tìm hiểu khả năng quang hợp ở cây mai dương (mimosa pigra l.) nhằm mục đích kiểm soát sự phát triển loài cỏ dại này

Hiện nay, đo sự phát huỳnh quang diệp lục tố là phương pháp thích hợp để nghiên cứu các stress quang oxid hóa vì đánh giá chính xác hoạt động của chuỗi chuyển điện tử quang hợp và mức độ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Sinh lý thực vật – Trường Đại hoc Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng thí nghiệm Bộ môn Thực vật học – Trường Đại học Wisconsin Madison – Hoa Kỳ, và Trường Đại học Florida Atlantic – Hoa Kỳ

Người hướng dẫn khoa học:

Hướng dẫn 1: PGS TS BÙI TRANG VIỆT

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Ở ĐẦU

Mai Dương (Mimosa pigra L , một trong số những loài cỏ dại

nguy hiểm nhất trên thế giới, đang phát triển mạnh tại các vùng khí hậu nhiệt đới Mai Dương có thể sống sót qua mùa khô, tồn tại trong điều kiện ngập nước nhiều tháng liền, ra hoa, tạo trái quanh năm và phát tán hột theo dòng nước Tại Việt Nam, Mai Dương xâm lấn dày đặc tại đồng bằng sông Cửu Long và đang đe dọa sự đa dạng sinh học tại các vườn quốc gia thuộc khu vực đất ngập nước Điều đáng chú ý là Mai Dương chỉ phân bố tập trung tại các khu vực nước ngọt,

soát loài cỏ dạng bụi thấp Paspalum vaginatum

Hiện nay, đo sự phát huỳnh quang diệp lục tố là phương pháp thích hợp để nghiên cứu các stress quang oxid hóa vì đánh giá chính xác hoạt động của chuỗi chuyển điện tử quang hợp và mức độ quang

ức chế (photoinhibition ở thực vật

Do yêu cầu ngăn chặn sự lan rộng của cây Mai Dương một cách

có hiệu quả nhưng ít gây hại cho môi trường, và tiếp tục hướng nghiên cứu cản tăng trưởng và làm chậm sự ra hoa (để cản sự tạo

hột , đề tài “T ở D

(Mimosa pigra ằ

” được thực hiện bằng cách tác động lên quá trình

quang hợp của thực vật, đặt trọng tâm vào việc đánh giá khả năng trao đổi khí và sự phát huỳnh quang diệp lục tố trong các điều kiện khác nhau của môi trường bao gồm nhiệt độ cao, cường độ chiếu sáng mạnh và sự thiếu carbon dioxide, và sau đó dùng các ion kim loại, đặc biệt là muối ăn (NaCl chủ yếu để làm tăng hiện tượng quang ức chế ở lá Mai Dương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN T I IỆU

Cây Mai Dương mọc thẳng đứng, có nhiều nhánh, tạo thành bụi cao Cây bắt đầu ra hoa khi được 6 đến 8 tháng tuổi và liên tục duy trì

sự ra hoa, tạo trái trong nhiều năm Cây sinh sản bằng hột với vỏ cứng, duy trì sự sống lâu trong đất Cây Mai Dương có thể vượt qua mùa khô nhờ sự rụng lá và sống sót được trong điều kiện ngập nước nhờ sự tạo rễ quanh gốc thân Hiện nay, cây Mai Dương đang xâm lấn mạnh ở nhiều địa phương như V nh Phú, Hà Nội, Phú Yên, Bảo Lộc, La Ngà Đặc biệt, loài cỏ dại này đang đe dọa các Vườn Quốc gia U Minh Thượng, Nam Cát Tiên và Tràm Chim

Quang hợp xảy ra theo hai giai đoạn: giai đoạn “sáng” và giai đoạn “tối” nối tiếp nhau: Giai đoạn sáng có vai trò chuyển quang năng thành hóa năng tích lũy trong các hợp chất cao năng NADPH và ATP; giai đoạn tối sử dụng năng lượng từ các hợp chất cao năng này

