ biến và là cây mang tính ñặc sản là nguồn thu nhập của nông hộ Khoai môn – sọ ở ñây ñã tiếp cận với thị trường Hà Nội và Trung Quốc Tuy nhiên, theo Nguyễn Thế Chinh ( 2003 ) ñể thực sự cây khoai sọ Lạng Sơn có chỗ ñứng bền vững trong sản xuất nông nghiệp tại ñịa phương thì sản phẩm ñầu ra của nó phải có thị trường ổn ñịnh và ngày càng ñược mở rộng

Như vậy, có thể nói mặc dù thực tiễn tồn tại và vai trò của khoai sọ trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam là không thể phủ nhận và xã hội thừa nhận, nhưng chỗ ñứng của nó ở ñâu trong phân nhóm phát triển kinh tế là vấn

ñề khó giải thích theo cách phân loại thống kê cụ thể về diện tích và sản lượng, song kết quả ñiều tra của chương trình cây có củ quốc gia năm 1993

cho thấy hằng năm cĩ khoảng 15.000 ha khoai mơn – sọ được trồng với năng suất bình quân khoảng 8 – 13 tấn tùy giống Trong tương lai gần, khoai mơn –

sọ sẽ phát triển được trên những điều kiện sinh thái mà những cây trồng khác rất khĩ tìm thấy chỗ đứng

2.5 Tình hình nghiên cứu bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen khoai

Mơn – Sọ (Colocasia esculenta(L.) Schott)

2.5.1 Các phương pháp bảo tồn

Cơng tác bảo tồn nguồn gen khoai Mơn - Sọ trên thế giới cĩ từ lâu nhưng chỉ được quan tâm chú ý nhiều bắt đầu từ những năm 1990 tới nay Bảo quản, lưu giữ chủ yếu là bảo quản Exsitu dưới dạng tập đồn nguồn gen trên đồng ruộng, trồng trong chậu vại tại các cơ quan nghiên cứu ( Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs, 2005)

Ngồi phương pháp bảo quản và nhân giống trên đồng ruộng, các nhà khoa học cịn tiến hành sử dụng phương pháp nuơi cấy mơ để nhân giống và bảo quản nguồn gen cây khoai Mơn – Sọ ðây là biện pháp lưu giữ những nguồn gen miền núi hoặc các dạng hoang dại khĩ lưu giữ trên đồng ruộng

Hiện nay, phương pháp nuơi cấy mơ được xem như là một cơng cụ quan trọng để nhân giống sạch bệnh, bảo quản dài hạn nguồn gen và cũng là phương tiện để trao đổi giống đối với những cây nhân giống vơ tính trong đĩ

cĩ cây khoai mơn - sọ ở Solomons, người ta dùng chồi đỉnh của cây khoai làm thực liệu nuơi cấy mơ để nhân giống sạch bệnh và bảo quản dài hạn (Jackson, 1979)

Hartman (1974) (trích Nguyễn Phùng Hà, 2001) loại trừ bệnh khảm virus (DMV) bằng nuơi cấy mơ phân sinh ở đỉnh của cây trên mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được bổ sung KIN (1,0mg/l) và IAA (10mg/l); Starisky và cs, (1986) đã sử dụng mơi trường MS giảm một nửa nồng độ và được bổ sung 1g/lKNO3, 10mg/l thiamine, 50mg/l cysteine HCl, 100mg/l inositol, 100mg/l casein hydrolysate, 30g/l sucrose, 0,5% agar (Oxoid), 5mg/l

BAP và 0,5mg/l IBA Với chế ựộ chiếu sáng 12 giờ trong 1 ngày ựêm, nhiệt

ựộ ựược duy trì 280C vào ban ngày và 240C vào ban ựêm, ựã nuôi cấy rất thành công mô phân sinh của cây khoai Môn Ờ Sọ và các cây khác trong các chi khác thuộc họ ráy (Araceae) như Xanthoxoma, AlocasiaẦ (Strauss and Arditti, 1980; Krikorian, 1994) ở Hawai và Samoa, người ta dùng cả chồi

ựỉnh và chồi bên của giống khoai thuộc nhóm C esculenta var esculenta ựể

nuôi cấy và nhân giống trên môi trường nước dừa và MS ựược bổ sung Adenine hoặc BAP và 2IP

Một số tác giả ựã ựề cập ựến tận dụng khả năng ra hoa, kết hạt ựể có thể làm giàu nguồn gen và có hạt giống tiến tới bảo quản trong ngân hàng gen hạt (Hirai, 1989)

