Nghiên cứu hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của loài thông lá dẹt (pinus krempfii lecomte) và ngũ gia bì hương (acanthopanax trifoliatus l merr )

MỞ ĐẦU Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua, Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá. Ngoài việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học còn tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn. Đây cũng là một phương pháp để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, định hướng cho ngành hóa dược. Theo thống kê dựa vào đơn thuốc ở Mỹ công bố cho thấy trên 50% loại thuốc được kê đơn chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp dựa vào cấu trúc của các hợp chất tự nhiên. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae. Loài này mới chỉ có một công bố duy nhất trên thế giới từ năm 1966 và là một thực vật đặc hữu của Việt Nam, “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC -

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L MERR.)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây

Tác giả luận án

Lê Thị Hồng Nhung

án

Tôi xin chân thành cảm ơn GS TSKH Trần Văn Sung đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi được học tập, nghiên cứu tại Phòng Tổng hợp hữu cơ và cũng là người

đã ủng hộ tôi thực hiện luận án này

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo

Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày…… tháng…… năm 2014

Tác giả luận án

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ………….……….……… v

DANH MỤC CÁC HÌNH ……….…… vi

DANH MỤC CÁC BẢNG……… … iix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………ix

MỞ ĐẦU………….……….……… … ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hai loài nghiên cứu 3

1.1.1 Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 3

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt 3

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu loài Thông lá dẹt 4

1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus 5

1.1.2 Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) 8

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương 8

1.1.2.2 Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương 9

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu của loài Ngũ gia bì hương 9

1.2 Các hợp chất flavonoid 14

1.2.1 Cấu trúc hóa học 14

1.2.2 Hoạt tính sinh học 16

1.3 Các hợp chất triterpene khung lupane 19

1.3.1 Cấu trúc hóa học 19

1.3.2 Hoạt tính sinh học 19

1.4 Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính sinh học của chúng 22

1.4.1 Chuyển hóa nhóm OH 22

1.4.1.1 Chuyển hóa thành ester 22

1.4.1.2 Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine 24

1.4.1.3 Chuyển hóa thành carbamate 26

1.4.2 Chuyển hoá nhóm isopropenyl 27

1.4.2.1 Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) 27

1.4.2.2 Oxy hoá nối đôi ∆ 20(29) 28

1.4.2.3 Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi 28

1.4.3 Chuyển hóa nhóm 28-COOH 29

1.4.3.1 Chuyển hóa thành ester 29

1.4.3.2 Chuyển hóa thành amide 30

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 32

2.1.1 Nguyên liệu 32

2.1.2 Hóa chất 32

2.1.3 Thiết bị 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1.Phương pháp chiết tách 33

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt 33

2.2.1.2 Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương 34

2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc 34

2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 35

2.2.3.1 Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 35

2.2.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 35

2.2.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa 37

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 39

3.1 Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 38

3.1.1 Cặn chiết n-hexane 40

3.1.2 Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) 40

3.1.2.1 Phân lập chất 40

3.1.2.2 Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 42

3.1.3 Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) 43

3.2 Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) 45

3.2.1 Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương 45

3.2.1.1 Quá trình phân lập 45

3.2.1.2 Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 48

3.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 48

3.2.2.1 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 48

3.2.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 57

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

4.1 Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 64

4.1.1 Thành phần hóa học của cặn n-hexane 64

4.1.2 Các chất phân lập được từ cặn EtOAc 65

4.1.2.1 Tectochrysin (PK1) 65

4.1.2.2 Pinostrobin (PK2) 68

4.1.2.3 Pinobanksin (PK3) 71

4.1.2.4 Galangin (PK4) 75

4.1.2.5 Strobopinin (PK5) 78

4.1.2.6 Crytostrobin (PK6) 82

4.1.3 Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH 85

4.2 Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L Merr.) 92 4.2.1 Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì hương 92

4.2.1.1 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) 92

4.2.1.2 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) 95

4.2.1.3 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) 98

4.2.2 Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2 105

4.2.2.1 Các dẫn xuất của AT1 106

4.2.2.2 Các dẫn xuất của AT2 112

4.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa học.117 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 117

4.3.2 Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119

4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa 120

BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HÓA HOÁ HỌC TỪ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU………….… … 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3 β-OH tạo các hợp chất

56.1–56.8

22

Sơ đồ 1.2 Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3 β-OH tạo hợp chất 57 23

Sơ đồ 1.3 Chuyển hóa nhóm 3 β-OH, 28-OH của betulin 23

Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 24

Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá nhóm 3 β-OH của betulinic acid thành ketone,

