Khảo sát cấu trúc hóa học của một số hợp chất chiết từ lá Chè đắng Cao Bằng (Ilex kaushue S. Y. Hu)

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, hoá học các hợp chất thiên nhiên, hóa dược là những lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, nó cung cấp cho con người những hiểu biết về mặt hoá học

Chuyên ngành: HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ

Mã số: 60 44 31

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS-TS CHU PHẠM NGỌC SƠN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến GS-TS Chu Phạm Ngọc Sơn, Ths Trương Thị Huỳnh Hoa, đã hết lòng hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong bộ môn Hoá Lý, khoa Hóa trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên tp Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức khoa học

Tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn sinh viên đã quan tâm và ủng hộ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Tp HCM, tháng 09 năm 2010 Học viên cao học Nguyễn Đức Hoán

1.2.3 Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên thế giới 18

1.3 Cây chè đắng Cao Bằng Ilex kaushue S Y Hu 18

1.3.3 Một số nghiên cứu về cây chè đắng Cao Bằng,

Ilex kaushue S Y Hu, ở Việt Nam 21

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.2 Trích ly và khảo sát thành phần tinh dầu lá chè đắng 24

2.4 Thử hoạt tính sinh học trên cao thô 27

2.4.1 Hoạt tính kháng oxi hoá trên hệ DPPH 27

2.5.2 Cô lập hợp chất HO35 32

2.5.3 Cô lập hợp chất ILC4443 và hợp chất ILC54321 33

2.5.4 Cô lập hợp chất ILM53421, ILM53422 và ILM542 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa học tinh dầu chè đắng chè đắng

Cao Bằng 38

3.3.1 Hoạt tính kháng oxi hoá trên hệ DPPH 41

s singlet, mũi đơn

d doublet, mũi đôi

t triplet, mũi ba

m multiplet, mũi đa

dd doublet of doublet, mũi đôi đôi

NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

COSY COrrelation SpectroscopY

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

NOESY Nuclear Overhause Enhancement SpectroscopY

ROESY Rotating frame Overhauser Enhancement SpectroscopY

DPPH 1,1-DiPhenyl-2-PicrylHydrazin

DMSO DiMethyl SulfOxide

SC Scanvenging Capacity, khả năng bẫy các gốc tự do

CS Cell Survival, khả năng sống sót của tế bào

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hoá học trong tinh dầu Ilex kudincha C J Tseng 7

Bảng 1.2: Thành phần hoá học trong tinh dầu Ilex paraguariensis 8

Bảng 3.1: Thành phần hoá học trong tinh dầu lá chè đắng Cao Bằng 39

Bảng 3.2: Sắc đồ phổ GC/MS một số thành phần chính

trong tinh dầu lá chè đắng Cao Bằng 40

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên các cao thô 42

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 43

của các cao thô

Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của HB55 so sánh với hợp chất 48

β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside

Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của HO35 so sánh với Uvaol 51

Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất ILC4443 so sánh với 55

hợp chất Ursolic acid

Bảng 3.9: Số liệu phổ NMR của ILC54321 so sánh với 59

hợp chất 27-p-(E)-Coumaroyloxyursolic acid

Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của ILM53421 so sánh với Kudinoside C 64

Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của ILM53422 so sánh với Kudinoside E 68

Bảng 3.12: Số liệu phổ NMR của ILM542 so sánh với Kudinoside D 73

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Loài Nemopanthus mucronatus 6

Hình 1.2: Một số loài thuộc chi Ilex 6

Hình 1.3: Nhánh, lá, cây chè đắng Cao Bằng 20

Hình 1.4: Lá chè đắng sau khi sấy khô dạng giống cây đinh và dạng cuộn 20

Hình 3.1: Sắc đồ GC/MS của tinh dầu lá chè đắng Cao Bằng 38

Hình 3.2: Một số tương quan HMBC của hợp chất HB55 49

Hình 3.3: Một số tương quan COSY của hợp chất HB55 48

Hình 3.4: Một số tương quan HMBC của hợp chất HO35 51

Hình 3.5: Một số tương quan COSY của hợp chất HO35 51

Hình 3.6: Một số tương quan HMBC của hợp chất ILC4443 54

Hình 3.7: Một số tương quan COSY của hợp chất ILC4443 54

Hình 3.8: Một số tương quan HMBC của hợp chất ILC54321 58

Hình 3.9: Một số tương quan COSY của hợp chất ILC54321 58

Hình 3.10: Một số tương quan HMBC của hợp chất ILM53421 62

Hình 3.11: Một số tương quan COSY của hợp chất ILM53421 63

Hình 3.12: Một số tương quan ROESY của hợp chất ILM53421 63

Hình 3.13: Một số tương quan HMBC của hợp chất ILM53422 68

Hình 3.14: Một số tương quan COSY của hợp chất ILM53422 68

Hình 3.15: Một số tương quan ROESY của hợp chất ILM53422 68

Hình 3.16: Một số tương quan HMBC của hợp chất ILM542 72

Hình 3.17: Một số tương quan COSY của hợp chất ILM542 73

Hình 3.18: Một số tương quan ROESY của hợp chất ILM542 73

MỞ ĐẦU

Thực vật được sử dụng rất phổ biến trong đời sống hàng ngày là nguồn cung cấp thức ăn, vật liệu xây dựng, đồ dùng hàng ngày, dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi với hệ thảm thực vật phong phú và đa dạng Đó là điều kiện thuận lợi cung cấp nguyên liệu cho ngành Y học cổ truyền nói riêng và ngành Y - Dược nói chung

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, hoá học các hợp chất thiên nhiên, hóa dược là những lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, nó cung cấp cho con người những hiểu biết về mặt hoá học, hoạt tính sinh học, giúp con người tìm ra những ứng dụng mới, nhất là trong lĩnh vực y học Việc cô lập, xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học là bước cần thiết cho việc tìm ra những ứng dụng mới của các loài thực vật Cho đến nay, nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng rất nhiều trong đời sống hằng ngày Trong đó, cây chè đắng Cao Bằng đã và đang được sử dụng ngày một phổ biến như một loại trà vừa làm thuốc, vừa giúp thanh nhiệt, giải độc, điều hoà huyết áp Hiện nay, cây chè đắng Cao Bằng là cây có giá trị kinh tế cao của tỉnh Cao Bằng Tuy nhiên, việc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây chè đắng chưa có nhiều