Từ năm 2001, Trung tâm TNDTTV bắt ựầu nghiên cứu bảo tồn Insitu cho nguồn gen cây có củ này Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Huệ

và cs (2002) cho thấy, nguồn gen Môn - Sọ ựược bảo tồn khá tốt trong các vườn gia ựình và tại một số vùng có truyền thống sản xuất khoai Môn - Sọ như huyện Yên Thuỷ và đà Bắc tỉnh Hoà Bình, huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng định tỉnh Lạng Sơn và huyện Thạch An tỉnh Cao BằngẦ

2.5.2 Thu thập và ựánh giá nguồn gen

Ở mức ựộ giống cây trồng, những nghiên cứu ựánh giá sự ựa dạng nguồn gen cây khoai môn - sọ còn nhiều tồn tại chưa có một sự phân loại hoàn chỉnh các giống (Ghani, 1984) Cây khoai môn -sọ là cây nhân giống

vô tắnh, tuy nhiên khả năng biến dị của các dòng vô tắnh xảy ra khá mạnh

mẽ Thêm vào ựó là sự chọn lọc trong sản xuất, khi người ta duy trì và sử dụng những giống phù hợp cho từng vùng canh tác, vì vậy có thể tồn tại hàng nghìn giống khoai Môn Ờ Sọ Hiện tượng tạp bội thể hiện rõ ở các giống khoai Môn Ờ Sọ ấn độ là một vắ dụ cho thấy khả năng biến dị kiểu gen không thể bị bỏ qua

để nhận biết các giống khoai Môn Ờ Sọ người ta có thể dựa vào các ựặc ựiểm hình thái và thời gian sinh trưởng của giống, màu sắc ruột củ cái, chỏm củ, dọc lá và phiến lá cũng ựược sử dụng ựể phân biệt các giống khoai (Plucknett, 1983; Diazuli, 1994)

Davis and Gilmartin (1985) (trắch Nguyễn Phùng Hà, 2001) nhấn mạnh ý nghĩa quan trọng của những mô tả hình thái trong lựa chọn ựặc ựiểm phân loại giống cây trồng ở mức ựộ dưới loài, ựồng thời cũng là những ựiểm ựáng chú ý ựối với nhà nghiên cứu nông học và chọn tạo giống đối với cây khoai Môn Ờ Sọ, nhiều nhà nghiên cứu ựã sử dụng những ựặc ựiểm hình thái

ựể xác ựịnh các nhóm giống và ựánh giá sự ựa dạng về mặt di truyền

Ở Hawaii, Tackson và cs (1979) (trắch Nguyễn Phùng Hà, 2001) ựã phân loại 82 giống khoai Môn Ờ Sọ thành các nhóm theo ựặc ựiểm hình thái

Vắ dụ: Nhóm Piko có ựặc ựiểm phiến lá mỏng và vết lõm của thuỳ lá cắt tới dọc lá Nhóm Mana bao gồm tất cả các giống có củ cái phân nhóm ở ựỉnh Nhóm Manini ựược phân biệt ở màu sắc củ là màu trắng và nhóm Ulaula bởi màu hồng ở phần gốc của dọc láẦ

Ở Nhật Bản, Kumazawa và cs, (1956) ựã thu thập ựược 158 giống khoai ở Nhật Bản và 42 giống khoai tại đài Loan và một vài hòn ựảo chắnh ở Trung Quốc Các giống khoai Môn Ờ Sọ ựã ựược phân loại thành 15 nhóm dựa vào các ựặc ựiểm hình thái Tuy nhiên, các giống khoai môn do Kumazawa và cs, (1956) thu thập và nghiên cứu không bảo tồn ựược giống (Takayanagi và Hirai, 1989) [20] Vào năm 1989, Takayanagi và cs, ựã thu thập lại các giống khoai Môn Ờ Sọ ựang ựược trồng tại Nhật Bản và 88 giống khoai ựã ựược phân loại thành các nhóm theo khoá phân loại của Kumazawa

và cs, (1956) Sau này Hirai và cs, (1989) phân loại các giống khoai ựã thu thập ựược dựa vào ựặc ựiểm hình thái và mẫu phân tắch ựiện di thành phần protêin củ, kết quả phân nhóm các giống ựã cho thấy phương pháp của Kumazawa và cs, (1956) ựã sử dụng là thắch hợp

Ghani (1984) ñưa ra khoá phân loại các giống khoai Môn – Sọ ñược thu thập ở Malaysia Dựa vào thời gian sinh trưởng và ñặc ñiểm hình thái, tác giả ñã phân thành bốn nhóm như sau:

Nhóm I: Có thời gian sinh trưởng 9- 11 tháng, cây cao 80- 110cm, dọc

lá to, mập, thẳng ñứng hoặc nghiêng, lá hình mũi tên Gồm hai phân nhóm: phân nhóm có stolon, không có củ con và phân nhóm không có stolon, nhiều

củ con

Nhóm II: Có thời gian sinh trưỏng 6- 8 tháng, cây cao 50- 70cm, dọc lá nhỏ, thẳng ñứng hoặc nghiêng, lá hình mũi tên hoặc hình tim Gồm hai phân nhóm: phân nhóm củ dài hình cầu, có stolon, stolon phát triển thành cây và hình thành củ và phân nhóm với củ dài hình trụ, ñơn ñộc, không có stolon Nhóm III: Có thời gian sinh trưởng 5- 6 tháng, cây cao 30- 50cm, dọc

lá bé, mảnh khảnh, không chụm, lá nhỏ và hình tim Gồm hai phân nhóm: phân nhóm củ cái không phân nhánh, ñược bao quanh bởi 6- 8 củ con có cùng kích thước và phân nhóm củ cái phân nhánh, có 6- 8 củ con kết thành khối Nhóm VI: Thời gian sinh trưởng không xác ñịnh ñược, dọc lá và lá ăn ñược, củ tiêu biến không ăn ñược

Từ bốn nhóm giống xác ñịnh ban ñầu, tác giả ñã ñưa ra một khoá phân loại các giống khoai Môn – Sọ, có 28 giống ñã ñược nhận biết chính xác Có thể nói ñây là tài liệu rất tốt giúp cho công tác phân loại các giống khoai Môn – Sọ ở Việt Nam

Ở nước ta, những tài liệu nghiên cứu về nguồn gen cây khoai Môn - Sọ còn rất ít Nguồn gen khoai Môn – Sọ ñược thu thập nghiên cứu từ những năm 60 nhưng chỉ dừng lại ở mức ñộ mô tả sơ bộ hình thái các nhóm khoai nước, khoai sọ ñịa phương (như khoai Lủi, khoai ðốm, khoai Mồng hương), chưa quan tâm ñến nhóm khoai môn Sau ñó dừng lại không thấy có tài liệu nghiên cứu tiếp Mãi tới năm 1993, Viện KHNNVN ñược sự tài trợ của Trung tâm nghiên cứu Quốc tế, Canada và có sự cố vấn kỹ thuật của Trung tâm

khoai tây Quốc tế, hợp tác với các cơ quan nghiên cứu khác ở Việt Nam ựã tiến hành thu thập, bảo quản và ựánh giá tập ựoàn quỹ gen khoai Môn Ờ Sọ nói riêng và cây có củ nói chung Hiện tại, quỹ gen khoai Môn Ờ Sọ ựược bảo quản bằng các phương pháp Exsitu, Insitu và bảo quản trong ống nghiệm ựối với những giống khoai môn miền núi Tổng số 380 mẫu giống khoai Môn Ờ

Sọ ựược thu thập trong thời gian qua ựã và ựang ựược ựánh giá có hệ thống bởi Trung tâm TNDTTV Nhiều nguồn gen quý từ tập ựoàn ựược phát hiện và

ựề xuất cho các chương trình sử dụng khác nhau

2 đa dạng di truyền

2.6.1 đa dạng sinh học ( Biology diversity )

đa dạng sinh học là toàn bộ các dạng sống trên trái ựất, là hàng triệu loài thực vật, ựộng vật và sinh vật, là những gen lưu ựộng trong các loài và là

những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên ( WWF ), ( 1989 )

2.6.2 đa dạng di truyền ( Genetic diversity )

đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức ựộ gen Gen tạo nên từ DNA là phần quyết ựịnh sự phát triển cấu trúc sinh vật cũng như ựặc ựiểm và khả năng mà sinh vật sẽ có Cấp ựộ ựa dạng này có thể tạo ra biến thể khác nhau của cùng một gen

2.6.3 Hiện tượng ựa hình ( Polymophism )

Thuật ngữ ựa hình dùng ựể chỉ tắnh biến dị bên trong của một quần thể nào ựó Theo một ựịnh nghĩa ựơn giản ựó là sự có mặt của những kiểu hình khác nhau rõ ràng bên trong một quần thể thống nhất giao phối ựược với nhau

( Phạm đình Hổ )

2.6.4.Ý nghĩa việc nghiên cứu ựa dạng di truyền sinh vật

đa dạng di truyền rất cần thiết cho sự tồn tại của loài, các quần xã tự nhiên Sự ựa dạng di truyền là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì ựược nòi giống, kháng với các loài dịch bệnh và thắch nghi ựối với những thay ựổi của

môi trường Sự ña dạng di truyền của cây trồng, vật nuôi có giá trị ñặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi ñể phục vụ cho lợi ích của con người