oxime, amine

25

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid 26

Sơ đồ 1.8 Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin 27

Sơ đồ 1.9 Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid 27

Sơ đồ 1.10 Oxi hóa nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid 28

Sơ đồ 1.11 Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 29

Sơ đồ 1.12 Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid 30

Sơ đồ 1.13 Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid 31

Sơ đồ 3.2 Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt 41

Sơ đồ 3.3 Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt 44

Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương 45

Sơ đồ 3.5 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan của loài

Ngũ gia bì hương

47

Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 106

Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 112

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt 4

Hình 1.3 Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid 14

Hình 4.1 Phổ khối ESI-MS (positive) của chất PK1 67

Hình 4.2 Phổ 1 H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d 6 ) 67

Hình 4.3 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d 6 ) 68

Hình 4.4 Phổ 1 H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD 3 OD) 70

Hình 4.5 Phổ 1 H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD 3 OD) 70

Hình 4.6 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD 3 OD) 71

Hình 4.8 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3 73

Hình 4.17 Phổ 1 H-NMR (giãn) của chất PK5 (500 MHz, CD 3 OD) 81

Hình 4.18 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD 3 OD) 82

Hình 4.19 Phổ 1 H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD 3 OD) 84

Hình 4.20 Phổ 1 H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD 3 OD) 84

Hình 4.21 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD 3 OD) 85

Hình 4.22 Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7 86

Hình 4.23 Một số tương tác chính trong phổ NOESY của chất PK7 87

Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7 88

Hình 4.33 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl 3 ) 95

Hình 4.34 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2 97

Hình 4.35 Phổ 1 H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl 3 ) 97

Hình 4.36 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl 3 ) 98

Hình 4.37 Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3 100

Hình 4.39 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3 101

Hình 4.40 Phổ 1 H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD 3 OD) 102

Hình 4.41 Phổ 1 H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD 3 OD) 102

Hình 4.42 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD 3 OD) 103

Bảng 3.1 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7 50

Bảng 3.2 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12 52

Bảng 3.3 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT15 – AT17 55

Bảng 3.4 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT20 – AT23 58

Bảng 4.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết

n-hexane bằng phương pháp GC-MS

64

Bảng 4.2 Số liệu phổ 1 H- , 13 C-NMR của PK1 và tectochrysin 66

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của PK2 và pinostrobin 69

Bảng 4.4 Số liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin 72

Bảng 4.5 Số liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của PK4 76

Bảng 4.6 Số liệu phổ 1 H - , 13 C-NMR của PK5 và (2S)-Strobopinin 79

Bảng 4.7 Số liệu phổ 1 H-, 13 C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin 83

Bảng 4.8 Số liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và

Bảng 4.11 Số liệu phổ 1 H, 13 C-NMR của AT3 (CD 3 OD, 500/125MHz) 99

Bảng 4.13 Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119

Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 120

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by

Spectroscopy

Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử

HR-ESI-MS

High Resolution Electron Spray

Ionization Mass Spectroscopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử

FT-IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính

bằng ppm (phần triệu)

CC Column Chromatography Sắc ký cột

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan người

Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi

RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư màng tim

12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm

nghiệm MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngoài ra, người ta còn có thể

sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở

nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua, Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá

Ngoài việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học còn tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn Đây cũng là một phương pháp để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, định hướng cho ngành hóa dược Theo thống kê dựa vào đơn thuốc ở Mỹ công bố cho thấy trên 50% loại thuốc được kê đơn chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp dựa vào cấu trúc của các hợp chất tự nhiên

Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae

Loài này mới chỉ có một công bố duy nhất trên thế giới từ năm 1966 và là một thực vật đặc hữu của Việt Nam, “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt ngoài ý nghĩa về khoa học còn có ý nghĩa rất lớn về mặt xã hội

Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae Ngay từ những năm 80 của thế kỷ trước, đã có nhiều

công trình công bố về thành phần hóa học của cây này Nhiều hợp chất triterpene acid có khung lupan với hàm lượng khá cao đã được phân lập và xác định Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình khoa học nào về nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất triterpene từ cây này được công bố

Trên nền tảng đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa học và thăm

dò hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) và Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)”

Mục tiêu của luận án:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii

Lecomte)

2 Nghiên cứu chiết tách các chất, đặc biệt là các triterpene khung lupane có

hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để làm

nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa

3 Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được

4 Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis, khả

năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa của các dịch chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này trong công nghệ hóa dược

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hai loài nghiên cứu

1.1.1 Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt

Thông lá dẹt hay còn được gọi là Thông hai lá dẹt hay Thông lá dẹp, Thông

Sré (Pinus krempfii, tên đồng nghĩa là Ducampopinus krempfii (Lecomte) A Chev), thuộc chi Pinus, họ Thông Pinaceae Loài này được ví như “sứ giả thời tiền sử” -

sinh cùng thời với khủng long, là một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay Hiện tại, Thông hai lá dẹt được xếp ở loài hiếm, mức độ đe dọa có thể bị tuyệt chủng (bậc R) do nạn săn lùng của sơn tràng và do môi trường sống của chúng (rừng) bị thu hẹp đáng kể Loài thông cổ với đặc trưng là có hai lá dẹt hình lưỡi kiếm, là loài đặc hữu của Việt Nam, nó phân bố hẹp ở tỉnh Lâm Đồng

và đây là loài thông được nhiều nhà thực vật học trên thế giới hết sức quan tâm [1], [2], [3], [4]