để cố định carbon dioxide và tạo ra glucose

Dưới ánh sáng, các phân tử diệp lục tố ở trung tâm phản ứng của quang hệ II (PSII) bị kích hoạt Năng lượng kích hoạt này có thể được phân giải theo hướng quang hóa bằng cách chuyển vào các con đường chuyển điện tử trên màng thylakoid hoặc phân giải theo hướng không quang hóa như sự tỏa nhiệt và phát huỳnh quang Khi chuỗi chuyển điện tử quang hợp bị quá tải do nhận ánh sáng quá mức, sự xuất hiện các oxygen phản ứng (ROS sẽ gây ra sự hư hỏng bộ máy quang hợp và dẫn đến hiện tượng quang ức chế Dựa trên nguyên tắc này, phương pháp đo sự phát huỳnh quang diệp lục tố cho phép khảo sát được khả năng hoạt động của PSII và chuỗi chuyển điện tử quang hợp, đồng thời đánh giá mức độ sự làm dịu không quang hóa Khi phương pháp này kết hợp với việc đo sự trao đổi carbon dioxide và oxygen cũng như độ dẫn khí khẩu sẽ là một công cụ hữu ích hỗ trợ cho những nghiên cứu về các stress oxid hóa

Khi cây chịu tác động của stress muối, sự mất cân bằng giữa hai quá trình hình thành và làm dịu ROS, do đó sự tạo ra quá mức những ROS như superoxide, hydrogen peroxide và gốc hydroxyl trong tế bào xảy ra Các ROS này phản ứng và phá hỏng các lipid, protein và

acid nucleic Stress muối cản mạnh chuỗi chuyển điện tử trong cả lục lạp và ti thể, và cũng làm tăng mạnh hoạt tính oxygenase của enzyme Rubisco (xúc tác cho bước đầu tiên trong chu trình quang hô hấp Các ion sodium có xu hướng tích tụ trong cây, đặc biệt trên ngọn

và lá dẫn đến sự cản quang hợp Đối với những cây chịu mặn, tế bào

có cơ chế để ngăn sự thu nhận quá mức ion sodium Stress muối dẫn tới tín hiệu calcium trong tế bào chất kích hoạt hệ thống SOS trong tế bào gồm các protein kinase và các protein màng tế bào giúp sự đối chuyển H+

và Na+ để loại Na+ ra khỏi tế bào Những cây nhạy cảm với stress muối có hệ thống SOS hoạt động kém và không phát triển được trên môi trường nhiễm mặn

CHƯƠNG 2: VẬT IỆU V PHƯƠNG PH P

- Cây Mai Dương đang ra hoa, mọc tại Thành phố Hồ Chí Minh

- Cây Mai Dương đang ra hoa, mọc tại khu C của Vườn quốc gia Tràm Chim (Tỉnh Đồng Tháp và khu vực bao quanh các đảo nhỏ trên hồ Sông Mực (Vườn Quốc Gia Bến En, Tỉnh Thanh Hóa

2 2 PHƯƠNG PH P

1 Khảo sát chu trình phát triển của cây Mai Dương tại Thành phố

Hồ Chí Minh, Vườn quốc gia Tràm Chim và Bến En

2 Các thí nghiệm sơ khởi về ảnh hưởng của các ion đồng, sắt, kẽm

và sodium trên sự hóa nâu lá Mai Dương, tác động của sodium chloride trên sự nảy mầm của hột, sự phát triển của tử diệp và khả năng sống của cây con Mai Dương

3 Quan sát cấu trúc giải phẫu của lá và tử diệp Mai Dương dưới tác động của sodium chloride bằng kính hiển vi quang học

4 Quan sát sự phát huỳnh quang diệp lục tố của tử diệp Mai Dương dưới tác động của sodium chloride bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Mỹ ở ánh sáng có bước sóng 460 – 490 nm

5 Quan sát sự phát huỳnh quang từ lục lạp của lá chét cấp hai Mai Dương dưới tác động của sodium chloride và FeSO4 bằng kính hiển vi Confocal với ánh sáng kích thích ở bước sóng 488 nm và kính lọc ánh sáng huỳnh quang ở bước sóng 560 nm

6 Đo hàm lượng diệp lục tố và carotenoid của tử diệp Mai Dương

cô lập dưới tác động của sodium chloride (theo Wellburn, 1994

7 Xác định số khí khẩu của lá bằng collodion

8 Đo độ dẫn khí khẩu của lá và tử diệp Mai Dương ở các cường độ ánh sáng và tại các thời điểm khác nhau trong ngày, hoặc dưới tác động của sodium chloride Độ dẫn khí khẩu được đo trực tiếp bởi đầu dò hồng ngoại bên trong buồng đo của máy LI-6400-40 LCF (Li-Cor, Lincoln, Neb., Mỹ hoặc bởi hai điện cực nhạy với hơi nước của khẩu kế (Porometer SC-1, ENVCO, Mỹ

9 Đo sự trao đổi carbon dioxide và sự phát huỳnh quang diệp lục tố của lá và tử diệp Mai Dương ở các độ tuổi khác nhau, ở các cường độ ánh sáng khác nhau, hoặc dưới tác động của sự thiếu carbon dioxide, điều kiện ngập nước ở rễ và bị xử lý sodium chloride, bằng máy LI-6400-40 LCF với đầu dò hồng ngoại và các giá trị huỳnh quang được ghi nhận gồm:

- Hiệu suất hoạt động của quang hệ II:

- Sự làm dịu quang hóa:

- Sự làm dịu không quang hóa:

điện cực oxygen của máy Leaf Lab 2 (Hansatech, Anh

11 Xử lý sodium chloride trên cây con Mai Dương

12 Xử lý sodium chloride trên cây Mai Dương sinh trưởng ở đất khô ráo tại Thành phố Hồ Chí Minh

13 Xử lý sodium chloride trên cây Mai Dương trong mùa khô tại Vườn Quốc gia Tràm Chim, ở các thời điểm khác nhau trong ngày, ở các nồng độ sodium chloride khác nhau và xử lý lặp lại

Hình 3.2 Số lá kép và tỷ lệ ra hoa của cây Mai Dương được trồng tại vườn thực nghiệm ở các độ tuổi khác nhau (từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2011

Trong tự nhiên, ở vùng đất khô ráo nay ngập nước định kỳ, cây cũng ra hoa khi đạt 5 đến 6 tháng tuổi, tạo nhiều nhánh và ra hoa tạo trái suốt đời sống của chúng (Ảnh 3.6)

Ảnh 3.6 Một cây Mai Dương nhiều năm tuổi ở trạng thái bụi lớn gồm nhiều nhánh ngang, sát trên mặt đất (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2011

3.1.2 C ệ ở

ZnSO4, CuSO4, và FeSO4 không gây ra sự nhạt màu lá ở các nồng

độ dưới 1 mM, nhưng có thể gây nhạt màu hoặc hóa nâu lá ở 10 và

20 mM Trong đó, FeSO4 gây ra sự hóa nâu trên 60% diện tích lá (Bảng 3.3) NaCl gây ra sự hóa nâu lá, cản sự nảy mầm và tăng trưởng của cây con Mai Dương (Ảnh 3.21

Bảng 3.3 Tỷ lệ diện tích lá nhạt màu hoặc hóa nâu của lá chét cấp hai Mai Dương tại thời điểm 12 giờ sau khi nhúng vào các dung dịch chứa ZnSO4, CuSO4, và FeSO4 ở các nồng độ khác nhau từ 0 đến 20 mM, trong các điều kiện ánh sáng 400 µmol/m²/giây

Nồng độ

(mM)

Tỷ lệ diện tích lá nhạt màu hoặc hóa nâu (%

0 3,05 ± 0,05 bc 3,55 ± 0,15 ab 3,08 ± 0,06 ab0,001 2,38 ± 0,31 c 6,13 ± 0,37 bc 2,91 ± 0,09 ab0,01 0,84 ± 0,06 a 3,44 ± 0,19 ab 3,10 ± 0,07 ab0,1 1,12 ± 0,05 ab 1,57 ± 0,22 a 3,05 ± 0,10 ab

Ảnh 3.19 Cây con Mai Dương 5 ngày tuổi nảy mầm từ hột trên gòn thấm nước cất (A , NaCl 1 (B , 3 (C , 6 (D , 9 (E , 12 (F , 30 (G , 60 (H g/l

Ảnh 3.24 Phẫu thức ngang gân

chính của lá chét cấp hai thuộc lá

kép 3 tuần tuổi của cây Mai Dương

22 tuần tuổi được nhuộm 2 màu

Ảnh 3.25 Phẫu thức ngang gân chính của lá chét cấp hai thuộc lá kép 3 tuần tuổi của cây Mai Dương

22 tuần tuổi được nhuộm I2KI Các

tế bào lục mô bắt màu nâu sậm (X

3 1 4 S ó ở é ấ v ử ệ D sodium chloride

Ở lá chét, NaCl 30 g/l làm các tế bào lá co nguyên sinh 30 phút sau xử lý (Ảnh 3.32 NaCl đều làm lá chét và tử diệp Mai Dương hóa nâu và xảy ra bắt đầu từ lớp tế bào lục mô giậu (Ảnh 3.33)

Sự hóa nâu gây ra do NaCl chỉ xảy ra khi được chiếu sáng Ảnh 3.35

và hoàn toàn bị triệt tiêu trong tối (Ảnh 3.36

Ảnh 3.30 Phẫu thức ngang lá chét

cấp hai Mai Dương cô lập, 30 phút

sau khi xử lý với NaCl 30 g/l

Ảnh 3.31 Phẫu thức ngang lá chét cấp hai Mai Dương, sau 2 giờ xử lý với NaCl 30 g/l (đã được ngâm trương nước trước khi giải phẫu)

Ảnh 3.33 Tử diệp Mai Dương cô

lập được chiếu sáng liên tục ở 1500

µmol/m²/giây trong 48 giờ, trong

hộp Petri chứa nước cất (A , NaCl 5

g/l (B), NaCl 10 g/l (C)

Ảnh 3.34 Tử diệp Mai Dương cô lập được che tối liên tục trong 48 giờ, trong hộp Petri chứa nước cất (A), NaCl 5 g/l (B), NaCl 10 g/l (C)

3.1.5 ở v ắ ê ỳ

v ở é ấ D

Lục lạp Mai Dương có dạng dẹp, dài ép sát vách ở lục mô giậu và

có hình tròn ở lục mô khuyết Sự phát huỳnh quang của lục lạp gần mặt dưới lá luôn cao hơn mặt trên (Ảnh 3.41 NaCl 30 g/l và FeSO4

10 mM đều làm giảm sự phát huỳnh quang diệp lục tố ở mặt trên lá 4 giờ sau xử lý, trong đó, tác động của NaCl mạnh hơn so với FeSO4 Lúc này, lục lạp bị uốn cong nhiều chỗ (Ảnh 3.42 Sau 24 giờ, tuy

sự phát huỳnh quang được phục hồi nhưng lục lạp tiếp tục bị phù ra

Ảnh 3.39 Vi ảnh huỳnh quang của

lục lạp trong tế bào lục mô ở mặt

trên (A và mặt dưới (B của lá chét

cấp hai (thuộc lá kép số 7 của cây

Mai Dương 16 tuần tuổi dưới kính

hiển vi confocal

Ảnh 3.40 Vi ảnh huỳnh quang của lục lạp trong tế bào lục mô ở mặt trên (A và mặt dưới (B của lá chét cấp hai (thuộc lá kép số 7 của cây Mai Dương 16 tuần tuổi ở thời điểm 4 giờ sau xử lý NaCl 30 g/l dưới kính hiển vi confocal (bước sóng kích hoạt

488 nm và kính lọc 560 nm

3.1.6 ở e ê ổ

ắ ố ở ử ệ D ô ậ

NaCl 5 - 20 g/l làm chậm sự gia tăng hàm lượng diệp lục tố a, b

và carotenoid tổng trong quá trình tăng trưởng của tử diệp ngay trong

24 giờ đầu sau xử lý Riêng NaCl 10, 15 và 20 g/l làm giảm mạnh

hàm lượng của các sắc tố này sau 96 giờ xử lý (Bảng 3.12)

Bảng 3.12 Hàm lượng carotenoid tổng cộng của tử diệp Mai Dương tại các thời điểm khác nhau sau khi đặt trên giấy thấm trong hộp Petri chứa NaCl ở các nồng độ từ 0 đến 20 g/l, trong các điều kiện ánh sáng 400 µmol/m²/giây (12 giờ chiếu sáng trong ngày , nhiệt độ 30,5 ± 0,5oC, ẩm độ 76 ± 5% Nồng độ

NaCl

(g/l)

Hàm lượng carotenoid tổng (µg/mg trọng lượng tươi

Thời gian sau xử lý (giờ

20 0,60 ± 0,04 2 0,52 ± 0,05 a,2 0,46 ± 0,19 a,2 0,15 ± 0,14 a,1

Các số trung bình trong cột với các ký tự khác nhau kèm theo thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p≤0,05

Các số trung bình trong hàng với các chữ số khác nhau kèm theo thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p≤0,05

3.1.7 Số ẩ ở ặ é ấ D

Số khí khẩu mặt dưới của lá chét cấp hai luôn cao hơn mặt trên khoảng hai lần Mặt trên và dưới của lá chét cấp hai Mai Dương được phủ một lớp lông dày trên bề mặt

3.1.8 Độ ẫ ẩ v ử ệ D

Độ dẫn khí khẩu ở lá gia tăng theo cường độ ánh sáng (Hình 3.4)

Hình 3.4 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng trên độ dẫn khí khẩu ở lá Mai Dương

NaCl 20 – 80 g/l gây đóng khí khẩu 30 phút sau xử lý Sự đóng khí khẩu tiếp tục gia tăng đến 4 giờ NaCl 10 g/l cũng gây đóng khí khẩu nhưng chậm hơn (bắt đầu ở phút thứ 120 và cũng gia tăng ở những phút tiếp theo (Bảng 3.16)

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trên độ mở khí khẩu của lá cây Mai Dương đang ra hoa tại các thời điểm khác nhau sau xử lý

30 102 ± 2 a,2 35 ± 3 c,1 37 ± 4 ab,1 40 ± 5 a,1 36 ± 5 a,1

60 103 ± 5 a,2 35 ± 3 c,1 30 ± 5 a,1 34 ± 2 a,1 34 ± 6 a,1

80 112 ± 6 a,2 38 ± 2 c,1 33 ± 2 ab,1 40 ± 5 a,1 30 ± 3 a,1

Các số trung bình trong cột với các ký tự khác nhau theo sau thì khác biệt có ý nghĩa

ở mức p≤0,05

Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau theo sau thì khác biệt có ý nghĩa

ở mức p≤0,05

3.1.9 S ỳ ệ ố v ổ b dioxide

Ở lá Mai Dương, sự làm dịu theo hướng không quang hóa luôn gia tăng và sự làm dịu theo hướng quang hóa luôn giảm dần theo cường độ ánh sáng Vận tốc chuyển điện tử ở lá cũng tăng mạnh theo cường độ ánh sáng nhưng bão hòa ở 1200 µmol/m²/giây (Hình 3.6)

Hình 3.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng trên sự làm dịu năng lượng theo hướng quang hóa (qP , không quang hóa (qN và tốc độ chuyển điện tử (ETR ở lá Mai Dương

Sự hấp thu carbon dioxide tăng đều theo cường độ ánh sáng (Hình 3.8) Sự giảm Fv/Fm của lá do NaCl 30 g/l được tăng cường bởi ánh sáng nhưng bị triệt tiêu khi lá được đặt trong tối (Hình 3.10)

Hình 3.8 Ảnh hưởng của

cường độ ánh sáng trên

cường độ trao đổi khí

carbon dioxide ở lá Mai

Dương

Hình 3.10 Khả năng hoạt động của quang hệ

II (Fv/Fm ở lá Mai Dương trồng trong nhà kính (Wisconsin, Mỹ 24 giờ sau khi phun NaCl 30 g/l ở các điều kiện ánh sáng khác nhau (0, 400 và 1600 μmol/m²/giây Đối chứng là cây được phun nước và chiếu sáng ở

1600 μmol/m²/giây

Sự loại carbon dioxide ở các nhiệt độ 30 oC và 40 oC luôn đi kèm với sự tăng độ dẫn khí khẩu, nhưng lại cản mạnh sự thu carbon dioxide của lá Giá trị ETR và Fv/Fm giảm mạnh trong khi qN tăng cao khi lá thiếu carbon dioxide (Bảng 3.20)

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao và sự thiếu carbon dioxide trên độ dẫn khí khẩu, vận tốc trao đổi khí carbon dioxide, tốc độ chuyển điện tử, sự làm dịu năng lượng theo hướng không quang hóa và tỉ lệ Fv/Fm ở lá Mai Dương (ánh sáng 1000 µmol/m²/giây

Điều kiện

thí nghiệm Độ dẫn

khí khẩu (mmol/m2/giây

Vận tốc trao đổi CO 2

Bảng 3.22 Năng suất hoạt động tối đa của PSII (Fv/Fm , sự làm dịu quang hóa (qP , sự làm dịu không quang hóa (qN và tốc độ chuyển điện tử (ETR của tử diệp Mai Dương hai ngày tuổi sau xử lý 15 phút với NaCl ở các nồng

độ khác nhau dưới ánh sáng 1600 µmol/m²/giây

qN Hiệu ứng giảm ETR, sự thu carbon dioxide và hạ thấp Fv/Fm do NaCl 10g/l gây ra được tăng cường khi phối hợp với FeSO4 10 mM nhưng lại bị cản khi phối hợp với FeSO4 0,1 mM (Hình 3.11)

Hình 3.11 Độ dẫn khí khẩu (mmol H2O/m²/giây , cường độ trao đổi carbon dioxide (μmol CO2/m²/giây , khả năng hoạt động của quang hệ II (Fv/Fm), vận tốc chuỗi chuyển điện tử (ETR , qN, qP của lá Mai Dương theo thời gian sau khi được phun NaCl 0, 10, 30, 60 g/l riêng lẻ hay phối hợp với FeSO4 0,1 và 10 mM

3.1.10.S ổ x e ở v ử ệ D

Ở 30 oC, tốc độ phóng thích oxygen của tử diệp Mai Dương không đổi, nhưng tăng theo cường độ chiếu sáng ở lá, và bão hòa ở

1200 µmol/m2/giây (Bảng 3.24)