Đề tài ảnh hưởng của vi khuẩn bacillus subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường khánh xuân thành phố buôn ma thuột

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆBỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM

ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC

XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU HOẠCH TẠI PHƯỜNG

KHÁNH XUÂN, THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trinh

Lớp: Cử nhân sinh K11

Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hóa

Đắk Lắk, ngày 09 tháng 10 năm 2014

MỤC LỤC

Contents

MỞ ĐẦU 3

1 Đặt vấn đề 3

2 Mục tiêu đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

3.1 Ý nghĩa khoa học 4

3.3 Ý nghĩa thực tiễn 4

4 Giới hạn của đề tài 4

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Khái quát về phường Khánh Xuân 5

1.1.1 Điều kiện tự nhiên 5

1.1.2 Điều kiện kinh tế xã hội 6

1.2 Phế phụ phẩm nông nghiệp 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Các phương pháp xử lý: 8

1.3 Vi sinh vật dùng trong xử lý 8

1.3.1 Các nhóm vi sinh vật 8

1.3.2 Vi sinh vật phân giải cenlulose 9

1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis 10

1.4.1 Lịch sử phát hiện 10

1.4.2 Đặc điểm phân loại, sự phân bố và đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn Bacillus subtilis 10

1.4.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo 11

1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy 11

1.4.5 Đặc điểm sinh hóa 12

1.4.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 13

1.4.6.1 Cấu tạo bào tử 13

1.4.6.2 Khả năng tạo bào tử 13

1.4.7. Hệ enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis 14

1.4.8. Bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis 15

1.5 Tình hình nghiên cứu 15

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và địa điểm tiến hành nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học xử lý nước thải 18

2.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng sử dụng oxy của vi khuẩn phân lập 18

2.3.4 Phương pháp định danh vi khuẩn tuyển chọn 19

2.3.4.1 Phương pháp xác định hình thái, tính gram 19

2.3.4.2 Phương pháp định danh sinh học phân tử 19

2.3.5 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn 20

2.3.6 Phương pháp xây dựng đường cong tuyến tính giữa nồng độ vi khuẩn và chỉ số OD 610nm 20

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn tuyển chọn 20

2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy 20 2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 21

2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 21

2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc 21 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của vi khuẩn đến gốc rau

22

2.3.8.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng

xử lý 22

2.3.8.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng xử

lý của vi khuẩn 22 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề.

Việt Nam là một nước đang phát triển với nền tảng là một nước nông nghiệp Từmột nước có hàng ngàn người chết vì nạn đói năm 1968 Đến nay, Việt Nam là một trongnhững nước có số lượng nông sản xuất khẩu đứng đầu thế giới

Đắk Lắk nói chung và phường khánh xuân nói riêng, là trung tâm sản xuất nôngnghiệp của vùng tây nguyên Từ nhiều năm nay, khu vực sản xuất rau an toàn ở tổ dânphố 12 thuộc hợp tác xã Nông nghiệp Thuận Hòa (Phường Khánh Xuân, TP Buôn MaThuột) đã trở thành nơi tin cậy của nhiều người tiêu dung, các nhà nghiên cứu khoa học

và các nhà quản lý sản xuất nông nghiệp

Tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Nông nghiệp Thuận Hòa được thành lập tháng 6năm 2008 với số hội viên ban đầu là 28 hộ nông dân có tổng diện tích đất sản xuất là 5,6

ha, đến nay, số hội viên của HTX đã tăng lên 44 hộ với tổng diện tích là 6,6 ha[1][6] Sốdiện tích đất sản xuất rau tăng lên cũng đồng nghĩa với lượng phế phụ phẩm trong sảnxuất nông nghiệp cũng tăng lên Lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạchđược người nông dân sử dụng dung dung để đun nấu và một phần rất nhỏ được dung đểsản xuất phân xanh Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các hộ dân đã chuyển sang dung các loạinguyên liệu khác như: than, gas, điện… Đặc biệt, vào mua mưa hoặc là những lúc gặpdịch bệnh, lượng phế phụ phẩm tăng lên nhiều Lượng phế phụ phẩm quá nhiều, ngườidân không kịp xử lý và khi chúng tự phân hủy sẽ gây ra mùi hôi thối rất khó chịu làm ônhiễm môi trường và tọa điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh cho hoa màu phát triển,gây ảnh hưởng đến hiệu quả của vụ canh tác tiếp theo

Để góp phần vào việc giúp đỡ người nông dân xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp sau

khi thu hoạch, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus Subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường Khánh

Xuân, Thành phố Buôn Ma Thuột”.