Thông lá dẹt là những cây đại thụ cao trên dưới 30m, đường kính có thể đạt 1,5-1,6m, đôi khi tới 2m Tán của cây thường khá rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ quạt Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như không có cành nhánh, tròn đều và đâm thẳng vào tán lá Cây mầm thường có khoảng 10-13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn cong về một hướng như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2-3cm, sau đến là các lá nhỏ mọc quanh thân, dài 1,5-2,5cm Khi cây ở độ tuổi non (5-20 tuổi), lá dài và rộng bản (dài 10-15cm) hơn lá cây trưởng thành, xếp như hai lưỡi kéo ở phần đầu cành Khi cây trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4-5cm), màu sẫm, mọc thành búi dày ở đầu cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn [3]

Hạt màu nâu nhạt và có cánh trắng khi chín, hạt có thể phát tán trong một phạm vi tương đối rộng và nón quả còn tồn tại một thời gian trên cây Quả chín vào mùa mưa

Hình 1.1 Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt

(lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam) Trong công trình Thực vật học đại cương của Đông Dương, Hickel cho biết thông lá dẹt thường gặp ở độ cao 1200 - 1500m và cây mọc thành quần thụ lớn Ở Việt Nam, Thông lá dẹt phân bố chính ở Lâm Đồng, song nơi dễ tiếp cận nhất là vùng Cổng Trời, trên dãy Hòn Nga thuộc xã Lát, huyện Lạc Dương, cách thành phố

Đà Lạt 20km hoặc vùng núi Bidoup nằm trong khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Đa Nhim,địa phận Long Lanh, cách thành phố Đà Lạt 50km

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Thông lá dẹt

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một công trình nghiên cứu về thành phần hóa học loài này của Holger Erdtman, Thụy Sĩ được công

bố vào năm 1966 Từ thân gỗ Thông lá dẹt thu tại Nha Trang, Việt Nam, 10 chất là chrysin (5,7-dihydroxyflavone) (1), strobopinin (2), cryptostrobin (3), demethoxymatteucinol (6,8-dimethylpinocembrin) (4), pinosylvin (5), pinosylvin monomethylether (6), tectochrysin (7), pinobanksin (8), pinocembrin (9), pinostrobin (10) đã được nhóm nghiên cứu này phân lập và nhận dạng [4] Điều thú

vị là tất cả các hợp chất này đều thuộc nhóm flavanoid Trong đó, các hợp chất

C-methyl flavanoid như 2, 3, 4, 8, 9 là các hợp chất có cấu trúc thú vị [4],[5]:

RO

HO

5: R = H 6: R = Me

O

O HO

OH

H

R H

8: R = OH 9: R = H

O OH

7

O OH

10

O

O HO

OH

1

O

O HO

OH

H

H H

2

H 3 C

O

O HO

OH

H

H H

4

H 3 C

CH 3

Bên cạnh đó, thành phần chính của nhựa gỗ được xác định là dehydroabietic

acid và của tinh dầu là các monoterpenoid, thành phần đặc trưng có mặt trong hầu

hết tình dầu của các loài thông, đặc biệt là α- và β-pinen

1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Pinus

Trong khi loài Thông lá dẹt mới chỉ được nghiên cứu rất ít thì có nhiều loài

thuộc chi Pinus lại có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh

học đã được công bố và cho thấy có nhiều điều thú vị ở chi này Theo thống kê trên

thế giới đến năm 2012 có trên 450 hợp chất được phân lập từ hơn 80 loài thuộc chi

Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpene (diterpene

khung abietane, cembrane; lignan; steroid….), phenol, flavonoid và flavonoid glycoside [5], [6]

Hầu hết các loài thông đều có chứa tinh dầu và nhựa Thành phần chính là các acid thuộc khung abietane, pimarane và monoterpenoid đặc trưng như α,β- pinene, có thể còn có β- phellandrene (P contorta, P banksiuna) Tuy nhiên, ở một

số loài P sylvestris, P albicaulis lại thấy có sự xuất hiện của sesqui- và diterpene như (+)-δ-cadinene, (-)-torreyol Đặc biệt, loài P jefieyi có thể sản sinh ra loại nhựa

mà thành phần chính của nó là n-heptane, một hợp chất không có sự liên quan nào

đến các hợp chất terpene

torreynol

H H

H OH

Bảng 1.1 Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi Pinus

Một điều thú vị là thân gỗ của hầu hết các loài Pinus nghiên cứu đều có chứa

các hợp chất flavonoid như pinosylvin (5), pinobanksin (8), pinocembrin (9), và các

dẫn xuất monomethyl của chúng Ngoài ra, phần lớn các hợp chất xác định được từ

chi này là các hợp chất terpene như thunbergene được phân lập từ hai loài P

thunbergii, P Albicaulis và lambertianic, communic acid – hai diterpene khung labdane có mặt trong các loài P lambertiana, P Elliottii tương ứng Từ hạt của P sylvestris, hai diterpene acid khung labdane là pinifolic và dehydropinifolic acid

cũng được phân lập Một chất mới thuộc nhóm này, anticopalic acid đã được tìm

thấy trong dịch chiết từ vỏ cây và gỗ của loài thông trắng P monticola

Bảng 1.2 Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi Pinus

Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi này cũng được công bố

Hoạt tính sinh học của các loài này được các nhà khoa học đánh giá cao là

khả năng chống oxi hóa Từ vỏ của loài P radiata và P pinaster đã phân lập được

procyanidin, catechin và gallic acid - các hợp chất được biết đến với khả năng chống oxi hóa [7], [8], [9] Trong một công trình công bố năm 2012 của Osman