Với tầm quan trọng như trên, nội dung nghiên cứu của luận văn này nhằm góp phần khảo sát cấu trúc hóa học một số hợp chất và tinh dầu chiết từ lá chè đắng, cũng như thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của một số cao trích từ lá chè đắng

Cao Bằng (Ilex kaushue S Y Hu) thuộc họ Aquifoliaceae

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về họ Aquifoliaceae [4], [34]

Họ Aquifoliaceae thuộc bộ Aquifoliaes còn gọi là họ Nhựa ruồi hay họ Trâm Bùi

Đặc điểm thực vật: Lá thường có răng cưa, mọc vòng có thể có bướu li ti phía mặt sau phiến lá; các lá nhỏ màu hơi đen Cụm hoa dạng xim thường mọc dưới tán Quả có cuống, hình cầu, chỏm quả là núm nhụy màu đen, bên trong quả chứa một vài hạch [4]

Trước đây, họ Aquifoliaceae được chia thành hai chi là Nemopanthus và chi Ilex Chi Nemopanthus chỉ có một loài là Nemopanthus mucronatus [34] (Hình 1.1); trong khi

đó chi Ilex có tới khoảng 600 loài Hiện nay, theo kết quả phân tích phân tử, chi

Nemopanthus được xát nhập vào chi Ilex với tên gọi chung là Ilex mucronata [4]

1.2 Giới thiệu về chi Ilex

1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Ilex [4]

Cây gỗ Lá có răng cưa hay nguyên Hoa đơn tính, nhỏ, có màu trắng, vàng hay lục mọc ở nách lá Quả hình cầu

Chi Ilex phân bố toàn cầu, nhưng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và ôn đới của

châu Á và châu Mỹ

Ở Việt Nam chi Ilex có khoảng 40 loài [35], [36], [37]

(Hình 1.2) như: Ilex cymosa

Blume, Ilex ficoidea Forbes et Hemsl, Ilex godajam ex Wall, Ilex kaushue S.Y.Hu,

Ilex macrocarpa Oliv, Ilex micrococca Maxim, Ilex rotunda Thumb, Ilex viridis

Champ, Ilex wallichi Hook f…

1.2.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Ilex trên thế giới

Những nghiên cứu về chi Ilex đã được tiến hành từ lâu, nhiều nhóm hợp chất

mới đã được tìm thấy

Hình 1.1: Loài Nemopanthus mucronatus

Hình 1.2: Một số loài thuộc chi Ilex 1.2.2.1 Nghiên cứu thành phần tinh dầu của chi Ilex trên thế giới

Năm 2002, Yang Xiao-Sheng [33] và các cộng sự phân tích thành phần hoá học

của tinh dầu cây Ilex Kudincha C J Tseng thu hái ở Trung Quốc; bằng phương

pháp ngâm dầm lá tươi trong dung môi ethanol, đuổi dung môi thu được cao ethanol; sau đó đem lôi cuốn hơi nước cao ethanol thu được tinh dầu Kết quả phân tích thành phần tinh dầu bằng GC/MS đã nhận danh được tám mươi sáu hợp chất

Trong đó, chủ yếu là các methyl và ethyl ester acid béo như ethyl hexadecanoate, methyl

hexadecanoate, một số chất khác như ester ethyl benzoate và eugenol (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong tinh dầu lá cây Ilex kudincha C J Tseng

T

Hợp chất

S T

T

Hợp chất

2 Ethylbenzene 31 Cis-Myrtanol 60 Methyl tetradecanoate

Ethyl-2-hydroxy-benzoate 62 Tetradecanoic acid

5 1-Cyclohexen-1-yl-ethanone 34

3,7-Dimethyl-2,6-octadienal 63 Ethyl tetradecanoate

6 Z-2-Heptanal 35 (E,Z) 2,4-Decadienal 64 Octadecane

7 Benzaldehyde 36 (E,E) 2,4-Decadienal 65 Methyl pentadecanoate

8 α -Methylstyrene 37 Eugenol 66

6,10,14-Trimethyl-2-pentadecanone

9 6-Methyl-5-hepten-2-one 38 2-Undecenal 67 Diisobutyl phthalate

10 1,3,5-trimethylbenzene 39 Copaene 68 Methyl hexadecanoate

11 Cappilic aldehyde 40 Methyl

3-phenyl-2-propenoate 69 n-Eicosane

12 2,4-Heptadienal 41 Junilpene 70 Hexadecanoic acid

13 2-Methylhexane-1-ol 42 Caryophyllene 71 14-mthyl hexadecanoate

14 Benzyl alcohol 43 α-Lonone 72 Methyl

9,12-octadecadienoate

15 2-Hydroxy-benzaldehyde 44

1,2-dihydroxy-4-methoxlyphenyl 73

Methyl octadecatrienoate

9,12,15-16 Benzenacetaldehyde 45 Nerylacetone 74 Phytol

17 Octenal 46 Ethyl

3-phenyl-2-propenoate 75 Methyl octadecanoate

18 Methyl benzoate 47 5-Epi-aristolochene 76 Ethyl linoloate

19 3,7-Dimethyl-1,6-octadien-3-ol 48 Cyclododecane 77 Ethyl

9,12,15-octadecantrienoate

20 6-Methyl-3,5-heptadien-2-one 49

dimethyl-1,2,3,4a,5,6,8- octahydroxydronaphtha lene

2-Isopropaenyl-4a,8-78 Docosane

21 2-Phenylethanol 50 β -Seliaene 79 Trieosane

22 Nopinone 51 Butylat hydroxytoluene 80

Tetramethylheptadecan- 4-olide

4,8,12,16-23 Camphor 52

4,4,7a-trimethyl-2,4H- benzofuranone

5,6,7,7a-tetrahydro-81 Teracosane

24 2,5-Dimethylphenol 53 Caryophyllene oxide 82 Squalene

25 Ethylbenzoate 54 3-Methylpentadecane 83 Vitamin E

26 Myrtanal 55 α -Cedrol 84 1,2-Benzendicarboxylic

acid

27 Diethyl butanedioate 56 Ethyl laurate 85 Ethyl hexadecanoate

28 Methyl salicilate 57

trimethyl-7-

3-Buten-2-one-4-2,2,6- 1-yl

oxabicyclo[4,1,0]hept-86 Ethyl octadecanoate

29 Dodecane 58

dimethylenebicyclo[7,2 ,0]undecan-5beta-ol

10,10-Dimethyl-26-Năm 2006, Deborah H Markowicz Bastos [14] và các cộng sự xác định thành phần

hóa học có trong tinh dầu cây Ilex paraguariensis thu hái ở Brazil, bằng phương pháp

lôi cuốn hơi nước Kết quả phân tích GC/MS đã nhận danh được hai mươi hai hợp chất

trong tinh dầu lá cây Ilex paraguariensis (Bảng 1.2)

Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong tinh dầu lá cây Ilex paraguariensis

T

Hợp chất

S T

T

Hợp chất

2 α -Pinene 10 n-Nonanal 18 β-(E)-Ionone

3 Hepten-2-one 11 α -Terpineol 19 Heptadecane

4 Myrcene 12 Geraniol 20 Methyl hexadecanoate

5 Furfuryl methyl sulfide 13 Heptadecane 21 n-Heneicosane

6 n-Octanal 14 E-2-Decenal 22 n-Tricosane

7 Furfuryl methyl sulfide isomer 15 β-(Z)-Damascone

8 Linalool 16 β-(E)-Damascone

1.2.2.2 Cô lập các hợp chất từ chi Ilex

Năm 1988, Munehino Nakatani [25], Yoshiaki Urata và Tsunao Hase đã cô lập

được các hợp chất caffeoyl tannin từ thân cây Ilex rotunda thu hái ở Nhật Bản là:

1-caffeoylquinic acid (1), neochlorogenic acid (2) và chlorogenic acid (3)

OH H OH

H

H

HOOC

H H

OH H H OH H H H

HOOC

OH OH CH

OCOCH HO

H

H H HOH H H

H OH

HOOC

HO

OH OH CH

OCOCH

Năm 1993, Kashiwada Y [23] và cộng sự đã cô lập được ba hợp chất

p-coumaroyltriterpene từ cây Ilex asprella là asprellic acid A (4), B (5), C (6)

R1O

COOH

CH2OR2

Năm 1994, Paulo Mazzafera [31] cô lập được hợp chất caffein, theobromin (7)

và theophylline (8) trong lá và thân cây Ilex paraguariensis Lamb, thu hái ở Bzazil

N NN O

O

CH3

CH3H

N

N O

O

CH3

CH3

H

Năm 1996, Katia H Kraemer [20] và các cộng sự người Pháp đã cô lập từ lá cây

Ilex paraguariensis các hợp chất matesaponin là ursolic

acid-3-O-{β-D- (28→1)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)- β-D-glucopyranosyl-(1→6)- β-D-

glucopyranosyl-(1→3)[-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl}-glucopyranosyl] este (9)

Năm 1996, Dong-Xu Wen [15], Zhong-Liang Chen và cộng sự đã cô lập được

các hợp chất syringaldehyde (10), sinapaldehyde (11), rotundanoic acid (12) và

ilexrotunin (13) từ thân cây Ilex rotunda thu hái ở Trung Quốc

OH

CH CH CH O OH

CH2O

OCH3

H3CO

O

OH OH HO

Nhóm nghiên cứu của Ming-An Ouyang [26], [27] và cộng sự đã cô lập từ lá của

cây Ilex kudincha thu hái ở Trung Quốc được hai triterpene là β-kudinlactone,

3β,12β,19α- trihydroxyurs-13(18)-en-28,20β-lactone (14); α-kudinlactone, 3β,19α- dihydroxyurs-11(12),13(18)-dien-28,20β-lactone (15) và mười triterpene glycosides

là kudinoside A,

(1→3)-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)}-α-L-arabinopyranosyl-β-kudinlactone (16); kudinoside B,

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α–L-arabinopyranosyl-β–kudinlactone (17);

kudinoside C, rhamnopyranosyl-(1→2)}-α-L-arabinopyranosyl-β-kudinlactone (18); kudinoside D

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{α-L-(19), kudinoside E (20), kudinoside F (21), kudinoside H (22), kudinoside G (23), kudinoside I (24), kudinoside J (25)

HO

OH

C

O HO

O

HO

C

O HO

O

13

12

OH

C

O HO

3 2

B C

Ara 3

Glc Glc2Glc Ara Glc Glc Rha

3 2 2

RO

C

O HO

O

R

Ara Glc Rha

3

2 Glc

Ara Glc Glc Rha

3 2 2

RO

O

C O

R

Ara32 Glc Rha

R 1 O

COOR2HO

Ara32 Glc Rha

OH

C

O HO

O

Năm 1997 và 1998, Ming-An Ouyang [28], [29] và cộng sự khảo sát thành phần

hoá học trên lá cây Ilex latifolia, đã nhận danh được tám triterpene saponin là

latifolosides A - H (26 - 33)

Năm 1999, Keiichi Nishimura và cộng sự người Nhật tiến hành khảo sát

thành phần hoá học của cây Ilex kudincha thu hái ở Trung Quốc Họ đã cô lập được

các triterpene saponin, ilekudinosides A - J (34 - 42), ilexolide XLVIII (43),

ilekudinols A - C (44 - 46), ulmoidol (47), 23-hydroxyursolic acid (48), coumaroyloxyursolic acid (49) và 27-cis-p-coumaroyloxyursolic acid (50)

O

H

H OH

H

H

H Glc

2

Glc Ara

Rha

3 2

Glc

2

Glc Ara

Rha

3 2

Glc

2

43 34

38 37 36 35

39 40

41 42

4

R

R1 R2 R3

Glc OH H GlcGlc

Rha

Ara3

2

H H Glc

HO

H

O O

HO HO

Năm 2000, Alexandre T Cardoso Taketa [10] cô lập được một triterpene và hai

saponin từ lá của cây Ilex brevicuspis đó là 23-Methyl

20(S)-3β,19α,24-trihydroxy-28-carboxyurs-12-en-23-oate (51), dihydroxyursolic acid (52) và 3-O-α-L-arabinopyranosyl-20(S)-19α,23,24-

latifolia bằng máy HPLC Kết quả cho thấy trong lá có chứa các amino acid chính

là aspartic acid, glutamic acid và histidine; các hợp chất catechin là L-catechin (54), L-epicatechin (55), L-epicatechin gallate (56), L-catechin gallate (57) và ba hợp chất flavonoid là rutin (58), mericetin (59) và quercetin (69)

