Khảo sát các điều kiện thích hợp để xác định nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến

Khảo sát các điều kiện thích hợp để xác định nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến

1

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA HÓA



Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ XÁC ĐỊNH NITRAT, NITRIT TRONG THỰC PHẨM

CHẾ BIẾN

Nguyễn Thị Hoa Khóa 2008 – 2012

Huế, 5/2012

1

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA HÓA



Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ XÁC ĐỊNH NITRAT, NITRIT TRONG THỰC PHẨM

CHẾ BIẾN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Ly

Huế, 5/2012

i

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Ly đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Qua đây, tôi xin cảm ơn các thầy cô trong tổ Hóa Vô Cơ – Phân Tích, các thầy cô trong khoa Hóa – trường Đại Học Khoa Học Huế, các bạn Hóa K32 đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Do thời gian làm khóa luận có hạn và lần đầu tiên tiếp xúc với công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi những sai sót Vậy kính mong quý thầy cô và các bạn bè tham khảo, đóng góp ý kiến để tôi thành công hơn nữa trong các lĩnh vực nghiên cứu sau này

Xin chân thành cảm ơn

ii

TÓM TẮT

Xã hội ngày một văn minh, đời sống con người ngày càng phát triển Do vậy, đánh giá chất lượng thực phẩm là một trong những vấn đề mà con người luôn quan tâm

Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng cao, đã ra đời nhiều phương pháp để xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm Tuy nhiên phương pháp trắc quang là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc kiểm soát chất lượng thực phẩm nói chung, thực phẩm chế biến nói riêng vì phương pháp này có thể định lượng nhanh chóng với độ chính xác cao

Vì vậy, trong bản khóa luận này chúng tôi đã nghiên cứu qui trình xác định nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm chế biến bằng phương pháp trắc quang dựa trên

cơ sở phản ứng tạo hợp chất diazo của axit sunfanilic và α-naphthylamin

Nội dung của phương pháp nghiên cứu gồm:

- Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho phản ứng tạo màu của hợp chất diazo giữa nitrit, axit sunfanilic và α-naphthylamin

- Nghiên cứu điều kiện thích hợp để khử nitrat thành nitrit

- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Áp dụng qui trình để xác định nitrat, nitrit trong một số mẫu thực phẩm chế biến trên thị trường

WHO : Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam ( Viet Nam Standards)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – Performance Liquid

Chromatography hoặc High – Pressure Liquid Chromatography)

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

SA : Acid sunfanilic ( Sulfanilic Acid)

NA : α-naphthylamin ( Alpha Naphthylamine)

Rev : Độ thu hồi (Recovery)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviatin)

UV-Vis : Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet Visible

Spectrometry)

iv

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Danh mục các từ viết tắt iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Phụ gia thực phẩm 2

1.1.1 Vai trò của phụ gia thực phẩm 3

1.1.2 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người 3

1.2 Ảnh hưởng nitrat, nitrit lên sức khỏe con người 4

1.3 Tính chất của nitrat, nitrit 5

1.3.1 Tính chất của nitrat 5

1.3.2 Tính chất của nitrit 6

1.4 Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit 7

1.4.1 Các phương pháp phân tích nitrat 7

1.4.2 Phương pháp phân tích nitrit 9

1.4.3 Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit 10

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 11

1.5.1 Kỹ thuật vô cơ hóa ướt 11

1.5.2 Kỹ thuật vô cơ hóa khô 12

1.5.3 Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp 12

1.6 Cơ sở của phương pháp trắc quang 13

1.6.1 Định luật Bouguer – Lambert – Beer 13

1.6.2 Phân tích định lượng 14

v

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.1.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp 16

2.1.2 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 17

2.1.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 19

2.1.4 Xác định độ ẩm trong mẫu thực phẩm chế biến 19

2.1.5 Xây dựng quy trình xử lý mẫu để phân tích nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm chế biến 20

2.1.6 Thử áp dụng qui trình phân tích trên các đối tượng thực tế 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu 20

