Phân lập và tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axit Lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực th

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, với xu hướng đa dạng và sản xuất hàng hoá ngành chăn nuôi trong phạm vi của cả nước nói chung đã có những bước phát triển khá mạnh Cho đến nay, các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56] Tuy nhiên, cùng với sự phát triển chăn nuôi thì dịch bệnh ở vật nuôi cũng phát sinh và phát triển, đặc biệt là bệnh đường ruột làm tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và là nguồn nhiễm tiềm tàng cho các sản phẩm, gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng

Với phát hiện khoa học về hoạt chất có khả năng kháng khuẩn của Alex Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đã mở ra một kỷ nguyên mới trong điều trị các bệnh truyền nhiễm và nhanh chóng đã được áp dụng ở thế giới Ngoài ra, kháng sinh còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ những năm 1950 của thế kỷ 20 [56] Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cho vật nuôi đã nảy sinh ra tính kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh và tồn dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Chính vì vậy, nên nhu cầu tìm ra các giải pháp nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi là vấn đề ngày càng trở nên cấp bách [37]

Trong tự nhiên quá trình cạnh tranh sinh học xảy ra thường xuyên giữa các loài sinh vật với nhau dẫn tới các sinh vật yếu hơn bị giảm số lượng hoặc là sẽ bị tiêu diệt trong khu vực cư trú [20], [45] Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi [29]

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo

probiotics Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường

tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và sản phẩm lên men, Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axít lactic rất cao là tiềm năng để sản xuất probiotics [42]

Các sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta hiện nay còn hạn chế, do vậy ngành chăn nuôi đang sử dụng phần lớn các sản phẩm probiotic nhập khẩu Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa được khẳng định rõ ràng Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa Mặt khác, các nghiên cứu chế tạo probiotics dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập,

tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các

sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn

được một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao, chống chịu tốt trong các điều kiện in vitro làm cơ sở cho việc chế tạo probiotic dùng trong chăn nuôi

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập các chủng Lactobacillus

- Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng Lactobacillus phân lập được

- Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập được trong điều kiện in vitro

- Phân loại một số chủng Lactobacillus phân lập được

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở cho việc lựa chọn một số chủng vi khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ

Eubacteriales Nhóm này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý

chúng tương đối đồng nhất Tất cả đều có đặc điểm chung là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển hóa hydrat cacbon và sinh ra axít lactic Khác với một số vi khuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra axít lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa các cytocrom và enzyme catalaza, sinh trưởng tùy tiện Hình dạng tế bào của vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài khác nhau Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này phụ thuộc vào môi trường, thời gian và sự có mặt của oxy cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [12]

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Cacbon là thành tố chính trong hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như glucose, fructose, manose, galactose; các loại đường đôi như saccarose, lactose, maltose cho đến các polysaccarit như tinh bột, dextrin

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu

trúc tế bào và sinh ra các axít hữu cơ như axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic

Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm có thể sử dụng các axít gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axít axetic và

axít lactic như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae

Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axít amin như axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2 Các loại vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau

và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các

quá trình xử lý sau này Khả năng sống sót của L bulgaricus trong và sau sấy

đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỉ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần

quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12]

1.1.2.2 Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ

Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống tất cả các sinh vật Những vật chất cơ bản của tế bào như protein, axít nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiểu axít amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình Axít amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic

có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ có từ nguồn nitơ vô cơ như L helveticus

chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axít amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn

nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu quả sản

xuất Trong đó nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều [12]

1.1.2.3 Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự

sinh trưởng Axít nicotinic và axít pantotenic rất cần cho sự sinh trưởng của tất cả các loài vi khuẩn lactic Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt

độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [12], [32]

1.1.2.4 Các chất hữu cơ khác cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

Axít axetic và axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Axetat có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Axetat được dung làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Một loại axít hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axít oleic, một dẫn xuất của axít oleic được sự dụng là Tween 80 trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic Một vài loài vi

khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần axít

béo không no cho sự phát triển [12], [50]

1.1.2.5 Nhu cầu về các muối khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magiê Đặc biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần thiết cho

quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với Lactobacillus thì mangan, magiê

và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [12], [45]

1.1.3 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s [21] Lactobacillus được phân

loại như sau:

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Eubacteriales

Họ: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus

Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic gồm một số

giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram

dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axít lactic

Giống Lactobacillus rất đa dạng Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá

bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình que và khả năng tạo ra axít lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu Bên cạnh

đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm khi di động Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que,

với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, đôi khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành

dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi

trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu Những

tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy saccharose Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose [25]

Về nhu cầu ôxy, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có ôxy Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO2 [22]

Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt

Chúng phát triển tốt trong môi trường nhiều phức chất Nhiệt độ phát triển tối ưu

của chúng là 30-400C, nhưng cũng có thể sinh trưởng trong phạm vi từ 5-530C Chúng có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axít, pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5-5,8 nhưng nhìn chung có thể sinh trưởng ở pH 5 [12]

1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic

1.1.4.1 Ảnh hưởng của oxy

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, không có hệ enzyme hô hấp xitocrom cũng như hệ catalaza Tuy vậy, chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều

hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit)

Các nghiên cứu cho thấy, một số chất trong môi trường chỉ có thể được sử

dụng khi có mặt oxy Chẳng hạn Pediococcus sp và L plantarum có thể đồng hóa được glyxerin trong điều kiện hiếu khí Một số loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase L brevis và L buchneri

phát triển tốt ở 30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC chủng chỉ phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện Hiện tượng tương tự cũng gặp

ở một số chủng thuộc loài S pyogenes Các nghiên cứu cho thấy, hệ enzyme

peroxylase có trong vi khẩn lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm tlợn việc tạo thành H2O2 Đồng thời

một số vi khuẩn lactic (S brevis, L mesenteroides) có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia cùng một số chất oxy hóa Như vậy, vi khuẩn lactic

có hệ peroxydase sử dụng NADH2 làm chất nhận điện tử và phân giải H2O2 Phương trình phản ứng như sau:

NADH2 + H+ + H2O2 → NAD+ + 2H2O Trong điều kiện hiếu khí, năng lượng sinh ra cũng lớn hơn rất nhiều so với trong điều kiện yếm khí (hơn 20 lần khi cùng phân hủy 1 mol glucose) Quan hệ với oxy giữa các loài vi khuẩn khác nhau có sự khác nhau Trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt, các trực khuẩn lên men dị hình chậm sinh trưởng Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên men arabinoase đạt tối ưu trong điều kiện kị khí, còn các loài khác không sử dụng được pentose lại sinh trưởng rất kém trong điều kiện này Trong quá trình lên men lactic, lượng oxy vượt quá giới hạn sẽ làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, do vậy quá trình tạo thành axít lactic không xảy

ra Trong quá trình lên men bảo quản các loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá, thịt,…), các vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường được sử dụng,

nhất là trong bảo quản bằng bao gói chân không Hình thức bảo quản này, một mặt tránh sự oxy hóa các sản phẩm, mặt khác tránh sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm Trường hợp này vi khuẩn lactic sẽ ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ các sản phẩm trao đổi chất của nó [12], [18]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khẩn lactic [12]

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn khá rộng, một số loài có thể sinh trưởng

ở 55oC trong khi một số khác có thể sinh trưởng được ở 50C Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ từ 15 – 400C (Bảng 1.1)

1.1.4.3 Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng, chịu tác động mạnh của sự thay đổi pH môi trường Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt tính sinh học cao nhất

Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp của các chi vi khuẩn lactic [12]

- 6,5 Giá trị pH thấp nhất mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác

nhau Chẳng hạn Lactobacillus chịu được pH = 3,2 - 3,5, Pediococcus chịu được

pH = 3,2 - 3,5 trong khi đó, Leuconostoc chịu được pH = 5,0 (Bảng 1.2) Trong quá

trình lên men lactic, axít lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các hoạt động của

vi sinh vật khác Sau đó, khi lượng axít tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, sự axít hóa tế bào chất gây ra do sự tích lũy nội bào axít lactic [12]

1.1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất của vi khuẩn Với nồng độ NaCl lớn hơn hoặc bằng 5%, sự sinh trưởng của phần lớn các chủng vi khuẩn lactic

bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi khuẩn lactic tăng, đồng thời ức chế hoạt tính enzyme của tế bào Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với NaCl hơn vi khuẩn Gram dương, nguyên nhân là do các enzyme của vi khẩn bị ức chế bởi ion Cl- Một số chủng P

pentosaceus sinh trưởng ở nồng độ NaCl 9-10% [12], [45]

1.1.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axít lactic Nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng axít sinh ra càng nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng tế bào vi khuẩn lactic do

đó giảm axít lactic tạo ra [12], [18]

1.1.5 Lên men lactic ở Lactobacillus

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axít lactic nhờ vi sinh

vật, điển hình là vi khuẩn lactic Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại

đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp

và tinh bột Sự phát triển của chúng cần có sự có mặt của peptone, axít amin hay

muối amôn Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu

vitamin, axít amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axít pH từ 5,5÷6, khi pH 5,5 quá trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích

hợp cho quá trình lên men từ 15÷500C Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn

Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì

sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa Sau đó phân tử đường này sẽ đi vào các chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là axít lactic, axít axetic, CO2…

Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra làm hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình [5], [18]

1.1.6 Sự phân bố vi khuẩn Lactobacillus trong tự nhiên

Lactobacillus phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các

sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các

sản phẩm chế biến từ sữa và rượu bia Người ta có thể tìm thấy Lactobacillus ở cả động vật và thực vật Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo [12].

1.2 Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus

1.2.1 Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh

Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất ức chế với cả vi khuẩn Gram

dương, Gram âm, kể cả nấm và có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm các axít hữu cơ, hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin [34], [40]

Axít hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản sinh bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, axít probionic Một vài vi khuẩn

chi Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển của E coli, M luteus,

Salmonella typhi và Shigella flexneri bằng cách sinh ra ra axít lactic [8] Cả axít

lactic và axít axetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác [40]

Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacteriocin, một loại protein

có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN

và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Bacteriocin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn

gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio, Campylobacter, Shigella, Clostridium, Candida

albicans, và một số virus khác [40]

1.2.2 Khả năng chịu mặn

Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố

đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này chế tạo chế phẩm sử dụng cho

nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau Một số chủng Lactobacillus đã được

biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ

3,1‰ tới 3,8‰ của nước biển như L amylovorus DCE 471 có thể tồn tại và sinh ra

bacteriocin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl [41]

1.2.3 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa

Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với

khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản như môi trường axít HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch tụy, dịch mật [50]

Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và các nguồn

dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại Một số chủng Lactobacillus có khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã được phân lập như: L curvatus, L

reuteri, L plantarum, L parapentarum, L pentosus, L keferi, L fermentum, L animalis, L mucosae, L Aviaries, L hilgardii, và L Panis [50], [54]

1.3 Probiotic

1.3.1 Định nghĩa probiotic

“ Probiotic là chất trợ sinh học gồm các vi sinh vật sống khi đưa vào đường tiêu hóa với một lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe” [28] Trái với kháng sinh,

“Probiotic” là các chất do vi khuẩn tiết ra có tác dụng kích thích sự phát triển các vi khuẩn có lợi khác (Kollath, 1953, là người đầu tiên đưa ra từ này)