O HO

OH

OH

53 52 51

55

54

57

56

OH OH

O OH

HO

O

OH OH

OH OH

O OH

O OH

HO

OH

Năm 2001, Jing Huang [17] cùng cộng sự người Nhật khảo sát vỏ của cây Ilex

latifolia và đã tìm được hai triterpene saponin là latifoloside I (61) và latifoloside J

Năm 2005, Lutfun Nahat [24] và các cộng sự người Anh đã cô lập được hai hợp

chất phenoloic từ hạt của cây Ilex aquifolium thu hái ở Pháp là

2,4-dihydrophenylacetic acid (63) và 2,4-dihydrophenylacetate methyl ester (64)

OH

CH3

Tóm lại, các nghiên cứu trên thế giới ở các cây thuộc chi Ilex cho thấy thành

phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu là các methyl và ethyl ester của acid béo; các hợp chất cô lập phần lớn là các hợp chất triterpene, ngoài ra còn có các hợp chất phenol, flavon…

61 R: CH2 OH

62 R: COOH

1.2.3 Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên thế giới

Trên thế giới một số loài thuộc chi Ilex được sử dụng nhiều trong Y học cổ truyền như ở Trung Quốc [12] các loài: Ilex kudincha, Ilex pubescens, Ilex

rotunda…, được dùng làm thuốc chống co thắt động mạch tim, chứng khó tiêu,

chống viêm và đau đầu

Các nhà khoa học Trung Quốc còn phát hiện cao methanol của lá cây Ilex

kudincha chứa các chất (45), (48), (49) có tác dụng ức chế enzym ACAT (Acyl

CoA Cholesteryl Acyl Transferase) [22] nên được dùng làm thuốc trị xơ vữa động mạch và bệnh béo phì Các hợp chất này có khả năng ức chế enzym ACAT cao hơn

so với các hợp chất polyacetylen chiết xuất từ cây Panax ginseng

Các nhà khoa học Argentina, G R Schinella [17] và các cộng sự khảo sát cho

thấy dịch nước chiết từ cây I paraguariensis St Hil, có quan dụng lợi tiểu, gây kích thích nhẹ Những thử nghiệm in vivo trên chuột cho thấy dịch nước chiết còn có tác

dụng rất tốt trong việc bắt gốc tự do anion superoxid (IC50 = 15μg/mL) giúp cơ thể chống lại quá trình oxi hoá

1.3 Cây chè đắng Cao Bằng (Ilex kaushue S Y Hu)

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố [4], [7], [38]

Năm 1999, các nhà thực vật học đã dựa vào một số đặc điểm để phân biệt hai

loài Ilex latifolia và Ilex kaushue như sau:

™ Ilex latifolia: Cành và cuống hoa hoàn toàn không có lông; phiến lá dài 7 -

8 cm, rộng 4,5 - 7,5 cm, gân bên của lá chỉ rõ ở mặt dưới, không rõ ở mặt trên Cụm hoa dạng tán giả gần như không có cuống; đài của hoa đực hình đấu, nhị dài bằng

cánh hoa

™ Ilex kaushue: Cành và cánh hoa có lông tơ thưa; phiến lá dài 13 - 16 cm,

rộng 5 - 6 cm, gân bên của lá rõ cả hai mặt lá Cụm hoa dài gần 1 cm, mọc dạng chùm giả với trục, đài của hoa đực hình đĩa, nhị ngắn hơn cánh hoa

Từ sự khác biệt trên, cây chè đắng ở Cao Bằng được GS TSKH Nguyễn Tiến Bân [1] xác định là Ilex kaushue S Y Hu, tên khác là khổ đinh trà hay ché khom

Đặc điểm thực vật [39], [40]

: Cây gỗ cao khoảng 6 - 20 m (Hình 1.3), đường kính thân khoảng 20 - 60 cm, cũng có cây cổ thụ cao tới 35 m đường kính thân tới 120 cm, cành khô màu nâu xám, không có lông, nhánh non hình trụ tròn có nhiều gờ nhỏ

Lá đơn, mọc so le, mỏng, hình thuôn dài hoặc hình ngọn giáo ngược Kích thước lá thay đổi như ở cây trưởng thành lá thường dài 11 - 17 cm, ở cây non lá thường lớn hơn, ở những cành chồi sau khi cây bị đốn lá có cỡ lớn hơn dài tới 27 -

31 cm, rộng 9 - 13 cm Cuống lá dài từ 1,5 - 2,0 cm Đầu lá có mũi nhọn ngắn hoặc

tù, gốc hẹp dần Mép lá có dạng răng cưa nhỏ, màu đen gần đều nhau; mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới lá màu nhạt hơn, không lông; gân bên của lá có 10 - 14 đôi, xếp chéo với gân giữa tạo thành một góc lớn hơn 450

Hoa đơn tính, mọc thành cụm hoa ở nách lá, cụm hoa đực thường gồm 20 - 30 hoa, đài hoa đực hình đĩa với 4 cánh hoa, 4 nhị ngắn hơn hoặc dài gần bằng cánh hoa Cụm hoa cái dạng chùm giả, gồm 3 - 9 hoa, có cuống thô dài 4 - 6 cm Cây ra hoa thường vào tháng 2 - 4

Quả hình cầu, đường kính cỡ 1 cm, cuống ngắn 2 - 3 mm, chứa 2 - 3 hạch Các hạt chứa trong hạch hình thuôn dài 7 mm, rộng 4 mm, mặt lưng và mặt bên có vân

và rãnh dạng mạng lưới Quả chín vào khoảng tháng 6 - 10, thường có màu đỏ

Phân bố: Chè đắng Cao Bằng phân bố các vùng như: Nguyên Bình, Phục Hoà,

Thông Nông, Hòa An

Hình 1.3: Nhánh, lá, cây chè đắng

Hình 1.4: Lá cy

Hình 1.4: Lá chè đắng sau khi sấy khô dạng giống cây đinh và dạng cuộn

Một số bài thuốc được dùng trong dân gian

™ Chữa bệnh cảm nắng, sốt cao: Chè đắng 10 g, sắc nước uống

™ Chữa bệnh viêm họng: Chè đắng 10 g và la hán quả 6 g, sắc nước uống

™ Chữa bệnh lỵ, viêm dạ dày cấp: Chè đắng 10 g và phượng vĩ thảo 30 g, sắc nước uống

