Ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủn

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.LÊ QUỐC HUY

Hà Nội– Năm 2012

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình

Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS

Lê Quốc Huy, Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, giáo viên bộ môn Vi sinh vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, những người Thầy đã giúp đỡ,

động viên tôi trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo sau Đại Học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn,giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn CN Ngô Thị Thanh Huệ và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường cũng như tập thể cán bộ thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này./

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Giang

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác./

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Giang

Trang 4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

1.1 Đặt vấn đề……… 2

1.2 Mục tiêu đề tài……… 2

1.2.1 Mục tiêu chung……….……….……… 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể………… … ……… 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……… 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học……… 2

1.3.1 Ý nghĩa thực tiễn……… 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……… 3

1.1 Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM ……… 3

1.1.1 Khái niệm……… 3

1.1.2 Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM(Arbuscular mycorrhiza)…… 4

1.1.3 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ……… 9

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogense……… 12

1.3 Nghiên cứu nẫm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam………… 13

1.3.1 Trên thế giới ……… 13

1.3.2 Trong nước ……… 19

Chương 2 VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu……… ……… 22

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… 23

2.2.1 Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro……… 23

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro……….……… 23

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro……… 23

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro……… ………… 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 24

Trang 5

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm……… 24

2.3.2 Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro ……… 24

2.3.3 Phương pháp cấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ ……… 28

2.3.4 Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro……… 28

2.3.5 Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro ……… 29

2.3.6 Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm……… 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 31

3.1 Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễin vitro ……… ……… 31

3.2.Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……… 32

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……… 38

3.4 Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……… 44

Chương 4 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ……… 50

4.1 Kết luận……… 50

4.2 Tồn tại và kiến nghị……… 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 52

PHỤ LỤC……… 58

Trang 6

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Trang 7

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen

AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

Bảng 3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen

sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

Trang 8

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

Biểu đồ3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

Biểu đồ3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen

Biểu đồ3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

Biểu đồ3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

Biểu đồ3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA… 42

Biểu đồ3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

Biểu đồ3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA,

M7-Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA

Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

Biểu đồ3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ

Trang 9

Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

Biểu đồ3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ

Trang 10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM……… … ….5

Hình 1.2.a: Búi sợi nấm (Arbuscules)……… ……… ……6

Hình 1.2.b: Túi sợi nấm (Vesicules)……… ………… …6

Hình 1.3.a : Sợi nấm ngoại bào(extraradical hyphae) ……… ……… 7

Hình 1.3.b : Bào tử (spores) ……… ……… 7

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình………8

Hình 1.5.a: Cây Medicago truncatula phát triển bình thường………… … 11

Hình 1.5.b: Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ……….…… 11

Hình 1.6: Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A rhizogenes(Veena and Taylor 2007)……… ……… ………13

Hình 2.1.a: Gieo hạt Medicago……… ……… ……… … 24

Hình 2.1.b: Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày……… …….……… 24

Hình 2.2.a: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt 25

Hình 2.2.b: Rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA phát triển sau 30 ngày 25

Hình 3.1.a : Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA 31

Hình 3.1.b :Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA 31

Hình 3.2 Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển gen Ri-tDNA Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen); băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA thang chuẩn 100 bp (Fermentas) 32

Hình 3.3.a: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA 32

Hình 3.3.b: Rễ Medicago có gen Ri-tDNA 32

Hình 3.4.a: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR 0,5% agar……… ….37

Hình 3.4.b: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR lỏng…… …… … 37

Hình 3.4.c: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MS 0,5% agar ……….….37

Hình 3.5.a: AM cộng sinh vào rễ Cà rốt và sinh trưởng sợi nấm mới…… … 45

Hình 3.5.b: AM cộng sinh vào rễ Medicago và sinh trưởng sợi nấm mới…… 45

Hình 3.6.a: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 1 tháng 50

Hình 3.6.b: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 4 tháng 50

Trang 11

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nhân loại đang rất nỗ lực trong việc giải quyết 3 vấn đề lớn, đó là (i) Tăng sinh trưởng và năng suất cây trồng, đảm bảo an ninh lương thực và năng lượng, (ii) Giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng với biến đổi khí hậu, (iii) Phát triển bền vững và nâng cao chất lượng cuộc sống(AFCconference 2012)

Các giải pháp sinh học theo hướng ―tiếp cận xanh‖ (Green approach) được nghiên cứu và hưởng ứng áp dụng mạnh mẽ nhằm làm tăng năng suất cây trồng, vật nuôi, giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng tốt nhất với biến đổi khí hậu Nghiên cứu phát triển ứng dụng các chế phẩm sinh học, vi sinh, dần thay thế các loại sản phẩm hóa học cho tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường đang ngày càng được quan tâm và đầu tư phát triển

Nâm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) được nghiên cứu sử dụng

như một loại phân bón sinh học, một mặt có tác dụng làm tăng cường hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, đặc biệt là hấp thụ Lân và giữ nước trên những lập địa thoái hóa, do đó làm tăng sinh trưởng và năng suất, mặt khác nó cũng có tác dụng làm

ổn định cấu trúc, đặc tính sinh học của đất và là yếu tố chỉ thị cho mức độ suy thoái của môi trường đất

Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ tập trung nhiều cho các cây trồng ngắn ngày, công nghệ chế phẩm AM vẫn phổ biến

áp dụng ở dạng thô sơ truyền thống là ―chất nhiễm đất‖ (soil innoculum), bẫy thực vật (AM trap plant), chưa đáp ứng được các nhu cầu đòi hỏi của xản xuất cả về mặt

số lượng, chất lượng sản phẩm, cũng như quy mô và hiệu quả của việc áp dụng vào sản xuất Do vậy, hướng đi đột phá mới trong nghiên cứu AM là công nghệ nhân

sinh khối AMinvitrocó khả năng góp phần giải quyết được các vấn đề tồn tại nêu

trên của các loại chế phẩm AM truyền thống, trong đó môi trường nuôi cấy và giá thể rễ thực vật chủ là những yếu tố rất quan trọng trong nghiên cứu về công nghệ

nhân sinh khối AM invitro

Trang 12

Nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại đã nêu trên của nghiên cứu ứng dụng công nghệ AM, đặc biệt trong lĩnh vực Lâm nghiệp, Đề tài nghiên cứu Thạc

sĩ ―Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro ‖đã được

đề xuất thực hiện Đề tài Thạc sĩ này của tôi được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài cấp Nhà nước về ―Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) cho cây Lâm nghiệp‖thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và

ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu chung

Nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng

sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi

trường

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được môi trường phù hợp cho hình thành cộng

sinh và nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro

- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được giá thể mô rễ phù hợp cho nhân sinh khối

cộng sinh nấm rễ AM in vitro

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1.Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng

cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng

dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường

1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được loại môi trường và giá thể mô

rễ phù hợp nhất cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, làm nguyên

liệu sản xuất chế phẩm AM phục vụ gây trồng cây lâm nghiệp

1.4 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm

Trang 13

Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM

1.1.1.Khái niệm

Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm trong đất với rễ của thực vật bậc

cao.Frank là người đầu tiên phát hiện ra đặc điểm kết hợp đặc biệt này ở rễ của cây

Cupulifereae vào năm 1885 và gọi đó là mycorrhiza Từ ―mycorrhiza‖ có nghĩa là

―nấm- rễ‖, tác giả đã dùng từ này để nhấn mạnh mối quan hệ giữa nấm và rễ cây (Roger et al 2004a)

