Thiết kế vector biểu hiện gen Organophosporus Hydrolase (OPHC2) phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu

Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN SƠN

2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Danh mục các chữ cái viết tắt iii

Danh mục các bảng trong luận văn v

Danh mục các hình trong luận văn vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 VẤN ĐỀ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 4

1.1.1 Ô nhiễm không khí 4

1.1.2 Ô nhiễm nước 4

1.1.3 Ô nhiễm đất 5

1.1.3.1 Tình hình ô nhiễm đất ở Việt Nam và thế giới 5

1.1.3.2 Ô nhiễm đất do sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật 7

1.1.3.3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật 10

1.1.4 Xử lý ô nhiễm môi trường bằng thực vật 14

1.2 XỬ LÝ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG BẰNG CÂY CHUYỂN GEN 17

1.2.1 Tác động của cây chuyển gen tới môi trường 17

1.2.2 Nghiên cứu về cây chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trường 18

1.2.3 Nghiên cứu tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc bảo vệ thực vật 20

1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 20

21

1.3.2 Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium 21

1.3.3 Giới thiệu về vector pBI121 22

1.3.4 Gen OPHC2 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 26

2.1.1 Vật liệu 26

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

Hình 2.2 Minh họa tóm tắt quá trình thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121/OPHC2opt và quá trình chuyển gen OPHC2opt vào cây thuốc lá thông qua A tumefaciens 29

2.2.1 Thiết kế cấu trúc OPHC2opt 29

2.2.2 Thiết kế vector chuyển gen OPHC2opt 34

2.2.3 Chuyển cấu trúc mang gen OPHC2opt vào cây thuốc lá 37

2.2.4 Phương pháp đánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen 38

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN OPHC2opt 40

3.1.1 Đổi mã gen OPHC2 tối ưu biểu hiện trong thực vật (OPHC2opt) 40

3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen OPHC2opt 43

3.1.3 Kết quả tổng hợp mồi và gen OPHC2opt 43

3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OPHC2opt 45

3.2.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121 mang gen OPHC2opt 45

3.2.2 Kết quả tạo dòng A tumefaciens 51

3.3 KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ MANG GEN OPHC2opt 52

3.3.1 Kết quả chuyển gen OPHC2opt vào mảnh lá 52

3.3.2 Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Kiến nghị 57

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

aa amino acid - axit amin

BAP 6- benzyl amino purine

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

E coli Escherichia coli

GM Germination medium - Môi trường nảy mầm của hạt

GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen

GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen

gus - Glucuronidase gene ( Gen mã hóa enzyme - Glucuronidase) IBA Indole 3 - butyric acid

IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside

Kb Kilo base

LB Luria Bertani

MS Môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog

MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS

MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS

MSIII Dung dịch III (|sắt) dùng để pha môi trường MS

MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS

OD Optical density

OP Organophosphorus

OPH Organophosphorus hydrolase

Opt optimization-Tối ưu hóa

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase PM10 Particulate matter 10 - Những hạt bụi có kích thước bé hơn

10 micromet

RM Rooting medium - Môi trường ra rễ

RDX Royal Demolition eXplosive – Chất độc gây nổ (hexahydro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine hay (CH2-N-NO2)3)

TAE Tris - Acetate - EDTA

Taq Thermus aquaticus

UOW The University of Wollongong – Trường đại học Wollongong

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Trang

Bảng 1.1 Thời gian tồn lưu trong đất của một số nông dược 7

Bảng 1.2 Lượng thuốc trừ sâu sử dụng ở Việt Nam qua các năm 8

Bảng 1.3 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong đất nghiên cứu (µg/kg) 9

Bảng 2.1 Các vector sử dụng trong thí nghiệm 26

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR 31

Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 32

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 33

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng 34

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối 36

Bảng 3.1 Trình tự mồi nhân gen OPHC2opt 43

Bảng 3.2 Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen OPHC2opt 53

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang

Hình 1.1 Thực vật xử lý ô nhiễm môi trường 15

Hình 1.2 Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật 15

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình chuẩn bị cấu trúc gen OPHC2opt 28

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector và chuyển gen OPHC2opt vào cây thuốc lá 29 Hình 2.3 Cấu trúc gen chuyển trong vector pBI121 35

Hình 3.1 Trình tự nucleotide của gen OPHC2 40

Hình 3.2 Trình tự các aa của protein quy định bởi gen OPHC2 40

Hình 3.3 Trình tự nucleotide của gen OPHC2opt 41

Hình 3.4 So sánh trình tự gen OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (OPHC2) và OPHC2 đã sửa đổi (OPHC2opt) 42

Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc OPHC2opt chuyển vào thực vật 42

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR pBluescipt II SK/ OPHC2opt 44

Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 bằng BamHI và SacI 45

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel vector pBI121 đã cắt mở vòng bằng 2 enzyme BamHI và SacI 46

Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 47

plasmid pBluescript II SK/OPHC2opt bằng 2 enzyme BamHI và SacI 47

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel cấu trúc OPHC2opt 48

Hình 3.11 Hình ảnh đĩa nuôi cấy E coli DH5α đã biến nạp pBI121/OPHC2opt 49

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt 49

Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector pBI121/OPHC2opt 50

Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR khuẩn lạc A tumefaciens

Cv58A1 bằng cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R 52

Hình 3.15 Ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 54

Hình 3.16 Hình ảnh so sánh khả năng phát sinh rễ của cây thuốc lá 55

sau khi nuôi cấy trên môi trường ra rễ 55

Hình 3.17 Hình ảnh điện di mẫu DNA tổng số các mẫu lá 55

cây thuốc lá chuyển gen OPHC2opt 55

Hình 3.18 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OPHC2opt 56

từ lá cây thuốc lá chuyển gen bằng cặp mồi đặc hiệu 56

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm đất ở nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người và cây trồng [25], [41] Một lượng thuốc trừ sâu đã và đang phát tán ra môi trường sau đó lắng đọng dần xuống, ngấm vào đất Thuốc trừ sâu tồn dư lâu trong đất dẫn đến ô nhiễm nước ngầm Chất độc từ thuốc trừ sâu ngấm vào các giếng khoan, các công trình nước sinh hoạt, hồ, ao, sông, suối ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, sức sinh sản của người và động vật

, làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình cấp thiết nhằm bảo vệ nguồn tài nguyên đất, nước và sức khỏe con người Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, oxy hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp, Các phương pháp này thường rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích Gần đây, nhờ những hiểu biết về

, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ môi trường đặc biệt

Việc sử dụng thực vật trong công tác làm sạch các loại đất bị ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật (phytoremediation) là công nghệ đã và đang được áp dụng ở rất nhiều nước trên thế giới, nó đã đem lại hiệu quả cao về công nghệ cũng như tiết kiệm tiền bạc Những nghiên cứu này đã được tiến hành trên

nhiều đối tượng thực vật như lúa, Arabidopsis thaliana và cây dương Tuy

nhiên các loại cây trồng truyền thống thường có những hạn chế nhất định về

khả năng xử lý ô nhiễm Hướng nghiên cứu mới hiện nay là tạo ra những cây trồng chuyển gen có khả năng xử lý ô nhiễm vượt trội hơn Đã có nhiều nghiên cứu như vậy được tiến hành ở các nước trên thế giới như: Pháp, Mỹ, Trung Quốc

Năm 2008 một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc công bố đã chuyển

thành công gen OPHC2 phân lập từ vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcagenes

vào cây thuốc lá Kết quả cho thấy cây này có khả năng kháng lại và tiết ra được enzyme organophosphorus hydrolase vào môi trường nuôi cấy và phân hủy đến 99% methyl parathion trong môi trường nuôi cấy sau 14 ngày

Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế vector biểu

hiện gen organophosphorus hydrolase (OPHC2) phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được cấu trúc mang gen OPHC2opt tối ưu phù hợp với biểu hiện trong thực vật

Thiết kế được vector mang gen OPHC2opt, nhằm mục đích tạo ra cây trồng có khả năng tiết enzyme OPH phân hủy thuốc trừ sâu dạng OP (Mep) tồn dư trong môi trường đất

Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang gen OPHC2opt có khả năng tiết enzyme OPH phân hủy thuốc trừ sâu dạng Mep (một loại OP)

3 Nội dung nghiên cứu

- Dựa trên thông tin về trình tự nucleotide của gen OPHC2 đã công bố ngân trên hàng gen GENBANK, đổi mã tối ưu trình tự gen OPHC2 phù hợp với biểu hiện trong thực vật

- Thiết kế cấu trúc mang gen OPHC2opt và đặt tổng hợp nhân tạo bởi một công ty uy tín của Mỹ

- Biến 121/OPHC2opt vào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VẤN ĐỀ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 1.1.1 Ô nhiễm không khí

Ô nhiễm không khí là sự có mặt một chất lạ hoặc một sự biến đổi quan

sự tỏa mùi, có mùi khó chịu, giảm tầm nhìn xa do bụi

Ô nhiễm môi trường khí quyển tạo nên sự ngột ngạt và "sương mù", gây nhiều bệnh cho con người Nó còn tạo ra các cơn mưa acid làm huỷ diệt các khu rừng và các cánh đồng

Báo cáo tổng quan môi trường Việt Nam lần 2 vừa được công bố cho

Chất lượng môi trường không khí trên toàn lãnh thổ đang bị suy giảm, nhất là tại các đô thị lớn Một số khu vực có biểu hiện ô nhiễm CO, SO2, và ô nhiễm tiếng ồn cục bộ Nồng độ bụi PM10 và bụi tổng số (TSP) ở các thành phố lớn vẫn duy trì ở mức cao, vượt ngưỡng cho phép Hầu hết các giá trị quan trắc

CO tại các thành phố khu vực phía Nam đều vượt ngưỡng quy chuẩn [3]

1.1.2 Ô nhiễm nước

Ô nhiễm nước là sự thay đổi theo chiều xấu đi các tính chất vật lý - hoá học - sinh học của nước, với sự xuất hiện các chất lạ ở thể lỏng, rắn làm cho nguồn nước trở nên độc hại với con người và sinh vật, làm giảm độ đa dạng sinh vật trong nước

Ô nhiễm nước có nguyên nhân từ các loại chất thải và nước thải công nghiệp được thải ra lưu vực các con sông mà chưa qua xử lí đúng mức, các loại phân bón hoá học và thuốc trừ sâu ngấm vào nguồn nước ngầm và nước

ao hồ, nước thải sinh hoạt được thải ra từ các khu dân cư ven sông

Theo đánh giá của WHO, hiện nay hàng năm trên thế giới có khoảng 1,5 tỉ người thiếu nguồn nước uống an toàn, ít nhất 5 triệu người bị chết hàng năm do các bệnh tật liên quan đến nước bẩn, cao gấp 5 lần số nạn nhân chết

đã có biểu hiện ô nhiễm các chất hữu cơ khó phân hủy, các chất vô cơ và vi sinh vật gây bệnh [5]

Một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nước tại Việt Nam và trên thế giới là do các hoạt động sản xuất nông nghiệp của con người Trong đó thuốc trừ sâu là một trong những nguồn ô nhiễm chính đặc biệt nguy hiểm

1.1.3 Ô nhiễm đất

1.1.3.1 Tình hình ô nhiễm đất ở Việt Nam và thế giới

Ô nhiễm môi trường đất được xem là tất cả các hiện tượng làm nhiễm bẩn môi trường đất bởi các chất gây ô nhiễm (pollutant) Người ta có thể phân loại đất

bị ô nhiễm theo nguồn gốc phát sinh, hoặc theo các tác nhân gây ra ô nhiễm

Môi trường đất có những đặc thù riêng và một số tác nhân gây ô nhiễm

có thể có cùng nguồn gốc nhưng lại gây tác động bất lợi rất khác nhau Có nhiều cách phân loại các nguyên nhân gây ô nhiễm Tuy nhiên, phân loại theo các tác nhân gây ô nhiễm phù hợp hơn đối với môi trường đất [12]

Ô nhiễm đất do tác nhân hoá học: bao gồm phân bón N, P, K (dư lượng phân bón trong đất), thuốc trừ sâu (clo hữu cơ, DDT, lindan, aldrin,

photpho hữu cơ, ), chất thải công nghiệp và sinh hoạt (kim loại nặng, độ kiềm, độ axit, )

Ô nhiễm đất do tác nhân sinh học: Trực khuẩn lỵ, thương hàn, các loại

ký sinh trùng (giun, sán, )

Ô nhiễm đất do tác nhân vật lý: nhiệt độ (ảnh hưởng đến tốc độ phân huỷ chất thải của sinh vật), chất phóng xạ (uran, thori, Sr90

, I131, Cs137) Thâm

tạo (phân hóa học, nông dược, ) làm cho đất ngày càng bị ô nhiễm nặng hơn tuy tốc độ ô nhiễm chậm nhưng xảy ra thường xuyên, liên tục [12]