2.2.2 Thiết bị và hóa chất 21

2.2.3 Chuẩn bị dung dịch thuốc thử và dung dịch chuẩn 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp 24

3.1.1 Điều kiện xác định nitrit 24

3.1.2 Điều kiện khử từ nitrat qua nitrit 28

_Toc3256528753.2 Xây dựng đường chuẩn xác định nitrat và nitrit 30

3.2.1 Đường chuẩn xác định nitrit 30

3.2.2 Đường chuẩn xác định nitrat 31

3.3 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 32

3.4 Khảo sát ảnh hưởng nitrat qua nitrit 33

3.5 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 34

3.6 Áp dụng quy trình xử lý mẫu để phân tích nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm chế biến 37

3.7 Xác định nitrit, nitrat trong mẫu thật……… 39

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 22

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào nồng độ axit sunfanilic 24

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào nồng độ α-naphthylamin 26

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu diazo theo pH 27

Bảng 3.4 Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với cột khử Cd-Cu 29

Bảng 3.5 Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với hỗn hợp huyền phù kẽm + dung dịch CdSO4 30

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrit và phương trình đường chuẩn xác định nitrit 30

Bảng 3.7 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrat và phương trình đường chuẩn xác định nitrat 32

Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của nitrit, nitrat 33

Bảng 3.9 Sự thay đổi độ hấp thụ quang khi cố định nồng độ nitrit 33

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu đến độ hấp thụ quang 35

Bảng 3.11 Giá trị độ hấp thụ quang tính sự mất mát nitrit qua quá trình xử lý mẫu 36

Bảng 3.12 Kết quả hàm lượng nitrat, nitrit trong Xúc xích bò ViSan 39

1

MỞ ĐẦU

Trong cuộc sống hiện đại, thực phẩm chế biến là những sản phẩm đi liền với đời sống hàng ngày của mỗi gia đình vì nó tiết kiệm thời gian và tiền bạc cho thực đơn bữa ăn gia đình Nhưng điều đáng lo ngại nhất là chất lượng của thực phẩm chế biến (hàm lượng chất bảo quản, phụ gia thực phẩm) mà người sản xuất đưa vào với mục đích giữ gìn và kéo dài thời gian sử dụng của các loại thực phẩm Một trong số đó là nitrit, nitrat (muối diêm) là một dạng muối được xếp vào nhóm chất bảo quản có chức năng ổn định màu, ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây độc.Tuy nhiên nếu dùng các muối này để chế biến, bảo quản không đúng qui định thì sẽ là mối đe dọa cho sức khỏe con người Vì thế, việc xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến

là rất cần thiết nhằm đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng

Trong bản khóa luận này chúng tôi nghiên cứu qui trình xác định nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm chế biến dựa trên cơ sở phản ứng tạo hợp chất diazo của nitrit với axit sunfanilic và α-napthylamin Phương pháp này có một số ưu điểm như

độ nhạy của phương pháp cao, ít bị ảnh hưởng của các chất cản trở, có thể thực hiện ở các phòng thí nghiệm trang bị đơn giản

Hiện nay có nhiều nghiên cứu xác định nitrat, nitrit tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trên thực phẩm chế biến một cách đầy đủ Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm chế biến bằng phương pháp trắc quang.Và với bất kỳ phương pháp nào thì việc nghiên cứu khảo sát các điều kiện thích hợp để phương pháp cho kết quả chính xác nhất vẫn

là nhiệm vụ quan trọng nhất

Theo WHO: Phụ gia là một chất khác hơn là thực phẩm hiện diện trong thực phẩm là kết quả của một số mặt: sản xuất, chế biến, bao gói, tồn trữ Các chất này không bao gồm sự nhiễm bẩn

Theo Ủy ban Tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (Codex Alimentarius Commisson - CAC): Phụ gia là một chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm và cũng không được sử dụng như một thành phần của thực phẩm Việc bổ sung chúng vào thực phẩm để giải quyết mục đích công nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải thiện cấu kết hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó Phụ gia thực phẩm không bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất độc bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì hay cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm

Theo TCVN: Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hay một thành phần chủ yếu của thực phẩm, có hoặc không có giá trị dinh dưỡng, đảm bảo an toàn cho sức khỏe, được chủ động cho vào thực phẩm với một lượng nhỏ nhằm duy trì chất lượng, hình dạng, mùi vị, độ kiềm hoặc axít của thực phẩm, đáp ứng về yêu cầu công nghệ trong chế biến, đóng gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm

Như vậy, phụ gia thực phẩm không phải là thực phẩm mà nó được bổ sung một cách chủ ý, trực tiếp hoặc gián tiếp vào thực phẩm, cải thiện tính chất hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó Phụ gia thực phẩm tồn tại trong thực phẩm như một thành phần của thực phẩm với một giới hạn tối đa cho phép đã được quy định

3

1.1.1 Vai trò của phụ gia thực phẩm [16]

- Làm tăng giá trị dinh dưỡng: Bổ sung vitamin, khoáng chất không có hoặc đã

bị mất đi trong khi chế biến Như thêm iôt vào muối; thêm vitamin A, vitamin D vào sữa; thêm vitamin B vào bánh mì, bột, gạo vì khi xay phần lớn vỏ cám có nhiều loại vitamin này đã mất đi

- Giữ cho thực phẩm an toàn, tươi lâu hơn

Thực phẩm thường bị một số vi khuẩn, nấm độc, mốc, men làm hư hỏng Chất phụ gia

có thể giúp bảo quản, làm chậm quá trình lên men, ngăn chặn sự phân hủy của thực phẩm Như sulfit được cho vào các loại trái cây khô, nitrit và nitrat được cho thêm vào các loại thịt chế biến như xúc xích, thịt muối, thịt hộp

- Làm thay đổi bề ngoài của thực phẩm: Nhằm giúp cho thực phẩm hấp dẫn hơn

Ví dụ: Chất nhũ hóa lecithin ở sữa, lòng đỏ trứng, đậu nành làm món ăn có độ ẩm, không khô cứng Chất làm bột nở như muối bicarbonat, natri phosphat được dùng khi làm bánh nướng, bánh mì để làm cho bánh mềm, xốp hơn

- Làm tăng mùi vị và sức hấp dẫn của thực phẩm: Một số chất màu có công dụng làm cho thực phẩm có vẻ ngoài hấp dẫn hơn hoặc phục hồi màu sắc nguyên thủy của thực phẩm; duy trì hương vị vitamin dễ bị phân hủy vì ánh sáng; tạo cho thực phẩm có dáng vẻ đặc trưng, dễ phân biệt

1.1.2 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người [2]

Hiện nay, việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khởe con người vẫn là một vấn đề phức tạp Vì lợi ích, những nhà kinh doanh cổ vũ mạnh

mẽ việc sử dụng hóa chất và họ thường tài trợ cho các cơ sở nghiên cứu để thực hiện những công trình nghiên cứu có lợi cho sản xuất Nói chung các triệu chứng thường thấy thuộc vào loại phản ứng dị ứng với một số chất phụ gia như: ngứa ngáy, da nổi

đỏ, nhức đầu, đau bụng, chóng mặt, khó thở vv Một vài thí dụ như:

 Nhóm sulfite: Có thể gây khó thở, những người bị hen suyễn không nên ăn

thực phẩm có chứa sulfite Sulfite được trộn trong rau quả, quả khô (như nho khô) hoặc đông lạnh, các loại nước giải khát, trong tôm tép đóng hộp để cho tươi hơn và cũng tìm thấy trong các loại xốt cà chua

4

 Nhóm nitrit và nitrat (muối diêm): Có khả năng gây ung thư khi chuyển

thành nitrosamin lúc chiên nướng Các chất này rất hữu hiệu trong việc ngăn cản sự phát triển và diệt vi khuẩn, đặc biệt là khuẩn clostridium botulinum trong đồ hộp Ngoài tác dụng giúp bảo quản tốt, nitrit và nitrat còn tạo cho thịt có màu hồng tươi rất hấp dẫn Thịt nguội, jăm - bông, thịt hun khói, xúc xích đều có chứa nitrit và nitrat

 Bột ngọt (MSG – monosodium glutamate): Có người không hợp với bột ngọt

nên cảm thấy khó chịu trong người, chóng mặt, nhức đầu, khô miệng, nóng ran ở mặt, Tuy nhiên, các triệu chứng trên chỉ tồn tại trong một khoảng thời gian ngắn

