Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal I bằng kỹ thuật knock down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCF7

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỒ THỊ THẢO

HÀ NỘI – 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ chân thành của các đồng nghiệp

Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS

Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái nguyên và Phòng Thử nghiệm sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm các anh, chị đồng nghiệp phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Cúc

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cƣ́u của đề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Ung thƣ 3

2.1.1 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và ở Việt Nam 3

2.1.2 Đặc tính và nguyên nhân của ung thư 3

2.1.2.1 Các đặc tính của bệnh ung thư 3

2.1.2.2 Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn 3

2.1.3 Phân loại ung thư 4

2.1.4 Tác nhân gây bệnh ung thư 4

2.1.4.1 Tác nhân hóa học 4

2.1.4.2 Tác nhân sinh học 5

2.1.5 Cơ chế di căn của tế bào ung thư 5

2.1.6 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 6

2.2 Giới thiệu về RNAi 6

2.2.1 Dòng thông tin di truyền trong tế bào 6

2.2.2 Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào 7

2.2.2.1 Khái niệm 7

2.2.2.2 Vai trò của RNAi 7

2.2.2.3 Thành phần RNAi 7

2.2.3 Lịch sử nghiên cứu siRNA 7

2.2.4 Cơ chế của RNAi 9

2.2.4.1 Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy của RNAi 9

2.2.4.2 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA 9

2.2.5 Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi 10

2.2.5.1 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư 10

2.2.5.2 Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh 10

2.2.5.3 Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh 11

2.2.5.4.Các ứng dụng khác của RNAi 11

2.2.6 Ý nghĩa của RNAi 11

2.2.7 Khái niệm về knock-down gene 11

2.3 Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST) 12

2.3.1 Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư 12

2.3.2 Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16

2.3.3 Phân loại các Enzyme sialyltransferase 17

2.3.4 Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase 18

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực đề tài 19 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20

3.1.1 Vật liệu 20

3.1.2 Hoá chất 20

3.1.3 Thiết bị 21

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21

3.3.2 Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ lipofectamin 22

3.3.3 Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down 23

3.3.4 Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm 23

3.3.5 Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen 23

3.3.6 Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của Applied Biosystem 23

3.3.7 Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 24

3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số 25

3.3.9 Phương pháp điện di trên gel 25

3.3.10 Phương pháp Western blot để xác định mức độ biểu hiện của các protein 26

3.3.11 Phương pháp nhuộm gel bằng siver staining 26

3.3.12 Phương pháp in-gel digestion 27

3.3.13 Phương pháp phân tích khối phổ 28

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Hình thái tế bào MCF7 sau khi knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA 29

4.2 Khả năng phát triển của tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm siRNA 30

4.3 Hiệu quả knock-down gene 31

4.4 Biểu hiện của protein tổng số khi gene ST3Gal-I bị knock-down 34 4.5 Biểu hiện của một số protein khi gene ST3Gal-I bị knock-down 35

4.6 Hàm lượng Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm 37

4.7 Nhuộm bạc 40

4.8 Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS 41

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

1 KẾT LUẬN 46

2 KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với phân

tử đường trong tự nhiên 13

Bảng 4.1 Giá trị OD trung bình ở bước sóng 570 nm 29 Bảng 4.2 Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu 30 Bảng 4.3 Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm siRNA 32 Bảng 4.4 Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm siRNA 37 Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Vị trí của gene ST3Gal-I 16 Hình 2.2 Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I 18 Hình 4.1 Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ phóng đại

20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào chuyển nhiễm siRNA 28 Hình 4.2 Sự sống sót và phát triển của các tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm siRNA 30 Hình 4.3 Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống NanoDrop của Thermo Scientific 31 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá trị OD thu được 33 Hình 4.5 Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số của mu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 35 Hình 4.6 Ảnh Western-blot các protein Actin, Akt, GSK, P42/44 và PODCL của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 37 Hình 4.7 Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining các glycoprotein màng của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 39

Complementary Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid

Môi trường nuôi cấy tế bào RNA sợi đôi

Ethylenediamintetraacetic acid Phosphate bufer saline (huyết thanh phôi bò) N-acetylgalactosamin

Dòng tế bào ung thư vú Dòng tế bào ung thư ruột người nuclear factor kappa from B cells Dòng tế bào ung thư vú

Dòng tế bào ung thư vú microRNA 21

Micro Ribonucleic acid RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid) N-acetylneuraminic acid

Rapid Immunofilter Paper Assay Phosphatidylinositol 3-kinases Revolutions per minute

RNA – incluced silencing complex Ribonucleic acid

RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference)

Small interference RNA/short interference RNA Single strand RNA

2,3 Sialyltransferase galatose Dòng tế bào ung thư ruột kết người

Tế bào ung thư

Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization)

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Là căn bệnh nan y , gây ra tỉ lệ tử vong cao cho người bệnh và rất khó chữa trị, ung thư đang là mối nguy hiểm cho con người trên toàn thế giới Khoảng 7 triệu người mỗi năm bị tử vong do ung thư và ước tính khoảng 9 triệu người chết vào năm 2015 và 11,4 triệu người chết vào năm 2030 do mắc các bệnh ung thư (http://www.ungthu.net.vn)