Nấm rễ nội cộng sinh AM được xác định là mối quan hệ không thể thiếu ở hầu hết các loài thực vật (hơn 90% các loài thực vật có khả năng hình thành cộng sinh AM) Sự kết hợp đó mang lại lợi ích cho cả thực vật và vi sinh vật, qua đó, nấm có được các hợp chất đồng hóa từ thực vật để sống, đồng thời nấm lại giúp rễ cây tăng cường khả năng hấp thụ nước, các chất hữu cơ hòa tan trong đất đặc biệt

là phospho, chống chịu các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng

Do đó, có tác dụng cải tạo và ổn định cấu trúc đất, cân bằng hệ sinh thái.Quan hệ cộng sinh này đặc biệt thể hiện vai trò trên những vùng đất khô cằn, hệ sinh thái bị xáo trộn nghiêm trọng, nghèo dinh dưỡng hay có tiềm năng độc hại cao Vì vậy công nghệ AM có khả năng áp dụng rộng cho nhiều loài cây lâm nghiệp, không chỉ giúp tạo ra được nguyên liệu cây trồng rừng có chất lượng cao, khả năng thích nghi

và năng suất tốt trên những lập địa cằn cỗi mà còn đáp ứng tốt nhất cho nhu cầu sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất đai theo mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng rừng nhưng không cạnh tranh với đất trồng cây nông nghiệp, tăng cường hiệu quả

sử dụng các vùng đất hoang hóa theo cách bền vững và thân thiện với môi trường

Mycorrhiza có phân bố ở hầu khắp các nơi, thấy ở cây cỏ, rêu, dương xỉ, một

số cây lá kim, và hầu hết các cây lá rộng Sự phổ biến cùng với những vai trò tích

cực của nấm rễ đã kích thích việc nghiên cứu về mycorrhiza ngày càng mở rộng và

sâu sắc hơn Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu cơ bản được thực hiện bởi hàng trăm các nhà nghiên cứu từ các nước khác nhau trên thế giới đã đem

lại nhiều kết quả hết sức ý nghĩa cho ứng dụng mycorrhiza trong hệ sinh thái nông

nghiệp,lâm nghiệp và môi trường

Trang 14

Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nấm vào rễ cây chủ, mycorrhiza được phân thành 2 nhóm chính là ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza, EM), và nội cộng sinh (Endomycorrhiza, AM)

Ectomycorrhiza:Ectomycorrhiza có ở những cây gỗ lớn, điển hình là thông,

sồi, cáng lò, những cây có giá trị kinh tế cao, tuy nhiên ectomycorrhiza có tính đặc trưng loài Đặc điểm của ectomycorrhiza là sợi nấm nội bào chỉ xâm nhập vào

khoảng gian bào của các tế bào vùng vỏ rễ và sợi nấm ngoại bào phân nhánh mạnh tạo thành lớp vỏ bao quanh rễ nên làm biến đổi hình thái bên ngoài của rễ Hầu hết

ectomycorrhiza thuộc LớpBasidiomycetes như Agaricales, số ít thuộc

LớpAscomycetes

Endomycorrhiza:Hình thành ở khoảng 80% thực vật bậc cao Đặc điểm của

endomycorrhyza là sợi nấm của chúng xâm nhập vào bên trong tế bào vỏ rễ của

thực vật bậc cao và không gây nên những biến đổi hình thái bên ngoài của rễ, thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp

vỏ bao ngoài rễ Cấu trúc điển hình của endomycorrhiza là sự hình thành những cấu trúc đặc biệt vesicules và arbuscules Ở một số nhóm endomycorrhiza người ta quan sát thấy có vesicules(Vesicular mycorrhiza, VM) hoặc arbuscules (Arbuscular mycorrhiza, AM) hoặc đồng thời cả hai cấu trúc này trong tế bào vỏ rễ (Vesicular arbuscular mycorrhiza, VAM)

Vậy AMlà thể cộng sinh giữa nấm với rễ cây ở thực vật bậc cao mà hình thành nên cấu trúc đặc biệt vesicules, arbuscules trong tế bào vỏ rễ và không gây biến đổi

hình thái ngoài của rễ

Do tính phổ biến, có lợi và không cố hữu cho 1 loài nên nhóm

vesiculesarbuscular mycorrhiza rất được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong

nông nghiệp cũng như trong lâm nghiệp

1.1.2 Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza)

a Phân loại

Trong một thời gian dài AM được xếp vào ngành phụ nấm tiếp hợp

(Zygomycota) do cấu trúc sợi nấm không có vách ngăn, lớp nấm tiếp hợp

(Zygomycetes) Hiện nay, bằng những nghiên cứu mức độ phân tử hệ thống phát

Trang 15

sinh loài đã cho thấy Zygomycota là ngành đa hệ (poli-phyletic), do đó nấm AM được tách ra khỏi ngành Zygomycota hình thành lên ngành mới là Glomeromycota

Phân loại đến cấp họ cho AM được dựa trên 4 tiêu chí cơ bản:

- Cấu trúc mycorrhiza cộng sinh trong rễ

- Phương thức hình thành bào tử khi được phân lập trong đất

- Cấu trúc nội bào tử

- Phương thức nảy mầm bào tử

Hệ thống phân loại AM hiện nay ( dựa trên trình tự của rRNA ) được tóm tắt trong hình sau:

(Nguồn:http://www.google.com.vn/url?source=imglanding&ct=img&q=http://invam.caf.

wvu.edu/fungi/taxonomy)

b Cấu trúc

Nấm rễ nội cộng sinh (AM) có cấu tạo điển hình bao gồm cấu trúc nội bào

(arbuscules, vesicules, sợi nấm nội bào) và cấu trúc ngoại bào (sợi nấm ngoại bào,

bào tử)

Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM

N

Trang 16

 Nhóm cấu trúc nội bào:

Hình 1.2: Búi sợi nấm (Arbuscules) (a)

Túi sợi nấm (Vesicules) (b)

Nguồn:(Hà 2011)

- Arbuscules: là thể giác mút, lưỡng phân, dạng như lông bàn chải, là phần

trao đổi dinh dưỡng chính giữa thực vật chủ và nấm (Gianinazzi et al 2002).Chúng được hình thành bên trong tếbào vỏ rễ(Mosse and Hepper 1975b) và là dấu hiệu

cho biết có hoạt động của mycorrhiza Tùy vào từng loài khác nhau mà arbuscules

cũng có những đặc trưng riêng về hình dạng và sự phân nhánh

- Vesicules: có dạng hình cầu hoặc trứng, có thành tế bào dày, là cơ quan dự

trữ dinh dưỡng cho nấm, có chứa lipit và glycolipit (Mosse and Thompson 1981a)

Nó được tạo thành bởi đoạn giữa hay đầu lồi tận cùng của sợi nấm nội bào, phân

bố trong khoảng gian bào hoặc bên trong tế bào vỏ rễ

- Sợi nấm nội bào: sợi nấm nội bào không có vách ngăn,dạng thẳng hoặc phân

nhánh hình chữ H hoặc Y,chúng cũng hình thành dạng cuộn, tần số xuất hiện của chúng phụ thuộc vào vị trí trong rễ và đặc điểm của từng loài nấm (Morton2000) Sợi nấm vừa là phần chứa chất dự trữ vừa là một phần của con đường vận chuyển

các chất hấp thụ bởi các sợi nấm bên ngoài từ đất tới arbuscules hoặc trực tiếp tới

tế bào rễ của cây chủ (Bieleski 1973)

Trang 17

 Nhóm cấu trúc ngoại bào:

Hình 1.3: a: Sợi nấm ngoại bào (extraradical hyphae)

b: Bào tử (spores)

Nguồn: (Hà 2011)