Sự ña dạng nguồn gen di truyền là nền tảng cho chương trình chọn tạo giống cây trồng Hiện nay mọi người ñều thấy sự tàn phá thiên nhiên như nạn ñốt phá rừng, mở rộng ồ ạt các giống mới, giống cải tiến, các cuộc cách mạng giống …ñã là mối ñe dọa xóa ñi nhiều nguồn gen quý hiếm

2.7 Các phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền

2.7.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền

2.7.2 Khái niệm

Bất kỳ ñoạn DNA nào ñược sử dụng ñể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình ( tính trạng ) giữa các cá thể dòng giống và các loài dều ñược gọi là chỉ thị DNA ñánh dấu

2.7.3 Phân loại bằng chỉ thị phân tử DN

Chỉ thị DNA ñược sử dụng ñể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình

giữa các cá thể dòng giống và các loài khác nhau Sự ña dạng dựa trên cơ sở

sự biến ñổi ở mức phân tử là công cụ ñể ñánh giá sự ña dạng di truyền giữa

các nguồn vật liệu cho lai tạo

Nhóm chỉ thị phân tử DNA dựa trên cơ sở khuyếch ñại gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR là: RAPD, AFLP, SSR, STS, … Trong những năm gần ñây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này ñã thành công trong ñánh dấu hệ gen thực vật và trong nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật

* Chỉ thị RAPD ( Random Amplified Polymorphism DNA )

RAPD là kỹ thuật nhân DNA dựa trên cơ sở PCR, bằng cách sử dụng các cặp mồi ngắn ( khoảng 10 nucleotide ) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những ñoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung

Nguyên tắc chung:

Theo nguyên lý 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp bằng ¼10 = 1/1048576, nghĩa là một ñoạn DNA khuôn có 1048576 cặp

nucleotide có một trình tự bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 ñoạn DNA ñược nhân bội Trong thực tế, số lượng ñoạn DNA ñược nhân bội nhỏ hơn nhiều vì còn phụ thuộc vào ñộ dài ñoạn ñược nhân bội và sự sắp xếp các trình

tự bắt cặp với mồi trên DNA của bộ gen

Khi hai cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở ñiều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các ñoạn bằng nhau và chiều dài các ñoạn tương ứng bằng nhau Khi có ñột biến làm xuất hiện hay mất ñi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các ñoạn DNA khác nhau giữa các cá thể Vì vậy, kỹ thuật RAPD có thể phát hiện ñột biến Chỉ thị RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội

Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng giống như nguyên tắc của phản ứng PCR thông thường Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt ñộ bắt cặp mồi thấp ñể tạo ñiều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt Nhiệt ñộ bắt cặp của phản ứng là 30OC – 36OC, chính vì yếu tố ñặc hiệu thấp nên kết quả của RAPD thường có ñộ lặp lại không cao và khó tối ưu phản ứng ðây chính

là trở ngại lớn nhất của RAPD Kết quả RAPD phụ thuộc rất nhiều vào thành phần trong phản ứng RAPD ( ñặc biệt là thành phần Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu ), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm

* Chỉ thị SSR ( Simple Sequence Repeates )

Chỉ thị SSR là những ñoạn DNA ñược lặp lại một cách có trật tự, gồm những ñơn vị lặp lại gồm từ 1 ñến 6 nucleotide Bản chất ña hình của SSR có thể ñược sinh ra do sự nhân bội của DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 ñoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai ñầu của vùng lặp lại Ưu ñiểm của chỉ thị SSR là sự ña hình thể hiện ở rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp

hệ gen và có bản chất ñồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Những chuỗi ña hình ñơn giản này ñã ñược ứng dụng trong việc lập bản ñồ ở cả hai ñối tượng ñộng vật và thực vật Ở người, SSR ñược gọi là thế hệ thứ 2 của các chỉ thị phân tử Ở thực vật, tần số và số lượng SSR ñã ñược xác ñịnh trên các cây

rừng nhiệt ñới, cây bắp cải, lúa mỳ và 34 giống cây trồng khác

* AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism):