Tài nguyên đất của thế giới hiện đang bị suy thoái nghiêm trọng do xói mòn, rửa trôi, bạc mầu, nhiễm mặn, nhiễm phèn và ô nhiễm đất, biến đổi khí hậu

Tại Việt Nam theo “Báo cáo tổng quan môi trường quốc gia 2010”:

- Ô nhiễm do sử dụng phân hóa học: sử dụng phân bón không đúng kỹ thuật trong canh tác nông nghiệp nên hiệu lực phân bón thấp, có trên 50% lượng đạm, 50% lượng kali và xấp xỉ 80% lượng lân dư thừa trực tiếp hay gián tiếp gây ô nhiễm môi trường đất Các loại phân vô cơ thuộc nhóm chua sinh lý như K2SO4, KCl, super photphat còn tồn dư trong đất sau khi canh tác

đã axit hóa và làm chua đất đồng thời cũng làm nghèo kiệt các cation kiềm và

là nguyên nhân của sự xuất hiện nhiều độc tố trong môi trường đất như ion

Al3+, Fe3+, Mn2+ giảm hoạt tính sinh học của đất và năng suất cây trồng [3]

- Ô nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật: thuốc bảo vệ thực vật có đặc điểm rất độc đối với mọi sinh vật; tồn dư lâu dài trong môi trường đất, nước; tác dụng gây độc không phân biệt, nghĩa là gây chết tất cả những sinh vật có hại

và có lợi trong môi trường đất Theo các kết quả nghiên cứu, hiện nay mặc dù khối lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng ở Việt nam còn ít, trung bình

từ 0,5-1,0 kg/ha/năm, tuy nhiên, ở nhiều nơi đã phát hiện dư lượng thuốc bảo

vệ thực vật trong đất [3]

- Ô nhiễm chất thải vào môi trường đất do hoạt động công nghiệp: kết quả của một số khảo sát cho thấy hàm lượng kim loại nặng trong đất gần các khu công nghiệp đã tăng lên trong những năm gần đây Như tại cụm công nghiệp Phước Long hàm lượng Cr cao gấp 15 lần so với tiêu chuẩn, Cd cao từ 1,5 đến 5 lần, As cao hơn tiêu chuẩn 1,3 lần [3]

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi quan tâm tới vấn đề

ô nhiễm đất canh tác do sử dụng thuốc trừ sâu, hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.3.2 Ô nhiễm đất do sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật

Ở Việt Nam, theo kết quả điều tra, khảo sát của Bộ Tài nguyên và Môi trường, trong số 1.153 điểm ô nhiễm có 864 khu vực bị ô nhiễm thuốc BVTV tồn lưu trên địa bàn 16 tỉnh, thành phố; 289 kho hóa chất BVTV tồn lưu trên địa bàn 37 tỉnh, thành phố [47]

Vì số lượng lớn hóa chất BVTV tích luỹ trong đất, đặc biệt là các thuốc

có chứa các nguyên tố như chì, asen, thuỷ ngân, có độc tính lớn, thời gian lưu lại trong đất dài, có loại nông dược thời gian lưu trong đất tới 10 đến 30 năm, những loại nông dược này có thể được cây trồng hấp thụ, tích trong quả

và lá và đi vào cơ thể người và động vật qua thực phẩm, ảnh hưởng đến sức khoẻ Thuốc trừ sâu đồng thời với việc diệt các côn trùng gây hại, cũng gây độc đối với các vi sinh vật và côn trùng có ích, các loại chim, cá, và ngược lại một số loại sâu bệnh thì lại sinh ra tính kháng thuốc [5]

Bảng 1.1 Thời gian tồn lưu trong đất của một số nông dược Loại nông dược Thời gian bán huỷ (năm)

Hợp chất kim loại nặng (Pb, As, Cu, Hg) Clo hữu cơ (DDT)

Thuốc trừ cỏ 2,4-D và 2,4,5-T Thuốc trừ sâu dạng lân hữu cơ Thuốc trừ sâu có gốc amoni

10 - 30

2 - 4

1 - 2 0,4 0,02 - 0,2 0,02

(Nguồn: Cục bảo vệ thực vật, 2004)

Qua bảng 1.1 cho thấy nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật có thời gian bán phân hủy rất lâu Trong đó, Thuốc trừ sâu mà chúng tôi quan tâm nghiên cứu có thời gian bán phân hủy nhanh hơn Tuy nhiên nhƣ với thời gian 0,2 năm cũng gây ra nhiều tác hại nguy hiểm bởi tính độc của nó rất cao

Tuy nhiên hiện nay việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc trừ sâu trong nông nghiệp nói riêng là việc làm cần thiết Lƣợng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng ở Việt Nam qua các năm theo thống kê của cục bảo vệ thực vật luôn ở mức cao

Bảng 1.2 Lƣợng thuốc trừ sâu sử dụng ở Việt Nam qua các năm Năm Khối lƣợng (tấn sản phẩm) Trung bình lƣợng chất tác

22 mẫu (58%) có dƣ lƣợng diazinon dao động từ 1 - 21 µg/kg, 14 mẫu (37%)

có chứa fenobucard từ 1 đến 8 µg/kg, 19 mẫu (50%) có chứa dimethoate từ 1 đến 9 µg/kg, 6 mẫu (16%) chứa methyl parathion từ 4 đến 8 µg/kg và 2 mẫu

có chứa fenthion với hàm lượng 1 µg/kg tuy có hàm lượng thấp nhưng rõ ràng quá trình tích lũy trong đất là rất phổ biến Vấn đề đặt ra là phải có các biện pháp quản lý tốt hơn để hạn chế sự gia tăng hàm lượng của chúng đến mức gây ô nhiễm môi trường đất [5]

Bảng 1.3 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong đất nghiên cứu

(µg/kg) Hóa chất

Phú Xuân

TCCP

(10/10)

1-21 (10/10)

4-5 (2/8)

0 (0/5)

0 (0/8)

0 (0/5)

7 (1/8)

0 (0/5)

4-7 (2/10)

0 (0/8)

0 (0/5)

(Nguồn: báo cáo đề tài cấp nhà nước KC.08.02)

(Số trong ngoặc chỉ số mẫu có dư lượng hóa chất trên tổng số mẫu phân tích, TCCP: Tiêu chuẩn Việt Nam 5941 – 1995)

Bảng 1.3 cho thấy các loại thuốc trừ sâu được sử dụng phổ biến tại Việt Nam đều để lại một lượng dư lượng nhất định trong đất trồng sau thu hoạch Kiểm tra dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ở một số vùng trồng rau ngoại thành