- Sợi nấm ngoại bào:Sợi nấm ngoại bào không có vách ngăn, vai trò làm tăng

rõ rệt diện tích hấp thụ của rễ cây (Bieleski 1973), cầu sợi nấm hình thành con đường vận chuyển chất dinh dưỡng giữa thực vật cộng sinh và khối đất bám quanh

rễ (Koske and Gemma 1989) Sợi nấm ngoại bào tạo ra chỗ cư ngụ quan trọng của

hệ nấm rễ (Jasper et al 1989, 1991)

- Bào tử:Bào tử có thể dạng đơn hoặc đa bào, chủ yếu hình thành ở đầu của

sợi sinh bào tử nối tiếp với sợi nấm ngoại bào, đôi khi bào tử cũng xuất hiện bên trong rễ (Koske et al 1985), trên bề mặt đất (BeCard and Fortin 1988), trên bề mặt thực vật hay các mảnh phân giải (Blaszkowski et al 1998) Số lượng bào tử hình thành phụ thuộc vào từng loài nấm (Blaszkowski, 1993), loài cây chủ và tính đa dạng của nó (Blaszkowski1993; Hetrick and Bloom1986), độ màu mỡ của đất và chế độ phân bón (Koske et al 1989), đặc điểm vật hậu của cây chủ (Giovannetti and Avio 2002), cường độ ánh sáng (Daft and El Giahmi 1978), và khả năng cạnh tranh của từng loài nấm (Koske et al 1989) Bào tử có kích thước tương đối lớn (50 ÷ 500 µm), lớn hơn nhiều so với bào tử của những loại nấm khác Vai trò của bào tử là phát tán đến nơi sống mới, và khởi đầu quá trình sinh trưởng khi được tách ra từ cơ thể mẹ Do đặcđiểm cấu trúc các thành phần cấu tạo nên bào tử ổn

Trang 18

định trong những điều kiện sinh thái khác nhau nên chúng được coi là tiêu chí quan trọng trong phân loại AM

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình (Bao gồm arbuscules, vesicles, sợi nấm ngoại bào và bào tử)

(Nguồn: http://mycorrhizas.info/vam/vamsoil2.gif)

c Sinh trưởng

AM là thể cộng sinh bắt buộc AM có thể tồn tại một thời gian dài trong đất, thậm chí khi đất bị hạn hay băng giá dưới dạng các mảnh sợi nấm trong các rễ chết hoặc tự do trong đất Tuy nhiên, để sinh trưởng được trong một thời gian dài AM cần có cây chủ để thu nhận cacbon và năng lượng cần thiết Do đặc điểm này mà không thể tiến hành nuôi cấy AM trực tiếp trên môi trường nhân tạo mà cần phải

có giá thể là rễ của thực vật bậc cao

d Chu trình sinh sản và vòng đời

Không có chứng liệu về sự sinh sản hữu tính của AM Nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử đã xác định không có sự tái tổ hợp hoặc ở mức độ rất thấp (Kuhn et al

Trang 19

2001) Vì thế thường giả định rằng bào tử được hình thành bằng sinh sản vô tính bằng bào tử hoặc sợi nấm

Phương thức nảy mầm của bào tử: Trong những điều kiện nhiệt độ thích hợp , bào tử AM sẽ nảy mầm trong đất , trên rễ cây chủ , hình thành sợi nấm tạo mạng lưới hệ sợi phân bố trong đất và ăn sâu vào rễ cây chủ Bào tử có thể tạo ra hệ sợi nấm bên trong cũng như bên ngoài rễ

Sinh sản bằng sợi nấm: Nhiều loài AM có thể nhân lên từ mảnh sợi nấm trong đất hoặc trực tiếp từ thể cộng sinh trên rễ cây Đặc điểm của nấm rễ nội cộng sinh AM

là thể cộng sinh bắt buộc với rễ cây chủ, do đó nếu không có rễ cây chủ cho các sợi nấm nảy mầm và cộng sinh thì sinh trưởng của nấm sẽ bị ngừng trệ lại sau một thời gian và tế bào chất có thể co lại bên trong bào tử

Phương thức nuôi cấy: Để nuôi cấy nấm rễ nội cộng sinh AM , có thể sử dụng

hai phương thức nuôi cấy , đó là: nuôi cấy in vitro và in vivo Đối với nuôi cấy in

vivo, có thể nuôi cấy trong chậu bằng đất hiện trường có chứa bào t ử hay sợi nấm

(Bianciotto và cộng sự , 2000; Hijri và cộng sự , 2002) Còn đối với nuôi cấy in

vitro, có thể tạo ra một số lượng lớn nấm rễ thông qua nuôi cấy mô rễ trên môi

trường nuôi cấy nhân tạo (Fortin et al 2002) Đặc biệt là trong nuôi cấy mô rễ, sinh khối nấm rễ tạo ra thường không chứa tạp chất và các vi sinh vật khác nên phương pháp này được sử dụng nhiều

1.1.3 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ

Nấm rễ là thể sống cộng sinh bắt buộc Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật dưới dạng đường hexoses và các vitamin Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang

nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào Tại các sợi nấm nội

bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipit… cho hoạt động của nấm (Turmel 2004) Gần 20% cacbon do thực vật tổng hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu cơ trong đất

Trang 20

Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ các chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ dinh dưỡng lân (P), hấp thụ nước, chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường, đặc biệt trên các hiện trường đất đai cằn cỗi, khô hạn Hoạt động này được tăng cường

là do nấm rễ nội cộng sinh hình thành nhiều hệ sợi nấm phân nhánh mảnh tạo thành vô số cầu nối giữa môi trường đất với các tế bào rễ, tăng diện tích tiếp xúc với đất, biến đổi môi trường quanh rễ làm cho các chất trở nên linh động và thực vật có thể hấp thụ được (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được cung cấp nhờ nấm) (Turmel 2004) Sợi nấm có thể lan rộng đến 8cm quanh rễ và hấp thụ chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao gấp

6 lần so với qua các lông rễ

Không những thế, thực vật còn được hưởng lợi nhờ được tăng cường khả năng hấp thụ nước và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh AM có vai trò kích thích sinh trưởng thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như auxins, cytokinins, gibberellic acids và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ chống lại các mầm bệnh từ trong đất

Sự cộng sinh AM có thể làm tăng cường sinh trưởng của cây con lên đến 400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn và nghèo dinh dưỡng (Pope 2007) Thực tế ở những loài gỗ lớn có cộng sinh AM cho thấy cây vẫn tồn tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây không có cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh AM đạt ngang với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng bằng một nửa Những loài sống phụ thuộc vào AM chủ yếu là ở những nơi đất chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh dưỡng tồn tại nhiều

ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ đến sự lan rộng của hệ sợi nấm

Trang 21

Hình 1.5 Cây Medicago truncatula phát triển bình thường (a)

Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ (b)

Nguồn:(Lan 2011)

Nấm AM không phải là một thành phần chính trong đất nhưng có vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh hoạt tính sinh học của đất nhờ sự phân bố rộng khắp của hệ sợi nấm AM trong lớp đất tầng mặt Nấm AM hấp thụ trực tiếp hợp chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính của carbon và năng lượng trong đất, chúng phân phối carbon này khắp cả khu vực đất quanh rễ cây cho vi sinh vật đất sử dụng Lượng cacbon đáng kể được vận chuyển bằng hệ sợi nấm từ cây này sang cây khác đã được xác định (Simard et al 1997) Điều này giúp giảm

sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổn định và đa dạng của

mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi những nông dân

sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh học mycorrhiza thì năng

Trang 22

suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập của nông dân tăng 61% so với khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa học