ðược Vos và cộng sự ñề xuất năm 1995 Phương pháp này tiến hành trên cơ sở kết hợp của phương pháp RFLP và RAPD, ñầu tiên người ta dùng enzym cắt hạn chế ñể cắt ñoạn DNA, sau ñó ñính thêm ñoạn DNA adapter dựa trên trình tự cắt của enzym, thiết kế ñoạn mồi trên cơ sở ñoạn adapter có chọn lọc thêm 1 - 2 nucleotit ngẫu nhiên gắn thêm vào ñầu 3' của adapter, dùng phản ứng PCR ñể nhân các ñoạn cắt, tạo ra sự ña hình các ñoạn DNA ñược nhân bản

* ALP (Amplicon length polymorphism):

Sự ña hình chiều dài những ñoạn DNA ñược nhân bản trên cơ sở phương pháp PCR

* Lai DNA/DNA (Phương pháp RFLP ña hình các ñoạn cắt giới hạn):

Dùng các enzyme cắt giới hạn (RE: restriction enzym) cắt các trình tự gen thành các ñoạn ngắn, ñiện di sản phẩm và phát hiện bằng các mẫu dò ñặc hiệu ñể nhận dạng gen

2.7.4 Ưu ñiểm của việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bộ gen thực vật

Trong những năm gần ñây việc nghiên cứu hệ gen thực vật sử dụng các chỉ thị phân tử ñược phát triển nhanh chóng Hiện nay, trên nhiều loại cây trồng người ta ñã thiết lập ñược bản ñồ chi tiết về các chỉ thị DNA liên kết với nhiều gen quy ñịnh các tính trạng nông sinh học, khả năng chống chịu sâu bệnh và môi trường bất thuận Trên cơ sở ñó, người ta ñã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này ðây ñược coi là phương pháp chọ

lọc dựa trên chỉ thị - Marker assisted selection ( MSA ) ( Phan Hữu Tôn )

Ưu ñiểm của chỉ thị phân tử trong chọn giống:

Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất ñịnh nào ñó trong quần thể phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một ñoạn DNA ñánh dấu

có liên kết chặt với gen quy ựịnh các tắnh trạng nông sinh học

đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kỳ giai ựoạn sinh trưởng nào, không phụ thuộc vào ựiều kiện môi trường, cùng một lúc có thể ựánh giá ựược nhiều tắnh trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật

Cho phép chọn lọc trong các môi trường khác nhau, thời vụ khác nhau mà kết quả không thay ựổi Tăng ựược hiệu quả và ựộ chắnh xác của chọn lọc ựặc biệt ựối với những tắnh trạng khó biểu hiện qua kiểu hình

Giúp cho nhà chọn giống phân biệt ựược sự sai khác nhỏ giữa cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chắ khác nhau chỉ do ựột biến nhỏ hoặc cây tái tổ hợp, phân biệt giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh

Là công cụ hữu hiệu ựể khẳng ựịnh quyền tác giả ựối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm Ầ

Nghiên cứu sự ựa dạng di truyền của quần thể, xác ựịnh mối quan hệ

họ hàng giữa các cá thể trong quần thể Từ ựó lựa chọ ra các cặp bố mẹ có khả năng cho ưu thế lai cao phục vụ cho công tác chọn tạo giống

Ứng dụng trong công tác chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử, sử dụng các chỉ thị ( Marker ) liên kết với các tắnh trạng quan tâm ựể phát hiện

sự có mặt của tắnh trạng ựó trong quần thể, từ ựó chọn ựược ựúng cá thể mang kiểu gen quy ựịnh tắnh trạng mong muốn

2.7.6 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái( kiểu hình)

Các chỉ tiêu hình thái phân loại sinh vật ñược sử dụng từ rất sớm Tuy nhiên những ñặc tính hình thái ñược sử dụng như là một chỉ thị di truyền là những tính trạng loại gen quy ñịnh và sự biểu hiện của chúng không bị ảnh hưởng của nhân tố môi trường Trong trường hợp này chỉ tiêu hình thái ñược

sử dụng như một chỉ thị di truyền

ðặc ñiểm di truyền nổi bật của cây giao phấn là các cá thể trong quần thể luôn ở trạng thái dị hợp, vì thế ñem lai giữa hai quần thể ấy với nhau thì không thể ñạt ñược tỉ lệ dị hợp cao Mặt khác, các ẩn bị lấn át ngay ở trạng thái ñồng hợp sẽ phát huy tác dụng làm sức sống của cây lai không cao, các gen này cần phải ñược loại bỏ khỏi các dạng bố mẹ của các tổ hợp lai Như vậy, ñể ñạt ñược xác suất cao nhất cho khả năng tạo ra cây lai dị hợp mà lại chứa rất ít gen lặn có hại thì bố mẹ phải là các dòng ñồng hợp việc tạo ra các dòng tự phối ở cây giao phấn dùng làm bố mẹ cho các tỏ hợp lai ñã ñáp ứng ñược mục tiêu trên Các vật liệu ñược chọn ñẻ chọn dòng tự phối phải ñạt ñược yêu cầu là tạo ra ñược các dòng tự phối có phổ di truyền rộng và khác nhau càng nhiều càng tốt