Ustun cho thấy tinh dầu của năm loài P brutia, P halepensis, P nigra, P pinea và

P sylvestris đều cho hoạt tính chống oxi hóa [10]

Năm 2012, Ipek Suntar và cộng sự còn phát hiện khả năng chống viêm của

tinh dầu một số loài thuộc chi này như P brutia Ten., P halepensis Mill., P nigra Arn., P pinea L và P sylvestris L [11]

Ngoài ra, tinh dầu của một số loài khác như P halepensis Mill., P densiflora, P thunbergii, P rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt

[12], [13]

1.1.2 Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương

Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,

thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m,

có phân cành,vỏ lúc non màu xanh, khi già

màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc; cuống dài

2,5-3,5 cm, có gai; 3-5 lá chét, từ hình trứng

thuôn có mép khía răng khô đến hình thuôn dài

ở mép có gai nhọn (var setosus Li), lá chét

giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích

thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm Cụm hoa

dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng

ngà hay trắng ngà, có cuống mảnh, dài 0,7-1

cm Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn

đầu Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa Bầu 2 ô,

đầu nhụy chẻ đôi Quả hình cầu, hơi dẹt, khi

chín màu tím đen 1-2 hạt nhỏ Vỏ thân, vỏ rễ

và lá vò nát có mùi thơm đặc biệt [14], [15],

mòn Lúc nhỏ ưa bóng và ẩm, khi lớn ưa sáng và có thể sống trong điều kiện khắc nghiệt về đất đai và khí hậu Tái sinh bằng chồi, rễ và giâm cành Mùa hoa tháng 7 - 9; mùa quả chín tháng 12

1.1.2.2 Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương

Trong y học, loài này được dân gian sử dụng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau Vỏ, rễ, thân, lá làm thuốc bổ, tăng lực, mạnh gân cốt, kích thích tiêu hóa, ăn ngon miệng, ngủ tốt, chữa đau nhức xương, mỏi gối, đau lưng, thấp khớp, ho, cảm mạo, viêm ruột, đi tả, sỏi thận

Vỏ được coi như một vị thuốc bổ Nước sắc và rượu chế từ vỏ cây được dùng phổ biến làm thuốc bổ nâng cao sức của các cơ, tăng trí nhớ, ngoài ra còn dùng làm thuốc chữa bệnh phụ khoa, chữa đàn ông liệt dương, chữa các bệnh dạ dày, nhất là

nó còn có hiệu lực để chữa bệnh chậm lớn của trẻ em Vỏ ngâm rượu cũng dùng chữa bệnh tê thấp

Rễ và cành lá dùng chữa: 1 Cảm mạo sốt cao, ho, đau ngực; 2 Đau lưng, phong thấp đau nhức khớp; 3 Đau dạ dày, viêm ruột, đau bụng tiêu chảy; 4 Vàng

da, viêm túi mật; 5 Sỏi niệu đạo, bạch đới; 6 Gãy xương, viêm tuyến vú Dùng 30 - 60g, sắc uống; 7 Dùng ngoài chữa đòn ngã, eczema, mụn nhọt và viêm mủ da Rễ tươi và lá được giã đắp ngoài hoặc nấu nước rửa, tắm

Cành nhỏ nấu lên rửa, tắm chữa ngứa, ghẻ Rễ và lá của nó cùng với hoa cúc trắng giã nhỏ đắp mụn nhọt và nứt kẽ chân cũng có công hiệu [14], [15], [16]

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Ngũ gia bì hương

Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

loài cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) đã được các nhà

khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố

a Thành phần hóa học

Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm chất triterpene

đã được tìm thấy từ loài cây này

Năm 1971, các nhà khoa học của Đại học Quốc gia Đài Loan đã nghiên cứu

về thành phần của loài này thu hái ở Taipei - Đài Loan Từ dịch chiết MeOH, các

hợp chất (1,2,3,4,5,6)-cyclohexanehexol (scyllitol, 11) và myo-inositol (12) đã được

phân lập Cũng chính từ cặn chiết này khi hòa tan trong nước và chiết phân lớp với

benzene nhóm tác giả đã phân lập được taraxerol (13), β-sitosterol (14), các ankan

C29 – C33, hai rượu béo triacontanol (15) và dotriacontanol (16) [17]

Từ lá của loài này thu hái gần Hà Nội, Ph.D.Ty và cộng sự đã phân lập và

xác định được năm triterpene acid khung lupane mới 17-21 là

3α,11α-dihydroxy-23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (17); 3α, 11α-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic

acid (18); 30α, 11α,23-trihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid (19) và hai hợp chất

nor-triterpene: 3α, 11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (20);

24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (21) Và cũng từ các chất phân lập

được, nhóm nghiên cứu đã tạo được 17 các dẫn xuất khác nhau bằng các phản ứng

este hóa, ankyl hóa,… [18], [19], [20]

khác như quercitrin (22), eleutheroside E (23),

1-(3-D-glucopyranosyl-2,6-dimethoxy-4-propenylphenol (acantrifoside E) (24),

1-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-2,6-dimethoxy-4-propenylphenol (acantrifoside F)