 Đường hóa học E951 – Aspartame: Người không hợp với chất aspartame nên có thể bị đau bụng, chóng mặt, nhức đầu

1.2 Ảnh hưởng nitrat, nitrit lên sức khỏe con người

Bản thân nitrat không độc, nhưng sự chuyển hóa của nitrat thành nitrit trong cơ thể người và động vật là rất nguy hiểm nếu nó tích lũy ở nồng độ cao [11]

Hàm lượng nitrat cao trong cơ thể có thể gây ra các bệnh về hồng cầu, dễ thấy

nhất là bệnh xanh da ở trẻ nhỏ (bệnh Blue baby), người ta gọi đây là hội chứng

methemoglobin và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt đối với trẻ dưới 6 tháng tuổi, do

dịch axit trong dạ dày trẻ nhỏ không đủ mạnh như của người trưởng thành Vì vậy, các loại khuẩn đường ruột dễ dàng chuyển hóa nitrat thành nitrit [11]

NO2- nó sẽ chuyển hoá Fe2+ thành Fe3+ làm cho hồng cầu không làm được nhiệm vụ chuyển tải O2, nếu duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong, phản ứng: [11]

2HbFe2+(O2) + NO2- + H2O → 2HbFe3+ + 2OH- + NO3- + O2

Nồng độ nitrit cao hơn 100 mg NO3-/L khi vào dạ dày, tại đây pH thấp nitrit được chuyển thành axit nitrơ có khả năng phản ứng được với amin hoặc amit sinh ra

1.3.1.2 Tính chất hóa học

Muối nitrat khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt (chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380 -5000C), còn các nitrat của kim loại khác kém bền với nhiệt dễ phân hủy khi đun nóng

Độ bền nhiệt của muối nitrat phụ thuộc vào bản chất cation kim loại

Nitrat của những kim loại hoạt động đứng trước magie ở trong dãy điện hóa, khi đun nóng bị phân hủy thành nitrit và oxy

6

Cách phân hủy khác nhau đó của muối nitrat kim loại là do độ bền khác nhau của muối nitrit và oxyt của của các kim loại quyết định Chẳng hạn như NaNO2 và PbO bền, trong khi Pb(NO2)2, Hg(NO2)2 và HgO không bền

Do dễ mất oxi, các muối nitrat khan khi đun nóng là chất oxi hóa mạnh

Ion NO3- trong môi trường axit có khả năng oxi hóa như axit nitric, trong môi trường trung tính hầu như không có khả năng oxy hóa, nhưng trong môi trường kiềm

có thể bị Al, Zn khử đến NH3

Ví dụ: NaNO3 + 4 Zn + 7 NaOH + 6 H2O = 4 Na2[Zn(OH)4] + NH3

1.3.2 Tính chất của nitrit [6]

1.3.2.1 Tính chất vật lý

Nitrit là muối của axit nitrơ Hầu hết muối nitrit dễ tan trong nước, muối ít tan

là AgNO2 Cũng như muối nitrat, đa số muối nitrit không có màu

1.3.2.2 Tính chất hóa học

Nitrit của kim loại kiềm bền với nhiệt, chúng không phân huỷ khi nóng chảy

mà chỉ phân huỷ trên 500oC Nitrit của các kim loại khác kém bền hơn, bị phân huỷ khi đun nóng, chẳng hạn như AgNO2 phân huỷ ở 140oC, Hg(NO2)2 ở 75oC

Trong môi trường axit, muối nitrit có tính oxy hóa và tính khử như axit nitrơ Muối nitrit oxy hóa được axit HI đến I2, dung dịch SO2 đến H2SO4, ion Fe2+ đến

Fe3+ còn bản thân nó chuyển thành NO

Ví dụ: 2 HI + 2 NO2- + 2 H+ = 2 NO + I2 + 2 H2O Với các chất oxy hóa mạnh như KMnO4, MnO2, thì NO2