™ Chữa bệnh đầu váng hoa mắt: Chè đắng 10 g và cam cúc hoa 12 g, sắc nước uống

™ Chữa bỏng lửa: Chè đắng không kể liều lượng đem nấu nước, để nguội, dùng xoa

1.3.3 Một số nghiên cứu về cây chè đắng Cao Bằng, I kaushue S Y Hu ở

Việt Nam

Lương Thị Hồng Vân [9] và các cộng sự đã nghiên cứu quan dụng của dịch chiết

lá cây chè đắng Cao Bằng đối với nhiễm sắc thể của chuột nhắt bị nhiễm độc 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) Dịch chiết này có khả năng làm giảm quan động khoảng 20 - 40 % của 2,4-D lên dòng bạch cầu, nhất là bạch cầu đa nhân và bạch cầu lympho; ngăn chặn sự ảnh hưởng của 2,4-D tới thể nhiễm sắc ở mô tuỷ xương,

mô tinh hoàn và không gây rối loạn ở thể nhiễm sắc ở chuột; làm giảm tới 36 % sự quan động của 2,4-D tới men SGOT (Serum Glutamyl Oxaloacetate amino Tranferase) Dịch chiết chè đắng còn có quan dụng hạ huyết áp từ từ và ổn định sau khi dùng dịch chiết từ 15 - 120 phút Làm hạ cholesterol trong máu, với liều lượng 2 g/kg có khả năng làm giảm 106 % lượng cholesterol được đưa vào qua đường uống Bùi Thị Bằng [2] và các cộng sự đã nghiên cứu quan dụng chống viêm gan và ức chế chống xơ gan của chế phẩm saponin toàn phần chiết xuất từ lá chè đắng thu hái

ở Cao Bằng Kết quả cho thấy chế phẩm saponin toàn phần có quan dụng bảo vệ gan và ức chế tạo collagen tương đương với chế phẩm cugama từ cúc gai và mã đề Bên cạnh đó chế phẩm saponin toàn phần này còn có quan dụng lợi mật, chống viêm mạn tính và viêm cấp rõ rệt

Năm 2001, Nông Văn Hai [5] và các cộng sự đã định lượng được bốn nhóm hợp chất trong lá chè đắng Cao Bằng với thành phần như sau: Saponin toàn phần 5,1 - 5,5 %, flavonoid toàn phần 0,5 - 0,6 %, polysaccharid toàn phần 2,8 - 3,4 %,

carotenoid (tính theo β-carotene) 5,0 - 5,8 %

Nguyễn Văn Đậu [3] và Lê Ngọc Thức đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất

là quercetin và dihydrocaffeic acid

Năm 2008, Vũ Anh Thơ [8] và Trần Lê Quan Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã cô lập từ lá chè đắng được các hợp chất kudinosid A

(16), kudinosid C (18), kudinosid D (19), kudinosid E (20) và kudinosid G (23)

Năm 2008, Trương Thị Huỳnh Hoa, Nguyễn Đức Hoán, Chu Phạm Ngọc Sơn, Poul Erik Hansen nghiên cứu trên cao ethanol của lá chè đắng Cao Bằng, trích bằng

phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, được các hợp chất methyl

hydroxylup-20(29)-en-24-oate (65), lupeol (66), lup-20(29)-en-3,24-diol (67),

3β-hydroxylup-20(29)-en-24 oic acid (68)

Chương 2: THỰC NGHIỆM2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá cây chè đắng I kaushue S Y Hu thu hái ở Vườn Cam, thị xã Cao Bằng, tỉnh

Cao Bằng Một phần lá tươi làm nguyên liệu nghiên cứu tinh dầu Phần còn lại được sấy khô đến trọng lượng không đổi, xay nhuyễn thành bột làm nguyên liệu nghiên cứu

Hoá chất:

n-hexane chưng cất 69 0C

Diethyl eter chưng cất

Petroleum ether chưng cất ở 60 - 90 0C

Methanol chưng cất ở phân đoạn 66 0C

Chloroform phân tích (Labscan)

Acetone chưng cất ở 56 - 57 0C

Ethyl acetate chưng cất ở 76 - 77 0C

Thuốc thử iod và dung dịch acid H2SO4 5 %

Muối Na2SO4, nước cất

Bản mỏng silica gel (250 μm, Merck, Kielselgel 60F250) hay RP18 (Whatman

KC18 F, 200 μm)

Silica gel (40 - 60 μm, Merck và Scharlau)

Sephadex (25 - 100 μm, Sigma Aldrich, LH 20100 - 100 g)

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

∗ Phương pháp chiết: ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, trích Soxhlet

∗ Phương pháp lôi cuốn hơi nước

∗ Sắc ký cột silica gel

∗ Sắc ký bản mỏng (TLC)

∗ Các phương pháp hoá lý để xác định cấu trúc của các hợp chất:

- Phổ GC/MS được ghi trên máy Agilent 7890A GC/5975C MS Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker Avance 500 (500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C với TMS là chất nội chuẩn) của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Hà Nội

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi với viên ép KBr trên quang phổ kế hồng ngoại FT-IR Impact - 410 của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam -

Hà Nội và máy Bruker của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh

- Phổ LC/MS được ghi trên máy LC/MSD bẫy ion của Agilent của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Hà Nội

- Điểm nóng chảy đo trên khối Maquenne không điều chỉnh nhiệt độ

- Đèn UV được sử dụng ở bước sóng 254 và 365 nm

2.2 Trích ly và khảo sát thành phần tinh dầu lá chè đắng

Cân 300 g lá chè đắng tươi, rửa sạch, để ráo nước sau đó xay nhuyễn Lá xay được đem trích Soxhlet với 1 lít n-hexane trong 8 giờ, cô quay thu được cao n-hexane Cao n-hexane được đem lôi cuốn hơi nước (1 lít) trong 6 giờ thu được tinh dầu chè đắng thô Chiết tinh dầu thô với n-hexane (20 ml x 3 lần), làm khan với

Na2SO4, lọc qua phễu thuỷ tinh, cô quay tiếp để đuổi dung môi thu được tinh dầu chè đắng (35 mg) (Sơ đồ 2.1)

Phân tích thành phần tinh dầu lá chè đắng trên máy GC/MS với:

Sơ đồ 2.1: Quy trình trích ly tinh dầu lá chè đắng

2.3 Điều chế các cao thô

∗ Điều chế cao thô ethanol (ILND-Ethanol) bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng

Cho 500 g bột lá chè đắng được ngâm với ethanol trong 24 giờ (2 lít x 3 lần) ngâm; lọc lấy dịch, cô quay thu hồi dung môi thu được cao ethanol thô (ILND-

Ethanol) (11 g) (Sơ đồ 2.2)

∗ Điều chế cao thô (ILSO-Eter, ILSO-CHCl 3 , ILSO-MeOH) bằng phương pháp trích Soxhlet

Bột lá chè đắng 800 g được đem trích Soxhlet với 1,6 lít petroleum ether trong

24 giờ, cô quay thu được cao thô petroleum ether (ILSO-Eter) (35 g); bã còn lại tiếp tục trích với 1,6 lít chloroform trong 24 giờ, cô quay thu được cao thô chloroform (ILSO-CHCl3) (10,5 g) Cuối cùng bã được tận trích với 1,6 lít methanol trong 24

giờ, cô quay thu được cao thô methanol (ILSO-MeOH) (30 g) (Sơ đồ 2.3)

- Xay, trích Soxhlet với n-hexane

- Cô quay, thu hồi dung môi

Lá chè đắng tươi

Cao n-hexane

- Lôi cuốn hơi nước

Tinh dầu lá chè đắng thô

Tinh dầu chè đắng

- Lắc với n-hexane

- Làm khan bằng Na2SO4

- Cô quay, thu hồi dung môi

Sơ đồ 2.2: Quy trình điều chế cao thô ethanol

Sơ đồ 2.3: Quy trình điều chế các cao thô từ lá cây chè đắng bằng phương

pháp trích Soxhlet

Bã chè

Bột lá chè đắng

Cao ethanol (ILND-Ethanol)

- Ngâm với ethanol

- Cô quay, thu hồi dung môi

- Trích Soxhlet với petroleum ether

- Cô quay, thu hồi dung môi

Cao petroleum ether

(ILSO-MeOH)

- Trích Soxhlet với MeOH

- Cô quay, thu hồi dung môi

2.4 Thử các hoạt tính sinh học trên các cao thô

Các mẫu cao: ethanol (ILND-Ethanol); petroleum ether (ILSO-Eter); chloroform (ILSO-CHCl 3 ); methanol (ILSO-MeOH) được gởi đến phòng Sinh

học thực nghiệm của Viện Hoá Học các Hợp chất thiên nhiên Hà Nội để thử các hoạt tính sinh học

2.4.1 Hoạt tính kháng oxi hoá trên hệ DPPH

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin, có màu vàng nhạt) có khả năng tạo ra gốc tự do DPPH• (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, có màu tím) bền trong dung môi ethanol Khi cho mẫu cao thử nghiệm vào dung dịch DPPH•trong ethanol, mẫu cao thử nghiệm có khả năng bắt gốc tự do DPPH•; do đó sẽ làm giảm nồng độ gốc tự do Hoạt tính kháng oxi hoá được đánh giá thông qua mật độ quang của mẫu cao thử nghiệm so với mẫu đối chứng đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm

Quy trình thử nghiệm

∗ Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch DPPH• nồng độ 300 μM trong ethanol

- Chứng dương tính là acid ascorbic 5 mM trong DMSO (Dimethyl sulfoxide) - Chứng âm tính là dung môi DMSO

- Mẫu cao thí nghiệm nồng độ 4 mg/mL trong DMSO

∗ Đo mẫu: Lần lượt cho vào các mẫu chứng dương, chứng âm và mẫu cao thí

nghiệm vào dung dịch DPPH• nồng độ 300 μM trong ethanol như sau:

9 Dãy chứng dương tính: 10 μL dung dịch acid ascorbic + 190 μL dung dịch DPPH•

9 Dãy chứng âm tính: 10 μL DMSO 10 % + 190 μL dung dịch DPPH•

9 Dãy blank (mẫu trắng): 10 μL mẫu cao thí nghiệm + 190 μL dung môi ethanol

9 Dãy thí nghiệm: 10 μL mẫu cao thí nghiệm + 190 μL dung dịch DPPH• Các giếng được bọc kín, để tránh ánh sáng và ủ trong tủ ấm ở 37 0C trong 2 giờ Đọc kết quả trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm

Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging capacity)

Giá trị SC % đánh giá khả năng bẫy gốc tự do DPPH• của mẫu cao thử nghiệm

ở nồng độ khảo sát tính theo phần trăm so với các mẫu đối chứng Giá trị trung bình

của SC % được tính theo công thức 2.1

OD

OD OD

X i : Là giá trị SC % của mẫu cao thử nghiệm lần thứ i

X : Là giá trị SC % trung bình của mẫu cao thử nghiệm

n: Số lần thử nghiệm

Mẫu có biểu hiện khả năng bẫy gốc tự do ứng với (SC ≥ 50 %) sẽ được lựa chọn để tiếp tục khảo sát nồng độ mà tại đó mẫu có khả năng bẫy 50 % gốc tự do DPPH• (SC50, mg/mL)

Giá trị SC 50 được xác định theo cách sau: đo và tính các giá trị SC % tương ứng với 5 nồng độ Dựa vào các giá trị SC % trên để xây dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nghịch đảo của nồng độ mẫu với logarit neper của giá trị SC % của mẫu

(Phương trình 2.3)

LnX b a

1

Trong đó: Y là nồng độ của mẫu cao thử nghiệm

X là giá trị SC % của mẫu cao thử nghiệm

Dựa vào đồ thị để xác định SC 50 tương ứng với nồng độ ở đó 50 % các gốc tự

do DPPH• trung hòa bởi mẫu thử

(2.1)

(2.2)

(2.3)

2.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào

Theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990), Likhiwotayawuid và cộng sự (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Hoa Kỳ (NCI)

Quy trình thử nghiệm

∗ Chuẩn bị mẫu:

- Chứng âm là dung môi DMSO 10 %

- Chứng dương tính là Ellipticine trong DMSO

- Mẫu cao thử nghiệm với nồng độ 4 mg/mL trong DMSO

- Mật độ tế bào là 3 - 4 x 104/giếng

- Dung dịch SRB (sulforhodamine B):

∗ Đo mẫu: Cho các mẫu cao thử nghiệm và dung dịch tế bào vào phiến 96 giếng

theo thứ tự

9 Dãy chứng âm tính: 10 μL DMSO 10 % + 190 μL dung dịch tế bào

9 Dãy chứng dương tính: 10μL dung dịch Ellipticine + 190 μL dung dịch tế bào

9 Dãy mẫu cao thử: 10 μL mẫu + 190 μL dung dịch tế bào

9 Dãy mẫu ngày zero: 200 μL dung dịch tế bào

Chú ý: Nồng độ DMSO trong các giếng không vượt quá 0.5 %

Các mẫu cao thử nghiệm và mẫu chứng được ủ trong 72 giờ ở 37 0C, độ ẩm là

98 % trong môi trường 5 % CO2 Còn mẫu ngày zero được ủ trong 10 phút cùng điều kiện

Sau khi ủ, loại bỏ dung dịch môi trường cũ ở các mẫu và cho vào 200 μL TCA

10 % (Trichloroacetic acid), ủ tiếp trong 30 phút ở 4 0C

Rửa bỏ TCA với nước và để khô phiến giếng ở nhiệt độ phòng

Tiếp theo, nhuộm tế bào bằng 100 μL dung dịch SRB (sulforhodamine B) trong

30 phút

Sau đó loại bỏ dung dịch SRB, dùng acid acetic 1 % rửa các tế bào nhiều lần, để khô ở nhiệt độ phòng

Hòa tan vết nhuộm bằng 200 μL dung dịch Tris base và lắc trên máy lắc trong 5 phút Đọc mật độ quang ở bước sóng 515 nm bằng máy Elisa

Đánh giá khả năng sống sót của tế bào (CS – Cell survival): Khả năng sống

sót của tế bào ở nồng độ khảo sát của mẫu thử tính theo phần trăm so với các mẫu đối chứng (Công thức 2.4)

NgàyO TN

OD OD

OD OD

CS

Trong đó: OD Âm , OD NgàyO và OD TN là độ hấp thu của mẫu chứng âm, mẫu ngày zero và mẫu cao thử

Độ lệch chuẩn σ tính theo công thức (2.2)

Các mẫu thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tế bào với CS % ≤ 50 thì được chọn tiếp để tiếp tục khảo sát nồng độ mà tại đó mẫu thử có khả năng gây độc

hay ức chế 50 % tế bào (IC 50, μg/mL)

Các giá trị IC50 được xác định theo cách sau: Đo và tính các giá trị CS % tương ứng với các nồng độ Dựa vào các giá trị CS % trên để xây dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nghịch đảo nồng độ mẫu thử với logarit neper của giá trị CS %

theo phương trình 2.3

Từ đồ thị xác định IC50, là nồng độ tương ứng với 50 % tế bào sống sót

2.4.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96 well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), MCKane, L., và Kandel (1996)

Quy trình thử nghiệm

∗ Chuẩn bị mẫu: Các chất kháng sinh và mẫu cao thử được pha trong dung môi

DMSO ở các nồng độ: Ampiciline 50 mM cho vi khuẩn Gr (+), Tetracycline 10

mM cho vi khuẩn Gr (-), Nystatin hoặc Amphotericin B 0,04 mM cho nấm sợi và nấm men Mẫu thử có nồng độ 4 mg/mL

Các vi sinh vật hoạt hoá và pha loãng trong môi trường tương ứng với nồng độ 0,5 đơn vị McFland (1,5 x 108 CFU/mL)

(2.4)

∗ Đo mẫu: Lần lượt cho các mẫu chứng, mẫu cao thí nghiệm và dung dịch môi trường chứa vi sinh vật vào các giếng trên phiến 96 giếng theo các dãy sau:

9 Dãy chứng dương tính: 10 μL mẫu kháng sinh + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật

9 Dãy chứng âm tính: 10 μL DMSO 10 % + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật

9 Dãy thí nghiệm: 10 μL mẫu cao thí nghiệm + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật

Chú ý: Nồng độ DMSO trong các giếng thử nghiệm không vượt quá 0,5 %

Các kết quả được đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm ở 37 0C trong 24 giờ cho thí nghiệm với các vi khuẩn và 30 0C trong 48 giờ cho nấm sợi và nấm men

Kết quả dương tính được ghi nhận tại các nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển nghĩa là tại nồng độ này trên môi trường nuôi cấy đĩa thạch số đơn vị lạc khuẩn (CFU) < 5

Nồng độ thấp nhất tương ứng với kết quả dương tính là nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) Mẫu thử có MIC ≤ 200 μg/mL đối với cao thô hay MIC ≤ 50 μg/mL đối với mẫu tinh khiết thì được xem là dương tính kháng vi sinh vật

2.5 Cô lập các hợp chất

2.5.1 Cô lập hợp chất HB55

Hòa tan 11,0 g cao ethanol (ILND-Ethanol) với 400 mL hỗn hợp nước cất và chloroform (tỉ lệ 1:1), lóng lấy phần dung dịch chloroform đem cô quay thu được 2,0 g cao ethanol - chloroform (Et-Ch) Sắc ký cột silica gel 2,0 g cao Et-Ch với hệ dung môi MeOH - CHCl3 (methanol tăng từ 0 → 100 %), dựa trên bản mỏng gộp các phân đoạn

có vết giống nhau thu được 21 phân đoạn và được mã hóa Et-Ch1→ Et-Ch21 Chọn phân đoạn 18 khảo sát tiếp, cô quay phân đoạn 18 thu được chất bột, rửa sản phẩm này nhiều lần với dung môi petroleum ether, thu được HB55 (Sơ đồ 2.4)

2.5.2 Cô lập hợp chất HO35

Hòa tan 4,0 g cao petroleum ether (ILSO-Eter) với 200 mL methanol, lọc thu được dịch chiết methanol, cô quay thu được 0,5 g cao petroleum ether – methanol (ED-Me)

Sắc ký cột silica gel 0,5 g cao ED-Me với hệ dung môi giải ly ethyl acetate - petroleum ether (ethyl acetate tăng từ 0 → 100 %), dựa trên bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 5 phân đoạn và được mã hoá ED-Me1 → ED-Me5 Cô quay đuổi dung môi phân đoạn 5 thu được chất bột, rửa lại chất bột lần lượt bằng các dung môi petroleum ether, thu được chất bột màu trắng mã hóa là HO35 (Sơ đồ 2.5)

Sơ đồ 2.4: Quy trình cô lập hợp chất HB55

HB55 Et-Ch18

- SKC silica gel

- Hệ MeOH – CHCl3

- Thu được 21 phân đoạn

- Rửa với petroleum ether

Cao ethanol-chloroform

(Et-Ch)

Cao ethanol (ILND-Ethanol)

- Hòa tan với nước và chloroform

Sơ đồ 2.5: Quy trình cô lập hợp chất HO35

2.5.3 Cô lập hợp chất ILC4443 và hợp chất ILC54321

Từ 10,5 g cao chloroform (ILSO-CHCl3) chạy sắc ký cột silica gel, dung môi giải ly acetone - petroleum ether (acetone tăng từ 0 → 100 %) Kết hợp với sắc ký bản mỏng (SKBM) gộp các phân đoạn có vết giống nhau lại thu được 7 phân đoạn

và được mã hóa là (ILC1 - ILC7) (Sơ đồ 2.6)

∗ Cô lập hợp chất ILC4443

Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn cao ILC4 với hệ dung môi giải ly acetone - petroleum ether (acetone tăng từ 0 → 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau lại thu được 6 phân đoạn (ILC41 → ILC46) Tiếp tục sắc ký cột slica gel phân đoạn ILC44 (504 mg), với hệ dung môi giải ly acetone - chloroform - petroleum ether (tỉ lệ 3 : 5 : 65), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau lại thu được 4 phân đoạn (ILC441 → ILC444) Cuối

- Hòa tan trong MeOH

- Cô quay, thu hồi dung môi

Cao petroleum ether (ILSO-Eter)

- SKC silica gel

- Hệ ethyl acetate - petroleum ether

- Rửa với petroleum ether

HO35

ED-Me2 ED-Me1

cùng sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC444 (200 mg), với hệ dung môi acetone - petroleum ether (acetone tăg từ 0 → 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau lại thu được 4 phân đoạn (ILC4441→

ILC4444) Trong đó, ILC4443 (40 mg) là chất bột màu trắng (Sơ đồ 2.7)

∗ Cô lập hợp chất ILC54321

Sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC5 (1.9 g) với hệ dung môi giải ly acetone - petroleum ether (acetone tăng từ 0 - 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 8 phân đoạn ILC51 → ILC58 Chọn phân đoạn ILC54 (360 mg) chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ethyl acetate - petroleum ether (ethyl acetate tăng từ 0 → 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 4 phân đoạn ILC541 → ILC544 Tiếp tục chọn phân đoạn ILC543 (270 mg) chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ethyl acetate - petroleum ether (ethyl acetate tăng từ 0 → 100 %) thu được 6 phân đoạn ILC5431 → ILC5436 Cuối cùng sắc ký cột trên phân đoạn ILC5432 (88 mg) với hệ dung môi acetone - petroleum ether (acetone tăng từ 0 → 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau lại thu được 3 phân đoạn ILC54321 → ILC54323 Trong đó, ILC54321 (15 mg) là chất rắn màu trắng (Sơ đồ 2.8)

Sơ đồ 2.7: Quy trình cô lập hợp chất ILC4443

Sơ đồ 2.8: Quy trình cô lập hợp chất ILC54321

Sơ đồ 2.6: Quy trình điều chế cao ILC4 và ILC5 2.5.4 Cô lập hợp chất ILM53421, ILM53422 và ILM542

Từ 30 g cao methanol (ILSO-MeOH) tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi giải ly methanol - chloroform (methanol tăng từ 0 → 100 %) Dựa trên sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 7 phân đoạn và được mã hoá ILM1 → ILM7

Từ phân đoạn ILM5 (15 g) tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi giải ly

H2O - MeOH - CHCl3 (tỉ lệ 5 : 25 : 70), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân

- SKC silica gel

- Hệ acetone -petroleum etherILC1 ILC2 ILC3 ILC4 ILC5 ILC6 ILC7

đoạn có vết giống nhau thu được 4 phân đoạn là ILM51 → ILM54 (Sơ đồ 2.9)

∗ Cô lập hợp chất ILM53421 và ILM53422

Tiến hành SKC silica gel phân đoạn ILM53 (1.8 g) với hệ dung môi H2O - MeOH

- CHCl3 (tỉ lệ 5 : 25 : 70), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 5 phân đoạn ILM531 → ILM535 Tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn ILM534 (400 mg) với hệ dung môi H2O - MeOH - CHCl3 (tỉ lệ 5 : 25 : 70), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được 5 phân đoạn ILM5341 → ILM5345 Cuối cùng sắc ký cột silica gel pha đảo phân đoạn ILM5342 với hệ dung môi acetone - H2O (acetone tăng từ 70 → 100 %), kết hợp với sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn có vết giống nhau thu được hai chất ILM53421 và ILM53422 Trong đó, ILM53422 được làm sạch bằng cách sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH 100 % (Sơ đồ 2.10)

∗ Cô lập hợp chất ILM542

Tiến hành SKC silica gel phân đoạn ILM54 (250 mg) với hệ dung môi giải ly H2O

- MeOH - CHCl3 (tỉ lệ 5 : 25 : 70), sau đó dựa vào sắc ký bản mỏng gộp các phân đoạn

có vết giống nhau thành 2 phân đoạn là ILM541 và ILM542, làm sạch lại phân đoạn ILM542 bằng cách sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải ly acetone - H2O (acetone tăng từ 70 → 100 %) thu được hợp chất ILM542 (15 mg) (Sơ đồ 2.11)

Sơ đồ 2.9: Quy trình điều chế cao ILM53 và ILM54

- SKC silica gel

- Hệ H2O - MeOH - CHCl3

Cao MeOH (ILSO-MeOH)