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses

Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses lần đầu tiên được phát hiện cách đây

hơn 70 năm (Riker et al 1930, Hildebrand 1934, White 1972) như một yếu tố gây

nên bệnh ―lông rễ― (hairy-root disease) ở một số thực vật A rhizogenses thuộc Chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất, gram âm, có hình que A rhizogenses có quan

hệ gần gũi với vi khuẩn A tumefaciens, một loại vi khuẩn được biết nhiều đến vì

gây nên bệnh ―u biếu thực vật― (crown gall disease) rất phổ biến (Conn 1942)

Cơ chế nhiễm thông qua quá trình tiếp xúc, vi khuẩn A rhizogenses chuyển

một đoạn T-DNA, trong đó có mang các gen liên quan đến tạo lông rễ(rol-genes), gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp và cả các gen chưa xác định được chức năng trong vòng Ri- Plasmid của chúng vào bộ gen của tế bào thực vật chủ; các gen (rol-genes) trong T-DNA tương tác với gen của thực vật chủ để tạo ra lông rễ Các biểu hiện gen có chứa các thông tin được mã hóa trong T-DNA này đã thúc đẩy quá trình phát triển và sản xuất ra lông rễ với hầu hết các thực vật hai lá mầm (Veena and Taylor 2007) (Hình 1.6) Quá trình chuyển các gen (rol-genes) trong T-

DNA từ vi khuẩn A rhizogenses sang thực vật chủ có thể được xảy ra ngẫu nhiên,

cũng có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật đồng nuôi cấy đơn giản với các

chủng A rhizogenses hoang dại tự nhiên (Abdoulaye 2003, Chabaud et al 2006),

và cũng có thể thực hiện bằng kỹ thuật biến nạp gen hiện đại (Pak et al 2009, Park

et al 2011)

Vi khuẩn A rhizogenses tiếp cận chuyển gen T-DNA sang thực vật chủ

thông qua các ―vết thương―, các hợp chất phenolic tiết ra từ các vết thương của tế

bào thực vật đã hấp dẫn A rhizogenses, sau quá trình nhiễm là quá trình hợp nhất các nguyên liệu di truyền T-DNA của A rhizogenses với hệ gen thực vật chủ, và

kết quả tạo nên bệnh lông rễ (Veena and Taylor 2007) Về hình thái học, lông rễ

tạo ra do vi khuẩn A rhizogenes có hình dạng và cấu trúc rất giống với các loại rễ

thông thường, tuy nhiên nó có những tính trạng rất đặc trưng, dễ dàng nhận biết là:

Trang 23

tóc rễ dài, sinh khối rễ lớn, phân nhánh nhiều, tóc rễ phát triển nghiêng và không

có tính hướng đất (negative geotropism)

Bệnh lông rễ từ vi khuẩn A rhizogenses được nghiên cứu áp dụng rộng rãi

như một công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu trao đổi chất thứ cấp, chức năng gen, cộng sinh vi khuẩn cố định đạm rhizobium, nấm rễ nội cộng sinh AM

(Abuscular mycorhizae), và các đặc tính sinh học rễ thực vật khác (Tsuro et al

2005, Chabaud et al 2006, Veena and Taylor 2007, Sidwa-Gorycka et al 2009, Park et al 2011)

Hình 1.6:Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A rhizogenes

(Veena and Taylor 2007)

1.3 Nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam

1.3.1 Trên Thế giới

Giai đoạn đầu, các nghiên cứu về AM trên thế giới tập trung ở các mặt: đa

dạng sinh học của các chủng bản địa, phân loại, chọn lọc các chủng hiệu lực với từng đối tượng cây trồng và đất trồng khác nhau, đồng thời phát triển những phương pháp để định lượng và nhân nhanh chúng Phương pháp nhân sản xuất chất

Trang 24

nhiễm AM truyền thống là sử dụng các thực vật chủ (trap plant) để nhân AM trong

nhà kính, vườn ươm từ hệ rễ của chúng trên các giá thể gây trồng khác nhau (in

vivo) Bằng phương pháp này, chất nhiễm AM thu được còn được gọi là ―soil

innoculum‖ ở dạng thô, thường có độ sạch AM không cao, số lượng, chất lượng

AM (IP- infective propagules) và hiệu quả áp dụng còn bị hạn chế Vấn đề đặt ra là cần có một công nghệ cao hơn, hiệu quả hơn để có thể nhân sinh khối lớn, sản xuất chế phẩm chất nhiễm AM thuần khiết, chất lượng và có hiệu quả áp dụng cao cho tăng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm cây trồng và bảo vệ môi trường đất Trong công nghệ này, chúng ta cần phải chú ý tới một đặc tính quan trọng của nấm rễ nội cộng sinh AM, đó là, trong bất kỳ điều kiện nuôi cấy nào, ở bên ngoài môi trường

đất (in vivo) hay trong điều kiện nuôi cấy vô trùng (invitro), sinh khối của chúng

chỉ có thể được nhân lên khi hình thành được cộng sinh với tế bào vỏ rễ của các thực vật chủ Do đó, việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nhân tạo không có giá thể mô rễ không đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng, phát triển của AM (Roger et

al 2004b)

Nghiên cứu về AM thường xuyên bị cản trở bởi đặc tính cộng sinh bắt buộc

của chúng (Bago and Bécard 2002) Một hướng nghiên cứu mới đó là, nuôi cấy in

vitro đã phát huy được rất nhiều lợi thế, nó cho phép nghiên cứu được cơ bản

những đặc tính sinh lý của sự cộng sinh nấm-rễ Những nghiên cứu thử nghiệm đầu tiên đã được tiến hành, có thể kể đến như (Mosse and Hepper 1975a) Sau đó được bổ sung bởi (Fortin et al 2002)(Declerck et al 2005)

Trong những năm 1980, sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô rễ đã mở ra một hướng đi mới, cho phép nuôi cấy thành công một số chủng AM trong điều

kiện in vitro Sử dụng phương pháp này, nấm AM và rễ cây được nhân lên đồng

thời và nhanh chóng qua một số lần cấy chuyển, thời gian được rút ngắn rất nhiều

và đảm bảo được độ thuần khiết cao (Fortin et al 1996b)

Hai loại môi trường được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy AM in

vitro là môi trường M(BeCard and Fortin 1988) và môi trường MSR (Strullu and

Romand 1986, Declerck et al 1998) Cả hai loại môi trường này đều có chứa các nguyên tố đa lượng, vi lượng, vitamin và đường (Cranenbrouck et al 2005) Đồng

Trang 25

thời, chúng có thể được làm rắn bởi hợp chất Agargel hoặc Phytagel Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Gadkar và cộng sự (Gadkar et al 2006) đã tiến hành nuôi cấy

AM trên môi trường M lỏng bằng phương pháp chia ngăn Theo đó, một ngăn của đĩa petri nuôi cấy nấm có cung cấp thêm đường, ngăn còn lại không có đường cũng như

vitamin Giống như trong phương pháp nuôi cấy in vivo, việc cung cấp đầy đủ ôxi cho môi trường lỏng là việc làm cần thiết trong nuôi cấy in vitro(Jolicoeur et al 1999)

Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi trường MSR (Strullu and Romand 1986, Declerck et al 1998) là môi trường đã được biến đổi thành phần với

mục đích tối ưu hóa cho sự phát triển của nấm rễ trong điều kiện in vitro Trong đó,

thành phần đa lượng của MSR là tương tự trong môi trường M (Minimal medium)

Sự khác nhau giữa hai loại môi trường này là ở thành phần vitamin: MSR vừa thiếu iốt, myo-inositol và glycin còn trong thành phần vitamin của môi trường M thiếu panthotenate, biotin và cyanocobalamine Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng,

sự vắng mặt của những thành phần này không có hiệu quả tiêu cực rõ rệt đến sự cộng sinh AM