7

1.4 Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit

1.4.1 Các phương pháp phân tích nitrat

1.4.1.1 Phương pháp khử bằng Zn [13]

Cơ sở của phương pháp: Ion NO3- được khử về NO2- khi cho tác dụng với Zn kim loại, sau đó NO2- được xác định khi cho tác dụng với axit sunfanilic và α-naphthylamin

Phản ứng khử phụ thuộc vào nhiệt độ, vì vậy tất cả các mẫu phải được khử ở cùng một nhiệt độ

Các ion ảnh hưởng: Au, Bi, Fe, Pb, Ag,…có thể làm giảm kết quả đo và màu của một số ion xen lẫn màu của chất hấp thụ

Khoảng xác định của phương pháp: 20 µg NO3--N/L ÷ 1,4 mg NO3--N/L

Khoảng nồng độ giới hạn: 0,01 ÷ 1,0 mg NO3--N/L

1.4.1.3 Phương pháp đo thế dùng điện cực chọn lọc ion [3]

ra khỏi mẫu thực vật bằng dung dịch phèn nhôm kali 1% (với tỷ lệ mẫu/dung dịch = 1/5) Sau đó xác định NO3- trong dung dịch nhờ điện cực chọn lọc ion

Nguyên lý của phương pháp là đo thế điện cực chọn lọc ion, mà giá trị thế phụ thuộc vào nồng độ ion xác định trong dung dịch Điện cực bạc clorua bão hòa được sử dụng như điện cực so sánh

Phương pháp này không áp dụng được nếu lượng Cl- trong mẫu phân tích lớn hơn nồng độ NO3

8

1.4.1.4 Phương pháp axit Cromotrophic [13]

Cơ sở của phương pháp: Phản ứng kết hợp giữa hai phân tử NO3

-

với một phân

tử của axit cromotrophic (C10H8O8S2) hình thành nên hợp chất màu vàng Sau đó đem

đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 410 nm

Nếu lượng clo dư (là chất oxy hóa) và có mặt nitrit cũng tạo nên hợp chất màu vàng với axit cromotrophic Tuy nhiên khi thêm muối sunfit có thể loại trừ được ảnh hưởng từ lượng dư clo (tác nhân oxi hóa) và dùng urê nhằm chuyển hóa NO2

thành N2

để loại ảnh hưởng của nitrit

Giới hạn phát hiện: 50 µg NO3- - N/L

1.4.1.5 Phương pháp Natri salixilat [9]

Cơ sở của phương pháp: Đo mật độ quang dung dịch có màu vàng dạng p – nitrosalixylat ở bước sóng 420 nm Đây là hợp chất được tạo thành giữa nitrat và natri salixilat trong môi trường axit

O3N

COONaOH

H++ NO3-

COONaOH

(p-nitrosalixylat)

Phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nitrit (≤ 2 mg/L), clorua (≤ 200 mg/L), sắt (≤ 5 mg/L)

1.4.1.6 Phương pháp axit Phenoldisulfonic [13]

Cơ sở của phương pháp: Dựa trên phản ứng giữa nitrat và axit Phenoldisulfonic hình thành nên hợp chất nitrophenol Khi kiềm hóa thì dung dịch trở nên màu vàng và

có cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ NO3

-

trong mẫu

C6H3(HSO3)2OH + 3 HNO3 = C6H2(OH)(NO2)3 + 2 H2SO4 + H2O

C6H2(OH)(NO2)3 + NH3 = C6H2(NO2)2ONH4

Độ hấp thụ đo ở bước sóng λ = 410 nm

Độ nhạy của phương pháp: 10-3 mg NO3- - N/L

Chất rắn lơ lửng được loại bỏ bằng cách lọc mẫu

Ảnh hưởng của CaCO3, Ca(OH)2 có thể loại bỏ bằng cách axit hóa bằng HCl

Giới hạn phát hiện: 40 µg NO3- - N/L

1.4.2 Phương pháp phân tích nitrit

 Phương pháp dùng hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin

Cơ sở của phương pháp: Cho nitrit cần xác định tác dụng với hỗn hợp thuốc thử

axit sunfanilic và α-naphthylamin để hình thành hợp chất diazo màu đỏ Sau đó đo độ

hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng λ = 540 nm, dựa vào các phương pháp định lượng (đường chuẩn, thêm chuẩn, ) để xác định nồng độ nitrit trong mẫu