Có thể nói, việc tìm hiểu các yếu tố liên quan đến cơ chế cũng như đặc tính di căn của tế bào ung thư là rất phức tạp Hiện nay, rất nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu đặc tính cũng như cơ chế di căn của tế bào ung thư Tuy nhiên, đặc tính cụ thể cũng như cơ chế di căn của tế bào ung thư vẫn chưa được làm sáng tỏ Những nghiên cứu gần đây cho thấy, có sự liên quan mật thiết giữa các glycoprotein cũng như glycolipid thuộc bề mặt tế bào tới sự liên kết giữa tế bào với tế bào, tới việc truyền tín hiệu giữa các tế bào trong cơ thể Sự sai khác xuất hiện trong quá trình glycosyl hóa các glycoprotein và glycolipid của màng sẽ khiến cho mối liên kết và quá trình truyền tín hiệu giữa tế bào bị sai lệch, dẫn tới nhiều căn bệnh của tế bào hoặc cơ thể, ví dụ như bệnh ung thư Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã báo cáo về sự tăng cường hoạt động của enzyme ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1 hay còn gọi là ST3Gal-I do gene ST3Gal-I mã hóa ở các bệnh nhân ung thư trong giai đoạn di căn nhưng lại rất ít hoặc hầu như không hoạt động ở người bình thường hoặc ở bệnh nhân ung thư giai đoạn sớm

Để nghiên cứu vai trò chức năng của một gene thì việc knock-down gene bằng siRNA là một công cụ hữu hiệu siRNA đóng một vai trò nhất định trong sinh học cơ thể Đặc tính nổi bật nhất của các siRNA là khả năng tác động và can thiệp vào sự biểu hiện của một gene đặc trưng nào đó Thêm nữa, siRNA còn đóng một vai trò nhất định liên quan đến cơ chế

hoạt động của các RNA, ví dụ như liên quan đến cơ chế chống virus của tế bào, liên quan đến sự tạo hình của các cấu trúc nhiễm sắc thể trong hệ genome Có thể nói, vai trò của siRNA là tương đối phức tạp, còn chưa được hiểu hết nhưng lại rất quan trọng tới các cơ chế sinh học trong cơ thể (Hamilton A, Baulcombe D, 1999) Hiện nay, siRNA đặc hiệu cho gene ST3Gal-I đã được hãng INVITROGEN (Mỹ) thương mại hóa và có hiệu quả cao Vì thế, với việc knock-down gene ST3Gal-I trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7 của người, chúng tôi mong muốn tìm hiểu mối liên quan giữa gene ST3Gal-I với đặc tính di căn của các tế bào ung thư nói chung và của tế bào ung thư vú MCF7 nói riêng

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề

tài: ‘‘Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down

với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7’’

1.2 Mục tiêu nghiên cƣ́u của đề tài

thư vú MCF7

bào ung thư

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ung thƣ

2.1.1 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và ở Việt Nam

Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và khó chữa trị, số lượng người mắc bệnh ngày càng cao Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới Hiện nay,

số ca mắc ung thư mới vào khoảng 10 triệu người/năm Ở Việt nam, số người mắc bệnh ung thư ngày càng tăng Năm 2000, tỷ lệ mắc ung thư ở nam giới là 141/100.000 dân, ở nữ giới là 101/100.000; năm 2010 tỷ lệ này

ở nam giới là 181/100.000 dân và ở nữ giới là 134/100.000 dân (http://www.ungthu.net.vn)

2.1.2 Đặc tính và nguyên nhân của ung thư

Ung thư là tên chung để gọi một nhóm bệnh với hơn 200 loại khác nhau về nguồn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn nhưng đều có chung một đặc điểm là sự tăng sinh vô hạn, không tuân theo cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể (Đái Duy Ban và cs., 2000; Hanahan D and Weinbeirg

RA, 2000)

2.1.2.1 Các đặc tính của bệnh ung thư

hoá hơn so với tế bào bình thường; tế bào phân chia nhanh, liên tục, tránh được apoptosis (chết theo chương trình); tế bào có khả năng phát triển vô hạn (bất tử); có khả năng di căn, xâm lấn đến các mô xung quanh ; có rất

nhân/tế bào chất cao , nhân to , bờ nét không rõ , xuất hiện nhiều sợi phân

bào hơn các tế bào bình thường khác (Darnell J et al., 1990; Hanahan D

and Weinbeirg RA, 2000)

2.1.2.2 Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn

Giai đoạn đầu là quá trình hình thành TBUT khởi phát (do ảnh hưởng

của các tác nhân nội bào hay ngoại bào) Tiếp theo là quá trình phân chia

liên tục không ngừng của TBUT để thành một khối u được gọi là quá trình

phát triển bệnh Cuối cùng là giai đoạn di căn, khiến bệnh nhân tử vong

(Darnell J et al., 1990)

2.1.3 Phân loại ung thư

Theo nguồn gốc mô phát sinh, ung thư được Hanahan D và Weinbeirg

R A (2000) phân chia thành các dạng:

+ Carcinoma: đây là dạng ung thư phổ biến nhất, phát sinh từ những

tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài, như ung thư phổi,

ung thư vú, ung thư trực tràng

+ Sarcoma: là dạng ung thư ít gặp, phát sinh từ những tế bào có nguồn

gốc lá phôi giữa, những tế bào thuộc hệ thống chống đỡ của cơ thể như

xương, sụn, mỡ, mô liên kết và cơ

+ Lymphoma: là dạng ung thư phát sinh từ các hạch bạch huyết và các

mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như: ung thư Lymphoma Burkitt

+ Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm, biểu hiện bệnh rất sớm, xuất

hiện ở trẻ em và người trẻ tuổi, phát sinh từ các mô tạo máu, các tế bào

máu non thuộc tuỷ xương, có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong

máu như ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia)

2.1.4 Tác nhân gây bệnh ung thư

Có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh ung thư , mỗi nguyên nhân lại tác

động theo một cơ chế khác nhau , gồm 2 nhóm tác nhân lớn: tác nhân hóa

học và tác nhân sinh học (Nguyễn Chấn Hùng, 1994)

2.1.4.1 Tác nhân hóa học

Tác nhân hoá học gây ung thư gồm khói thuốc lá , các thành phần hoá

học trong thuốc trừ sâu, các sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực

phẩm, chất tạo màu không đạt tiêu chuẩn, khí đốt xăng dầu, động cơ, khí

thải nhà máy công nghiệp cũng được xem là độc hại và là nguyên nhân gây bệnh ung thư cao cho con người (Đái Duy Ban và cs, 2000; Pezzuto

JM, 1995)

Cơ chế gây ung thư của tác nhân này là tác động vào cơ thể thông qua

cơ thể, gây ra phản ứng oxi hoá làm thay đổi cấu trúc của phân tử DNA

dẫn đến bệnh ung thư (Darnell J et al., 1990)

2.1.4.2 Tác nhân sinh học

Tác nhân sinh học bao gồm một số loại virus và vi khuẩn có khả năng khởi động châm ngòi cho sự phát triển ung thư khi nó lây nhiễm vào tế bào

bình thường (Đái Duy Ban và cs, 2000; Darnell J et al., 1990)

Virus gây ung thư gồm 2 loại: DNA virus (đặc trưng nhất là các

papovavirus, thường gặp là SV40 và polyoma) và RNA virus (Retrovirus)

Cơ chế gây ung thư của các virus là tương đối phức tạp và chưa được hiểu hết Virus có thể làm biến đổi các tính chất đặc thù của tế bào chủ (hình thái, sinh lý, sinh hoá) bằng cách hợp nhất một số gene của mình vào hệ gene của tế bào khiến cho một số gene của tế bào hoạt động bất thường mở

đầu cho sự hình thành căn bệnh ung thư (Darnell J et al., 1990)

2.1.5 Cơ chế di căn của tế bào ung thư

Các TBUT trong khối ung thư sẽ tiếp tục tăng sinh, tự mất đi các thụ cảm nhận biết giới hạn phát triển so với các tế bào lân cận, sản xuất ồ ạt các cytokine (cell signals) và các enzyme protease dẫn tới phá huỷ màng đệm lót và môi trường ngoại bào bao quanh khiến chúng liên kết lỏng lẻo,

dễ dàng bất ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di chuyển tới các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổ

chức Quá trình này gọi là sự di căn (Darnell J et al., 1986) Joan Massague

và cộng sự thuộc Trung tâm Ung thư Memorial Sloan-Kettering (Mỹ) nhận thấy cơ chế di căn trong ung thư phổi cũng giống như cơ chế tế bào di căn

trong ung thư đại trực tràng, nhưng nhanh hơn và thích ứng nhanh chóng khi di căn sang các cơ quan nội tạng khác Nhóm tác giả đã nhận ra cơ chế

"tín hiệu tế bào WNT" là một trong 6 cơ chế được thử nghiệm về tính hoạt hóa quá mức trong các khối ung thư phổi khi chúng di căn và không di căn Các thử nghiệm sâu hơn trên chuột cho thấy tế bào ung thư phổi với đột biến gây khối u ở gen KRAS và EGFR phụ thuộc vào cơ chế WNT hoạt hóa quá mức gây di căn Các nhà khoa học cũng nhận thấy 2 gen HOXB9 và LEF1 được hoạt hóa bởi WNT và làm tăng khả năng tế bào ung thư phổi xâm lấn và tăng sinh khối u

2.1.6 Dòng tế bào ung thư vú MCF7

Dòng tế ung thư vú MCF7 được phân lập đầu tiên vào năm 1970 từ một bệnh nhân nữ, da trắng, 69 tuổi có tên là Frances Mallon và dòng tế bào này được Herbert Soule và cộng sự thành lập, được lưu trữ tại Viện nghiên cứu ung thư Barbara Ann Karmanos Đây là dòng ung thư vú đầu tiên có khả năng sống lâu hơn một tháng Dòng tế bào ung thư vú này mang đặc điểm giống các dòng tế bào ung thư vú biểu mô khác

2.2 Giới thiệu về RNAi

2.2.1 Dòng thông tin di truyền trong tế bào

Mã di truyền trên DNA quy định việc hình thành thông tin di truyền trong DNA và được sao chép thành RNA, sau đó tổng hợp protein Dòng thông tin di truyền từ DNA qua mRNA đến protein được gọi là “Học thuyết trung tâm” của sinh học phân tử Bộ gene của con người có khoảng 30.000 gene Tuy nhiên, không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trình phiên mã Quá trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác mà chúng ta còn chưa nghiên cứu hết

2.2.2 Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào

2.2.2.1 Khái niệm

RNAi (RNA interference) là một hệ thống bên trong các tế bào sống, giúp kiểm soát các gene đang hoạt động hay giúp tế bào ức chế biểu hiện một gene khi trong tế bào có sự xuất hiện một chuỗi RNA xoắn kép có trình tự giống với gene này Đây là hệ thống tự vệ của tế bào nhằm chống lại sự xâm nhập của siêu vi khuẩn, các phần tử di truyền ngoại lai khác, những yếu tố sử dụng chuỗi RNA xoắn kép trong chu kỳ sống của tế bào

2.2.2.2 Vai trò của RNAi

RNAi có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào như: bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virus và các yếu tố di truyền vận động (Transposon) Điều hoà biểu hiện gene Điều khiển sự phát triển của tổ chức Duy trì hình dạng nhiễm sắc thể và tăng cường phiên mã…

2.2.2.3 Thành phần RNAi

RNAi gồm 2 thành phần siRNA và miRNA

siRNA (small interfeing RNA, short interfering RNA) là các RNA ngắn có kích thước khoảng 20 - 30 nu, được hình thành từ các RNA sợi đôi, tham gia vào quá trình tổng hợp protein, siRNA có khả năng điều khiển protein họ Argomaute tới đích điều hòa (Ghildiyal M and Zamore

PD, 2009)

miRNA (micro RNA) là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 24

nucleotit, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein

2.2.3 Lịch sử nghiên cứu siRNA

Nguồn gốc hình thành siRNA chính là từ kỹ thuật antisense-RNA

(Pestka et al., 1984) Khi phân tử RNA chiều ngược (antisense RNA) được

hình thành thì việc tổng hợp protein beta-galactosidase bị ức chế gần như hoàn toàn (98%) Tuy nhiên, đến năm 1990 các nhà khoa học mới phát

hiện ra cơ chế gây ra sự ức chế trên là do gene (Napoli et al., 1990; Van

der Krol et al., 1990) Đó là nghiên cứu trên loài hoa dạ yến thảo (petunia)

Các nhà khoa học đã cố gắng tạo màu tím trên cánh hoa petunia bằng cách

chuyển gene quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới sự điều

khiển của promoter 35S Gene CHS là gene có liên quan đến chu trình hình thành chất anthocyanin trong hoa petunia Tuy nhiên, cánh hoa lại thể hiện các đốm màu khác nhau và cho ra màu trắng chứ không phải là màu tím Năm 1994, Cogoni và các cộng sự đã tiến hành một thí nghiệm nhằm

phát triển màu cam của nấm Neurospora crassa thông qua việc chuyển

một gene có chức năng tạo ra carotenoid Tuy nhiên, nấm lại không có màu cam Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt tên là "quelling" Năm 1995, Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến

trùng Caenorhabditis elegans, đó là hiện tượng RNA sợi sense và antisen

có hiệu quả ức chế biểu hiện gene như nhau (Guo S and Kemphues KJ, 1995)

Hiện tượng RNAi được khám phá đầu tiên trên giun tròn

Caenorhabditis elegans do việc ức chế biểu hiện gene bởi RNA sợi đôi

(Fire A et al., 1998) Timmons L và Fire A đã dùng antisense RNA để ức

chế biểu hiện gene Hiệu quả tác động của hỗn hợp sense và antisense RNA gấp ít nhất 10 lần so với chỉ là dùng sợi sense hay antisense (Timmons L and Fire A, 1998)

Trong các tế bào người sự kích hoạt gene được tìm thấy đầu tiên do các siRNA kích hoạt các promoter của E-cadherin và p21, làm tăng mức

độ biểu hiện của mRNA và protein (Morris KV and Vogta PK, 2010)

Trong in vivo, siRNA đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế lây nhiễm

virus vì nó làm bất hoạt RNA được tạo ra trong chu kỳ sống của virus (Klattenhoff C and Theurkauf W, 2008)

Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma) RNAi được kích hoạt bởi dsRNA và được cắt thành những mảnh có độ dài

khoảng 21 - 28 cặp bazơ bởi một enzyme Dicer ở ngoài tế bào chất Những mảnh dsRNA bị cắt được gọi tắt là siRNA, các siRNA này sẽ liên kết với protein và gây nên sự ức chế

2.2.4 Cơ chế của RNAi

2.2.4.1 Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy của RNAi

RNAi đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm của các virus vào cơ thể vật chủ Khi virus xâm nhiễm vào tế bào, nó truyền thông tin di truyền vào tế bào vật chủ, RNA virus lập tức bị cắt bởi enzyme Dicer, phức hợp RISC được kích hoạt và RNA virus bị phân hủy,

tế bào vật chủ thoát khỏi xâm nhiễm

Gene nhảy (trasposon) là các trình tự DNA có thể di chuyển trong

bộ gene Gene nhảy hoạt động bằng cách sao chép DNA thành RNA, sau

đó RNA phiên mã ngược thành DNA và gắn vào vị trí khác trên bộ gene RNAi sẽ bảo vệ bộ gene chống lại các gene nhảy

2.2.4.2 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

Trong tế bào, sự biểu hiện của RNA sợi kép là kết quả của sự bắt cặp giữa mạch mang mã và mạch đối mã Các đoạn RNA sợi kép dài được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn (siRNA) khoảng 21-28 nucleotit Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới tác dụng của enzyme helicase và một mạch được nạp vào phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu là RISC*) Cuối cùng phức hợp siRNA-RISC* này sẽ tìm kiếm các sản phẩm của quá trình phiên mã (transcriptome) một cách đặc hiệu

Cơ chế tắt gene phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA và mRNA đích Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải (do hoạt tính nuclease của RISC), do vậy không có mRNA mã hoá cho protein đó

Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào có thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu hiện của một gene nào đó (vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào)

2.2.5 Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi

2.2.5.1 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư

Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy các đột biến liên tiếp có lợi cho sự phân chia và tồn tại của chúng Những biến đổi vật chất di truyền (epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch cơ thể và cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) hay các tín hiệu kìm hãm phân chia (antiproliferative signals) Sự khám phá ra cơ chế can thiệp RNA chính là công cụ cần thiết để dò tìm các cơ chế phân tử bị thay đổi trong tế bào ung thư Do tính đặc hiệu của quá trình can thiệp RNA nên

có thể dễ dàng tiến hành thực nghiệm trên hàng ngàn gene hoặc toàn bộ hệ genome trong một thí nghiệm Từ đó, các khía cạnh của bệnh ung thư sẽ được giải mã và sẽ tìm ra thuốc điều trị ung thư đặc hiệu

2.2.5.2 Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh

Trong cây trồng phân tử anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) được coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái cây và các mô tế bào khác Thông thường các màu chính của hoa bắt nguồn từ DHK với sự có mặt của một ít các chất carotenoid Ngoài ra, DHK lại là một enzyme chi phối cho cả 3 chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin

và delphinidin Gene cyanidin mã hóa enzyme DHK làm biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà Một loại enzyme khác có tên gọi là dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ chị trong cả ba chu trình trên, enzyme này tạo màu trên các cánh hoa Chính vì vậy, mà các đột biến gene DFR đều cho ra những hoa có màu trắng Chu trình delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác động của DRF và pH

Để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học đã áp dụng một bộ 3 gene Một gene nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gene DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu Sau đó chuyển gene delphinidin từ loài hoa păng-xê và gene DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa Khi nồng độ

pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh hơn Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền Vì vậy các nhà khoa học đã ức chế gene bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gene ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa

2.2.5.3 Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh

Đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu việc chuyển gene Bt (Bacillus thuringiensis) vào thực vật để kháng lại sâu bệnh

2.2.5.4.Các ứng dụng khác của RNAi

Nghiên cứu các RNAi để chống lại sự nhiễm virus, bảo đảm ổn định

hệ gene bằng cách chống lại các gene nhảy, để kiềm chế sự tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển của tổ chức, trong điều trị bệnh di

truyền, các bệnh về gene…

2.2.6 Ý nghĩa của RNAi

Khám phá về RNAi đã góp phần giải thích nhiều hiện tượng sinh lý quan trọng trong tế bào và cơ thể Ví dụ như tại sao một số virus không thể tấn công các tế bào khỏe lành mạnh

2.2.7 Khái niệm về knock-down gene

Knock-down là thuật ngữ chỉ các quá trình can thiệp làm biến đổi cấu trúc của một hay nhiều gene đã biết rõ trình tự Từ đó làm giảm biểu hiện của một gene đặc thù (Morris KV and Vorgt PK, 2010)

Kỹ thuật knock-down gene (hay còn gọi là kỹ thuật can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gene) là phương pháp sử dụng một đoạn DNA hay

RNA có trình tự bổ sung với gene cần tác động hoặc bổ sung với RNA thông tin (mRNA) của nó Các đoạn này sẽ kết hợp với các gene cần tác động hay các mRNA làm giảm biểu hiện của gene Dựa vào sự thay đổi của kiểu hình có thể hiểu hơn về chức năng của gene bị tác động Sử dụng siRNA là phương pháp được ứng dụng trong knock-down gene (Đỗ Năng Vịnh, 2007)

Kỹ thuật knock-down gene là một kỹ thuật mới, chỉ cần một vài phân

tử RNA sợi kép (dsRNA) trong một tế bào cũng đủ để phân hủy các mRNA của một gene đặc thù Kết quả thực nghiệm cho thấy RNAi có thể gây bất hoạt gene một cách hiệu quả ở bất kì cơ thể sống nhân thực nào

2.3 Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST)

2.3.1 Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư

Fukuda M (1995), Kannagi R và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng có sự thay đổi đáng kể đối với quá trình glycosyl hóa của các protein nằm trên bề mặt tế bào và sự thay đổi này liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự di

căn của tế bào ung thư (Fukuda M, 1995; Kannagi R et al., 2004)

Các phân tử glycan của tế bào như glycoprotein (GP), glycosphingolipid (GSL) và proteoglycan được gọi chung là glycome đóng vai trò rất quan trọng đối với các hoạt động sinh học nội và ngoại bào ví dụ như quá trịnh tự định dạng của tế bào, quá trình gắn kết tế bào, tương tác giữa các tế bào với nhau và truyền tín hiệu (Haltiwanger RS, Lowe JB, 2004) Trong đó, sự hình thành mối liên kết giữa phân tử đường với các amino acid là một bước quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phân tử glycoprotein từ các đơn vị carbohydrate Đây cũng là một khâu quan trọng trong một loạt các bước phức tạp của quá trình hậu dịch mã dẫn tới sự hình thành các phân tử protein gắn kết chuỗi oligosaccharide với chức năng sinh học cực kì đa dạng Phản ứng sinh học này xảy ra trong toàn bộ sinh giới từ sinh vật cổ sinh cho tới các vi sinh vật và giới sinh vật nhân chuẩn Các phản ứng gắn kết này còn được gọi chung là phản ứng glycosyl hóa

(Kanoelani TP, Mahal LK, 2007; Lowe JB, 2002) Spiro đã chỉ ra rằng phản ứng glycosyl hóa được xúc tác bởi một hệ thống các enzyme phức tạp nhằm hình thành các cầu nối glycopeptide cũng như vị trí hoạt động nội bào hay quyết định ái lực của các phân tử glycoprotein này với các cổng peptide đặc thù Báo cáo này cũng chỉ ra 13 phân tử monosaccharide và 8 amino acid khác nhau liên quan đến tới sự hình thành của ít nhất 41 cầu nối

glycoprotein ví dụ như cầu nối N- và O-glycosylation, C-mannosylation,

phosphoglycation và glypiation Hiện tại các nhà khoa học đã xác định được ít nhất 16 enzyme liên quan và đã được định dòng Vị trí hoạt động của chúng rất khác nhau và đa dạng ví dụ như ở mạng lưới nội chất, ở thể golgi, cytosol và cả ở trong nhân tế bào (Schauer R, 2000)

Bảng 2.1 Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với

phân tử đường trong tự nhiên

Sinh vật cổ

Vi sinh vật

N-glycosyl Asn GlcNAc + + +

Ovalbumin, fetuin, insulin receptor

Asn Rha – – + Thành tế bào S sanguis

O-glycosyl Ser/Thre GalNAc + – – Mucins, fetuin, glycophorin

Thr Man – – + M tuberculosis glycoproteins

Thr GlcNAc + – – Rho proteins (GTPases)

H halobium S-layer, vent

worm collagene

Ser Man + – – L mexicana acid phosphatase

Ser Fuc + – – Dictyostelium proteins

T brucei VSG, Thy-1, Sulfolobus

Trong khi đó, đa phần các protein trên bề mặt tế bào đều được glycosyl hóa nên những thay đổi dù nhỏ cũng sẽ khiến cho hoạt động của tế bào bị biến đổi theo Sự chuyển dạng từ tế bào thường thành tế bào ung thư

kèm theo sự thay đổi trong quá trình glycosyl hóa ở các liên kết N- và O-

với phân tử protein Ví dụ như ở tế bào ung thư thì nhánh 1,6GlcNAc thuộc

chuỗi N-glycans gắn với Asn-X-Ser/Thr thường xuất hiện nhiều hơn bình thường; trong khi dạng mucin-O- nối với các phân tử glycan gắn kết với Ser hoặc Thr thường bị giảm (Cazet A et al., 2010; Kanoelani TP, Mahal

LK, 2007)

Đặc biệt, người ta cũng nhận thấy rằng các glycoprotein, glycolipid, proteoglycan bề mặt có liên quan rất chặt chẽ tới đặc tính di căn của tế bào ung thư Hơn nữa, các glycoprotein còn tác động rất mạnh và liên quan chặt chẽ tới hoạt động của hệ miễn dịch Ví dụ như kháng nguyên Sialyl-Tn

carbohydrate dạng mucin đơn giản nhưng lại khiến cho các nhà nghiên cứu phải bỏ nhiều công sức để nghiên cứu vì một số lí do như sau: (i) Sialyl-Tn hiếm khi được quan sát hay phát hiện ở các mô khỏe mạnh nhưng lại biểu hiện tăng cường mạnh mẽ ở rất nhiều dạng ung thư như ung thư thận, đại tràng, buồng trứng, vú, gan v.v…(ii) Sialyl-Tn luôn gắn liền với những bệnh nhân ung thư ở giai đoạn cuối và còn ít khả năng chữa trị (iii) Sialyl-

Tn được nhận thấy là ở tình trạng bất thường đối với các dạng tiền ung thư chẳng hạn như ở bệnh nhân viêm loét đại tràng mãn tính v.v (Crocker PR, 2002; Kanoelani TP, Mahal LK, 2007)

Tương tự như vậy, hầu hết các phân tử protein liên quan đến cơ chế miễn dịch thì đều ở dạng glycosyl hóa và điều đặc biệt là luôn có phân tử sialic acid là phân tử đường cuối cùng hay còn gọi là phân tử chặn cuối Là một monosaccharide với bộ khung gồm 9 phân tử carbon, sialic acid là tên

gọi chung cho các dẫn xuất có liên kết dạng N- hoặc O- của neuraminic

acid Nó cũng là tên gọi chung cho các thành viên phổ biến nhất của nhóm N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac hay NANA) Sialic acid xuất hiện rất phổ biến trong các mô động vật, cả các loài từ thực vật cho tới nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Sialic acid xuất hiện ở hai dạng là glycoprotein và ganglioside Nhóm amino thường chứa đựng các gốc acetyl hoặc glycolyl nhưng cũng thấy xuất hiện các dạng biến đổi khác nữa Rất nhiều các phân

tử sinh học có cấu trúc sialyl hóa được biết đến là có mối liên hệ với các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch thu được Ví dụ như kháng nguyên Lewis X (LeX) được sialyl hóa, có liên quan đến việc gắn

kết chọn lọc (selectin) trong quá trình di chuyển của các tế bào bạch cầu tới các vị trí bị viêm nhiễm hay tới các cơ quan lympho thứ cấp (Crocker

PR, 2002; Kanoelani TP, Mahal LK, 2007; Lowe JB, 2002; Marcos N T

et al., 2004)

Quá trình gắn kết sialic acid còn gọi là sự sialyl hóa, được thực hiện dưới sự xúc tác của các enzyme sialyltransferase (ST) Sialyltransferase là protein màng tế bào type II, chất xúc tác chuyển giao sialic acid từ các phân

tử đường nucleotide CMP-NeuAc đến các phân tử oligosaccharide nằm trên màng glycoprotein, glycolipid và polysaccharide (Paulson and Colley,

1989; Harduin-Lepers et al., 1995; Tsuji et al., 1996) Nói chung, acid

sialic được tìm thấy tại các vị trí tận cùng đầu cuối của phân tử glycoconjugates sialylated nơi có vai trò quan trọng trong tế bào, là sự ràng buộc giữa tế bào và thụ quan (Kelm and Schauer, 1997)

2.3.2 Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I

Hình 2.1 Vị trí của gene ST3Gal-I

(http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ST3GAL1)

Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I được mã hóa bởi gene ST3Gal-I,

là một protein typ II nằm trên màng tế bào, có tác dụng xúc tác để chuyển CMP-sialic acid tới gắn kết vào nhánh của lõi galactose 1

Gene ST3Gal-I

bệnh nhân ung thư Enzyme này kiểm soát cân bằng nội tế bào bạch huyết CD8+T và là một chất ức chế chính của core 2 O-polisaccarit hình thành

trên CD43 và CD45 trong tế bào T nhớ (Priatel JJ et al., 2000)

Mã hóa cho enzyme ST3Gal-I là gene ST3Gal-I hay còn được gọi dưới các tên như DKFZp666E036; DKFZp779K2051; FLJ36548; Gal-NAc6S; MGC9183; SIAT4A; SIATFL; ST3GalA; ST3GalA.1; ST3GalIA

và ST3O Gene này nằm trên nhiễm sắc thể thứ 8 tại vị trí 8q24.22 và có kích thước là 6971 bp Gene ST3Gal-I ở dạng mã hóa thường được tìm thấy ở thể Golgi nhưng cũng có thể tìm thấy ở dạng hòa tan Enzyme ST3Gal-I là một thành viên của họ glycosyltransferase số 29 có cùng cơ chất như sialyltransferase 4B Hiện tại người ta đã tìm thấy hai phiên bản dịch mã của gene này cùng mã hóa cho một phân tử protein Tuy nhiên, có thể còn tồn tại các phiên bản khác mà chúng ta chưa nhận dạng được

Trong các nghiên cứu về glycan ở các mẫu phẩm ung thư của bệnh nhân giai đoạn di căn người ta nhận thấy rằng enzyme ST3Gal-I hoạt động tăng cường Ngược lại, ở người bình thường hoặc ở bệnh nhân ung thư giai

đoạn sớm thì enzyme này lại rất ít hoạt động (Moody AM et al., 2003)

2.3.3 Phân loại các Enzyme sialyltransferase

Enzyme sialyltransferase ở động vật có vú có thể được phân loại thành ba loại: α2,3 (ST3), α2,6 (ST6), và α2,8-sialyltransferases (ST8)

(Tsuji et al., 1996) α2,3-Sialyltransferases (ST3Gals) được phân loại thành

6 họ từ ST3Gal-I đến ST3Gal-VI (Tsuji et al., 1996; Tsuji, 1998) Mỗi một

loại có một tính chất đặc trưng ST3Gal-I có hoạt tính cao đối với phân tử

disaccharide type III (Galβ1-3GalNAcα) (Gillespie et al., 1992; Lee et al., 1993; Kitagawa and Paulson, 1994b; Kurosawa et al., 1995) STGal II cũng

sử dụng phân tử disaccharide type III để mã hóa cho glycolipid aglycon

(Lee et al., 1994) ST3Gal III và ST3Gal IV lại sử dụng phân tử

disaccharide type I (Galβ1-3GlcNAcβ) và type II (Galβ1-4GlcNAcβ) một

cách tương ứng (Wen et al., 1992; Kitagawa and Paulson, 1993; Sasaki et

al., 1993; Kitagawa and Paulson, 1994a) ST3Gal V chuyên sản xuất

lactosylceramides sialylated và không liên quan gì đến các disaccharide

type I, II, hoặc III (Ishii et al., 1998; Kono et al., 1998) ST3Gal VI thì chịu

trách nhiệm glycolipid hóa các phân tử disaccharide type II ở các đầu

không chặn cuối (Okajima et al., 1999)

Cho đến nay 16 loại sialyltransferase ở động vật có vú đã được tạo dòng trong đó có 6 loại ST3Gal Trình tự amino acid của tất cả các dòng sialyltransferase đã được phân tích và tất cả chúng đều chứa trình tự L-, S, và

VS-sialyl (Drickamer, 1993; Kurosawa et al., 1994; Geremia et al., 1997)

2.3.4 Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase

Một nghiên cứu đã đưa ra mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I như sau:

Hình 2.2 Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực đề tài

Burchell J và cộng sự (1999) đã nghiên cứu gene ST3Gal-I trên tế bào ung thư vú MDA-Ba-231 và đưa ra kết quả rằng ST3Gal-I chịu trách nhiệm gắn thêm acid sialic vào nhánh lõi galactose 1(GalB1,3 Gal NAc) O-

glycan, do đó làm tăng khả năng di căn của TBUT (Burchell J et al., 1999)

Schneider F và cộng sự (2001) đưa ra mối quan hệ giữa biểu hiện của TF trên bề mặt tế bào của SW480 (tế bào ung thư đại tràng) phụ thuộc vào tỷ lệ của ST3Gal-I Phản ứng RT-PCR cho thấy biểu hiện của acid sialic sialyltransferases CMP phát hiện trong niêm mạc bình thường là 7%

động của alpha 2,3-sialyltransferases ST3Gal-I và mRNA của enzyme này được tăng lên đáng kể (p < 0,05) (Schneider F et al., 2001)

Trong các nghiên cứu ở chuột bị knock-down gene ST3Gal-I, các tác giả nhận thấy rằng các chuột này gần như bị thiếu hẳn các tế bào lympho CD8β T ngoại vi Đồng thời các tác giả cũng nhận thấy rằng enzyme này tăng cường hoạt động ở những bệnh nhân ung thư đang có

khối u di căn nhưng chưa biết được cơ chế cụ thể (Moody AM et al, 2003)

Việc sử dụng siRNA để knock-down COX-2 và phân tích sự biểu hiện của COX-2 trong tế bào ung thư vú MDA-MB-231 cho thấy rằng COX-2 đã làm giảm biểu hiện của ST3Gal-I và ở 74 bệnh nhân ung thư

(Sproviero D et al., 2012)

Các nghiên cứu trên cho thấy, sự biểu hiện quá mức của ST3Gal-I dường như là một phần của chuyển đổi gây ung thư Các nghiên cứu đều thực hiện trên các gene và các dòng tế bào ung thư khác nhau tuy nhiên

chưa có nghiên cứu nào thực hiện knock-down gene ST3Gal-I trên mô hình

tế bào ung thư vú MCF7

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

Fisher, Fermentas, Sigma, Gibco, Roche v.v

RNAiMAX (INVITROGEN)