Trong những năm 2000, rất nhiều nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy AM in

vitro được tiến hành trên môi trường MSR (Strullu and Romand 1986, Declerck et

al 1998) không bổ sung đường và vitamin (Voets et al 2005a)(De Boulois et al 2006)và được làm rắn bởi Phytagel hoặc Agargel Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc

bổ sung đường và vitamin là không cần thiết trong hệ thống nuôi in vitro vì thực

vật có khả năng tự quang hợp tạo đường và chuyển hóa vitamin cần thiết cho sự phát triển của chúng Nghiên cứu của (Declerck et al 2009) cũng sử dụng MSR mà không có đường và vitamin

Năm 1996, St-Arnaud và cộng sự (St-Arnaud et al 1996) lần đầu tiên sử dụng phương pháp chia ngăn Trong phương pháp này, đĩa petri được chia thành hai ngăn riêng biệt, một ngăn có chứa giá thể rễ, ngăn còn lại chỉ có AM phát triển

Sử dụng phương pháp phân chia đĩa, (Douds 2002a) đã chứng minh được rằng, bào

tử AM tiếp tục được hình thành sau khi có sự bổ sung môi trường có đường từ ngăn chứa giá thể rễ

Trang 26

Việc nghiên cứu về AM được thực hiện bởi rất nhiều nhà khoa học, có thể

kể đến như (Chabot et al 1992)(Declerck et al 2001)(Douds 2002b)(St-Arnaud et

al 1996) Giá thể đầu tiên được sử dụng cho nuôi cấy này là rễ Cà rốt Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nhiều loại giá thể khác nhau đã được đưa vào sử dụng

thành công như Chicory (Cichorium intybus L.) và Medicago(Medicago truncatula

Gaertn)(Boisson-Dernier et al 2001)(Fontaine et al 2004) Tuy nhiên, việc sử

dụng các loại giá thể khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến việc sản sinh bào tử

AM (Tiwari and Adholeya 2003) Voets và cộng sự, 2005 (Voets et al 2005b) đã

nghiên cứu sử dụng giá thể là rễ cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) và thu được

gần 12.000 bào tử/ đĩa petri sau 12 tuần nuôi cấy Gần đây, một kết quả nghiên cứu

khác đã thu được gần 50.000 bào tử/đĩa petri khi cộng sinh giữa chủng G

intraradices (MUCL 41.833) với rễ cây Medicago sau 14 tuần nuôi cấy Một số giá

thể khác như chuối (Koffi et al 2009) hay nho cũng có khả năng cộng sinh với AM nhưng không đáp ứng được nhu cầu áp dụng sản xuất bào tử trên quy mô lớn

Năm 1996, Fortin và cộng sự (Fortin et al 1996a) đã trình bày phương pháp

nuôi cấy AM in vitro sử dụng 2 nguồn nguyên liệu là rễ đã được chuyển gen

Ri-tDNA hoặc chưa được chuyển gen Phương pháp chọn cây chủ, kỹ thuật cộng sinh

rễ AM, thành phần môi trường nuôi cấy Nghiên cứu cũng đồng thời trình bày khả

năng nuôi cấy và tạo bào tử liên tục trong môi trường in vitro, phương pháp bảo quản bào tử trong thời gian dài Những lợi ích khi nuôi cấy AM in vitro, cho phép

phát triển nghiên cứu sâu và rộng hơn như hình thái AM, phân loại và tìm hiểu cơ chế cộng sinh với rễ

Trong nghiên cứu nhân sinh khối rễ có mang Ri-plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes, nhóm tác giả (Mugnier and Mosse 1987) đã quan sát

thấy có sự hình thành nhiều lông rễ trong môi trường nhân tạo và đã thúc đẩy cơ sở

cho nhân sinh khối AM in vitro Tác giả đã quan sát thấy sự cộng sinh hình thành giữa AM và rễ chuyển gen khi nuôi cấy cùng với bào tử Glomus mosseae Tuy

nhiên đã có sự sinh trưởng giới hạn và chu trình sinh trưởng phát triển hoàn chỉnh

của AM trong môi trường in vitro chưa được hoàn thiện Trong nhiều nghiên cứu sau đó, các nhóm tác giả đã nghiên cứu AM in vitro theo nhiều hướng khác nhau

Trang 27

nhằm tìm ra điều kiện để thu hồi được sinh khối AM chất lượng nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất Các nghiên cứu bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, phương thức cộng sinh, phương thức nuôi cấy, phương thức thu hồi AM… Một trong những kết quả nổi bật có thể kể đến là (Fortin et al 1996b) đã thu hồi được

30.000 bào tử sau 6 tuần nuôi cấy AM in vitro qua rễ Cà rốt có chuyển gen Ri trên

đĩa petri và thu hồi được 120.000 bào tử AM sau 2 tháng nuôi cấy bằng bioreator Đây là kết quả hết sức có ý nghĩa để phát triển và hoàn thiện công nghệ nhân

nhanh AM in vitro

(Jolicoeur et al 1999) đã công bố sản suất chế phẩm từ loài Glomus

intraradices bằng bioreactor Bằng phương pháp nuôi cấy Glomus intraradices với

rễ cây Cà rốt được chuyển gen Ri-tDNA của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

trên đĩa petri và bioreactor đã cho kết quả tăng sinh khối AM cực đại đạt ~ 0,6g sinh khối khô trong 1lít môi trường, khi phát triển quả giá trị đó sinh trưởng của rễ

sẽ bị suy giảm Trong điều kiện tối thích nuôi cấy trên đĩa petri, tốc độ sinh trưởng

rễ tối đa và bào tử G intraradices lần lượt là 0,021 và 0,035/ngày Nghiên cứu

bước đầu nhân sinh khối AM trong bioreactor luân chuyển khí đã cho kết quả thấp hơn so với nuôi cấy trên đĩa petri 10 lần và cũng thấy sự hình thành cộng sinh ít hơn (0,13g sinh khối khô trong 1 lít môi trường) Kết quả nghiên cứu đã mở ra khả năng nhân nhanh bào tử AM bằng bioreactor

Gần đây, tháng 1 năm 2009, nhóm tác giả Venter, Marianne, Wilma đã báo cáo kết quả nghiên cứu trình bày thông tin khá đầy đủ và toàn diện về nhân sinh

khối AMin vitro,bao gồm: phương pháp tạo cộng sinh AM, nhân sinh khối bào tử

AM trong môi trường in vitro, các bước phân lập bào tử từ môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu cũng tạo ra hạt bào tử có nhiều đặc điểm ưu trội như mật độ bào tử cao, có tính ổn định và phân tán tốt trong môi trường đất Hạt bào tử có thể áp dụng trong sản xuất nông lâm nghiệp như một loại chế phẩm có thể dùng trực tiếp Nghiên cứu cũng đề cập đến một số thành phần có thể bổ sung vào hạt bào tử làm tăng tác dụng ở hiện trường như chất kích thích sinh trưởng, các chất trao đổi thứ cấp

Công nghệ nhân sinh khối AMinvitro và chế phẩm AM tinh khiết của Viện

Trang 28

Năng lượng và Tài nguyên (TERI), Ấn Độ là một bước đột phá công nghệ quan trọng trong lịch sử nghiên cứu AM trên thế giới, đã mang lại cơ hội áp dụng lớn

hơn và hiệu quả hơn Công nghệ AM in vitro đã được TERI chuyển giao áp dụng

tới 5 nước khác trên thế giới, hiệu quả cho gây trồng nhiều loài cây nông lâm nghiệp, trong đó có Cọc rào, đặc biệt hiệu quả cho các vùng sinh thái suy thoái nghiêm trọng như vùng cát khô cằn, bãi thải khai thác và vùng ô nhiễm chất thải(Adholeya and Singh 2006)

Trong nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh AM in vitro, mô rễ Cà rốt (Daucus

carrota L.) chuyển gen Ri-tDNA được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả cho các

nghiên cứu cộng sinh AM in vitro, sản xuất sinh khối AM invitro và sản xuất chế

phẩm AM (Declerck et al 1996, Douds Jr 1997, Abdoulaye 2003, Ijdo et al 2011)

Mặc dù, hiện nay, phương pháp nuôi cấy AM in vitro vẫn còn một vài hạn

chế như việc cần đầu tư khá tốn kém về nhân lực cũng như trang thiết bị phục vụ cho nghiên cứu nhưng với những ưu thế của nó, đặc biệt là việc có thể kiểm soát chất lượng chế phẩm AM cũng như giảm nguy cơ ô nhiễm thì trong tương lai, đây

sẽ là một hướng đi mới có khả năng đáp ứng được tiêu chuẩn chất lượng cho sản xuất thương mại hàng loạt

Trong những thập kỷ qua, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về AM theo

cả chiều rộng lẫn chiều sâu Với hơn 40 bằng sáng chế liên quan đến AM, trong đó

có nghiên cứu về những đặc tính có lợi của AM Một số nghiên cứu lại tập trung vào kỹ thuật nuôi cấy (Sylvia and Jarstfer 1992), một số khác nghiên cứu các ứng dụng của nó (Cano and Bago 2007)(Fernandez et al 2006), và phương pháp nuôi cấy trên các loại giá thể khác nhau (Mosse and Thompson 1981b) hoặc nuôi cấy

trong điều kiện in vitro(Declerck et al 1996)(Cranenbrouck et al 2005)(Declerck

et al 2009)(Fortin et al 1996b)(Mugnier et al 1986)(Wang 2003)

Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu phát triển công nghệ AM cho mục tiêu phục vụ cây trồng nông lâm nghiệp, làm tăng sinh trưởng, năng suất và chất lượng sản phẩm cũng như phục vụ các mục tiêu làm sạch môi trường, góp phần làm cân bằng ổn định các hệ sinh thái đang ngày càng được quan tâm đầu tư nhiều hơn về

Trang 29

mọi khía cạnh, nghiên cứu chuyên sâu và mở rộng lĩnh vực áp dụng công nghệ và sản phẩm Nhiều trung tâm nghiên cứu lớn về AM trên thế giới được thành lập để tiếp tục phát triển và ứng dụng không chỉ những sản phẩm AM mà còn cả những giải pháp công nghệ cho thực tiễn sản xuất, các hệ sinh thái và môi trường sống Một số trung tâm lớn có thể kể đến như INVAM (Mỹ), GINCO (Canada), CESAMM (Bỉ), Mycorrhiza Association (Úc), TERI (Ấn Độ), ACT (Đài Loan) v.v

1.3.2 Trong nước

Ứng dụng nấm rễ ngoại cộng sinh Ectomycorrhiza cho sản xuất cây con thông

nhựa đã được nghiên cứu bằng việc sử dụng đất mùn rừng thông như một loại chất nhiễm tự nhiên (natural soil innoculum) và tuyển chọn sản xuất chất nhiễm nhân tạo (Giao and Nhâm 1988) Tuy nhiên, quy mô & kết quả áp dụng còn rất hạn chế

Lê Quốc Huy với nghiên cứu kỹ thuật mycorrhiza cho lâm nghiệp (Viện

nghiên cứu năng lượng TATA, New Delhi - Ấn Độ, 1999)(Huy 1999) đã đưa ra

một hướng đi mới cho nghiên cứu mycorrhiza ở Việt Nam

Nghiên cứu Ectomycorrhiza cho Bạch đàn và Phi lao (Phạm Quang Thu, Viện

Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, (Nguyễn Văn Mão, Trường Đại học Lâm nghiệp)

đã có những kết quả bước đầu ứng dụng thử nghiệm vườn ươm và rừng trồng Sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh đa chủng chức năng cho cây Lâm nghiệp (Phạm Quang Thu, 2001- 2004) Đề tài đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh

cho Thông và Bạch đàn dưới dạng bột chứa bào tử hữu tính của nấm Pisolithus

tinctorius và một số vi sinh vật chức năng Hiệu quả của chế phẩm khi nhiễm cho

bạch đàn PN2 trồng trên các lập địa thoái hoá cho thấy có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh hỗn hợp dạng viên nén cho bạch đàn và thông trên các lập địa thoái hoá, nghèo chất dinh dưỡng(Thu 2006-2010)

Chế phẩm nấm rễ ngoại cộng sinh (ECM) dạng viên nang (gel) đã được

nghiên cứu và áp dụng thử nghiệm cho đối tượng cây Sao đen (Hopea odorata),

nhằm tăng sinh trưởng, sản xuất cây con Sao đen chất lượng cao cung cấp cho trồng rừng Kết quả áp dụng đã làm tăng sinh trưởng cây con sao đen tại vườn ươm

Trang 30

lên 50-80% so với đối chứng Tuy nhiên, vấn đề tồn tại cần được tiếp tục nghiên cứu giải quyết đối với chế phẩm ECM dạng này đó là tỷ lệ sống sót của các sợi nấm ECM trong viên Gel giảm nhanh chóng sau một thời gian bảo quản, và làm sao để bảo quản cho sử dụng dạng chế phẩm này trong một thời gian dài, tối thiểu

là 6 tháng cũng đã được đặt ra (Châu and Huy 2007)

Các nghiên cứu trên chủ yếu tập trung nấm rễ ngoại cộng sinh

Ectomycorrhiza Dotính chất đặc biệt của Nấm rễ nội cộng sinh Abuscular mycorrhiza (AM), việc nghiên cứu AM cần có phương pháp tiếp cận khác; các

chủng AM phân lập tuyển chọn từ một đối tượng cây chủ này có khả năng ứng dụng hiệu quả cho nhiều loài cây trồng khác, nghiên cứu và ứng dụng AM trong lâm nghiệp hiện nay tại Việt Nam là một đòi hỏi hết sức cần thiết

Đề tài Nghiên cứu, áp dụng kỹ thuật phát triển cộng sinh mycorhiza cho một

số cây trồng chính tại một số vùng sinh thái phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững ở Việt Nam (Viện Thổ Nhưỡng Nông Hoá 2004 -2006) đã cho thấy vai trò của cộng sinh nấm rễ cây không chỉ thúc đẩy sinh trưởng mà còn ảnh hưởng tốt đến năng suất cây trồng nông và lâm nghiệp

Nghiên cứu sự đa dạng nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ

đất ô nhiễm chì(Chính and Cường 2007)

Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy dung dịch lỏng (MS cải tiến) in vitro Keo

lai và Keo tai tượng (hay gọi là phương pháp ―nuôi cấy trên cầu giấy‖) nhằm làm nảy mầm bào tử AM và xúc tiến quá trình hình thành cộng sinh AM trong rễ Keo

đã được tiến hành thành công(Huy and Châu 2004) Kết quả phương pháp là một

cơ sở quan trọng cho thử nghiệm phát triển phương pháp nuôi cấy nhân nhanh sinh

khối AM in vitro và Bioreactor cải tiến cho sản suất chế phẩm AM

Những kết quả bước đầu về phân lập, tuyển chon các chủng AM cho sản xuất

thử chế phẩm in vivo và nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của bón nhiễm một số loại

chế phẩm AM tới sinh trưởng và năng suất quả hạt của cây Cọc rào tại vườn ươm

và rừng trồng rất khả quan (thực hiện tại Trung tâm CNSH Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) Tại vườn ươm, khi áp dụng bón nhiễm chế phẩm AM 25mg/cây (200IP) đạt được phản ứng sinh trưởng cao nhất của cây con Cọc rào về đường kính (D), chiều cao (H) và sinh khối (P) sau 24 tuần thí nghiệm,