Phản ứng tạo thành hợp chất màu diazo như sau:

HO3S

NH2+

N N

10

Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trắc quang đo nitrit: [13]

+ pH của môi trường phản ứng: Thường được tiến hành ở pH khoảng 1,7 ÷ 3; + Nếu trong mẫu có hợp chất chứa nitrogentriclorua là hợp chất có màu đỏ,

do đó sẽ ảnh hưởng khi đo quang;

+ Ion Cu2+ làm giảm kết quả đo, do nó là xúc tác cho sự phân hủy muối diazonium;

+ Một số ion Sb, Fe, Pb, Ag, có trong mẫu sẽ kết tủa, gây cản trở phép đo quang

1.4.3 Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit

1.4.3.1 Phương pháp dùng axit sunfanilic và α-naphthylamin [7]

Nitrit ở trong mẫu được xác định bằng cách cho tác dụng với hỗn hợp axit

sunfanilic và α-naphthylamin, phản ứng tạo ra hợp chất diazo màu đỏ Sau đó đo độ

hấp thụ quang ở bước sóng λ = 540 nm

Tổng nitrat, nitrit trong mẫu được xác định bằng cách cho thêm dung dịch EDTA và đệm amoni Sau đó cho chảy qua cột khử Cd-Cu Ở đây nitrat bị khử về nitrit, sau đó nitrit được xác định bằng phương pháp quang phổ như trên

Độ thu hồi của phương pháp: 95 ÷ 105 %

Giới hạn áp dụng phương pháp: 0,01 ÷ 1,0 mg NO3- - N/L

1.4.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]

bằng detectơ UV Hỗn hợp pha động là octyl amonium orthophotphat 0,01M + metanol theo tỷ lệ 30% (thể tích/thể tích) ở pH = 7, tốc độ bơm pha động là 0,8 mL/phút, thời gian phân tích cho một mẫu là 10 phút

Đường chuẩn xác định nitrat, nitrit xây dựng trong khoảng 0,1 ÷ 100 µg/mL có

hệ số tương quan r = 0,999

Độ thu hồi của phương pháp: 96,6 ÷ 105,7%

+ Kênh thứ hai chứa dung dịch thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin Chất màu diazo tạo thành được nhận ra và đo bằng detectơ UV- VIS tại bước sóng λ =

540 nm

Giới hạn định lượng được xác định là 5.10-8 M

Trường hợp các mẫu sinh học có chứa nhiều protein được loại trừ trước bằng hỗn hợp NaOH-ZnSO4

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm [5]

1.5.1 Kỹ thuật vô cơ hóa ướt

a Bằng axit đặc mạnh, có tính oxy hóa mạnh:

Dùng axit vô cơ mạnh và đặc (HCl, H2SO4), axit mạnh đặc có tính oxy hóa mạnh (HNO3, H2SO4), hỗn hợp hai axit (HNO3 + H2SO4), hay ba axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để phân hủy mẫu trong bình Kendan hay ống nghiệm được đun nóng Lượng axit thường gấp 15 - 20 lần lượng mẫu và còn tùy thuộc vào loại mẫu Thời gian hòa tan mẫu trong các hệ hở, bình Kendan thường vài giờ đến vài chục giờ, cũng tùy thuộc vào loại mẫu, cỡ mẫu, bản chất của các chất cần xác định,

Trong quá trình xử lý này các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ kim của mẫu rau quả sẽ bị oxy hóa, đốt cháy các chất hữu cơ, đưa các kim loại về các muối vô

cơ tan trong dung dịch nước, quá trình hóa học chính là:

Mẫu + HNO3 + H2SO4 = CO2 + H2O + Men(SO4)m + Mex(NO3)y

12

b Xử lý mẫu trong lò vi sóng:

Trong các hệ lò đơn giản:

 Hệ bình mẫu hở;

 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao);

Trong các hệ nhiều bình và tự động hoàn toàn:

 Hệ bình mẫu hở có khống chế nhiệt độ;