2 Mục tiêu đề tài.

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển

chọn trong chế phẩm sinh học xử lý nước thải của Nhật Bản và đánh giá khả năng xử lý

phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch của vi khuẩn Bacillus subtilis.

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

3.1 Ý nghĩa khoa học.

Đánh giá khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch (gốc rau và lá

rau bị hỏng) của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học xử lý môi trường của

Nhật Bản, từ đó bổ sung thêm nhóm vi khuẩn có giá trị này vào việc xử lý phế phụ phẩmrau xanh tại phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thuột

3.3 Ý nghĩa thực tiễn.

Việc nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng xử lý phế phẩm

rau xanh góp phần quan trọng trong việc giảm ô nhiễm môi trường và hạn chế các mầmbệnh phát triển tại khu sản xuất rau an toàn ở phường khánh xuân, từ đó bảo vệ môitrường và cải thiện tình hình sản xuất nông nghiệp ở đây

4 Giới hạn của đề tài.

Trong quá trình thực hiện, vì lý do kinh phí có hạn nên đề tài không thể thực hiệnlặp lại thí nghiệm nhiều lần

Địa điểm tiến hành thí nghiệm là tại khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX ThuậnHòa, tổ dân phố 12, phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thuột

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về phường Khánh Xuân

1.1.1 Điều kiện tự nhiên

- Phía Đông tiếp giáp phường Ea Tam, thành phố Buôn Ma Thuột.

- Phía Tây tiếp giáp xã Hòa Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột.

- Phía Nam giáp xã Hòa Khánh, thành phố Buôn Ma Thuột.

- Phía Bắc giáp Phường Tân Thành, thành phố Buôn Ma Thuột.

Đất đen trên sản phẩm đá Bazan

 Khí hậu, thủy văn:

Phường Khánh Xuân nằm ở vùng khí hậu cận nhiệt đới, khí hậu gió mùa, một năm

có hai mùa rõ rệt, mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10 và mùa nắng bắt đầu từtháng 11 đến tháng 4 năm sau

Các thông số về điều kiện khí hậu của phường Khánh Xuân được trung tâm dự báokhí tượng thủy văn tỉnh Đắk Lắk ( trạm Buôn Ma Thuột), ghi nhận từ năm 2004 – 2006như sau:

+ Nhiệt độ, độ ẩm: Nhiệt độ bình quân khoảng 23,6oC Độ ẩm bình quân là 84%,thấp nhất là 71% Về mùa khô không khí thường khô hạn.

+ Lượng mưa: Lượng mưa bình quân hàng năm khoảng 1.900-2.000 mm tập trungvào mùa mưa (90%) Lượng mưa phân bố không đều, ảnh hưởng đến sản xuất nhất là sảnxuất nông nghiệp và sinh hoạt của nhân dân

+ Hệ thống sông suối: có suối Ea Knia và suối Ea Tam

+ Hệ thống Hồ, Đập: có hồ Thống Nhất, hồ Đồi Thông và đập Giò Gà

1.1.2 Điều kiện kinh tế xã hội

Năm 1999 phường Khánh Xuân có khoảng 21583 người Hiện nay, dân số củaphường đã có khoảng 23.444 người với mật độ là 986 người/km2

‘ Trên địa bàn phường có 16 thôn, buôn và có 2 dân tộc anh em cùng chung sống,

đó là dân tộc Kinh và Ê Đê

Người dân chủ yếu sống bằng nghề nông (lúa, cà phê, hoa màu)