Hà Nội (Vũ Anh Tú, Phạm Việt Tiến) cho thấy 7/10 mẫu có hàm lượng DDT: 0,001 – 0,4 mg/kg; 7/10 mẫu có lindan: 0,001 – 0,1 mg/kg; 2/10 mẫu có methyl parathion: 0,08 – 1 mg/kg; 3/10 mẫu có monitor: 0,005 - 0,1 mg/kg Nhìn chung dư lượng thuốc BVTV là không lớn Tuy nhiên sự tích tụ thuốc BVTV tồn dư trong đất theo thời gian báo động một nguy cơ ô nhiễm đất và

nước ngầm rất cao đòi hỏi chúng ta cần chuẩn bị những biện pháp xử lý một cách có hiệu quả [5]

* Organophotphase nhóm thuốc trừ sâu phổ biến nhất hiện nay

Organophosphates là một nhóm thuốc trừ sâu chứa các chất độc thần kinh, cơ; nó tác động lên các enzyme acetylcholinesterase Organophosphates

bao gồm các hợp chất phốt pho hữu cơ có chứa OP [44]

Thuốc trừ sâu lân hữu cơ (organophosphates) gây bất hoạt acetylcholinesterase, làm cho chức năng thần kinh, cơ của côn trùng bị ngưng trệ không thể phục hồi Đồng thời các chất này cũng gây độc tương tự ở con người và nhiều loài động vật khác Các loại thuốc trừ sâu organophosphate sẽ

bị thủy phân khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, không khí và đất; một lượng nhỏ được phát hiện tồn dư trong thức ăn và nước uống Vì lý do này các loại thuốc trừ sâu gốc organophosphate được sử dụng phổ biến để thay thế các loại thuốc trừ sâu organochlorides như: DDT, aldrin, dieldrin Mặc dù các organophosphates bị phân hủy nhanh hơn so với các organochlorides nhưng

nó có độc tính cấp tính lớn, mức độ rủi ro cao cho những người tiếp xúc với thuốc với số lượng lớn Các organophosphates thường được sử dụng bao gồm: parathion, malathion, methyl parathion, chlorpyrifos, diazinon, dichlorvos, phosmet, fenitrothion, tetrachlorvinphos, và azinphos methyl [44]

1.1.3.3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật

a) Phương pháp hóa học

- Phương pháp oxy hóa ở nhiệt độ thấp

thuốc BVTV tạo sản phẩm không độc hoặc ít độc Các chất oxy hóa thường dùng là khí clo (Cl2), kali pemanganat (KMnO4), ozon (O3), hyđroperoxyt (H2O2), hypoclorit natri (NaOCl), canxi hypoclorit (Ca(OCl)2),…[5]

- Phương pháp oxy hóa bằng khí ướt

Phương pháp này dựa trên cơ chế oxy hóa bằng hỗn hợp không khí và hơi nước ở nhiệt độ cao 200 - 3500C và áp suất 70 – 140 atm [5]

- Phương pháp thủy phân

Nguyên tắc của phương pháp này căn bản dựa trên sự tác động của ion

H+ và OH- tấn công vào các phân tử hóa chất BVTV biến chúng thành các hóa chất không độc hoặc ít độc [5]

- Phương pháp chiết

+ Chiết bằng dung môi: Lợi dụng khả năng hòa tan tốt của các loại thuốc BVTV trong các dung môi hữu cơ, trong khi các dung môi này không hòa tan trong nước, có thể tinh chế bằng phương pháp lọc chiết qua các công đoạn xử lý [5]

+ Chiết bằng màng lỏng: Sử dụng một hệ nhũ tương trong dầu, trong nước để phân tách [5]

b) Phương pháp hóa – lý

- Phương pháp phân hủy bằng tia cực tím

Do có năng lượng lớn tia cực tím có khả năng làm gãy mạch vòng hoặc làm gãy các mối liên kết clo với cacbon, hoặc các nguyên tố khác trong cấu trúc phân tử của các hợp chất hữu cơ với cacbon và sau đó thay thế nhóm đó bằng nhóm phenyl hoặc nhóm hyđroxyl để làm mất hoặc giảm độc tính của chất đó [5]

- Phương pháp phân hủy bằng hồ quang plasma

Phương pháp tiến hành trong các thiết bị cấu tạo đặc biệt, các liên kết hóa học của hợp chất hữu cơ bị bẻ gãy ở nhiệt độ cao tạo nên plasma khí ion hóa, sau đó dẫn đến sự tạo thành SO2, CO2, H2O, HPO3, Cl2, và Br2,…[5]

Sản phẩm phân hủy tạo ra phụ thuộc vào bản chất của thuốc BVTV Ví

dụ như sự phân hủy parathion methyl có các sản phẩm sau:

C10H14O5PS + 15 O2  SO2 + 10 CO2 + 7 H2O + HPO3 + NO2 [5]

- Phương pháp điện hóa

Phương pháp dựa trên khả năng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp bởi các tác nhân oxy hóa mới sinh dưới tác dụng của dòng điện để phân hủy các thuốc BVTV về dạng không độc hoặc ít độc hơn [5]

- Phương pháp hấp thụ, hấp phụ

Phương pháp này thường được sử dụng trong công nghệ xử lý khí, khói Trước khi thải ra môi trường, khí thải được dung dịch hấp phụ tuần hoàn, thu gom và xử lý các chất ô nhiễm Có thể sử dụng các chất hấp phụ có nguồn gốc tự nhiên như than hoạt tính, bentonit, hoặc các chất hấp phụ tổng hợp khác nhau Vật liệu hấp phụ được tái sinh hoặc xử lý bằng phương pháp oxy hóa hay thiêu đốt sau mỗi chu kỳ sử dụng [5]

Thuốc BVTV sau khi được thu gom trên chất hấp phụ có thể áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để xử lý chúng (chiết bằng dung môi, oxy hóa, ) [5]

- Phương pháp phân hủy nhiệt

Dựa trên cơ sở sự phân hủy bởi quá trình đốt cháy (thiêu đốt) và sự phân hủy bởi nhiệt độ cao, áp suất lớn còn gọi là phản ứng nhiệt phân [5]

nano giúp cho việc thúc đẩy quá trình phân bố tại những khu vực có diện tích lớn làm tăng quá trình chuyển hóa các chất ô nhiễm Hiện nay việc đổi mới trong công nghệ tổng

hợp nano và sản phẩm của nó đã đem lại kết quả quan trọng là làm giảm giá thành và tăng khả năng ứng dụng rộng rãi của Fe0

nano Có thể ứng dụng công nghệ Fe0

nano để xử lý cả các chất thải vô cơ và hữu cơ [5]

d) Xử lý tồn dư hóa chất BVTV bằng vi sinh vật

Biện pháp phân hủy hóa chất BVTV bằng các tác nhân sinh học dựa trên cơ sở sử dụng các nhóm vi sinh vật có sẵn trong môi trường đất, các vi sinh vật có khả năng phá hủy cấu trúc hóa học phức tạp của hóa chất BVTV

và hoạt tính sinh học của hóa chất BVTV Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trường đất quần thể vi sinh vật luôn có khả năng thích nghi với sự thay đổi của điều kiện sống Ở trong đất, hóa chất BVTV bị phân hủy thành các hợp chất vô cơ nhờ các phản ứng oxy hóa - khử, thủy phân, xảy ra ở mọi tầng đất Tác động quang hóa xảy ra ở tầng đất mặt cũng làm hóa chất BVTV được phân hủy Tập đoàn vi sinh vật đất rất phong phú và phức tạp Chúng có thể phân hủy hóa chất BVTV và sử dụng thuốc như là nguồn cung cấp cacbon, nitơ và năng lượng để chúng xây dựng tế bào Quá trình phân hủy của

vi sinh vật gồm một hay nhiều giai đoạn, để lại các sản phẩm trung gian và

một số chất khác [5]

Quá trình phân hủy hóa chất BVTV của vi sinh vật đất đã được phát hiện từ rất lâu trong môi trường đất nhưng có hiệu suất chuyển hóa thấp Để tăng tốc độ phân hủy hóa chất BVTV và phù hợp với yêu cầu xử lý người ta

đã tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như thay đổi pH, môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ thoáng khí Bổ sung vào môi trường đất chế phẩm vi sinh vật có khả năng phân hủy hóa chất BVTV đối với những khu vực có thể kiểm soát được các yếu tố môi trường [5]

Một số trở ngại có thể sử dụng vi sinh vật trong xử lý sinh học là những điều kiện môi trường tại nơi cần xử lý như: sự có mặt của kim loại nặng nguy

hại, nồng độ các chất ô nhiễm hữu cơ cao có thể làm cho vi sinh vật tự nhiên không thể phát triển được và làm chết vi sinh vật đưa vào, giảm đáng kể ý nghĩa của xử lý sinh học [5]

Hướng nghiên cứu mới hiện nay đang được các nhà khoa học tại nhiều phòng thí nghiệm quan tâm là sử dụng thực vật để xử lý ô nhiễm hóa chất BVTV

1.1.4 Xử lý ô nhiễm môi trường bằng thực vật

Làm sạch các chất ô nhiễm là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp

và vốn đầu tư cao Hầu hết các phương pháp hóa học hoặc vật lý truyền thống đều rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích, Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hóa, chống chịu và loại bỏ chất ô nhiễm của một số loài thực vật người ta đã chú ý đến khả năng

sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ đặc biệt Việc sử dụng thực vật để xử lý ô nhiễm môi trường (Phytodegradation) là công nghệ

đã và đang được áp dụng ở rất nhiều nước trên thế giới, nó đã đem lại hiệu quả lớn về công nghệ cũng như tiết kiệm tiền bạc Năm 1990 phương pháp này chính thức được nhắc đến như một loại công nghệ mới dùng để xử lý môi trường đất bị ô nhiễm [5] Cho đến nay, đã có nhiều loài thực vật được chứng minh là có thể dùng để làm sạch các loại chất gây ô nhiễm môi trường bao gồm các chất vô cơ và hữu cơ Các nhà khoa học trên thế giới cũng đã xác định được bản chất của các quá trình hấp thụ, vận chuyển và lưu giữ các chất gây ô nhiễm ở trong cơ thể thực vật Giải pháp công nghệ này bao gồm một

số quá trình cơ bản như sau:

- Chuyển dạng chất ô nhiễm ( Phyto-tranfomation)

- Xử lý tại vùng rễ (Rhizosphere Bioremediation)

- Công nghệ cố định các chất ô nhiễm (Phytostabilization)

- Công nghệ chiết suất bằng thực vật (Phytoextraction)

- Công nghệ lọc bằng rễ (Rhizo-filtration)

- Công nghệ bay hơi qua lá cây (Phyto-volatilization) [5]

Hình 1.1 Thực vật xử lý ô nhiễm môi trường

Hình 1.1 minh họa cho mối liên quan giữa các quá trình chuyển đổi chất ô nhiễm bằng phương pháp xử lý ô nhiễm bằng thực vật Bản chất các quá trình hấp thụ, vận chuyển và lưu giữ các loại chất gây ô nhiễm vô cơ và hữu cơ đã được nghiên cứu rất chi tiết Ở thực vật, quá trình hấp thụ các chất này được thực hiện với nhiều quá trình khác nhau Các chất ô nhiễm được cơ thể thực vật hấp thụ thông qua hệ thống rễ và các chất này sẽ được chuyển hóa thành các dạng bay hơi an toàn [20], [35] Các quá trình này được mô tả trong hình 1.2

Hình 1.2 Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật

Các nghiên cứu cho đến nay đã chỉ ra cơ thể thực vật là hệ thống hoàn chỉnh và tốt nhất để loại bỏ các hợp chất ô nhiễm không bị phân hủy từ môi trường đất và nước Hơn 400 loài thực vật được ghi nhận là có khả năng này [27] Hai yếu tố quan trọng giúp cho cơ thể thực vật là lựa chọn tốt nhất cho

quá trình này đó là khả năng tổng hợp sinh khối và hiệu quả tích lũy các chất được hấp thụ vào cây [18]

Các chất ô nhiễm có thể được hấp thụ vào cây thông qua rễ và lá và được chuyển hóa thành các chất không có hại và tích lũy trong mô của cây [33] Chính vì vậy, tăng cường quá trình hấp thụ, chuyển hóa và tích lũy của cây trồng sẽ giúp cho việc thúc đẩy quá trình loại bỏ chất ô nhiễm trong môi trường đất Ngoài ra việc tạo cây chuyển gen có khả năng tiết ra các loại enzyme giúp phân hủy chất ô nhiễm trong môi trường đất cũng là hướng nghiên cứu mới đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Xử lý thuốc bảo vệ thực vật trong đất bằng thực vật có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau phụ thuộc vào từng cơ chế loại bỏ thuốc bảo vệ thực vật như:

- Phương pháp làm giảm nồng độ thuốc bảo vệ thực vật trong đất bằng cách trồng các loài thực vật có khả năng tích luỹ thuốc bảo vệ thực vật cao trong thân Các loài thực vật này phải kết hợp được 2 yếu tố là có thể tích luỹ thuốc bảo vệ thực vật trong thân và cho sinh khối cao Có rất nhiều loài đáp ứng được điều kiện thứ nhất, nhưng không đáp ứng được điều kiện thứ hai Vì vậy, các loài có khả năng tích luỹ thấp nhưng cho sinh khối cao cũng rất cần thiết Khi thu hoạch các loài thực vật

bỏ ra khỏi đất [33]

-, ngăn chặn ô nhiễm nguồn nước ngầm [33]

ng dụng kỹ thuật di truyền để phát triển các loài thực

vật cho sinh khối nhanh và cải tiến khả năng hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu tốt đối với các điều kiện môi trường [33]

1.2 XỬ LÝ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG BẰNG CÂY CHUYỂN GEN 1.2.1 Tác động của cây chuyển gen tới môi trường

Một trong những lợi ích to lớn của cây trồng chuyển gen đối với môi trường là chúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sâu được sử dụng, với

tỷ lệ phụ thuộc vào loại cây trồng và các đặc điểm mới được đưa vào cây trồng đó Một nghiên cứu về các tác động của cây trồng công nghệ sinh học đối với môi trường và kinh tế sau 9 năm được canh tác (1996 – 2004) cho thấy việc ứng dụng công nghệ sinh học đã làm giảm lượng thuốc trừ sâu cần phải sử dụng khoảng 172 triệu kg, và làm giảm các tác động lên môi trường khoảng 14% Công nghệ sinh học cũng góp phần làm giảm đáng kể lượng khí nhà kính thải ra từ các hoạt động nông nghiệp, tương đương với loại bỏ khoảng 5 triệu xe ôtô [43]

Ở Mỹ, việc sử dụng cây trồng công nghệ sinh học làm giảm khoảng 210.000 tấn thuốc trừ sâu năm 2003 Việc sử dụng bông Bt ở Trung Quốc làm giảm khoảng 78.000 tấn thuốc trừ sâu năm 2001 Thực vật kháng thuốc diệt

cỏ tiếp tục tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của phương pháp canh tác giúp bảo tồn đất ở Mỹ, đặc biệt là phương pháp canh tác không cần cày đất Việc sử dụng phương pháp canh tác bảo tồn đất này giữ được khoảng 1 tỷ tấn đất 1 năm Cây trồng công nghệ sinh học đã được chứng minh là có ảnh hưởng tích cực lên số lượng và sự đa dạng của các loại côn trùng có lợi trên

cánh đồng bông của Mỹ và Australia Ngô Bt được sử dụng ở Philippines

không cho thấy bất cứ ảnh hưởng tiêu cực nào lên sự đa dạng và phong phú của côn trùng [43]

1.2.2 Nghiên cứu về cây chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trường

Một loại cây cỏ dại trong họ mù tạt (Arabidopsis thaliana) đã được

chuyển gen trong đó có gen có khả năng chuyển đổi những muối thuỷ ngân thành dạng thuỷ ngân kim loại và phát tán chúng vào không khí [48].

Cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea) chuyển gen (GM) đã hút sạch

lượng selen dư thừa trên một cánh đồng tại California Đây là cuộc thử nghiệm đầu tiên trên thực địa đối với một số loại cây GM chống ô nhiễm Selen là một nguyên tố hoá học, gây độc đối với thực vật nếu hàm lượng của chúng quá cao trong đất Cây mù tạt Ấn Độ vốn có khả năng kháng và hấp thụ selen qua rễ Tuy nhiên, Terry và cs (Đại học California) đã thúc đẩy thêm khả năng trên của cây mù tạt này bằng cách bổ sung một số gen tạo enzyme đói selen Kết quả là loại thực vật GM này có thể hấp thụ selen cao gấp 4,3 lần so với mù tạt Ấn Độ dạng hoang dại, và chúng được thu hoạch 45 ngày sau khi trồng [48]

Các chuyên gia ở Đại học Washington Mỹ đã dùng kỹ thuật chuyển

gen tạo ra một loại cây dương (poplar) có khả năng khử được ô nhiễm tại chỗ

bằng cách hấp thụ nước ô nhiễm vào hệ thống rễ của nó Loại cây này có khả năng bẻ gãy các chất gây ô nhiễm thành những sản phẩm phụ vô hại và kết hợp với rễ, gốc và lá của nó tiến hành xử lý sau đó nhả ra môi trường không khí Qua thí nghiệm, những cây trồng chuyển gen có khả năng khử được tới 91% trichloroethylen có trong nguồn nước bị ô nhiễm [50]

Cùng với việc tạo ra các loại thông, bạch dương có khả năng "ăn" các chất ô nhiễm, các chuyên gia ở UOW còn phối hợp với nhóm đề tài ở Đại học York của Anh tạo ra những loại cây trồng có thể khử được các chất gây nổ độc hại hay còn được gọi là chất RDX, một loại hợp chất có thể gây nhiễm độc cả nguồn đất lẫn nguồn nước và tự nó rất khó phân huỷ trong môi trường

tự nhiên Qua nghiên cứu nhóm đề tài đã tìm ra một loại khuẩn có thể bẻ gãy

RDX bằng cách di chuyển trong đất Các nhà khoa học đã cách ly được các

gen khử độc và đưa nó vào hạt cây cải xoong (Arabidopsis thaliana), giống

cải này có khả năng làm sạch các chất RDX nhanh hơn rất nhiều so với các loại cây trồng truyền thống Có thể bẻ gãy nhanh RDX thành các chất metalotes không độc và sử dụng các chất này giống như nguồn đạm nitơ [32]

Các nhà khoa học ở Đại học Purdue đang thử nghiệm tính hiệu quả của cây dương chuyển gen để loại bỏ ô nhiễm trong đất và nước ngầm Cây dương chuyển gen được tạo ra bằng cách đưa gen mã hóa crom tế bào của động vật có vú (protein có chứa sắt) Giống cây chuyển gen này có thể làm giảm và loại bỏ hoàn toàn các chất gây ô nhiễm như trichloroethylene, vinyl clorua và cacbon tetrachloride trong đất và nước ngầm Tất cả các chất trên đều có độc tính hoặc gây ung thư, được sử dụng trong công nghiệp và ngấm vào trong đất và nước qua nguồn nước thải không được xử lý Cây dương chuyển gen cũng có thể loại bỏ ô nhiễm trong không khí chứa vinyl clorua, chloroform và benzen, những chất thường thấy trong xăng dầu và chất dẻo Nếu được dịch vụ kiểm tra sức khỏe cây trồng vật nuôi cho phép, giống cây này sẽ được trồng thử nghiệm ở cơ sở chứa dầu không còn hoạt động ở bang Indiana của Mỹ [48]

Hiện nay việc xử lý đất ô nhiễm vẫn mang tính thô sơ, chủ yếu là đào đất và chôn nó ở một nơi khác hoặc rửa đất Cả hai phương pháp đều rất tốn kém và làm giảm chất lượng đất Việc sử dụng thực vật để loại bỏ chất ô nhiễm khỏi đất ít tốn kém hơn song có thể mất nhiều năm [48] Vấn đề tạo ra cây trồng chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trường trên thế giới đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu, hứa hẹn nhiều khả năng xử lý ô nhiễm môi trường đất đạt hiệu quả tối ưu hơn

Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu tập trung nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen hấp thụ kim loại nặng, việc tạo cây trồng chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu chưa được nghiên cứu nhiều

1.2.3 Nghiên cứu tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc bảo vệ thực vật

Thuốc trừ sâu organophosphorus (OP) là một nhân tố ức chế acetylcholinesterase, rất độc hại với con người Sự tích lũy OP dẫn tới thiếu hụt acetylcholinesterase và gây nên phản ứng của cơ, tạo ra một số triệu chứng lâm sàng dẫn đến cái chết Hiện nay, OP

[22], [36[17], [23], [26], [29], [30] Thực vật có khả năng chuyển hóa các

hợp chất OP, các nghiên cứu trước đây đã sử dụng cây Typha latifolia để xử lý

chất ô nhiễm Mep trong nước [14] Có một số công trình nghiên cứu tạo cây trồng có khả năng xử lý ô nhiễm như ion kim loại nặng [37], và chất nổ (TNT, RDX) [21], [32] hoặc thuốc trừ sâu chlo (atrazine) [38] Tuy nhiên, đến nay rất ít công bố về gen và cây chuyển gen làm tăng sự phân hủy và loại

bỏ độc hại các chất bảo vệ thực vật nói chung và hợp chất OP nói riêng

[14], [42]

Năm 2008 ghi nhận nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc

trong việc chuyển gen mã hóa enzyme OPHC2 phân lập từ Pseudomonas

pseudolicagel biến nạp và biểu hiện trong cây thuốc lá Kết quả phân tích cho

thấy, cây thuốc lá chuyển gen đã tiết enzyme OPH ra môi trường nuôi cấy Cây chuyển gen phân hủy được trên 99% lượng thuốc trừ sâu methyl parathion (Mep) tồn dư trong môi trường nuôi cấy [39]

1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Việc hiểu biết những quá trình hấp phụ chất ô nhiễm cho phép các nhà khoa học có thể tạo ra được các loài cây mới mang những tính trạng này bằng việc sử dụng các kỹ thuật hiện đại của công nghệ sinh học, cụ thể là chuyển gen

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính dựa vào cách thức đưa gen vào tế bào thực vật đó là: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp [1]

Theo phương pháp này, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý Chuyển gen trực tiếp gồm: phương pháp bắn gen, phương pháp vi tiêm, phương pháp dung hợp tế bào trần, phương pháp dùng xung điện, phương pháp dùng polyethylen glycol (PEG) Trong những nhóm phương pháp này thì phương pháp bắn gen và chuyển gen trực tiếp nhờ polyethylen glycol (PEG) được ứng dụng phổ biến và thu được nhiều kết quả hơn cả [8]

Phương pháp bắn gen: là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng

được bao bọc DNA bắn vào tế bào Một số ưu điểm của phương pháp bắn gen là: thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào, nguyên liệu để bắn gen đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh) Tuy nhiên nhược điểm của nó là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm [11]

Phương pháp chuyển gen trực tiếp nhờ polyethylen glycol: là

phương pháp chuyển DNA thông qua xử lý polyethylen glycol Là phương pháp chuyển gen cho hiệu quả cao, cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ Ưu điểm: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao, có thể chuyển gen vào protoplast của bất kì loài cây nào Tuy nhiên, việc nuôi cấy protoplast cũng như việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ hệ thống này còn khó khăn ở một số loài cây [11]

1.3.2 Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium

Là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen ở thực vật Cho

đến nay, chuyển gen thông qua Agrobacterium là phương pháp cho tần số

biến nạp cao hơn và có thể xác định được sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp chuyển gen nào [8]

Quá trình chuyển gen gồm nhiều bước khác nhau với mục đích đưa được các gen quan tâm vào hệ gen của tế bào thực vật, để thu nhận được các protein tái tổ hợp biểu hiện các tính trạng mong muốn Trong các bước của quy trình chuyển gen ngoài đối tượng cây chuyển gen và phương pháp chuyển gen thì việc xác định vector và gen chuyển là những yếu tố quan trọng làm cơ sở cho quá trình chuyển gen thành công [10], [11]

1.3.3 Giới thiệu về vector pBI121

Vector pBI121 có kích thước khoảng 13kb với các thành phần chính như sau:

(1) Đoạn khởi động gen (promoter)

Các gen ngoại lai có thể được biểu hiện thành protein cần phải có mặt các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp tương ứng Những tín hiệu không thể thiếu trong quá trình biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và đoạn kết thúc gen Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotide phía đầu 5’ của các gen cấu trúc Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên

mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho RNA polymerase, các yếu

tố hoạt hóa và khởi động Trong thực tế phần lớn promoter 35S từ virus khảm hoa Súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter, viết tắt CaMV 35S) được sử dụng cho sự biểu hiện của gen biến nạp ở tất cả các loại mô và tế bào [6] Tuy nhiên, CaMV 35S-P có khả năng hoạt động mạnh và rộng rãi ở nhiều loại mô của cây hai lá mầm nhưng lại ít hoạt động ở cây một lá mầm Để khắc phục nhược điểm này CaMV35S-P được sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳng hạn promoter pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu

phần phản ứng kị khí của gen Adh1 từ ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từ A tumefaciens đã làm gia tăng sự biểu hiện của gen trong cây một

lá mầm lên hàng chục lần [6]

Promoter 35S có kích thước 350bp gồm 3 thành phần như sau:

(2) Vùng khởi động sao chép DNA (DNA-ori)

Các kĩ thuật di truyền liên quan rất nhiều đến E coli mà Ti-plasmid thiếu điểm khởi đầu sao chép trong E coli Do đó, cần thiết kế thêm điểm khởi đầu sao chép để Ti-plasmid vừa có thể tự sao chép trong E coli và A

(3) Vùng cắt nối đa vị trí (Multi cloning site - MCS)

Trong vùng này chứa trình tự điểm cất của một số enzyme giới hạn

như: HindIII, SmaI, BamHI, SacI, XbaI, SphI, PstI, EcoRV,… Trong đó, trình

tự cắt của hai loại enzyme BamHI và SacI được thiết kế ở hai đầu ở gen gus

được quan tâm sử dụng trong nội dung nghiên cứu này Vì vậy, khi cắt vector pBI121 bằng hai loại enzyme trên chúng ta sẽ thu được hai băng có kích thước tương ứng khoảng 11,2 kb (vector) và khoảng 1,8 kb (gen Gus) Khi thiết kế vector chuyển gen, gen mục tiêu sẽ được gắn thay thế cho vị trí của gen Gus trong vector [4]

(4) Vùng kết thúc (terminator)

Vùng kết thúc (vùng 3’) của các gen có các trình tự đặc trưng riêng Vùng 3’ bao gồm các trình tự cho phép RNA polymerase nhận biết dấu hiệu ngừng phiên mã, và các trình tự kết thúc một gen để phân biệt gen này với

gen khác Các đoạn kết thúc thường có đuôi poly A như: AATTAA hoặc AACCAA [11]

(5) Gen chỉ thị

Các gen chỉ thị trong chuyển gen thực vật thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại như sau:

- Gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene): Các gen có nguồn gốc

từ plasmid của vi khuẩn, gen mã hóa cho các enzyme phân hủy kháng sinh

hoặc các chất chọn lọc đặc hiệu Ở vector pBI121 chứa gen nptII (neomycine

phospho transferase gene) được điều khiển bởi đoạn khởi động NOS promoter, do đó chỉ có những thể biến nạp gen mới sống được trên môi trường có bổ sung thêm kháng sinh kanamycin Việc sử dụng gen chỉ thị cần

có một số yêu cầu: chất chọn lọc ức chế sinh trưởng của các tế bào không được biến nạp, đồng thời sự biểu hiện của gen chọn lọc không làm ảnh hưởng tới trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp gen [11]

- Gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker gene hoặc reporter gene) cần

có một số đặc điểm như: sản phẩm chỉ thị là duy nhất và không độc với tế bào thực vật, các enzyme chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptide ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzyme Ví dụ, chỉ thị glucuronidase (gus) cho phép sàng lọc hoạt tính enzyme dễ dàng trên cơ sở

kĩ thuật nhuộm tế bào với dung dịch X-gluc Tế bào, mô chuyển gen sẽ có mầu xanh đặc trưng [11]

Promoter 35S hoạt động mạnh trong vector biểu hiện gen cho phép dịch mã, tạo nhiều protein lai Các vị trí cắt đặc hiệu của enzyme giới hạn có vai trò cài gắn các gen quan tâm Các gen chỉ thị được gắn vào các vector chuyển gen góp phần sàng lọc để loại bỏ các mẫu biến nạp không mang gen chuyển Các gen chỉ thị này có thể là gen chọn lọc di truyền tức là những gen

mã hóa cho các loại enzyme có khả năng khử độc đối với các chất kháng sinh như: kanamycin, hygromycin, streptomycin, gentamycin,…hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta hoặc là các gen chỉ thị chọn lọc sinh hóa như gen gus -gen thông báo [10], [11]

1.3.4 Gen OPHC2

Trong sản xuất nông nghiệp, việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật góp phần tăng năng suất cây trồng Tuy nhiên việc sử dụng nó gây nguy hiểm cho chính con người và các loài động vật không gây hại khác trong cùng khu vực canh tác Thuốc trừ sâu được phun xịt trên đồng ruộng sau khi trừ được sâu hại nếu bị phân hủy hết thì sẽ đem lại lợi ích môi sinh to lớn cho toàn nhân loại

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy ở một số nhóm vi khuẩn trong đất

có khả năng tiết ra enzyme phân hủy thuốc trừ sâu lân hữu cơ dạng OP Việc phân lập và tách dòng, đọc trình tự gen này đã được các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học hàn lâm Trung Quốc đã phân lập

được từ các chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1 tại các hồ chứa

nước bị ô nhiễm Từ chủng vi khuẩn này các nhà khoa học đã phân lập được gen OPHC2 có kích thước 906bp, mã hóa cho 301aa Gen OPHC2 đã được công bố trên ngân hàng Genbank của NCBI mang mã số AJ605330 [42]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E coli DH5α, chủng vi khuẩn

A tumefaciens Cv58A1 do phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp

Các vector: Các vector được sử dụng trong quá trình nghiên cứu có tên

Epochlifescience (Mỹ), có trình tự nhận biết của 2 cặp enzyme là NotI/NcoI và

BamHI/SacI nằm ở vị trí 2 đầu gen OPHC2opt (phụ lục 3)

- Vector chuyển gen pBI121 chứa 2 trình tự nhận biết BamHI/SacI nằm 2

đầu gen Gus Hai trình tự nhận biết này cũng không xuất hiện trong gen OPHC2

thuận lợi cho việc sử dụng pBI121 để thiết kế vector chuyển gen (phụ lục 2)

Các enzyme:

- Enzyme DNA Taq polymerase do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam cung cấp

- Các enzyme giới hạn (BamHI, SacI), enzyme T4 ligase của hãng Fermentas

Môi trường: môi trường nuôi vi khuẩn LB, các loại môi trường nuôi

cấy mô tế bào thực vật: MS, GM, RM, (phụ lục 1)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị

Hóa chất:

- Hai cặp mồi NcoI-OPHC2-F/NotI-OPHC2-R và OPHC2-F/OPHC2-R nhân

đoạn gen mã hóa OPHC2opt được tổng hợp tại công ty Epochlifescience (Mỹ)

- Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ)

- Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction)

- Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN)

- Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn 1Kb, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol, ) và các hóa chất cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB), môi trường nuôi cấy thực vật (MS, GM, RM) (thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1) Các loại kháng sinh như: kanamycin, rifamycin, cefotaxim, carbenicillin đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng như: New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ)

(Bio-System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), bể ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện (Gel Pluser), máy vortex, cùng các trang thiết bị khác của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình chuẩn bị cấu trúc gen OPHC2opt

Hình 2.1 minh họa tóm tắt quá trình thí nghiệm thiết kế cấu trúc chuyển gen OPHC2opt