 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao) có khống chế nhiệt độ và áp suất;

 Xử lý trong lò vi sóng hệ kín (có áp suất) thì chỉ cần 50 - 60 phút

1.5.2 Kỹ thuật vô cơ hóa khô

Nung để xử lý sơ bộ mẫu có phụ gia và chất bảo vệ là quá trình xử lý mẫu sơ bộ nhờ tác dụng của nhiệt độ thích hợp, có thêm tương tác hỗ trợ của chất phụ gia, thường

là các chất chảy, axit đặc để phá vỡ cấu trúc dạng tinh thể ban đầu của mẫu phân tích,

để chuyển nó sang một dạng các hợp chất khác dễ hòa tan tiếp bằng axit Khi có chất chảy, nhiệt độ nung thường thấp hơn khi không có chất chảy, thời gian ngắn hơn, song lại triệt để hơn, mà lại không mất chất phân tích Nhất là các mẫu có cấu trúc bền, chịu nhiệt hay mẫu hữu cơ thì tác dụng cảu chất bảo vệ là rất quan trọng

Ví dụ: Tro hoá mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co, Cr,

Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn), dùng chất phụ gia là 8 mL H2SO4 45% và 2 g KNO3 Lấy 5 g mẫu vào chén nung thạch anh, thêm chất phụ gia, trộn đều, sấy khô cẩn thận cho mẫu khô và thành than đen, sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 440-4500C, rồi sau đó ở 550-5300C, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng Sau đó hòa tan tro thu được trong 15 mL dung dịch HCl 18%, đun nhẹ cho mẫu tan hết rồi định mức thanh 25 mL bằng dung dịch HCl 2%

1.5.3 Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp

Vì là xử lý khô ướt kết hợp là kế tiếp nhau, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó mới nung, nên tính chất và diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kiểu đã đề cập ở trên, chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư quá nhiều

13

như trong xử lý ướt Sau khi xử lý ướt ta đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt Phương pháp này hạn chế được mất chất phân tích của một số kim loại khi nung

Ví dụ: Xử lý mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co,Cr, Cu, Fe,Mn, Ni, Pb, Zn) Lấy 5 g mẫu vào chén nung, thêm 15 mL HNO3 65%, 2 mL H2SO498% và 5 mL Mg(NO3)2 5%, trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ sấy mẫu trên bếp điện hay trong

tủ sấy cho đến khi khô và thành than đen Sau đó đem nung ở nhiệt độ 400-450 0C trong

3 giờ, sau đó nung ở 530 0C cho mẫu tro hóa đến khi thấy bã không còn đen Sau đó hòa tan tro thu được trong 15 mL HCl 1/1, đun nóng cho mẫu hòa tan hoàn toàn, đuổi hết axit

dư đến còn muối ẩm, và định mức thành 25 mL bằng axit HCl 2 %

1.6 Cơ sở của phương pháp trắc quang [1]

1.6.1 Định luật Bouguer – Lambert – Beer

Khi chiếu một dòng sáng qua dung dịch chất hấp thụ ánh sáng thì chất đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tia sáng tùy theo màu sắc của chất

Định luật Lambert – Beer mô tả mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ dung dịch

và độ hấp thụ ánh sáng, được biểu diễn bằng phương trình toán học sau:

Aλ = ελ.l.C (1.1) Trong đó:

Aλ : độ hấp thụ quang của chất tại bước sóng λ

ελ : hệ số hấp thụ của chất tại bước sóng λ

l : chiều dày cuvet đựng mẫu (cm)

C : nồng độ của cấu tử (mol/L)

Điều kiện sử dụng định luật:

+ Chùm tia sáng đơn sắc

+ Dung dịch phải loãng, trong suốt

+ Chất phân tích phải bền và bền dưới tác dụng của tia UV – VIS

14

1.6.2 Phân tích định lượng

1.6.2.1 Phương pháp đường chuẩn

+ Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tăng dần nhất định

Cx1, Cx2, Cx3, Cx4, của chất chuẩn cần phân tích

+ Đo độ hấp thụ quang Ax1, Ax2, Ax3,Ax4 của các dung dịch chuẩn tại bước sóng

λmax đã khảo sát

+ Xây dựng đường chuẩn A = f(C)