Trang 31

tăng hơn so với đối chứng tương ứng cho các chỉ tiêu là 18,8%, 27,4% và 63% (Vũ Quý Đông, 2009)

Tương tự, kết quả đánh giá mức độ cộng sinh AM trong tế bào rễ cây Cọc rào vườn ươm với các loại chế phẩm AM và công thức nhiễm khác nhau đã được nghiên cứu tiến hành tại Trung tâm CNSH Lâm nghiệp: công thức FM1 25mg/cây

(≈200IP), loại chế phẩm AM in vitro của TERI cho thấy mức độ cộng sinh AM - rễ

cao nhất (F: 96,67%, và A: 39,79%, cao hơn so với đối chứng (F: 83,33% và A: 16,62%) (Vũ Quý Đông, 2009)

Kết quả áp dụng bón nhiễm chế phẩm AM cho Cọc rào trồng rừng tại vùng cát khô hạn Ninh Phước, Ninh Thuận sau 01 năm trồng đã làm tăng năng suất hạt trung bình đạt 25-35% so với đối chứng không bón nhiễm(Huy et al 2009)

Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ khởi đầu,

chưa có những nghiên cứu chuyên sâu và hệ thống về công nghệ chế phẩm AM in

vitro và do đó kết quả và sự ứng dụng còn rất hạn chế.Phát triển nghiên cứu ứng

dụng công nghệ AM trong nông lâm nghiệp, phục vụ gây trồng rừng, quản lý phục hồi sinh thái là một hướng đi quan trọng, phù hợp với những nỗ lực phát triển trên thế giới

Chương 2: VẬT LIỆU -NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Hạt Cà rốt (Daucus carrota L.), hạt Medicago (Medicago truncatula) được

sử dụng để tạo vật liệu mô rễ in vitro không có gen Ri-tDNA tại Trung tâm Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

- Mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.)in vitro được nghiên cứu tạo ra tại Phòng

thí nghiệmCông nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam; trong khi đó mô rễ

Medicago ( Medicago truncatula) in vitro có Ri-tDNA được cung cấp từ Phòng thí

nghiệm AM của Trung tâm CESSAM (Trung tâm nghiên cứu Nấm rễ nội cộng

sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ)

- Chủng AM sử dụng cho nghiên cứu bao gồm (i) chủng 41833 (Glomus

intraradices)được cung cấp từ trung tâm CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm

rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ), trong báo cáo này được gọi tắt là chủng AM 41 (ii) chủng M7 (Glomus sp.) là

chủng bản địa được phân lập, tuyển chọn tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh

và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, trong báo cáo này được gọi tắt là chủng AM7

- Chủng AM sử dụng cho nghiên cứu bao gồm (i) chủng 41833 (Glomus

intraradices) được cung cấp từ trung tâm CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm

rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ), (ii) chủng M7 (Glomus sp.) là chủng bản địa được phân lập, tuyển chọn tại Phòng

thí nghiệm Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

- Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses: Chủng A4 từ Phòng thí nghiệm CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học

Catholique, Louvain-la-Neuve, BELGIUM)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Trang 33

2.2.1 Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro

- Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) và

Medicago (Medicago truncatula) in vitro không có gen Ri-tDNA

- Nghiên cứu tạo vật liệu mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro có gen Ri-tDNA

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Trang 34

2.3.1.Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả

năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng giá thể là mô rễ Cà rốt và

Medicago có chuyển gen Ri-tDNA cộng sinh với chủng 41833 và chủng M7

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trưởng MSR 0,5% agar (là loại

môi trường đã được lựa chọn với mục đích tối ưu hóa cho khả năng nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trong thí nghiệm ở mục 2.2.2)

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trường nuôi cấy là môi trường

MSR 0,5% agar, pH 5,5

2.3.2 Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro

a Tạo vật liệu mô rễ không chuyển gen Ri-tDNA(Abdoulaye 2003, Chabaud et al 2006)

Hình 2.1: Gieo hạt Medicago (a)

Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày (b)

- Hạt Cà rốt và Medicago đều được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15 phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite 5% trong 30 phút, tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng

- Hạt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít; thực hiện trong bốc cấy vô trùng), 5-7 hạt/đĩa, đậy kín parafin và úp ngược trong tủ ấm

270C và theo dõi nảy mầm trong thời gian 10 ngày

Trang 35

- Sau 7-10 ngày, hạt nảy mầm với đoạn rễ dài khoảng 3 - 5 cm, dùng panh

và dao vô trùng cắt đoạn rễ (khoảng 3 - 4 đốt phân nhánh) và chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skook 1962)có bổ sung IBA (Indole butylic acid) với nồng độ 1,5 ppm, cấy chuyển và lựa chọn được các dòng mô rễ Cà rốt và

Medicago in vitro thuần, có sinh trưởng tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo

b Tạo vật liệu mô rễ chuyển gen Ri - tDNA

 Tạo mô rễ invitro(Abdoulaye 2003, Chabaud et al 2006):

Hình 2.2: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 7 ngày gieo hạt (a)

Nhân rễ Cà rốt (b)

- Hạt Cà rốt (Daucus carrota L.) được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15

phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm 30 phút trong dung dịch Sodium hypochlorite 5%; tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng

- Hạt Cà rốt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít; thực hiện trong bốc cấy vô trùng), đậy kín, parafin và úp ngược trong tủ ấm 270C

và chờ nảy mầm trong 10 ngày

- Sau khoảng 10 ngày, hạt nảy mầm với rễ trụ khoảng 1 cm, dùng panh và dao vô trùng cắt bỏ đầu rễ (khoảng 2 mm) và chuyển sang cấy nhiễm vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenseschủng A4 bằng cách ngâm nhúng và phủ toàn bộ bề

mặt rễ trụ và vết cắt vào dung dịch vi khuẩn A rhizogense với nồng độ tế bào 8

triệu cfu/ml

 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogensesChủng A4

(Abdoulaye 2003, Chabaud et al 2006):

Trang 36

Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses Chủng A4được duy trì nuôi cấy trên

môi trườngTY/calcium [5g/l Bacto-tryptone, 3g/l Yeast extract, 6mM CaCl2 (được

bổ sung sau khi hấp vô trùng); pH = 7,2; Agar 15g/l] Sau 48 giờ nuôi cấy trên

môi trường TY/calcium, sinh khối khuẩn lạc A rhizogenses được sử dụng cho cấy nhiễm mô rễ invitro với nồng độ tế bào là 8 triệu cfu/ml

 Cấy nhiễm, đồng nuôi cấy A rhizogenses với mô rễ invitro và chuyển gen:

- Sử dụng môi trường nuôi cấy mô rễ cấy nhiễm A Rhizogenses là môi

trường MS (Murashige and Skoog 1962) (đa lượng, vi lượng, vitamin, không chất kích thích sinh trưởng thực vật) 0,5% agar (Park et al 2011)

- Hạt Cà rốt nảy mầm với rễ trụ đã cắt bỏ típ rễ được ngâm nhúng trong sinh

khối khuẩn lạc A rhizogenses (sau 48 giờ nuôi cấy) trong 5 - 7 phút, và được phủ 1

lớp vi khuẩn, sau đó được cấy chuyển vào môi trường trên nuôi cấy trong tủ ấm

250C trong 48 giờ (tối)

- Cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5% agar), bổ sung kháng sinh

carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A rhizogenes và nuôi cấy phòng sinh

trưởng 200

C, quang chu kỳ là 16 giờ trong 5 - 7 ngày

- Theo dõi và chọn lựa giá thể mô rễ có sự hình thành phát triển lông rễ tốt sau khoảng 7 - 21 ngày

 Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có kháng sinh và tạo ―dòng thuần mô rễ

invitro có Ri-tDNA―:

- Sau 48 giờ đồng nuôi cấy với vi khuẩn A rhizogenses, chủng A4 trong tủ

ấm 250

C (tối), Các mô rễ Cà rốt được cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5%

agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A

giờ: đánh giá hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin

bằng phân tích PCR (polymerase chain reaction) (Sidwa-Gorycka et al 2009)

- Các mô rễ hình thành và phát triển lông rễ tốt nhất, phân nhánh và nhiều

nhất (dấu hiệu hình thái là đã được chuyển gen Ri-tDNA từ vi khuẩn A

rhizogenses) được chọn lọc, cắt và cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5%

agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để tiếp tục loại bỏ vi khuẩn A

Trang 37

mô rễ Cà rốt invitro có Ri-tDNA― (cấy 1 mô rễ 3cm/đĩa petri) (Abdoulaye 2003,

Sidwa-Gorycka et al 2009)

- Các ―dòng thuần mô rễ invitro có Ri-tDNA― (không còn vi khuẩn A

rhizogenes) sau đó được cấy chuyển trên môi trường MSR (0,5% agar), nuôi duy

trì trong phòng sinh trưởng hoặc tủ ấm 270

C và sử dụng làm giá thể cho nghiên

cứu cộng sinh AM (Abuscular mycorrhizae) invitro(Declerck et al 1998, Ijdo et al

2011)

 Kiểm tra mô rễ chuyển gen Ri-tDNA và hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A

rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin bằng phân tích PCR (polymerase

chain reaction):

- Tách DNA từ mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA (đối chứng) bằng kit tách chiết GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Fermentas), các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và có bổ sung 1% PVP vào Lysis Buffer DNA sau đó được điện di trên gen agarose 1% để kiểm tra chất lượng và được đo trên máy quang phổ NanoDrop ND1000 để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu Phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt C1000 Thermal Cycler (BioRad) Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện theo Krolicka et al (2001) Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 l với thành phần bao gồm 10 l PCR Master Mix (Fermentas), 2 l mỗi mồi (10 pmol), 2 l của DNA (10 ng/l) và 6 l nước khử ion vô trùng Chu trình nhiệt gồm: 940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 940C

- 1 phút, 540C – 1 phút 720C – 1 phút, cuối cùng là 720C – 10 phút và lưu ở 120C

GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3‗ để phát hiện các gen rolB và

trong phản ứng PCR để phát hiện các gen rolC của vi khuẩn A rhizogenses (có

trên đoạn T-DNA) trong bộ gen của mô rễ Cà rốt

- Nhằm khẳng định các mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch vi

khuẩn A rhizogenes, phản ứng PCR được tiến hành với các mồi

Trang 38

virG5‗-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(Aoyama et al 1989) để xác định có hay không các gen virG (gen nằm trên vòng

Ri plasmid, ngoại trừ đoạn T-DNA) được chuyển sang mô rễ: Chu trình nhiệt gồm:

940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 940C - 1 phút, 540C – 1 phút 720C – 1 phút, cuối cùng là 720C – 10 phút và lưu ở 120C

2.3.3 Phương phápcấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ

- Rễ phát triển sau khoảng 15 ngày trên môi trường phù hợp, tiến hành cấy chuyển để nhân nhanh sinh khối rễ, các bước tiến hành như sau:

- Dùng dao cắt đoạn rễ đã xác định dài khoảng 3-5 cm

- Dùng kẹp gắp mảnh rễ cấy chuyển sang đĩa petri đã có sẵn môi trường, mỗi đĩa petri cấy 2 đoạn rễ với chiều ngược nhau

- Bọc kín bằng parafilm

- Ghi đầy đủ thông tin trên đĩa petri (loại mẫu, ngày/tháng/năm cấy chuyển)

- Đưa vào tủ nuôi cấy trong điều kiện tối ở 270C

- Thực hiện cấy chuyển nhiều lần trong bốc cấy vô trùng để nhân sinh khối

mô rễ tạo nguồn vật liệu đưa vào cộng sinh với AM

2.3.4.Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro

- Trên đĩa thạch chứa môi trường, cắt bỏ mảnh thạch ở phần chính giữa đĩa

- Trên đĩa thạch chứa vật liệu AM vô trùng đã nảy mầm, cắt lấy AM sao cho mảnh nguyên liệu nằm trọn bên trong phần thạch đã loại bỏ ở đĩa môi trường Dùng dao cẩn thận chuyển vật liệu AM đặt vừa vào phần thạch vừa loại bỏ trên môi trường MSR (the modified Strullu Romand) (Strullu and Romand 1986,

Declerck et al 1998) Cấy chuyển đoạn rễ in vitro lên đĩa thạch chứa AM sao cho

chiều hướng phát triển của rễ mới sẽ chạm sợi nấm

Trang 39

- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, trong tối, ở 270C Theo dõi tiến triển của rễ, sợi nấm, cộng sinh và sinh bào tử mới trên đĩa cấy

2.3.5 Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro

Sau thời gian 4-5 tháng, sử dụng nguồn vật liệu AM đã cộng sinh với rễ làm

nguyên liệu AM vô trùng tạo cộng sinh với rễ in vitro trong bước tiếp theo với mục tiêu nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro Các bước tiến hành như sau:

- Trên đĩa thạch chứa môi trường, cắt bỏ mảnh thạch ở phần chính giữa đĩa

- Trên đĩa thạch chứa vật liệu AM vô trùng đã nảy mầm, cắt lấy AM sao cho mảnh nguyên liệu nằm trọn bên trong phần thạch đã loại bỏ ở đĩa môi trường Dùng dao cẩn thận chuyển vật liệu AM đặt vừa vào phần thạch vừa loại bỏ trên môi trường MSR (the modified Strullu Romand) (Strullu and Romand 1986,

Declerck, Stullu et al 1998) Cấy chuyển đoạn rễ in vitro lên đĩa thạch chứa AM

sao cho chiều hướng phát triển của rễ mới sẽ chạm sợi nấm

- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, trong tối, ở 270C Theo dõi tiến triển của rễ, sợi nấm, cộng sinh và sinh bào tử mới trên đĩa cấy

2.3.6 Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm

a Phương pháp thu thập số liệu

Số lượng bào tử (bt/đĩa petri): Đếm trực tiếp bằng quan sát trên kính hiển vi

soi nổi trên các ô đếm được thiết kế sẵn, tổng các ô quan sát bằng 2/3 diện tích đĩa petri, thu số lượng bào tử ở các khoảng thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng

và 5 tháng sau khi tiến hành cộng sinh giá thể rễ với chủng AM tương ứng, trong báo cáo này các khoảng thời gian trên được gọi tắt tương ứng là T1, T2, T3, T4 và T5

b Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu được sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20 So sánh

ý nghĩa khác biệt các giá trị trung bình của các công thức thí nghiệm bằng phân tích ANOVA Post Hoc Multiple Comparison Test theo tiêu chuẩn Bonferroni và Duncan nếu phương sai bằng nhau và Tamhane‘s T2 nếu phương sai không bằng nhau, p<0,05 được xem là có ý nghĩa

Trang 40

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro

Định dạng
Số trang	90
Dung lượng	2,51 MB

Ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro

Phương pháp tạo vật liệu mô rễ invitro

Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AMinvitro