ðứng về mặt di truyền bố mẹ càng xa nhau hay các cá thể xa nhau về ñịa lý ñem lai với nhau sẽ tạo ra các giống có ưu thế lai cao, có năng suất cao, tính chống chịu tốt sâu bệnh và ñiều kiện bất thuận tốt là những nguồn vật liệu quý ñể tách chọn các dòng tự phối

Tuy nhiên việc sử dụng chỉ tiêu hình thái trong phân tích da dạng di truyền cũng có những hạn chế nhất ñịnh:

- Số lượng các chỉ tiêu hình thái là có hạn

- Bị ảnh hưởng bởi tương tác gen và môi trường

- Hơn nữa các chỉ tiêu hình thái chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể ( Nguyễn Văn ðồng, 1998 )

2.7.7 Phương pháp sử dụng chỉ tiêu hĩa sinh

Chỉ thị hĩa sinh được sử dụng phổ biến nhất là chỉ thị isozym hay cịn được gọi là chỉ thị isoenzym là các dạng khác nhau của cùng một loại enzyme của một cá thể cĩ cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng giống nhau Nĩi cách khác isozym là tất cả các dạng khác nhau của một enzym mã hĩa bởi một locus di truyền ( Nguyễn Xuân Thụ và cộng sự )

ða dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu cĩ thể được đánh giá thơng qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và thường dựa trên các phả hệ, dùng các chỉ thị isozym và gần đây là chỉ thị phân tử DNA

Chỉ thị isozym: là những dạng enzym cĩ hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Cĩ hai dạng là:

● Isozym đơn gen: là các isozym chịu sự kiểm sốt của một gen và

cĩ thể phân tách bằng phương pháp điện di

● Isozym đa gen: là các isozym được mã hĩa bởi hai hay nhiều gen

và chúng cĩ thể được phân biệt bằng các đặc điểm hĩa miễn dịch hoặc bằng đặc tính enzyme

Sự đa hình isozym là một cơng cụ để xác định đa dạng di truyền giữa các dạng bố mẹ Tuy nhiên, yếu tố về số lượng chỉ thị isozym cĩ khả năng nhận biết sự đa dạng cĩ thể là một trong những hạn chế việc sử dụng chỉ thị isozym để dự đốn ưu thế lai

2.7.8 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị RAPD

Sử dụng phương pháp này sẽ cĩ vơ số đoạn DNA khác nhau trong bộ genom được nhân lên tạo nên một phổ biến rất phong phú, trên cơ sở đĩ tìm được mối liên kết hoặc liên quan trực tiếp tới những đoạn DNA được nhân lên với những tính trạng nhất định

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu hai cá thể cĩ bộ gen hồn tồn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR – RAPD

với bất kỳ mồi nào cũng cĩ băng DNA giống nhau Nếu chúng ít nhiều cĩ sự khác nhau về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho các băng khác nhau giữa các giống Sự khác nhau này thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể cần nghiêm cứu Do đĩ phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc đánh

giá tính đa dạng di truyền của các cá thể trong quần thể

2.9.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền

2.9.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngồi

Orozeo và cộng sự, 1994, đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hĩa của các giống cà phê được lai từ các lồi bố

mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai và mục đích tạo con lai cĩ đặc điểm quý để tạo giống cà phê mới

L.L.B.Lanza et al ( 1997 ) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để xác định khoảng cách di truyền và dự đốn cặp lai đơn ưu tú của dịng ngơ tự phối được tạo từ nguồn BR106 và BR105

S Lakhanpaul, K.C Velarudhan và Bhat KV đã phân tích đa dạng đi truyền cây khoai mơn – sọ bằng cách sử dụng ngẫu nhiên khuyếch đại đa hình DNA ( RAPD ) sử dụng 13 mồi ngẫu nhiên sử dụng để phân tích 32 mẫu khoai mơn – sọ thuần giống Kết quả 3 trong số 13 mồi cho kết quả đa hình 100% Phần trăm đa dạng di truyền từ 60 – 100% trong các mồi đa hình Hệ