+ Chuẩn bị mẫu trong điều kiện tương tự, đo độ hấp thụ quang Ax

+ Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ Cx

Hình 1.1 Dạng đường chuẩn trong phân tích trắc quang

1.6.2.2 Phương pháp thêm chuẩn

Dùng mẫu phân tích làm nền, thêm vào các mẫu phân tích một lượng xác định dung dịch chuẩn của chất phân tích có nồng độ tăng dần và thực hiện phản ứng tạo màu để có dãy mẫu thêm chuẩn Đo độ hấp thụ của các mẫu thêm chuẩn này, ta có:

15

Vẽ đường thêm chuẩn A – C được dạng đường như sau

Hình 1.2 Dạng đường thêm chuẩn

Bằng phương pháp ngoại suy (đường 1) hoặc phương pháp hình học (đường 2)

ta tính được Cx của chất cần phân tích trong mẫu

16

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu xác định nitrat, nitrit bằng phương pháp trắc quang trên cơ sở phản

ứng giữa nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin để tạo ra hợp chất diazo màu đỏ Xây dựng quy trình phân tích, từ đó áp dụng để phân tích một số mẫu thực phẩm chế biến Chúng tôi đã nghiên cứu các nội dung sau:

2.1.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp

2.1.1.1 Khảo sát điều kiện xác định nitrit

Cố định nồng độ axit sunfanilic ở 2,5.10-4 M, thay đổi nồng độ α-naphthylamin

từ 0,5.10-4 – 10,5.10-4 M và ngược lại Lập đồ thị độ hấp thụ quang phụ thuộc vào sự thay đổi đó rồi chọn ra tỷ lệ nồng độ thích hợp nhất

b Môi trường pH tối ưu

Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic

và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại môi trường pH khác nhau để chọn

ra được pH thích hợp cho phản ứng tạo màu diazo

c Thời gian ổn định màu

Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic

và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại bước sóng hấp thụ cực đại (λ = 540 nm) liên tục trong 35 phút (mỗi lần đo cách 30 giây), để chọn thời gian ổn định màu thích hợp cho phương pháp

2.1.1.2 Khảo sát điều kiện khử từ nitrat qua nitrit

a Chọn phương pháp khử

Thực hiện phản ứng khử nitrat bằng hai phương pháp: Cột khử Cd-Cu và hỗn hợp huyền phù kẽm + dung dịch CdSO4 rồi so sánh hiệu suất khử ở hai phương pháp này

17

b Chọn pH khử thích hợp

Thực hiện phản ứng khử với hỗn hợp huyền phù kẽm + dung dịch CdSO4 đã chọn ở các pH khác nhau để chọn pH thích hợp

2.1.2 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

2.1.2.1 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu đo có thể phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu đo của mẫu trắng (hay tín hiệu nền) Giới hạn phát hiện được xác định theo qui tắc “3”

y = yB + 3B hay y = yB + 3SB (2.1) Trong đó: y: tín hiệu ứng với LOD

yB: tín hiệu ứng với mẫu trắng (blank)

B (hay SB): độ lệch chuẩn của tín hiệu mẫu trắng

yB và SB được xác định, dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = a + b.C (C là nồng độ) được thiết lập theo phương pháp "bình phương tối thiểu" yB

được chấp nhận là giá trị của y khi C = 0  yB = a và SB được chấp nhận bằng Sy/C (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn)

yi: các giá trị thực nghiệm của y; n là số điểm thí nghiệm (yi, Ci)

Yi: các giá trị của y tính từ phương trình đường chuẩn (hay các giá trị y lý thuyết)

Từ (2.1) ta có: y = yB + 3SB = a + 3Sy/C

LOD được tính từ phương trình hồi quy y = a + bC như sau:

y = a + bLOD = a + 3Sy/C  bLOD = 3Sy/C  LOD = 3Sy/C/b (2.3)

- Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trên một đường chuẩn tin cậy.Thường người ta chấp nhận LOQ = 10Sy/C/b hay LOQ = (3  4).LOD (2.4)