(25), syringin (26), (2R,3R)-2,3-di-(3,4-methylenedioxybenzyl)-butyrolactone (27),

3α-acetoxy-30-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (acantrifoic acid A) (28),

3α-acetoxy-30-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

α-L-(acantrifoside C) (29), 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid

28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(l→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl ester

(acantrifoside B) (30), ent-kaur-16-ene-19-oic acid (31),

ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid (32) Trong đó, các chất 24, 25, 28, 29 và 30 là những hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên và chất 27 lần đầu tiên phân lập từ chi này [21], [22],

Như vậy, các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Ngũ gia bì

hương (A trifoliatus, họ Araliaceae) đã chỉ ra cây này có chứa nhiều triterpene, đặc

biệt là triterpene khung lupane và trong đó nhiều chất có hàm lượng cao

b Hoạt tính sinh học

Bên cạnh nghiên cứu về thành phần hóa học, Phan Van Kiem và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính của một dãy các chất được tách ra từ cây

này Kết quả cho thấy, các chất 22, 28 có hoạt tính kháng MAO khá cao ngay cả ở

nồng độ thấp với các IC50 tương ứng là 0,12 và 0,18 mM Các chất 31, 32 có hoạt

tính kháng enzim COX-1 với giá trị IC50 = 0,15 và 0,19 μg/ml, do đó có hoạt tính

kháng viêm rất tốt Kiểm tra khả năng kháng vi khuẩn kiểm định, các chất 24, 31 lại

có thể kháng vi khuẩn Gr (+) là B subtilis và chủng S aureus Đặc biệt hợp chất

phenylpropenyl glycosid mới, acantrifoside E (24) có hoạt tính kháng mạnh cả ba

dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư biểu mô người (KB) IC50 = 1,22 μg/ml,

tế bào ung thư màng tim người (RD) IC50 = 2,06 μg/ml, và tế bào ung thư gan người (Hep-2) IC50 = 0,75 μg/ml [26]

Năm 2004, Xing Fu Cai và các cộng sự cũng tiến hành khảo sát hoạt tính

một số các hợp chất triterpene khung lupane có trong rễ loài A koreanum Kết quả

cho thấy impressic acid (20), hợp chất có trong loài A trifoliatus với hàm lượng

lớn, thể hiện hoạt tính ức chế yếu tố sao chép (transcription factor) ở giá trị IC50 = 12,65 µM [27]

Ở một công bố mới nhất, năm 2013, một nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử

khả năng kháng viêm, chống phù nề ở chuột với ba dịch chiết n-hexane, dichloroform, methanol của lá A trifoliatus Kết quả cho thấy, dịch chiết methanol

có khả năng chống viêm đáng kể, ở nồng độ cao nhất 500mg/kg thì có thể kháng đến 77,24% [28] Bên cạnh đó, một nhóm nghiên cứu khác lại tiến hành thử khả năng cải thiện trí nhớ, chống trầm cảm với dịch nước từ lá loài này và cũng cho kết quả tốt [29]

Từ các kết quả đã được công bố về hai loài nghiên cứu cho thấy thành phần chính của chúng chủ yếu là các hợp chất flavonoid và triterpene khung lupane Vì

vậy dưới đây là vài nét tổng quan về hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp chất chính này từ hai cây nghiên cứu

1.2 Các hợp chất flavonoid

Flavonoid là lớp hợp chất có cấu trúc phenolic, tồn tại phổ biến trong thực vật Có thể nói flavonoid được độc quyền hình thành trong thực vật (exclusively produced in plants), chỉ có thực vật mới có khả năng sinh tổng hợp flavonoid và được tìm thấy trong hầu như tất cả các loài thực vật nghiên cứu Theo tính toán của các nhà khoa học, mỗi năm có khoảng 2% lượng cacbon được thực vật quang hợp (khoảng 109 tấn) được chuyển hóa thành các flavonoid và các hợp chất liên quan [30] Các hợp chất flavonoid được các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1940, đến nay có hơn 9000 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc,

hoạt tính sinh học Thuật ngữ “Flavonoid” xuất phát từ chữ Latin flavus nghĩa là

màu vàng – màu sắc của phần lớn các hợp chất flavonoid Tuy nhiên, một số hợp

chất có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc lớp này [31] 1.2.1 Cấu trúc hóa học

Flavonoid là những hợp chất tự nhiên có cấu tạo khung cacbon theo kiểu C6–

C3–C6 hay nói cách khác khung cơ bản gồm hai vòng benzene A, B nối với nhau qua một mạch 3C Trừ một số trường hợp mạch 3C hở như chalcone, đa số trường hợp mạch 3C đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C chứa O như [32]:

Hình 1.3: Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid [31]

Dựa trên mức độ oxi hóa của mạch 3C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết với vòng benzopyrano, người ta chia flavonoid thành các loại khác nhau như:

• Euflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C2 như anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanone, 3-hydroxy flavone, flavone flavonol, dihydro chalcone, chalcone, aurone

• Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C3 như isoflavan, iso flav-3-ene, isoflavan-4-ol, isoflavanone, isoflavone, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihydroisochalcon, homo-isoflavone

• Neoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C4 Nhóm hợp chất này chỉ mới thấy giới hạn trong một số loài thực vật như 4-arylchroman, 4-aryl couramin, dalbergion, 3,4-dihydro-4-arylcouramin, neoflavene

Ngoài ra, người ta còn phân loại thành flavonoid, biflavonoid (những flavonoid dimer), triflavonoid (cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid), flavonlignan (những flavonoid mà phân tử có phần cấu trúc lignan)

Trong thực vật flavonoid tồn tại ở nhiều dạng nhóm thế khác nhau như thêm nhóm hydroxyl, methyl hóa và quan trọng nhất là glycosyl hóa Đôi khi, các nhóm thế khác như vòng thơm, aliphatic acid, sunfate, prenyl, methylendioxy hay isoprenyl cũng đính vào nhân flavonoid và các glycoside của chúng

O

O

2

3 4 5 6

7

8 9

10

1'

3'

5' 6'

Bảng 1.3 Một số khung flavonoid thường gặp

1.2.2 Hoạt tính sinh học

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung Nhờ vậy chúng mang lại những hoạt tính quý báu

Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa là hoạt tính đặc trưng của các hợp chất flavonoid Theo Rice-Avans và các cộng sự [33], khả năng chống oxi hóa có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng như: Trong phân

tử có chứa các nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp các flavonoid có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do; chứa các vòng thơm (vòng benzene, vòng dị nguyên tố) và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa các gốc tự do được hình thành khi chúng bắt giữ các phần tử oxi hoạt động; chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra

các phần tử oxi hoạt động Ví dụ, từ rễ loài Scutellaria baicalensis đã phân lập được

ba flavonoid chính là wogonin (5,7-dihydroxy-8-methoxyflavonoid) (35), baicalein (5,6,7-trihydroxy-flavone) (36) và dẫn xuất 7-glucuronid của nó (baicalin) (37)

Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các chất này cho thấy baicalin có hoạt tính chống oxi hóa tốt nhất (72%) Như vậy, việc gắn thêm một nhóm glucuronid tại C-7 làm cho khả năng chống oxi hóa tăng lên đáng kể [34]

Trong một nghiên cứu, Das và Pereira chỉ ra rằng trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm cacbonyl ở C-4 và liên kết đôi giữa C-2, C-3 thì có khả năng chống

oxi hóa cao như butein (38) [35]:

Rất nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy sự kỳ diệu của các hợp chất flavonoid trong việc điều trị các căn bệnh ung thư Hai flavones 39, 40 đã được tìm

thấy từ lá của loài Baeckea frutescens (Myrtaceae) có khả năng gây độc tế bào rất

mạnh (IC50 = 0,25μg/ml) đối với dòng tế bào bạch cầu (L1210) [36]:

Hoạt tính chống ung thư bằng cách thay đổi hình thái tế bào dẫn đến khả năng ức chế sự phân bào của các dòng tế bào ung thư đã được tìm thấy ở các hợp

chất naringenin (41) và kaempferol 3-O-(2’’,6’’-di-O-p-trans-coumaroyl) glucosid (42), phân lập từ hoa của loài Melastoma malabathricum trên dòng tế bào ung thư

vú (MCF-7) với các giá trị tương ứng là 0,28 và 1,3μM [37]

Bên cạnh đó, các hợp chất flavonoid còn cho thấy khả năng kháng virus

HIV Baicalin (5,6,7-trihydroxy-flavon 7-glucuronide) (37) được phân lập từ cây

Scutellaria baicalensis có khả năng ức chế trực tiếp lên virus HIV; hay hai

biflavone là hinokiflavone (43) và robustafavone (44) có thể ức chế enzym phiên

mã ngược HIV-1 với IC50 = 65µM [38], [39]

Ngoài ra, các hợp chất flavonoid còn thể hiện các hoạt tính như kháng viêm, kháng khuẩn, tiểu đường…Do sự gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường và các biến chứng nguy hiểm mà căn bệnh này gây ra nên các hoạt tính của chúng đối với căn bệnh tiểu đường đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự nó có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzym trong quá trình chuyển hóa đường…[40],[41] Từ rễ của cây

Dorstenia psilurus (họ Dâu tằm, Moraceae), Tabopda và cộng sự đã phân lập được

hợp chất dạng prenyl flavonol dorsilurin F (45) có hoạt tính ức chế enzym

α-glucosidaza tốt với giá trị IC50 = 4,13μM Đặc biệt, cũng với enzym α-glucosidaza,

một dẫn xuất của luteolin là 6-hydroxyluteolin (46) có thể ức chế đến 92% ở nồng

độ 500μM [42]

Từ cây Eysenhardtia platycarpa (họ Đậu, Fabaceae),

5,4,1”-trihydroxyy-6,7-(3”,3”-dimethylchromano) flavone (47) đã được phân lập Chất này có khả năng

chống lại sự tăng đường huyết ở chuột với liều lượng 30 mg/kg trọng lượng cơ thể [43]