Tổng diện tích đất gieo trồng cả năm là 1.673 ha

Trong đó trồng các loại cây sau:

Bảng 1: Các loại cây trồng và sản lượng hàng năm tại phường Khánh Xuân

TT TÊN CÁC LOẠI CÂY TRỒNG SỐ LƯỢNG/

Bảng 2: Các loại vật nuôi và sản lượng hằng năm tại phường Khánh Xuân

TT TÊN CÁC LOẠI VẬT NUÔI SỐ LƯỢNG/

SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM

1.2.2 Các phương pháp xử lý:

Phế phụ phẩm trong sản xuất nông nghiệp bao gồm phế phụ phẩm sau khi thuhoạch và các phế phụ phẩm sau khi chế biến Lượng phế phụ phẩm thải ra hằng ngày là

rất nhiều Ở nhiều nơi như ở đồng bằng sông cửu long, lượng phé phụ phẩm thải ra quánhiều mà người dân không có biện pháp xử lý đã gây ra hiện tượng ô nhiễm nghiêmtrọng.

Có nhiều biện pháp để xử lý các loại phế phụ phẩm nông nghiệp tùy thuộc vào loạiphế phụ phẩm được thải ra Tuy nhiên, các biện pháp này chỉ mang tính khu vực, phụthuộc vào tập quán sản xuất của người dân

 Dùng Làm thức ăn cho gia súc: Các loại phế phụ phẩm như rơm rạ, thân cây bắp,cây mì… thường được người dân sử dụng để làm thức ăn cho các loại trâu bò

 Dùng làm nguyên liệu để đun nấu: Ở một số vùng quê nghèo, người dân vẫnthường dùng rơm rạ hay vỏ trấu để đun nấu phục vụ cho cuộc sống hằng ngày

 Dùng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ: Các loại phế phẩm như rơm rạ, vỏ

cà phê, thân cây bắp… được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ tại mộtkhu vực nhỏ

Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng lớn phế phẩm không được sử dụng, đặc biệt làphế phụ phẩm rau xanh Chúng thường được người dân đem đổ bỏ sau khi thu hoạch, khiphân hủy thì chúng tạo ra mùi hôi thối rất khó chịu và gây ô nhiễm môi trường

1.3 Vi sinh vật dùng trong xử lý.

1.3.1 Các nhóm vi sinh vật

 Các vi khuẩn hiếu khí: Chủ yếu là các vi sinh vật thuộc các chi Arzotobacter,

Achromobacter, Pseudomonas, Cellumonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium….

 Các vi khuẩn kị khí: Điển hình là các vi khuẩn có trong dạ dày của động vật nhai

lại như các vi khuẩn thuộc các chi Ruminococcus flavefeciens, R albus, R parvum,

Bacteroides succinpgenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens….

 Các xạ khuẩn hiếu khí: Là các vi khuẩn thuộc các chi Micromonospora,

Proactinomyces, Actinomyces, Streptomyces…

 Các nhóm vi nấm: Nẩm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môitrường một lượng lớn enzymes có đầy đủ các thành phần Ví dụ như Nấm mốc ( thuộc các

chi: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium…), Nấm đốm (ví dụ như các loài:

Ceratocystis sp, Cladosporium sp, Aureobasidium sp, …), Nấm mục (là các loại nấm

thuộc các chi: Chaetomium, Humocola và Phialophora).[2]

1.3.2 Vi sinh vật phân giải cenlulose

Cenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật Cenlulose là hợp chất rấtbền vững, đó là loại polysaccharide cao phân tử Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vậtsinh ra các men xúc tác cho quá trình phân giải cenlulose Chúng có ý nghĩa rất lớn trongviệc thực hiện vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việcnâng cao độ phì nhiêu của đất

Cenlulose có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện thoángkhí Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia vào quá trình phân giải

cenlulose Ví dụ như các loài vi khuẩn: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống

Clostridium, Aspergillus, Penicillium….