Probiotic là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống Probiotic được định nghĩa lần đầu tiên bởi Parker (1974) “là những sinh vật và các chất giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Năm 1989, Fuller [29] đã định nghĩa lại probiotic: “là những vi sinh vật sống khi bổ sung vào thức ăn, chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách

tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Bifidobacteria và Lactobacilli là những chi được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất probiotic Nấm men (Saccharomyces

cerevisiae), một vài chủng Bacilllus spp cũng đã được sử dụng như một probiotic

Đến năm 1992, probiotic được Havenaar và Huis Int Veld định nghĩa là: “Probiotic

là một hoặc sự kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột” Nhóm các nhà khoa học làm việc tại Châu Âu thuộc Viện Khoa học quốc tế năm 1998 đã định nghĩa probiotic là vi sinh vật sống

bổ sung vào thức ăn tác động có lợi đến vật chủ” Theo Tổ chức Thực phẩm, Nông nghiệp và Sức khỏe thế giới cho rằng “probiotic là những vi sinh vật sống khi sử dụng một lượng đầy đủ sẽ mang lại sức khỏe tốt cho vật chủ” [39]

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser một bác sỹ người Pháp năm 1900 đã quan sát và thấy phân của những trẻ

em mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [30]

Sau đó, đến năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã

chứng minh rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh

vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-đắc

ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và có thể sống tới 115 tuổi hoặc hơn Nguyên nhân có thể do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này đã được Ông

mô tả trong sách “Kéo dài cuộc sống” [30]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [29]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota đã phân lập được các

vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh Cùng năm đó, các nhà

nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm

giảm bệnh táo bón thường xuyên Nhiều nhà khoa học của đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sinh ra được Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là có khả năng hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung probiotic được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [29]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

đã được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến khắp nơi trên thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

1.3.3 Vai trò của probiotic

Cho đến nay, vẫn còn có ít tài liệu chứng minh được việc bổ sung probiotic

có thể thay thế hoàn toàn quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đường ruột Tuy nhiên, người ta hy vọng rằng probiotic có thể hình thành những tập đoàn vi khuẩn có lợi,

có thể hỗ trợ cho cơ thể động vật mà vẫn duy trì được những chức năng như những VSV đường ruột tự nhiên (trong trường hợp tập đoàn vi sinh vật tự nhiên này bị suy yếu và phải sau một thời gian mới hồi phục được) Từ đó, probiotic được xem như

là yếu tố điều hoà cho hệ sinh thái nội quan Một vài tác dụng có lợi của probiotic được liệt kê dưới đây:

- Điều hoà trường hợp không dung nạp lactose: có những cá thể không dung nạp được lactose, nhưng nhờ chủng vi khuẩn tích cực có trong probiotic giúp cơ thể chịu đựng được lactose tốt hơn

- Đề phòng được ung thư kết tràng: một số chủng vi khuẩn lactic có tác dụng kháng chất gây đột biến, có khả năng đính vào các amin khác vòng và các chất gây ung thư, thấy rõ ở loài gặm nhấm Đối với người, có những chủng có tác dụng kháng ung thư do giảm hoạt tính enzyme β-glucuronidase (enzyme xúc tác hình thành chất gây ung thư đường ruột)

- Làm giảm cholesterol: nhiều chủng lactic làm giảm cholesterol huyết thanh ở động vật bằng cách phân ly mật trong ruột, nhờ đó ức chế quá trình tái hấp thu mật (mật vào trong máu có vai trò như cholesterol)

- Cải thiện chức phận miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng: các vi khuẩn lactic có thể ngăn ngừa những mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh (cạnh tranh sinh trưởng)

- Giảm viêm: probiotic có các vi khuẩn lactic điều hoà được quá trình viêm và những đáp ứng quá mẫn nhờ điều hoà chức năng cytokin, ngăn ngừa tái phát viêm ruột

- Cải thiện hấp thu khoáng: vi khuẩn lactic trong probiotic có thể vô hiệu hoá chứng suy hấp thu các khoáng vi lượng

- Vi khuẩn trong probiotic có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn gây bệnh viêm ruột (đặc biệt đối với bệnh viêm ruột hoại tử ở gà) [1], [44]

1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic

Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn

có nhiều ý kiến khác nhau Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [7], [14]

1.3.4.1 Probiotic sản sinh các chất ức chế

Sự có mặt của các vi khuẩn sản sinh các chất ức chế trong ruột của vật chủ, trên bề mặt hoặc trong môi trường nuôi đã tạo ra một rào ngăn chặn sự sinh sôi của các tác nhân gây bệnh cơ hội Các chất diệt khuẩn hay ức chế hoạt động của vi khuẩn gây bệnh do vi khuẩn probiotic sinh ra có thể tác động đơn độc hoặc phối hợp với nhau bao gồm: các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophores, lysozyme, protease, hydro peroxit và các axít hữu cơ (làm biến đổi độ pH) Ngoài ra, gần đây amoni và diaxetyl cũng được đưa thêm vào danh sách này Các nhà vi sinh học đã cho biết:

Lactobacillus spp có thể sản sinh bacterocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi

khuẩn khác (chủ yếu là vi khuẩn Gram dương) Các vi khuẩn biển sản sinh enzyme

phân giải vi khuẩn chống lại Vibrio parahaemolyticus Alteromonas sp dòng

B-10-31 phân lập từ nước biển gần bờ biển của Nhật Bản sản sinh monastatin có tác dụng

ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V anguillarum [7], [14]

1.3.4.2 Cạnh tranh hóa chất/năng lượng với những vi khuẩn khác

Tất cả các vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng Siderophore là chất có khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với các ion sắt Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật, do đó nó là một công cụ

chuyển hóa sắt rất quan trọng đối với các vi sinh vật Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể được sử dụng như probiotic để cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại Bản thân vi khuẩn có hại bị loại bỏ thì cũng có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn

probiotic và cho vật chủ Sử dụng Pseudomonas fluorescens như probiotic trong nuôi cá hồi nước ngọt và cá hồi đại dương có tác dụng hạn chế A salmonicida

theo cơ chế này [7], [14]