1.3 Các hợp chất triterpene khung lupane

1.3.1 Cấu trúc hóa học

Hợp chất triterpene khung lupane thuộc lớp chất triterpene (C30Hn) - được tạo bởi 6 đơn vị isopren hợp với nhau bởi 2 mảnh C15 nối với nhau ở giữa theo cách đầu - đầu, đuôi - đuôi [44] Về mặt cấu trúc hóa học các triterpene khung lupane có hệ năm vòng (6-6-6-6-5) với các nhóm thế thường là các nhóm metyl

ở các vị trí C-4α và β, C-8β, C-10β, C-14α, C-17β và nhóm thế isopropyl ở vào

vị trí C-19α

Các triterpene khung lupane tồn tại tương đối phổ biến trong những loài thực vật bậc cao Triterpene khung lupane đầu tiên được tìm thấy ở trong vỏ hạt

đậu Lupin (Lupinus luteus), thuộc họ Leguminosae có chứa nhóm OH ở vị trí C-3,

chính vì điều này mà các hợp chất thuộc nhóm này có tên gọi là lupeol [45]

1.3.2 Hoạt tính sinh học

Trong quá trình nghiên cứu hợp chất thiên nhiên nói chung, các hợp chất triterpene khung lupane nói riêng, các nhà khoa học đã thấy được những hoạt tính quý báu của hợp chất thuộc nhóm triterpene khung lupane

Lupeol (48) là hợp chất thuộc nhóm triterpene khung lupane có chứa trong

nhiều loài thực vật, trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, dưa chuột, cà chua, trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài, dâu tây, nho đỏ và trong cây thuốc như nhân sâm Mỹ Mohammad Saleem đã chứng minh được chất này có khả năng chống viêm và ung thu rất tốt [46] Ở một nghiên cứu gần đây của M.A Fernandez cho thấy lupeol có thể gây độc đối với các dòng tế bào Hep-G2, A-431, H-4IIE với giá trị IC50 lần lượt là 77; 101; 77,6µM và khả năng chống oxi hóa cao Chính vì

vậy, lupeol còn được ứng dụng trong mỹ phẩm bảo vệ da [47].

Tia cực tím là nguyên nhân phổ biến nhất của ung thư da Hợp chất 3β,

25-epoxy-3α-hydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid (49) được tìm thấy ở loài

Liquidamber styraciflua (họ Hamamelidaceae) có thể hoạt động như một khởi sự

chống khối u mạnh do UVB gây ra [48]

Hai hợp chất (+)-20(29)-lupene-3β,11α-diol (50) phân lập từ loài Salvia deserta và (+)-1,11-dihydroxy-20(29)-lupene-3-one (51) từ loài Nepeta hindostana

(Labiatae) đều có khả năng kháng khuẩn cao, giảm mức cholesterol [45]

Hợp chất (+)-12,20 (29)- lupadiene-3β,27,28-triol (52) được phân lập từ loài

cây trúc đào (Nerium oleander), thuộc họ Apocynaceae có khả năng chống HIV và

khối u ác tính [49]

Acid 3α-hydroxy-lup-20(29)-ene-23,28-dioic (53) là một triterpene diacid

khung lupane có hàm lượng cao tới 7% trọng lượng lá khô của loài cây chân chim

(Schefflera octophylla), loài cây được dân gian dùng làm thuốc chữa bệnh về gan

[50]

Betulin hay 20(29)-lupene-3β,28-diol (54) là một chất đặc trưng cho khung

lupan, được phân lập lần đầu tiên vào năm 1988 từ loài Betula alba (Betulaceae)

Qua nhiều công trình nghiên cứu cho thấy chất này có mặt trong nhiều loài thực vật thuộc các họ khác nhau và có nhiều hoạt tính như: hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống HIV, có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm khả năng gây độc của CdCl2 ở nồng độ thấp [51]

Ngoài betulin (54), betulinic acid (55) cũng là một triterpene khung lupane

được tìm thấy từ nhiều loài Betula (Betulaceae) Ở nồng độ 5µM betulinic acid đã

ức chế đáng kể sự phát triển của TPA (2,5µg) khi được kích thích bởi 50µg hợp chất 7,12-dimethylbenzanthracen [52] Ngoài ra, theo tài liệu công bố năm 2013 của

K Julius và các cộng sự, betulinic acid có khả năng chống oxi hóa cao với IC50 = 0,141μg/ml, đặc biệt khi kết hợp với acid ascorbic thì khả năng chống oxi hóa càng tăng (IC50 = 0,037μg/ml) [53] Tuy nhiên, betulinic acid được nhắc đến nhiều với khả năng chống HIV cao, khả năng ức chế sự phiên bản của virus HIV trong tế bào

Lympo-H9 [54] Hoạt tính cao và hàm lượng trong thực vật lớn nên 55 và các dẫn

xuất của chúng hiện đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về mặt hóa học, dược lý và đặc biệt là mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học [55], [56]

1.4 Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính

sinh học của chúng

Với mục tiêu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, các nhà khoa học