số tương đồng từ 0,5 – 0,98

Trong khuơn khổ dự án TaroGen (Taro Genetic Resources; Conservation and Utilisation) được tài trợ bởi AusAID do Ban thư ký cộng đồng Thái Bình Dương (SPC) thực hiện từ năm 1998 với mục đích là thu thập và bảo tồn qũy gen cây khoai mơn ở các quần đảo Thái Bình Dương kết hợp chọn tạo các giống chống chịu với bệnh sương mai Kết quả của Dự án là đã thu thập được 2225 mẫu giống khoai mơn tại các quần đảo Papua New Guinea, Solomon, Vanuatu, Fiji, New Caledonia và Polynesia Tổng số 400 mẫu giống điển hình đã được đánh giá bằng chỉ thị phân tử DNA để xây dựng tập đồn hạt

nhân 200 giống của vùng ựể chọn lọc, làm sạch bệnh virus và ựưa vào bảo tồn tại Trung tâm quĩ gen vùng, SPC ở Suva(Param Sivan, 2000)

Một nghiên cứu do Tiến sĩ Lebot, V (2000) chủ trì ựã nghiên cứu biến ựộng di truyền của 2081 mẫu giống khoai môn - sọ của 7 nước ựại diện của đông Nam Á và châu đại Dương (Thailand, Malaysia, Indonesia, Vietnam, Philippines, Papua New Guinea) sử dụng 6 hệ enzym MDH (malate dehydrogenase), PGI (phosphoglucous isomerase), ICD (isocitric dehydrogenase), PGD (phosphoglucomic dehydrogenase), ME (malic enzyme) và SKDH (shikimic dehydrogenase) với dịch chiết từ nõn lá của cây môn - sọ Kết quả ựánh giá cho thấy tổng số 319 zymotypes ựã ựược phát hiện giữa các giống môn - sọ của vùng đáng kinh ngạc, là chỉ có 8 zymotypes ựã bao gồm hơn 56% tổng số mẫu giống ựã ựiện di và chỉ có 21 zymotypes ựã thể hiện hơn 70% tổng số mẫu giống, ngoài ra kết quả nghiên cứu cũng cho thấy biến ựộng di truyền giữa 8 zymotypes chắnh khá hạn chế ựiều này cho thấy cơ sở di truyền của hầu hết các giống hiện có trong một vùng ựịa lý rộng lớn nhưng lại khá hẹp Xét ở mức ựộ isozyme, biến ựộng di truyền ựáng kể giữa các giống môn - sọ ựược tìm thấy ở các nước Indonesia, Malaysia và Thailand Hai vùng đông nam Á và Châu đại Dương có 2 vốn gen rất khác nhau điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc chọn vật liệu khởi ựầu cho công tác chọn tạo giống khoai môn - sọ của vùng và toàn cầu

Tại Vân Nam, Trung Quốc, nơi ựược coi là trung tâm nguồn gốc của loài khoai môn - sọ, các nhà khoa học ựã sử dụng phân tắch Isozyme và phương pháp RAPD ựể nghiên cứu mối quan hệ giữa thực vật dân tộc học và

ựa dạng của tập ựoàn khoai môn - sọ ựiển hình của tỉnh Vân Nam ( Li Maolin (2000) ựã tiến hành nghiên cứu lựa chọn ựược bộ primers phù hợp cho khoai môn - sọ Các primers này ựã ựược các nhà nghiên cứu Viện thực vật Côn Minh sử dụng ựể xác ựịnh biến ựộng di truyền của các mẫu giống thu thập từ

7 huyện với 7 dân tộc ở Vân Nam 32 Primers DNA ựã ựược chọn ựể phân

tích RAPD với 46 giống khoai môn - sọ Kết quả chạy ñiện di cho 193 bands DNA ñể phân tích thống kê, một số dòng gen ñã ñược xác ñịnh Cây phát sinh của 46 mẫu giống ñã ñược vẽ theo phương pháp của Ward Từ cây phát sinh cho thấy 46 mẫu giống bao gồm 2 nhóm: một nhóm gồm các dạng hoang dại, nhóm kia gồm các giống trồng Kết quả phân tích RAPD cũng cho thấy rõ quan hệ di truyền của nhóm Dasheen (khoai môn 2n= 2x= 28) và nhóm Eddoe (khoai môn

- sọ, 2n= 3x = 42), nhóm eddoe phát triển từ nhóm dasheen lên Kết quả phân tích RAPD của một nhóm tác giả khác với 28 giống cho thấy chỉ có 19 primers trong tổng số 100 primer nghiên cứu cho 183 bands (161 ña hình) giữa 28 giống môn - sọ Theo cây phát sinh kết quả phân tích RAPD và Isosyme cùng cho kết quả như nhau là có 2 nhóm loài ñược phát hiện: một nhóm là Khoai môn - sọ