1.3.4.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại

Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cạnh tranh giành vị trí bám trên niêm mạc ruột hay trên bề mặt các mô khác Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào fimbritae bám dính của vi khuẩn và các phân tử thụ thể của thượng bì ruột) và cơ chế không đặc trưng dựa vào những yếu tố hóa lý học Người ta đã chứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột hoặc niêm

mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này cạnh tranh vượt

trội và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V

anguillarum và A hydrophila [7], [14]

1.3.4.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh Chất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ Trong thực nghiệm, người ta thấy động vật thí nghiệm được

bổ sung vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột khá

rõ rệt Tôm không có khả năng tạo kháng thể vì không có đáp ứng miễn dịch thể dịch Probiotic có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên [7], [14]

1.3.5 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật sử dụng chế tạo probiotic tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng tồn tại

và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa

chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro qua đó người ta sẽ

tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic [7], [30]

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn

gây bệnh như E coli, Salmonella và Campylobacteria Hoạt tính kháng khuẩn

của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất bacteriocin

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axít lactic

+ Tạo ra H2O2

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

- Khả năng tồn tại trong môi trường axít dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axít pH từ 2-3 và có mặt các enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lysozyme…) Các chủng vi sinh vật được coi là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này Hiện nay, các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsule) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày

- Khả năng chịu muối mật: thông thường, muối mật trong ruột của động vật trung bình là 0,3% [35] Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật trung bình khoảng 0,3%, ngoài ra

một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh

enzyme tiêu hóa như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

1.3.6 Các vi sinh vật probiotic

Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và

Bifidobacterium

Các loài thuộc chi Lactobacillus: L acidophilus, L amylovorus, L brevis, L

casei, L rhamnosus, L caucasicus, L crispatus, L delbrueckii, L bulgaricus, L fermentum, L gasseri, L helveticus, L johnsonii, L lactis, L leichmannii, L paracasei, L plantarum, L reuteri, L rhamnosu

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B adolescentis, B bifidum, B breve, B

infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum

Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus

và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces

boulardii, Saccharomyces cerevisiae [14]

1.3.7 Tính an toàn của probiotic trên động vật

Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm Các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật Điều này cho thấy yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường

Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh nhiễm khuẩn và các phản ứng phụ Ngoài ra, cần có những thông số phân tích sinh hóa về máu và

đánh giá chỉ số Coliform trong phân [19]

Đối với con người, cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng cần chú

ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt [19], [34] Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử dụng Tổ chức FAO (2002) [28] đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hóa các thông tin

về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài

Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập Ủy ban khoa học

về dinh dưỡng động vật đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm

và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật trực tuyến [48]

Tổ chức FAO [28] khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân

loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices)

1.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm [1], [30]

1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm

Lactobacillus được tìm thấy trong một số sản phẩm thực phẩm (sữa lên

men, rau củ lên men, phomat ) với vai trò bảo quản, cung cấp chất dinh dưỡng hoặc mùi vị cho sản phẩm Trong các sản phẩm từ sữa, chúng có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với các vi khuẩn lactic khác Sữa acidophilus là một ví

dụ điển hình về các sản phẩm lên men từ sữa này với sự tham gia của L

acidophilus Ngoài ra, sự kết hợp L bulgaricus với Streptococcus thermophilus

có thể tạo nên sản phẩm sữa chua [1]

Rau củ lên men là một món ăn phổ biến của nhiều nước trên thế giới như: dưa cải chua, dưa cải bắp và nhiều loại rau củ lên men khác là những món ăn thường ngày trong các gia đình ở Việt Nam; Kimchi là một sản phẩm lên men lactic khác của hơn 100 loại rau củ và là một món ăn truyền thống nổi tiếng của Hàn

Quốc… Trong quá trình muối chua rau củ, các vi khuẩn Lactobacillus trong rau củ

tươi tạo ra một lượng axít lactic đáng kể góp phần làm chua rau củ và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm [30], [48]

Ngoài ra, Lactobacillus còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm bánh

mì Nhiều loài Lactobacillus được tìm thấy trong bột chua làm bánh mì gồm: L

acidophilus, L farciminis, L casei, L plantarum, L rhammosus, L brevis, L sanfrancisco và L fermentum Vi khuẩn lactic được sử dụng như một chất bảo

quản sinh học vì một số sản phẩm trao đổi chất của các vi khuẩn lactic có hiệu quả kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít béo, hydrogen peroxide, diacetyl… người ta đặc biệt chú ý đến các bacterioxin, là các chất tạo bởi một số

vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh như: Listeria,

Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus… Do đó các bacterioxin

được nhận định là có hiệu quả cao và an toàn trong quá trình bảo quản các loại

thực phẩm Các nhà nghiên cứu nhận thấy Lactobacillus là một trong những vi

khuẩn lactic có khả năng tạo ra nhiều loại bacterioxin Các bacterioxin của

Lactobacillus có thể đưa vào thực phẩm để ngăn chặn sự phát triển của nhiều

loài vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh [48]

1.4.2 Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axít lactic Axít lactic là axít hữu cơ đầu tiên được sản xuất bởi vi sinh vật vào năm 1880 Có vị chua dễ chịu và

có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng được dùng để axít hóa rượu vang và hoa quả nghèo axít, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo

Người ta có thể sử dụng các loài Lactobacillus lên men tự nhiên các loại cơ chất khác nhau để tạo ra axít lactic, như: L bulgaricus có thể tạo ra axít lactic bằng cách

lên men nước sữa (whey) Axít lactic là một trong những axít hữu cơ được dùng đầu tiên trong thực phẩm Axít lactic được sử dụng theo một số cách như dùng trong đóng gói ô liu Tây Ban Nha nhằm ngăn chặn sự hư hỏng và sự lên men, giúp bảo quản bột trứng khô, cải thiện vị của dưa chua khi thêm vào giấm, làm chua nước ép trái cây trong quá trình làm rượu vang… [1], [58]