đã tiến hành chuyển hóa hóa hóa học ở một số triterpene khung lupane có hoạt tính sinh học cao Đặc biệt các chất có khả năng chuyển hóa phong phú nhờ sự có mặt của các nhóm OH, COOH, nối đôi Δ 20(29) trong phân tử như betulin, betulinic acid, 23-hydroxy betulinic acid…được quan tâm

1.4.1 Chuyển hóa nhóm OH

1.4.1.1 Chuyển hóa thành ester

Có rất nhiều công trình khoa học đã chỉ ra rằng các dẫn xuất tạo ester ở vị trí

3β-OH của betulinic acid cho hoạt tính cao hơn hẳn so với hợp chất acid ban đầu

[57], [58] Tiến hành phản ứng ester hoá trong pyridine với tác nhân tham gia phản

ứng là các acid anhydride hoặc các acyl chloride (Sơ đồ 1.1) và thử hoạt tính sinh

học các dẫn xuất, Kashiwada đã chỉ ra được 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl) betulinic

acid (56.6) có hoạt tính kháng HIV rất mạnh với giá trị EC50< 3,5 ×10-4µM và độ

chọn lọc TI > 20000 trong trường hợp tế bào lymphô H9 bị nhiễm cấp [54]

Sơ đồ 1.1: Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3 β-OH tạo hợp chất 56.1–56.8[54]

Theo một công bố gần đây, dẫn xuất 3-O-3’-Methylsuccinyl-betulinic acid

(57) được tổng hợp theo Sơ đồ 1.2 có khả năng chống HIV mạnh với giá trị EC50 = 0,0087 μM, thấp hơn rất nhiều so với betulinic acid (EC50 = 1,4 μM), thậm chí còn thấp hơn cả AZT (EC50 = 0,034 μM) Ngoài ra, 57 có giá trị TI = 6,3 × 103, thấp hơn so với bevirimat (TI= 20000), một loại thuốc đã được thử nghiệm lâm sàng [54], [59]

Sơ đồ 1.2: Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3 β-OH tạo hợp chất 57 [54], [59]

Bên cạnh đó, nhóm các nhà khoa học người Nga, Oxana B Kazakova cũng

chứng minh các dẫn xuất ester hóa ở vị trí C-3, C-28 của betulin (54) (Sơ đồ 1.3)

cũng cho hoạt tính sinh học đáng chú ý [60] Cả hai hợp chất 58 và 59 đều có khả

năng kháng lại chủng virus ung thư cổ tử cung HPV-11 Ngoài ra, 58 còn có hoạt

tính bảo vệ gan, chống loét, chống viêm, hoạt tính điều hòa miễn dịch và hoạt tính kháng HIV

Sơ đồ 1.3 Chuyển hóa nhóm 3β-OH, 28-OH của betulin [60]

Theo Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự, betulin được phản ứng với các acid anhydride trong dung môi CH2Cl2, ở nhiệt độ phòng từ 23-26 giờ để tạo thành các

este 60, 61 [61] Các ester tạo thành tác dụng với ethylclorua format, dung môi

CH2Cl2, xúc tác triethylamine ở 0oC trong 60 phút thu được hai sản phẩm 62, 63

tương ứng Tiếp tục cho thêm triethylamine và AZT vào trong bình phản ứng và khuấy ở 0oC trong 60 phút, sau đó nâng lên đến nhiệt độ phòng trong 12 giờ, nhận

được các hợp chất 64, 65 (Sơ đồ 1.4) Điều đáng chú ý là hai hợp chất lai AZT với

betulin (64, 65) đều có hoạt tính chống HIV cao hơn rất nhiều so với các thuốc

kháng HIV truyền thống như Zidovidin (AZT), Lamivudin (3TC), Stavudin (d4T) với 0,1 µM < EC50 < 0,3µM

Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 [61] 1.4.1.2 Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine

Đây là các chuyển hóa được quan tâm đến trong các dẫn xuất của betulinic acid Betulinic acid được oxy hoá bằng CrO3/pyridine thành ketone (66), sau đó sản phẩm này phản ứng với hydroxylamine cho oxime (67), khử hoá 67 với NaBH4 cho

amine (68) (Sơ đồ 1.5) [62]

Sơ đồ 1.5: Chuyển hoá nhóm 3 β-OH của betulinic acid

thành ketone, oxime, amine [62]

Trong một công bố năm 2013, C B Leopoldo và các cộng sự đã chỉ ra khả

năng chống ung thư của hợp chất betulonic acid (66) mạnh hơn rất nhiều so với

betulinic acid trên hầu hết các dòng tế bào được thử với IC50 từ 5,97 đến 14,0μM [59]

Betulinic acid (55) ngoài được tìm thấy từ nhiều loài Betula (Betulaceae), nó

còn được bán tổng hợp từ betulin (54) qua hợp chất 3-oxo-betulinic acid (69) với độ

chọn lọc betulinic acid lên đến 85% và 15% còn lại là 3-epi-betulinic (70) (Sơ đồ 1.6) [57], [63] Kết quả nghiên cứu cho thấy chất 55 có nhiều hoạt tính ưu việt hơn

rất nhiều so với 54

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp acid betulinic từ betulin [57], [63]