Colocasia esculenta với 26 mẫu giống, một nhóm loài Colocasia gigantea với 2 mẫu giống Trong nhóm C esculenta lại chia thành 2 nhóm ở khoảng cách 6.5

Với kết quả ñánh giá chỉ thị phân tử bằng RAPD của các mẫu giống khoai môn -

sọ, nhóm tác giả cho rằng ñiều kiện sinh thái, ñịa lý và hoạt ñộng nông nghiệp của con người có ảnh hưởng ñáng kể ñến ña dạng nguồn gen môn - sọ ở Vân Nam (Li Xixiang et al., 2000)

2.9.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nguyễn Văn ðồng, Viện di truyền Nông Nghiệp, ñã dùng 15 mồi RAPD ñể phân tích ña dạng di truyền 19 dòng lúa, thu ñược 97 băng ña hình

và hệ số tương ñồng từ 0,67 – 1,0

Nguyễn Thị Dung, Viện Công Nghệ Sinh Học, ñã phân tích mồi tương ñồng của 11 cây vải ở các ñộ tuổi khác nhau dựa trên cơ sở phân tích

ña dạng DNA bằng phương pháp RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên

Nguyễn Văn Khiêm và cộng sự, Viện di truyền Nông Nghiệp, ñã dùng 17 ñoạn mồi RAPD ñể ñánh giá mối quan hệ di truyền của 20 mẫu khác nhau thuộc loài Boswellia Flueck

Bùi Mạnh Cường và cộng sự, Viện nghiên cứu Ngô ñã sử dụng chỉ thị

phân tử RAPD với 60 mồi ngẫu nhiên, 29 dòng thuần ựể nghiên cứu ựa dạng

di truyền của tập ựoàn ngô lai

Khuất Hữu Trung và cộng sự, Viện di truyền Nông Nghiệp ựã sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên ựể nghiên cứu ựa dạng di truyền của tập ựoàn giống ngô lai

Ở Việt Nam, trong khuôn khổ dự án TANSAO do CIRAD chủ trì với

7 nước đông Nam Á và Thái Bình Dương tham gia (Thailand, Malaysia, Indonesia, Vietnam, Philippines, Papua New Guinea) giai ựoạn 1998 - 2000, lần ựầu tiên nghiên cứu ựa dạng di truyền của tập ựoàn môn - sọ bằng kỹ thuật ựẳng men (isosyme) ựã ựược thực hiện tại Trung tâm Tài nguyên thực vật nhằm ựánh giá ựược mức ựộ biến dị của các tắnh trạng trong tập ựoàn 201

mẫu giống, phân loại các nhóm giống dưới loài Colocasia esculenta, và ựề

xuất giống triển vọng cho các mục ựắch sử dụng khác nhau Trong nghiên cứu

ựã sử dụng kỹ thuật ựiện di trên 6 hệ enzyme: MDH (malate dehydrogenase PGI (phosphoglucous isomerase), ICD (isocitric dehydrogenase), PGD ( phosphoglucomic dehydrogenase), ME (malic enzyme) và SKDH (shikimic dehydrogenase ) với dịch chiết từ nõn lá của cây môn - sọ ựể khảo sát sự biến ựộng di truyền của tập ựoàn môn - sọ

Kết quả tập hợp nhóm trên cơ sở của biến ựộng enzyme cho thấy trong tập ựoàn 201 mẫu giống tồn tại 74 zymotypes Trong số ựó có 39 zymotypes ựặc trưng chỉ có ở Việt Nam điều này khẳng ựịnh tắnh ựa dạng di truyền của tập ựoàn khoai môn Ờ sọ ựang nghiên cứu và giả ựịnh cho rằng Việt Nam có thể là một phần của trung tâm khởi nguyên của cây khoai môn Ờ khoai sọ là có cơ sở Biểu ựồ minh họa chỉ số tương ựồng của các mẫu giống khoai môn Ờ sọ cho thấy Việt Nam có hai kiểu nhóm gen khoai môn Ờ sọ rõ rệt Một nhóm mang các kiểu gen của miền núi phắa bắc tương tự như các giống ở Vân Nam ( Trung Quốc ) Nhóm kia bao gồm các kiểu gen ựặc trưng của vùng đông Nam Á Nghiên cứu sự phân bố của các kiểu zymotypes tại các vùng sinh thái của Việt Nam cho thấy rằng các tỉnh ở miền núi phắa Bắc có sự ựa dạng di truyền cao hơn ở các vùng khác ( Nguyễn Thị Ngọc