1.4.3 Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm

gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây

yếu và là cơ hội gây bệnh cho cây trồng Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [37]

1.4.4 Trong chăn nuôi thú y

Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường

ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn

chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trưởng ở thú nuôi Ngoài ra, người ta còn dùng L casei và L plantarium để ủ

rơm, rau, cỏ cho gia súc ăn Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra một

số sản phẩm có giá trị như vitamin, chất thơm, kháng sinh làm cho thức ăn gia súc ủ chua có giá trị dinh dưỡng cao làm tăng năng suất vật nuôi [37], [58]

1.4.5 Probiotic

Ngày nay, vai trò probiotic của Lactobacillus trong các loại thực phẩm và dược phẩm rất được quan tâm Nhiều chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic

đã được nghiên cứu gồm : L acidophilus NCFM, L acidophilus DDS-1,

L.acidophilus SBT-2062, L acidophilus LA-1 và L.acidophilus LA-5, L casei

Shirota (Yakult, Nhật), L casei immunitas (Danone, Pháp), L fermentum RC-14 (Urex Biotech, Canada), L Johnsonii LA1 và L Johnsonii Lj1 (Neestle, Thụy Sĩ), L paracasei CRL 431 (Chr Hansem, Inc.), L plantarum 299V (Probi AB,

Thụy Điển) Bên cạnh đó, nhiều lợi ích liên quan đến sức khỏe của các chủng

Lactobacillus cũng đã và đang được công bố như: tăng cường khả năng miễn

dịch, ngăn ngừa rối loạn đường ruột, giảm tiêu chảy do virus Trong thực tế,

phần lớn các chủng Lactobacillus cho thấy có khả năng sống trong đường ruột

và tạo nên những tác động tích cực lên hệ vi sinh vật đường ruột, kể cả việc ngăn chặn sự tồn tại của các vi khuẩn gây bệnh và làm giảm bệnh lý của một số bệnh

Khả năng định cư của Lactobacillus có tác dụng kìm hãm sự phát triển của

các vi sinh vật gây bệnh Sự kìm hãm được thực hiện theo những phương thức sau:

cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản sinh ra độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axít béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [29]

1.5 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật tới sức khỏe vật chủ

Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa của động vật còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch trong cơ thể, do là hệ thống bảo

vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Thêm vào các cơ chế bảo vệ chung, hệ thống miễn dịch với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hóa của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi vật nuôi được sinh ra các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hóa [27] Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên Số lượng

tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần

số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 CFU/ml chất chứa tương ứng) [7]

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính là: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi cả một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ sau một thời gian rất ngắn sau khi sinh [7], [27]

Có nhiều ý kiến khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia thành 3 nhóm: (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí

(Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và

Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các

nhóm trên dao động trong khoảng tương ứng là 90; 1,0 và 0,01% Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ) Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải khi các chất chuyển hóa Đổi lại, hệ

vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý… đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzyme, chất đệm và chất nhầy…) cũng như kiểu và tần số của đường ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật Kiểu

và tần số của đường ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển…) Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”) Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể trạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử…(tóm tắt trạng thái eubiosis

và dysbiosis có trong bảng 2.1) Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật

ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng

Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn một cách không có kiểm soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi Chính vì vậy, từ năm 2006 các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress Để vượt qua những thử thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân vừa để thay thế kháng sinh, vừa an toàn với vật nuôi Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic [27], [28]

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.6.1 Trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các đặc tính probiotic của các chủng

Lactobacillus làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ cho con người

và các động vật

Năm 2008, Srikanjana Klayraung và cs đã nghiên cứu về khả năng chống

chịu của 2 chủng lactic là Lactobacillus oris và Lactobacillus fermentum ở ngưỡng pH=3, nồng độ muối mật 0,3% và khả năng kháng khuẩn gây bệnh (như Salmonella

thyphimurium, Escherichia coli) [50]

Trong năm 2010, cũng có nhiều nghiên cứu liên quan đến vấn đề này trong đó có

thể kể đến là nghiên cứu của Hoque và cs đã cho thấy Lactobacillus spp có khả năng

chống chịu với các nồng độ NaCl (1% - 9%), muối mật (0,05% - 0,1% - 0,15% - 0,3%),

có khả năng chống chịu ở pH khác nhau (2,2 và 6,6) và mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh (như amoxicillin, gentamicin, tetracyclines, clindamicins, kanamycin, axít nalidixic, metronidazole, azithromicin và cefradine) [35]

Nghiên cứu của Tambekar và cs cũng đã chỉ ra rằng Lactobacillus sp có khả

năng chống chịu trong môi trường axít (pH= 2, 3, 4, 5), trong môi trường muối mật

(0,5%; 1%; 1,5%; và 2%), có khả năng kháng khuẩn tốt (với Enterobacter aerogenes,

Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhi và Shigella flexneri) và mẫn

cảm với nhiều loại kháng sinh (như ampicillin, cephalothin, co-trimoxazole, gentamicin, axít nalidixic, nitrofurantoin, norfloxacin và tetracycline) [51]

Nghiên cứu của Xiao-Hua Guo và cs đã cho thấy Lactobacillus có khả năng kháng khuẩn (với E coli, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus),

chống chịu ở ngưỡng pH axít (pH = 2 và pH= 3) và đặc biệt giữa các chủng lựa chọn không có sự đối kháng lẫn nhau [52] Đồng quan điểm với Xiao-Hua Guo nghiên cứu của Sameh H.M và cs cũng đề cập đến sự kháng khuẩn của

Lactobacillus acidophilus và khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng này trong

các điều kiện như: ở pH=1, 2 và 3; ở nhiệt độ là 37oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC và

60oC; ở nồng độ muối mật là 1%, 2% và 4% [47] Năm 2011, nghiên cứu của

Sahadeva và cs sự đã chỉ ra một số đặc tính probitoic của chủng Lactobacillus như

khả năng sống sót ở pH thấp (1,5 – 3 – 7,2 (đối chứng) và trong dịch mật (0% - 0,3% và 2%) [49]

1.6.2 Ở Việt Nam

Hiện nay, việc nghiên cứu chế phẩm probitoic ngày càng trở nên phổ biến

ở Việt Nam Lê Hoàng Bảo Vi và cs đã nghiên cứu thành công các chủng

Lactobacillus, Bacillus, Aspergillus, Saccharomyces mang đặc tính probiotic

được đề cập đó là: sự đề kháng với kháng sinh; khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ,

pH, NaCl tới khả năng tăng trưởng của vi khuẩn; xác định khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp; xác định độ kháng khuẩn; xác định vi sinh vật gây bệnh Dựa trên sự nghiên cứu này tạo cơ sở sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong thức

ăn chăn nuôi [16]

Nghiên cứu của Mai Thị Đàm Linh và cs; Nguyễn Thúy Hương và cs đã chỉ

ra rằng bằng việc ra bacteriocin chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng được

nhiều vi khuẩn gây bệnh như Bacillus sp., E coli, [6], [8]

Hồ Trung Thông và cs đã đánh giá khả năng sống của các chủng vi sinh vật

trong đường tiêu hóa ở điều kiện in vitro bao gồm các điều kiện như khả năng sống

trong môi trường có pH thấp, trong môi trường có pepsine, trong môi trường pancreatine và trong môi trường có muối mật 0,3% [15]

Trần Quốc Việt và cs đã cho thấy chủng vi sinh vật (vi khuẩn lactic và nấm men) có khả năng chịu nhiệt (300

C; 370C; 450C; 550C), khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau (2,2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối mật khác nhau (0,2%; 0,5%; 1%;1,5%; 2%; 3%) [17]

Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ in vitro của một số

chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic” của Hồ Lê Quỳnh Châu và cs

đã đề cập đến khả năng bám dính của 9 chủng vi sinh vật (B pumilus N1, B

pumilus B2/1, B clausii B1, B clausii B2/2, L suntoryeus LII1, E faecium LII3/1,

B subtilis LII4, L casei LII5/1 và nấm men S cerevisiae LA5) và khả năng đối

kháng giữa vi sinh vật thử nghiệm với vi khuẩn gây bệnh [2]

Đào Thị Lương và cs đã nghiên cứu được khả năng sinh axít lactic, kháng

khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn lactic (E coli, M luteus, Salmonella typhi và Shigella

flexneri) và khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn [9]

Ngô Thị Phương Dung và cs đã cho thấy Lactobacillus acidophilus có khả năng sinh bacteriocin kháng lại vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis [3]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các sản phẩm lên men được thu thập ở khu vực thành phố Thái Nguyên

- Hai chủng vi khuẩn G (+): Staphylococcus aureus ATCC 25923 do Viện Kiểm nghiệm – Bộ Y tế và Bacillus subtilis VTCC-B-888 do Viện Bảo tàng giống chuẩn

VSV Việt Nam cung cấp

- Hai chủng vi khuẩn G (-): Escherichia coli VTCC-B-883 và Pseudomonas

aeruginosa VTCC-B-481 do Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam cung cấp

2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.2.1 Hóa chất

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Xuất xứ Tên hóa chất Xuất xứ

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ

máy soi gel

Bio-Rad, Mỹ

Các dụng cụ khác được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: micropipette 100µl, 100-1000µl, đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống eppendorf, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, giá eppendorf…

10-2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

Các mẫu lên men được thu thập với khối lượng khoảng 200g/mẫu cho vào túi nilon vô trùng (với mẫu rắn); 100ml/mẫu (đối với mẫu lỏng) Mẫu thu thập cần ghi đủ các thông tin: tên mẫu, kí hiệu, ngày lấy, địa điểm, người lấy và đặc điểm của mẫu (màu, mùi, ) Các mẫu trên sau khi thu thập tiến hành phân lập ngay hoặc bảo quản ở

40C (không quá 24 giờ) [4], [35]

2.3.2 Phương pháp hoạt hóa mẫu

Pha môi trường MRS lỏng sau đó phân phối vào các bình tam giác vô trùng chứa 90ml môi trường, khử trùng ở 1210

C trong 15 phút Cân 10g (đối với mẫu ở dạng rắn) hoặc 10ml (đối với mẫu ở dạng lỏng) mẫu cho vào bình môi trường trong

tủ cấy vô trùng, nuôi lắc ở 370

C, 100 vòng/phút trong 24 giờ [4], [35]

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập

Tiến hành pha loãng mẫu bằng cách hút 100µl dịch hoạt hóa vào ống eppendoff chứa 900µl nước cất vô trùng lắc đều khoảng 30 giây được nồng độ pha loãng 10-1, tiếp tục tiến hành pha loãng mẫu cho đến nồng độ pha loãng thích hợp Hút 100µl ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp trang đĩa, mỗi nồng độ pha loãng trang ở

3 đĩa petri môi trường MRS Bao gói các đĩa sau khi đã trang nuôi ở 370C, 48 giờ

Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vòng trong suốt xung quanh (axít phân giải CaCO3 tạo vòng trong) Nhận dạng các khuẩn lạc này bằng đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram, phản

ứng catalase Các vi khuẩn thuộc nhóm Lactobacillus thì cấy chuyển sang đĩa petri

mới bằng phương pháp cấy ria để thuần giống Khi đã thuần ta tiến hành giữ giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng hoặc trong môi trường MRS lỏng

có bổ sung 40% glyxerol và bảo quản ở -800C [53]

2.3.4 Phương pháp thử nghiệm catalaza

Thuốc thử: dung dịch 3% H2O2 (hydrogen peroxide)

Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện

tử có xytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp.) Catalase thủy

phân H2O2 thành H2O và O2 (được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí)

Tiến hành: Dung dịch H2O2 3% cần được giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm photphate pH 7,0 Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên đĩa môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật thuần cần kiểm tra Ghi nhận

sự sủi bọt nếu có

Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra,

ngược lại là (-) khi không có sự sủi bọt khí Vi khuẩn Lactobacilllus sp cho phản

ứng catalase âm tính [53]

2.3.5 Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc: Nhuộm Gram có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phân loại

vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh

và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iốt bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iốt và làm cho vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc (đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím-iốt bị giữ lại bên trong tế bào

Tiến hành: Lấy một giọt nước cất vô trùng nhỏ lên lam kính Dùng que cấy vòng lấy mẫu Hòa mẫu vào giọt nước và dàn đều trên lam kính có đường kính khoảng 1-2cm Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút, rửa bằng nước Nhuộm tiếp bằng dung

dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước Tẩy màu bằng dung dịch etanol (etanol 95% - axeton 1:1) trong 30 giây Sau đó nhuộm tiếp bằng safranin trong 30 giây, rửa qua nước, thấm khô Nhỏ dầu lên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi điện tử

ở vật kính dầu 100X

Kết quả: Khi soi dưới kính hiển vi điện tử vi khuẩn Gram dương có màu tím,

vi khuẩn Gram âm có màu hồng [4]

Tiến hành: Sử dụng môi trường bán lỏng (MRS có bổ sung agar 8g/l) Môi trường được đun tan, phân phối thành dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 15 phút Các ống môi trường này được làm nguội

ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4-100C Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần Chủng được cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2/3 môi trường Các ống môi trường được ủ ở 370C trong 24-48h

Kết quả: Thử nghiệm là (+) vi khuẩn có khả năng di động khi vi sinh vật mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh; là (-) vi khuẩn không có khả năng di động khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong [4], [43]

2.3.7 Phương pháp định lượng vi khuẩn lactic [10]

Chọn các nồng độ pha loãng mà số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch không quá 150 khuẩn lạc Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp Từ đó tính toán giá trị khuẩn lạc trung bình

Tính kết quả:

Để xác định tổng số vi khuẩn lactic có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp Sự phân

bố các khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Tổng

số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml mẫu thử (N) được tính theo công thức sau:  C

N = -

Vx( n 1 + 0,1xn 2 )d

Trong đó:

 C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn

V : Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml

n1 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

n2 : Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất

2.3.8 Phương pháp định lượng axít lactic được sinh ra [11], [58]

Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 7 phút loại

bỏ sinh khối tế bào, bổ sung 20ml nước cất và thêm 2 giọt phenolphthalein Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây Xác định thể tích NaOH 0,1N (ml) đã sử dụng cho chuẩn độ Độ axít được tính bằng công thức sau:

% axít lactic = VNaOH x 0,009 (g/l)

(1 ml dung dịch NaOH tương đương 0,009g axít lactic)

2.4 Các phương pháp lựa chọn chủng Lactobacillus có tính chất probiotic 2.4.1 Phương pháp đánh giá khả năng tồn tại trong môi trường pH axít thấp và pH kiềm

Pha chế đệm PBS dạng lỏng và phân phối đồng đều ra 5 bình tam giác có dung tích 100ml, điều chỉnh pH dung dịch đệm ở ngưỡng 2; 3 và 8 bằng dung dịch HCl 30% và NaOH 1M Tiến hành khử trùng ở 1210C trong 15 phút

Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi lắc 250vòng/phút ở 370C trong 24h Thu dịch nuôi ly tâm thu cặn tế bào ở 9000vòng/phút trong 7 phút, rửa 2 lần bằng đệm PBS 7,2; bổ sung 200µl vào các bình tam giác có chứa đệm PBS có

pH lần lượt là 2; 3 và 8 lắc đều trong vòng 3 phút Thu dịch tiến hành đo OD600nm

và định lượng số lượng tế bào vi khuẩn lactic ở các thời điểm T0, T1,5, T3 tương ứng với các thời điểm 0h; 1,5h và 3h [49]

2.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng chống chịu trong muối mật

Bổ sung vào 100ml môi trường MRS với các nồng độ muối mật 0,3%, khử trùng ở 121o

C trong 15 phút Hút 1000µl dịch nuôi các chủng vi khuẩn lactic được hoạt hóa 24h vào các bình thí nghiệm ở các nồng độ muối mật khác nhau Đếm mật độ tế bào ở các thời điểm T0, T1, T2, T3, T4 thí nghiệm [35]

2.4.3 Phương pháp xác định khả năng ức chế các chủng kiểm định

Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus được xác định bằng

phương pháp đục lỗ thạch như sau: cấy trải 4 chủng vi khuẩn kiểm định trên môi trường MPA dạng thạch, sau đó tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ 100μl dịch nuôi cấy đã loại bỏ cặn tế bào của 4 chủng vi khuẩn lactic (dịch nuôi cấy đã được trung hòa về pH=7 bằng NaOH 0,1N) vào các lỗ đã đục, để ở 40C trong 6h, sau đó chuyển các đĩa thạch này sang 370C trong 24h Sau 24h, tiến hành đo vòng kháng khuẩn được hình thành [4], [15] Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

được tính bằng đường kính vòng vô khuẩn ∆D:

∆D = D – d (mm)

Trong đó: ∆D: đường kính thực của vòng vô khuẩn (mm)

D: Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (10 mm)

2.4.5 Phương pháp nghiên cứu tính kháng giữa các chủng Lactobacillus

Hoạt tính đối kháng giữa các chủng Lactobacillus được xác định theo phương pháp như sau: các chủng Lactobacillus sau khi hoạt hóa 24h, được cấy vạch

thành đường thẳng và giao nhau trên môi trường thạch MRS, nuôi ở 370C trong 24h Sau 24h nuôi ủ, tiến hành quan sát sự phát triển của vi khuẩn tại những vị trí

giao nhau của đường cấy giữa các chủng Các chủng được cho là không đối kháng khi sự phát triển của vi khuẩn tại điểm giao nhau giữa chúng vẫn tốt, tức là các

đường cấy phát triển thành các đường liền mạch không đứt đoạn [12], [52]

2.5 Phương pháp định danh Lactobacillus

2.5 1 Tách ADN của vi khuẩn lactic [46]

ADN tổng số của các chủng vi khuẩn được tách theo theo các bước sau:

1 Nuôi cấy 1 khuẩn lạc các chủng trong 5ml môi trường MRS trong 20-24 giờ, tốc

độ lắc 200 vòng/phút ở 370C

2 Hút 1,5-3ml dịch huyền phù tế bào, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

3 Loại bỏ dịch nổi phía trên, thu tế bào

4 Hòa tan tế bào trong 510µl đệm TE pH 8,0 (50mM Tris; 10mM EDTA, pH 8,0)

5 Bổ sung 60µl dung dịch EDTA 0,5M; pH 8,0

6 Thêm 5µl dung dịch protease K có nồng độ 20mg/ml trong đệm TE

7 Bổ sung 60µl dung dịch có nồng độ 50mg/ml trong đệm TE

8 Ủ hỗn hợp trên ở 650C trong 1-2 giờ

9 Sau đó, bổ sung 5µl protease K, 30µl SDS 10% (khối lượng/thể tích)

10 Thêm 110µl dung dịch NaCl có nồng độ 5M và 90µl dung dịch CTAB (CTAB 10%, NaCl 0,7mM)

11 Chiết ngay lập tức với 0,7ml dung dịch Chloroform : iso amyl alcohol (24:1)

12 Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy pha trên cùng vào ống eppendorf mới

13 Chiết 3 lần với 0,7ml phenol:chloroform:iso amyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ nhàng 20 phút/1lần chiết

14 Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và hút pha trên sang ống eppendorf mới

15 Kết tủa ADN tổng số của các chủng Lactobacillus với 500µl isopropyl alcohol

18 Rửa ADN tủa 2 lần với 0,5ml Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng (250C), ly tâm

10000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch

19 Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ

20 Hòa tan tủa trong 40µl đệm TE, pH 8,0; đảo nhẹ nhàng Bảo quản ADN tổng

số ở 40

C

2.5.2 Khuếch đại trình tự gen mã hóa ARNr 16S bằng phản ứng PCR

Trình tự gen ARNr 16S của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt:

60oC 60 giây

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% Kích thước của các đoạn ADN thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang ADN chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM–DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy máy đọc trình

tự tự động ABI PRISM®

3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Việt Nam

2.5.3 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

Chuẩn bị gel agarose:

- Cân bột agarose rồi hòa tan vào đệm TAE 1X để đạt nồng độ cần thiết

- Đun sôi cho tới khi tan hết, để dung dịch agarose nguội đến khoảng 500C thì đổ vào khuôn có cài sẵn lược

- Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút

- Nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X tới khi ngập mặt gel

Tra mẫu ADN vào giếng

- Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng

độ ADN cao thấp khác nhau

- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel Mẫu được trộn với loading dye 6X rồi được đưa vào giếng Chạy điện di bằng dòng một chiều với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di

Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide

- Khi băng màu bromophenol chạy được 2/3 bản gel agarose, ngừng chạy điện di và nhẹ nhàng gỡ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng

độ 0,5 µg/ml trong khoảng 10 phút rồi được rửa lại bằng nước

Quan sát và chụp ảnh

- Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát và chụp lại dưới ánh sáng tử ngoại (λ = 302nm)

2.5.4 Đọc trình tự gen mã hóa ARNr 16S

Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mềm phân tích ADN STAR (Lasergene Inc., Madison, WI, Mỹ), so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) Trình tự nucleotide của gen mã hóa ARNr 16S được phân tích và so sánh với trình tự nucleotide tương ứng lần lượt bằng công cụ Clustal-X (ver 1.83); Đánh giá mức độ tương đồng di truyền giữa các chủng vi khuẩn nghiên cứu với các chủng vi khuẩn khác được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11

2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử trên các phầm mềm: Excel; SPSS16.0; Annhyb, Clustal X, BioEdit, Treeview

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập các chủng Lactobacillus

Dựa vào đặc điểm Lactobacillus, chúng tôi đã sử dụng môi trường MRS bổ

sung CaCO3 0,5%, nuôi 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 370C, có 5% CO2 chỉ giữ lại các khuẩn lạc trên đĩa thạch xung quanh có vòng trong suốt Kết quả phân lập trình bày tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng Lactobacillus phân lập

Tên

mẫu

Ký hiệu

mẫu

Đặc điểm

Tên mẫu

Ký hiệu mẫu

Đặc điểm Nhuộm

Gram

Phản ứng catalaza

Di động

Nhuộm Gram

Phản ứng catalaza

Di động

Nem chua (Tân Thịnh)

Chú thích: +: dương tính, -: âm tính, ± không xác định

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy từ 10 sản phẩm lên men thu thập tại khu vực thành phố Thái Nguyên chúng tôi đã phân lập được 24 khuẩn lạc nghi ngờ thuộc chi

Lactobacillus Theo khóa phân loại của Bergey’s (1984) [21] mô tả vi khuẩn lactic

có khuẩn lạc hình tròn đều, Gam dương, có khả năng phân giải H2O2, không có khả năng di động, dựa vào đặc điểm này, chúng tôi đã tuyển chọn được 14 khuẩn lạc

mang đặc điểm của nhóm Lactobacillus/24 khuẩn lạc nghi ngờ

3.2 Kết quả định lƣợng axít lactic sinh ra từ các chủng phân lập

Từ 14 chủng vi khuẩn thuần khiết phân lập được, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng có khả năng sinh axít lactic cao Để xác định khả năng sinh axít, 14 chủng trên được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C theo phương pháp Therner Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Khả năng sinh axít lactic của các chủng Lactobacillus phân lập được

Ký hiệu

Thời gian nuôi (giờ)