 Cơ chế phân giải cenlulose:[3]

Chất hữu cơ là thành phần rất quan trọng trong quá trình hình thành và làm thayđổi độ phì của đất Sự chuyển hóa các chất hữu cơ trong đất chủ yếu đi theo hai hướng là

vô cơ hóa các chất hữu cơ và mùn hóa vật chất hữu cơ

Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn.Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo ramùn

Khi mùn được tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa,

sự chuyển háo này giúp đất tích lũy NH3, quá trình tạo thành NH3 trong đất xảy ra rấtchậm chạm, điều này thì rất có lợi cho cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ NH3 chocây hấp thụ:

Chất mùn + O2 + Vi sinh vật  CO2 + H2O + NH3

1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis.

1.4.1 Lịch sử phát hiện.

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 bởi Christion Erenberg

và ông đã dặt tên cho loài vi khuẩn này là “Vibrio subtilis”

Hơn 30 năm sau, Casimir Davaine đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là

“Bacteridium”

Đến năm 1872, Ferdimand Cohn đã quan sát loài vi khuẩn này có đầu hình vuông

và đặt tên là Bacillus subtilis.

Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện được vi khuẩn Bacillussubtilis trong phân ngựa Lúc đầu chủ yếu được dùng trong phòng bệnh lỵ cho các binh sĩcủa Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949-1957, khiHenry và các cộng sự tách được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết Từ đó,

“thuốc subtilis” hay còn gọi là “subtilis therapy” ra đời và được sản xuất hàng loạt dùngtrong diều trị các chứng viêm đại tràng, viêm ruột, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa

Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, nó được sử dụng rộngrãi trong yhọc, thực phẩm, chăn nuôi.[4]

1.4.2 Đặc điểm phân loại, sự phân bố và đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Đặc điểm phân loại:

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis

 Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng phân bố

hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng nhiều cư trú trong đất, đặc biệt là cỏ khô nên cònđược gọi là trực khuẩn cỏ khô, thông thường các loại đất trồng trọt có chứa khoảng 10 –

100 triệu CFU/g Các loại đất nghèo chất dinh dưỡng như đất ở vùng sa mạc, đất hoang

thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Bào tử và tế bào của vi khuẩn cũng được tìm thấy

ở vùng cửa sông và ở biển.[4]

1.4.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương,hình que, ngắn và nhỏ, hai đầu nhỏ,

kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, các tế bào thường đứng riêng rẽ hoặc đôi khi các tếbào nối lại với nhau tạo thành chuỗi dài ngắn khác nhau Vi khuẩn có 8 – 12 lông, có khảnăng di động, sinh bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kíchthước bào tử 0,8 – 1,8 µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,không kháng a xít, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ

Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis khô, không màu hoặc màu xám trắng,

hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay

ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo từ polypeptit chủ yếu

là a xít polyglutamic Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu đượcđiều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh

bị tổn thương khi khô hạn.[4]

1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon cho quá

trình sinh tổng của bản thân, trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus

cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino axit

- Điều kiện phát triển: hiếu khí, là loài ưa nhiệt cao, nhiệt độ thích hợp là từ 36oC –

50oC, tối đa khoảng 60oC

- Nhu cầu oxy: Bacillus subtilis phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy và phát

triển tốt trong môi trường giàu oxy vì vi khuẩn thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc

- Độ pH: Bacillus subtilis phát triển mạnh ở pH = 7,0 – 7.4.

- Môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường thạch đĩaTSA: khuẩn lạc tròn, rìa rang cưa không đều, có tâm sẫmmàu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơinâu.

+ Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám rìa nhăn gợn sóng.+ Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin

+ Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt

+ Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng

nhăn, lắng cặn kết lại như vầng mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.[4]

1.4.5 Đặc điểm sinh hóa

Khi lên men, vi khuẩn Bacillus subtilis không tạo ra các loại đường: glucose,

maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose

Thử nghiệm Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase(+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).[4]

Bảng 4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis.