Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật pyrolysis ghép nối sắc ký khí trong phân tích dược liệu

Mỗi loại vật liệu khi phân hủy ở một nhiệt độ nhất định sẽtạo thành một hỗn hợp các sản phẩm đặc trưng có thể sử dụng như dấu vân tay để địnhdanh vật liệu ấy.. Do đó, quá trình nhiệtphân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

    

TRƯƠNG LÂM SƠN HẢI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PYROLYSIS GHÉP NỐI SẮC KÝ KHÍ TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số chuyên ngành: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN ÁNH MAI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

LỜI CẢM ƠN

Trải qua hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã học, đã rút ra được nhiềukinh nghiệm cùng những kiến thức quý báu, được những thành quả đó là nhờ có sựgiúp đỡ nhiệt tình của tất cả thầy cô, anh, chị em trong bộ môn nói riêng cùng các thầy

cô trong Khoa Hóa nói chung

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Cô Nguyễn Ánh Mai, người đã tậntình hướng dẫn và chỉ dạy cho tôi mọi thứ, truyền đạt rất nhiều kinh nghiệm không chỉtrong khoa học mà còn cả những điều trong cuộc sống, cho công việc sau này, nhất là

Cô luôn giúp đỡ khi tôi gặp rắc rối và những trường hợp gần như không còn cách giảiquyết cho các vấn đề thực nghiệm Tôi đã học hỏi được rất nhiều ở Cô về cách làmviệc khoa học và cách suy nghĩ thấu đáo

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến Đại Học Umea - Thụy Điển đặc biệt làLarks - Lundmark, Marcus và Elin đã hỗ trợ thiết bị Pyrola 85 cũng như các kiến thức

về lĩnh vực pyrolysis để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn đến anh Trần Thanh Tú đã giúp tôi rất nhiều khi bắt đầu làm quentrong lĩnh vực chemometrics, tận tình chỉ bảo tôi về phần mềm SIMCA - P và đặc biệtluôn đưa những lời khuyên hữu ích cho tôi

Tôi cũng xin cảm ơn đến tất cả các anh, chị và các em trong phòng thí nghiệm,luôn quan tâm chia sẻ, động viên, cho tôi thật nhiều kỷ niệm đẹp, vui có, buồn có,nhưng đó điều là những điều đáng nhớ trong suốt cuộc đời tôi

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người bạn SACUS, luônchia sẻ, động viên, luôn mang đến những nụ cười cho tôi, giúp đỡ trong những lúc khókhăn nhất Một lần nữa, cảm ơn “ những người bạn bên tôi - SACUS”

Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình Có thể gia đình tôi chẳng bao giờđọc được lời cảm ơn này Ba tôi chỉ nâng niu quyển luận văn, vuốt ve cái bìa xanhnhung, tấm tắc khen dòng chữ mạ vàng, nhưng ba sẽ không lật vào trong để đọc lờicảm ơn của tôi Nhìn tôi khôn lớn, nhìn tôi mặc áo chùng xanh nhận bằng tốt nghiệp,nhìn tôi ôm quyển luận văn rạng rỡ,… thì vài dòng cảm ơn nhỏ nhoi ấy có đáng là gì!Cũng như nhiều người xuất hiện trong lời cảm ơn của tôi, chắc chẳng bao giờ họ đọc,chắc họ cũng quên mất rằng họ từng góp phần giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này.Nhưng với tôi thì tôi vẫn phải viết lời cảm ơn một cách trân trọng nhất, vẹn trònnhất! Không chỉ là một “thủ tục luận văn”, không chỉ là một hành động tri ân, mà còn

để sau này khi vuốt ve trang đầu tiên ấy tôi sẽ nhớ: ờ, ngày đó, tháng đó, những khókhăn lúc đó, đã có những lòng tốt, những người tốt như thế đó ở bên cạnh tôi,…

Thành Phố Hồ Chí Minh, Tháng 9 năm 2012

DANH MỤC VIẾT TẮT

EI: (Electron Impact) va chạm electron

GC-FID: (Gas chromatography - Flame Ionization Detector) Sắc ký khí đầu dò ion hoángọn lửa

MS: (Mass Spectrometry) khối phổ

PVC: Polyvinyl Chloride

RSD: (Relative Standard Deviation) độ lệch chuẩn tương đối

MVDA: (Multivariate Data Analysis) phân tích dữ liệu đa biến

PCA: (Principle Component Analysis) phân tích thành phần (cấu tử) chính

PC: (Principle Component) thành phần (cấu tử) chính

PLS - DA: (Partial Least Square - Discrimination Analysis) bình phương cực tiểu từngphần dùng để phân loại

SPSS: (Statistical Package for the Social Sciences) phần mềm thống kê phục vụ ngànhkhoa học xã hội

STATISTICA: phần mềm xử lý số liệu thống kê

SIMCA: Soft independent modeling of class analogy

QSAR: (Quantitative Structure - Activity Relationship) Quan hệ tuyến tính giữa cấutrúc và hoạt tính

HQ: Hàn Quốc

NIR: (Near - infrared spectroscopy) Cận hồng ngoại

FT - IR: (Fourier transform infrared spectroscopy) Quang phổ hồng ngoại biến đổiFourier

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1-1: Sơ đồ thiết bị của Furnace Pyrolyzer ghép nối máy sắc ký khí 2

Hình 1-2: Sơ đồ pyrolyzer sử dụng kỹ thuật Curie - point 3

Hình 1-3: Sơ đồ pyrolyzer kỹ thuật gia nhiệt điện trở filament 5

Hình 1-4: Sơ đồ các bộ phận của máy Pyrolysis ghép trực tiếp MS 1

Hình 1-5: Sơ đồ mặt cắt ngang của hệ thống inlet 1

Hình 1-6: Sắc ký đồ nhiệt phân của polyvinyl chloride ở nhiệt độ 600oC 1

Hình 1-7: Cấu trúc Polyurethane 8

Hình 1-8: Hệ thống GC - FID 9

Hình 1-9: Cấu tạo buồng tiêm chia dòng 1

Hình 1-10: Cấu tạo của cột mao quản 1

Hình 1-11: Các loại cột mao quản dùng trong sắc ký 1

Hình 1-12: Cấu tạo đầu dò FID 14

Hình 1-13: Sơ đồ hệ thống buồng nhiệt phân 15

Hình 1-14: (a) Bộ điều khiển (Control unit); (b) Buồng nhiệt phân được gắn trực tiếp trên GC (c) Lá platin được đặt bên trong cuvet thủy tinh; (d) Vị trí kim tiêm vào GC của hệ Pyrola 85 16

Hình 1-15: Bộ dữ liệu đa biến và khó khăn trong việc phân tích các bộ dữ liệu này 1

Hình 1-16: Ba ứng dụng cơ bản của MVDA từ trái sang phải (1) Khái quát bộ dữ liệu, (2) Phân loại và (3) Mô hình hoá quan hệ giữa khối dữ liệu X và khối dữ liệu Y 18

Hình 1-17: Điểm i trong không gian 3 chiều 19

Hình 1-18: Đồ thị biễu diễn cách hiệu chuẩn điểm trung bình về 0 (mean - centering) 1 Hình 1-19: Thể hiện sự thay đổi của các biến sau khi xử lý sơ bộ dữ liệu (hiệu chỉnh phương sai bằng 1 và giá trị trung bình bằng 0) 1

Hình 1-20: (a) PC1 và PC2 trong không gian; (b) Mặt phẳng tạo bởi PC1 và PC 2 22

Hình 1-21: Biểu đồ score biễu diễn phân bố tập quán ăn uống của 16 nước châu Âu Trong đó Thụy Điển (Swe), Đan Mạch (Den), Phần Lan (Fin), Na Uy (Nor), Bỉ (Bel), Đức (Ger), Anh (Eng), Áo (Aus), Ý (Ita), Tây Ban Nha (Spa), Bồ Đào Nha (Por), Pháp (Fra), Hà Lan (Hol) 1

Hình 1-22: Điểm lệch mạnh của tập hợp mẫu nghiên cứu 23

Hình 1-23: Biểu đồ loading của 20 loại thực phẩm thường sử dụng của người châu Âu.Trong đó Tỏi (Garlic), Dầu olive (Olive_oil), Chất tạo ngọt (Sweetner), Bánh mì dòn(Crisp_Brea), Cá đông lạnh (Fro_Fish) 1Hình 1-24: Sự phụ thuộc Q2 và R2 theo số cấu tử PC 25Hình 1-25: Chức năng xây dựng quan hệ định lượng giữa hai bộ dữ liệu X (biến dựđoán) và Y (biến đáp ứng) 25Hình 1-26: Khái quát về PLS 27Hình 1-27: Mức độ chặt chẽ trong mối tương quan giữa X và Y giải thích bởi thànhphần PLS thứ nhất (trái) và PLS thứ hai (phải) 27Hình 1-28: Thí dụ về biểu đồ trọng số trong PLS 1Hình 1-29: Bài toán phân loại mẫu khi sử dụng PLS - DA 29Hình 1-30: Biểu đồ score theo PC1 và PC2 của nhân sâm vùng Ganghwa và Punggi.29Hình 2-1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa điện trở Ro và nhiệt độ TC 35Hình 2-2: Đường chuẩn (1) biểu diễn sự phụ thuộc giữa điện trở Ro và nhiệt độ láPlatin 35Hình 2-3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa Ediod và nhiệt độ nhiệt phân Tp 36Hình 2-4: Đường chuẩn (2) biểu diễn sự phụ thuộc của Ediod tuyến tính nhiệt độ nhiệtphân TR 37Hình 2-5: Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ oven của hệ Pyrolysis 38Hình 2-6: Ảnh hưởng của nhiệt độ nhiệt phân trên sản phẩm nhiệt phân của mẫu nhânsâm HQ khi phân tích bằng GC - FID 39Hình 2-7: Sắc ký đồ tương ứng với các loại khí mang He, Ar, N2 cho hệ Pyrolyzer 40Hình 2-8: Sơ đồ hệ thống khí mang kết nối với Pyrola 85 thông qua bộ điều chỉnh lưulượng 41Hình 2-9: Sắc ký đồ tương ứng với các tốc độ dòng khí mang cung cấp cho hệ Pyrola85 42Hình 2-10: Biểu đồ biểu diễn thời gian và cường độ dòng tạo xung khi thực hiện quátrình pyrolysis 43Hình 2-11: Sắc ký đồ khảo sát các tỷ lệ tiêm chia dòng 44Hình 2-12: Sắc ký đồ khảo sát tiêm không chia dòng 44Hình 2-13: Sắc ký đồ khảo sát chương trình nhiệt trên mẫu nhân Sâm Hàn Quốc 6tuổi Trong đó (a) Chương trình nhiệt (1) và (2), (b) Chương trình nhiệt (3) 46

Hình 2-14: Hình dạng của các đối tượng dược liệu, (a): Cát cánh, (b): Đảng sâm, (c):Hồng sâm; (d): Sâm Ngọc Linh, (e): Tam thất, (f): Huyền sâm 51Hình 2-15: Sắc ký đồ của sâm HQ 6, 5, 4 tuổi và sâm HQ 6 tuổi chiết 1 lần 51Hình 2-16: (a) Biểu đồ score của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các mẫu sâm HQ

và các loại giả sâm; (b) Giá trị R2 và Q2 cuả mô hình ứng với 1PC, 2PC và 3PC 32Hình 2-17: Biểu đồ score (a), R2 và Q2 (b) và loading (c) của 2 thành phần chính PC1

và PC2 của các mẫu sâm và giả sâm HQ Trong đó, nhóm (2), (3) và (5) là sâm HQ 6,

5 và 4 tuổi; nhóm (4), (6) và (7) là sâm HQ 6, 5, và 4 tuổi bị chiết 1 lần, nhóm (8) làsâm HQ bị chiết 2 lần, nhóm (1) là các mẫu giả sâm 32Hình 2-18: Biểu đồ score (a), R2 và Q2 (b) và loading (c) của 2 thành phần chính PC1

và PC2 của các mẫu sâm HQ Trong đó, nhóm (1), (3) và (4) là sâm HQ 6, 5 và 4 tuổi;nhóm (2), (5) và (6) là sâm HQ 6, 5 và 4 tuổi bị chiết 1 lần, nhóm (7) là sâm HQ bịchiết 2 lần 32Hình 2-19: a) Biểu đồ score của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các loại mẫu SâmHàn Quốc với nhóm (1), (2), (3) nhân sâm 6, 5 và 4 tuổi và nhóm (4) nhân sâm 6 tuổi

đã chiết 1 lần b) Biểu đồ sự thay đổi của R2và Q2 theo số lượng thành phần chính của

mô hình 32

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2-1: Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng nhiệt phân trên điện trở Ro của lá Pt 34

Bảng 2-2: Ba chương trình nhiệt khảo sát trên mẫu nhân sâm 6 tuổi 46

Bảng 2-3: Khảo sát độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak 48

Bảng 2-4: Tên, phân loại và công dụng của các loại dược liệu 50

Bảng 2-5: Thành phần các hợp chất trong nhân Sâm Hàn Quốc 56

Bảng 2-6: Phần trăm dự đoán một số mẫu sâm HQ thuộc nhóm 4, 5 và 6 tuổi và 6 tuổi chiết 1 lần 57

Bảng 2-7: Phần trăm dự đoán một số mẫu sâm HQ 4, 5 tuổi chiết 1 lần và các mẫu giả sâm 59

LỜI MỞ ĐẦU

Khi đời sống con người không ngừng đựơc nâng cao thì sức khỏe chính là mốiquan tâm hàng đầu Bên cạnh các loại tân dược thì các loại thảo dược thiên nhiên ngàycàng được sử dụng nhiều do có khả năng điều trị bệnh tốt mà lại ít gây tác dụng phụ.Hơn thế nữa, thị trường thảo dược ngày càng phức tạp với hiện tựơng cung không đủcầu đã gây nên tình trạng các thảo dược này bị trà trộn với các loại thuốc giả, cây thuốckhông rõ nguồn gốc, pha trộn với các loại thuốc khác, nguồn nguyên liệu bị nhiễm bẩn,cũng như dược liệu đã bị chiết xuất hết các hợp chất có hoạt tính và được tái sử dụng.Ngoài ra, những cơ sở sản xuất dược liệu ở nước ta lại không đảm bảo vệ sinh, phơitrực tiếp dược liệu trên mặt đất hoặc mọi chỗ trống nên dược liệu có tốt cũng nhanhmất chất lượng Song, năng lực kiểm tra và giám sát chất lượng thuốc của các cơ quanchức năng còn nhiều bất cập Chính vì thế, sự an toàn và chất lượng của các loại thảodược đã ngày càng trở thành những mối quan ngại lớn cho cộng đồng vì gây ảnh hưởngtrực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng

Trước nhu cầu cần thiết về việc quản lý chất lượng dược liệu cần xây dựng cácphương pháp phân tích có khả năng xác định nhanh nguồn gốc, phẩm chất thành phầndược liệu, tránh loại bỏ các bước xử lý mẫu phức tạp, tiêu tốn nhiều loại dung môi độchại gây ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường Với mục đích trên trong luận văn cao họcnày chúng tôi tập trung vào việc phát triển một phương pháp phân tích nhanh kết hợppyrolysis và sắc ký khí nhằm góp phần phát triển và bảo vệ ngành công nghiệp dượccủa nước ta

Kỹ thuật pyrolysis, đơn giản là sự nhiệt phân trong môi trường khí trơ đểchuyển hóa các hợp chất khó bay hơi trong mẫu rắn thành các chất có phân tử lượngnhỏ hơn, dễ bay hơi hơn Mỗi loại vật liệu khi phân hủy ở một nhiệt độ nhất định sẽtạo thành một hỗn hợp các sản phẩm đặc trưng có thể sử dụng như dấu vân tay để địnhdanh vật liệu ấy Kết hợp giữa kỹ thuật pyrolysis và sắc ký khí với khả năng phân táchrất cao và các đầu dò nhạy như đầu dò ion hóa ngọn lửa hoặc chọn lọc như đầu dòkhối phổ cho phép việc định danh các vật liệu được chắc chắn hơn

Phương pháp pyrolysis ghép nối sắc ký đã được phát triển và đưa vào ứng dụngtrong các lĩnh vực polymer, công nghệ dệt, vật liệu, dược liệu,… ở các nước pháttriển như Trung Quốc, Thụy Điển, Pháp, Mỹ, Anh, Đức,… Tại Trung Quốc, kỹ thuậtnày được ứng dụng rất mạnh trong việc xác định thành phần, chất lượng, nguồn gốc

dược liệu đặc biệt là các sản phẩm đông dược Pyrolysis ghép nối sắc ký khí tuykhông phải là vấn đề mới đối với thế giới nhưng ở Việt Nam chưa có nhiều nghiêncứu sâu về kỹ thuật này, đặc biệt là kết hợp với phương pháp thống kê (như phân tích

dữ liệu đa biến) để xử lý số liệu phân tích giúp việc phân biệt độ tuổi và giống câycủa các loại dược liệu quý được dễ dàng hơn (nhân sâm, trầm hương,…) Mặt khác,phương pháp này sẽ giúp các cơ quan chức năng quản lý được chất lượng cũng nhưphân biệt dược liệu giả trên những đối tượng dược liệu đặc thù cho Việt Nam

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về pyrolysis [1]

Pyrolysis được định nghĩa là kỹ thuật chỉ sử dụng nhiệt năng để cắt đứt các liênkết hóa học của các hợp chất trong mẫu (thường ở dạng rắn) tạo thành các phân tử nhỏhơn chất ban đầu Quá trình này diễn ra tương tự như trong giao diện

EI (Electron Impact) của khối phổ khi chất phân tích bị bắn phá bởi các electron cónăng lượng cao và bị cắt ra thành nhiều mảnh ion con Pyrolysis được xem như mộtloại phản ứng rất đặc biệt vì tại nhiệt độ diễn ra phản ứng, vận tốc phản ứng đạt đượcrất cao và rất nhiều sản phẩm hình thành thông qua phản ứng này Hầu hết các sảnphẩm này không có mặt ở môi trường bình thường hoặc khi nhiệt độ tăng nhẹ

Pyrolysis xảy ra ở khoảng nhiệt độ trên 300 oC, thường ở giữa 500 - 800 oC.Thông thường pyrolysis sử dụng trong phân tích là pyrolysis nhanh (flash pyrolysis),tức là diễn ra với vận tốc gia nhiệt nhanh 10000oK/s và khi đạt đến nhiệt độ cuối thìđược giữ cố định trong một khoảng thời gian nhất định[2] Bên cạnh pyrolysis flash còn

có các kỹ thuật khác như: pyrolyis từng phần, pyrolysis từng bước, pyrolysis chươngtrình nhiệt

Pyrolysis thường được tiến hành trong môi trường khí trơ Trong điều kiện lýtưởng sự nhiệt phân xảy ra trong môi trường hoàn toàn trơ không chứa oxy, tuy nhiêntrên thực tế khó đạt được điều này Như vậy bên cạnh sự giải hấp của các chất dễ bayhơi trong mẫu, còn có sự phân hủy nhiệt của các sản phẩm khó bay hơi và các sảnphẩm oxy hóa do tạp chất oxy trong dòng khí mang Chính vì thế, trong pyrolysis còn

có kỹ thuật nhiệt phân oxi hóa (xảy ra khi có mặt chất oxi hóa) và nhiệt phân khử (diễn

ra trong môi trường có chất khử)

Pyrolysis chỉ là một quá trình chuyển hoá mẫu rắn thành các hợp chất có phân tửlượng nhỏ hơn Quá trình này có thể bao gồm sự cắt đứt liên kết, hình thành liên kếtmới, có hoặc không có tác động của chất xúc tác Vấn đề là làm sao quá trình ấy xảy ramột cách lập lại thì đều có ý nghĩa đối với mục tiêu phân tích Do đó, quá trình nhiệtphân trong pyrolysis cần được kiểm soát chặt chẽ các thông số về nhiệt độ, thời giannhiệt phân và lưu lượng khí mang,…

Bản thân pyrolysis là một phản ứng hóa học, không cung cấp bất kỳ dữ liệu nàonếu không kết hợp với một phép ghi đo khác như sắc ký hay quang phổ Vì vậy, đểđịnh tính và định lượng hỗn hợp các sản phẩm nhiệt phân này hệ nhiệt phân

(pyrolyzer) cần phải kết hợp với các thiết bị phân tích khác như khối phổ, phổ hồngngoại (FT - IR), sắc ký khí để những thông tin về mẫu được chính xác và rõ ràng hơn.

1.2 Phân loại các kỹ thuật nhiệt phân [1,2]

Ba kỹ thuật pyrolysis sử dụng phổ biến là: Curie - point (gia nhiệt filament cảmứng), lò đẳng nhiệt (isothermal furnace), gia nhiệt điện trở filament (resistively heatedfilaments) Mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm khác nhau

1.2.1 Nhiệt phân bằng lò (Furnace Pyrolyzer)

Nguyên tắc hoạt động: Mẫu được gia nhiệt với nhiệt độ không thay đổi trong

suốt quá trình nhiệt phân, sản phẩm sinh ra sẽ được dòng khí mang thổi đến hệ thốngcủa sắc ký khí Tại đây quá trình phân tích mẫu sẽ diễn ra trong cột sắc ký

Lò đốt đẳng nhiệt của bộ nhiệt phân được lắp đặt trực tiếp trên inlet của máy sắc

ký và ổn định nhiệt độ, thông thường được giữ trong phạm vi ± 1oC Lò đốt gồm mộtống kim loại hay thạch anh bao phủ xung quanh một lá kim loại bằng platin(Pt - filament) được đốt nóng (Hình 1-1), dòng khí mang đi vào trong lò đốt, dẫn hơimẫu trực tiếp vào cổng tiêm mẫu (injection port) của máy sắc ký Bộ cảm biến nhiệtđược cài đặt giữa lò đốt và ống đốt để đo nhiệt độ của thành ống Cảm biến này đóngvai trò rất quan trọng để giúp thiết bị ổn định Nhiệt độ của các vị trí trong lò sẽ khácnhau vì phụ thuộc vào đường kính, độ dày, vật liệu và khối lượng của ống trung tâmtrong lò đốt

Hình 1-1: Sơ đồ thiết bị của Furnace Pyrolyzer ghép nối máy sắc ký khí

Ưu điểm: Hoạt động đơn giản Có thể thiết lập được nhiệt độ mong muốn.

Cột mao quản Van chia dòng

Nhược điểm: Để đảm bảo ổn định nhiệt, khoảng không gian giữa ống trung

tâm và chốt đẩy chứa mẫu được thiết kế tương đối lớn Vì thế, để có sự tương thíchgiữa pyrolyzer và hệ thống GC, cần sử dụng lưu lượng lớn (100 mL/phút) Điều nàylàm giảm độ nhạy một số hợp chất hữu cơ trong mẫu khi ở nồng độ thấp Mặt khácống đốt có cấu tạo bằng kim loại Do đó khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì các sản phẩmhữu cơ bị các thanh kim loại làm xúc tác phản ứng và sinh ra các sản phẩm phụ khôngmong muốn

1.2.1.1 Đốt nóng filament bằng cuộn cảm (kỹ thuật Curie - point)

Nguyên tắc hoạt động: Kỹ thuật này hoạt động dựa trên nguyên lý khi dòng

điện đi qua cuộn cảm ứng cao tần (lõi xoay) và sinh từ trường Khi từ trường được cấpliên tục, dây đốt nóng làm bằng kim loại đặt trong lõi từ sẽ nóng dần lên và đạt đếnnhiệt độ nhất định Dây kim loại đốt nóng thường làm bằng hợp kim có từ tính, nhiệt

độ của quá trình nhiệt phân sẽ khác nhau phụ thuộc vào hợp kim làm dây đốt nóng.Mỗi loại dây khi đốt nóng bằng từ trường sẽ đạt một nhiệt độ nhất định như 770oC đốivới dây sắt và 900oC với hợp kim gồm 40 % nickel và 60 % cobalt (Hình 1-2)

Hình 1-2: Sơ đồ pyrolyzer sử dụng kỹ thuật Curie - point

Ưu điểm: Curie - point là phương pháp nhiệt phân có độ lặp lại tốt Nhiệt độ

không tăng thêm khi đã đạt tới điểm Curie của kim loại

Nhược điểm: Dây đốt nóng làm bằng các hợp kim khác nhau, chỉ có hiệu quả

tốt trong một khoảng nhiệt độ nhất định, vì thế các mẫu khác nhau đòi hỏi các dây đốtnóng khác nhau, khó để tự động hóa Mặt khác, dây đốt nóng làm bằng các hợp kimnên dễ gây xúc tác cho các phản ứng hữu cơ ở nhiệt độ cao

1.2.1.2 Gia nhiệt điện trở filament

Nguyên tắc hoạt động: Mẫu phân tích được đặt trực tiếp lên lá kim loại

(filament) và được gia nhiệt trong buồng nhiệt phân, sau đó các sản phẩm phân hủybởi nhiệt được chuyển qua buồng tiêm mẫu của sắc ký khí, vào cột theo dòng khí trơ.Quá trình tách sẽ diễn ra trong cột Filament thường được làm bằng sắt, platin hoặchợp kim nickel và chromium (Hình 1-3)

Ưu điểm: Sử dụng được ở nhiều nhiệt độ khác nhau (500 - 2000 oC), điềuchỉnh được tốc độ gia nhiệt, dễ dàng thay filament Độ lặp lại của phương pháp này rấttốt với điều kiện phải đảm bảo sự đồng bộ kích thước của mẫu và vị trí mà mẫu đượcđặt trên lá filament Phương pháp filament tạo ra sản phẩm nhiệt phân thứ cấp ít hơnhai phương pháp trên, vì vậy kết quả phổ đồ dễ dàng giải thích hơn Thời gian đốtnóng của phương pháp điện trở filament thường từ 0,2 tới 0,4 giây, nhanh hơn hai kỹthuật trên khoảng 10 lần

Nhược điểm: Với mỗi lá filament có một điện trở riêng biệt bất kì sự thay đổi

về điện trở cũng gây ra sự thay đổi về cường độ dòng, dẫn tới nhiệt độ cũng thay đổi,

độ lặp lại của phương pháp sẽ bị ảnh hưởng

Hình 1-3: Sơ đồ pyrolyzer kỹ thuật gia nhiệt điện trở filament

Nhược điểm lớn còn tồn tại với cả ba phương pháp nhiệt phân này là cácpyrolyzer đều gắn phía ngoài của hệ thống sắc ký khí, dễ xảy ra sự phân hủy các sảnphẩm nhiệt phân có điểm sôi cao hoặc sự ngưng tụ các sản phẩm của phản ứng nhiệtphân trong quá trình chuyển tải từ buồng nhiệt phân đến buồng tiêm của sắc ký khí Vìthế các chất có khối lượng phân tử lớn, khó bay hơi, thường bị mất mát nhiều hơn cácchất dễ bay hơi

Để có thể định danh chính xác các sản phẩm nhiệt phân, bất kì kỹ thuật pyrolysisnào cũng cần phải ghép nối với các phương pháp phân tích khác hoặc kết hợp nhiềuphương pháp Thông thường người ta hay sử dụng các hệ pyrolysis ghép nối với GC

và các đầu dò ion hoá ngọn lửa (FID) hay khối phổ (MS) hoặc ghép trực tiếp với khốiphổ (MS)

1.2.2 Thiết bị Pyrolysis ghép nối với khối phổ [3]

Cấu tạo của thiết bị Pyrolysis ghép nối với MS gồm các bộ phận chính được trình bàytrong Hình 1-4

Vòng “O” được lắp phía bên ngoài giữ cho hệ thống hoàn toàn kín, pittong sẽ dichuyển từ vị trí A sang vị trí B (Hình 1-5), đường dẫn các chùm tia phân tử tới nguồnion hóa sẽ đóng lại, phần không khí ở vùng C được đẩy hết qua đường vòng Khipittong di chuyển từ vị trí B sang vị trí C, đường vòng đóng lại, đường dẫn các chùmtia phân tử tới nguồn ion hóa mở ra đồng thời lôi kéo hơi sản phẩm nhiệt phân vàovùng A để tạo cân bằng áp suất với buồng nhiệt phân Hơi này sẽ đi qua chùm phân tửđược gia nhiệt tới nguồn ion Tại đây, hơi sản phẩm nhiệt phân bị bắn phá bằng cácelectron ở 70 eV của đầu dò EI/MS Các phân tử mang điện tích được phân tích bằng

bộ tứ cực và khối phổ của các sản phẩm nhiệt phân được ghi nhận bằng bộ nhân điện

tử sử dụng phương pháp cộng xung

Ngày nay, hướng nghiên cứu đã phát triển kỹ thuật pyrolysis ghép nối trực tiếpvào hệ thống sắc ký khí để tách chất và dùng các loại đầu dò để định danh các hợpphần đã tách Vì vậy, các kết quả có độ chọn lọc cao hơn, chính xác hơn và mở rộngđến nhiều đối tượng phân tích khác nhau

Hình 1-4: Sơ đồ các bộ phận của máy Pyrolysis ghép trực tiếp MS

Việc chuyển các sản phẩm từ vùng nhiệt phân tới cột sắc ký khí phải nhanh vàhiệu quả để có độ phân giải các peak tốt nhất Điều này phụ thuộc vào giao diện giữapyrolysis và injector, phải đảm bảo giao diện tiếp xúc nhỏ, không gian tiếp xúc cầnđược giữ nóng liên tục và cách nhiệt để loại bỏ các hơi lạnh từ bên ngoài và ngăn cản

sự ngưng tụ các sản phẩm nhiệt phân

1.2.3 Ứng dụng pyrolysis trong hoá học [4]

1.2.3.1 Ứng dụng pyrolysis để kiểm tra nhựa polvinyl chloride

Nhựa polyvinyl chloride (PVC) được ứng dụng rất nhiều trong đời sống hằngngày như các loại màn plastic, ống nước, đồ chơi trẻ em,…vì thế trong nghiên cứu nàytác giả đã tiến hành nhiệt phân với kỹ thuật Curie - point Quá trình nhiệt phânpolyvinyl chloride tạo ra rất ít monomer vinyl chloride (1,0 %) nhưng lại tạo lượng lớnHCl bằng phản ứng loại bỏ một mắt xích Polyvinyl chloride có cơ chế phân hủy nhiệtphụ thuộc vào chiều dài và độ bền nối C - C Kết quả của quá trình phân tách polymerliên quan tới cơ chế phản ứng và độ bền của các mảnh cũng như của chuỗi polymer.Hình 1-6 là sắc ký đồ của các sản phẩm nhiệt phân của polyvinyl chloride và đượcxem là dấu vân tay (fingerprint) đặc trưng cho polymer này và được sử dụng để phânbiệt với các loại nhựa khác, quá trình nhiệt phân thực hiện ở 600 oC, tách trên cộtCarbowax

Hình 1-5: Sơ đồ mặt cắt ngang của hệ thống inlet

1.2.3.2 Xác định thành phần monomer của polyurethane [4]

Polyurethane là một loại polymer tạo thành từ một diisocyanate và một diol Cónhiều loại diol đã được sử dụng, nhưng phổ biến nhất là ethyleneglycol hoặcpropyleneglycol oligomer và acid adipic Cấu trúc của loại polyurethane trong

acetaldehyde, ether, keto ether (1- methylethoxy - 2 - propanone) Các sản phẩm nhiệtphân này dùng để xác định thành phần polymer Từ các sản phẩm nhiệt phân này sẽxác định được thành phần của các monomer.

1.2.3.3 Ứng dụng pyrolysis trong kiểm nghiệm dược liệu [5]

Nhóm tác giả chuyên ngành Kỹ thuật Hoá học và Khoa Học Vật liệu - trườngĐại học Công nghệ Zhejiang - Trung Quốc đã nghiên cứu ứng dụng trên kỹ thuậtpyrolysis trong việc kiểm nghiệm dược liệu Cụ thể nhóm tác giả sử dụng kỹ thuậtpyrolysis nhiệt phân bằng lò ghép nối với thiết bị GC - FID để xác định nguồn gốc và

chất lượng của các loài Địa Lan (tên khoa học Dendrobium candium Wall Ex Lindl)

trồng ở 3 vùng khác nhau và phân biệt với các mẫu thuộc các loài khác

Khoảng 0,4 mg bột mẫu của hoa Địa Lan được nhiệt phân ở buồng nhiệt phântại nhiệt độ 450oC và sản phẩm được chuyển trực tiếp vào hệ sắc kí khí, đầu dò FID.Sắc ký đồ của 16 mẫu từ các vùng và loài khác nhau cho thấy độ lặp lại khá tốt về thờigian lưu RSD ≤ 0,12 % (n = 5) và RSD diện tích peak ≤ 3,77 % (n = 5) Bên cạnh đómỗi mẫu lựa chọn 40 peak đặc trưng trong sắc ký đồ và nhóm tác giả sử dụng thuậttoán chemometrics để giải quyết bài toán phân loại giữa loài địa lan với các loài dượcliệu khác một cách hiệu quả với độ tin cậy  85 % Đây là phương pháp đơn giản,nhanh và chọn lọc, thích hợp cho việc quản lí chất lượng nguyên liệu dược đầu vào

1.3 Hệ thống sắc ký khí đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC - FID) [6]

Trong hệ thống GC - FID bao gồm các bộ phận chính như: bình khí mang, buồngtiêm mẫu, cột, buồng điều nhiệt, đầu dò, và bộ phận ghi nhận tín hiệu (Hình 1-8)

Hình 1-8: Hệ thống GC - FID

để loại oxy, nước và hydrocarbon Tùy thuộc vào loại đầu dò, loại cột, độ an toàn mà

có sự lựa chọn khí mang cho phù hợp Và khí mang vào cột phải đảm bảo được cácyêu cầu như trơ về mặt hóa học, độ tinh khiết cao, an toàn, hiệu năng và tốc độ táchphải phù hợp với đầu dò Hai loại khí mang thông dụng nhất là N2 và He

1.3.2 Buồng tiêm mẫu

Buồng tiêm mẫu dùng để hóa hơi mẫu trước khi đưa vào cột sắc ký Mẫu lỏngđược tiêm vào buồng hóa hơi qua một septum Nhiệt độ của buồng tiêm phải cao hơnnhiệt độ của cấu tử có nhiệt độ bay hơi thấp nhất trong mẫu Trong sắc ký khí có nhiều

kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau, trong đó kỹ thuật tiêm chia dòng và không chia dòng làphổ biến nhất, được ứng dụng rộng rãi với nhiều loại mẫu Sơ đồ một hệ tiêm mẫu chiadòng và không chia dòng được trình bày trong Hình 1-9

Hình 1-9: Cấu tạo buồng tiêm chia dòng

Với tiêm không chia dòng thì van khí tại ngã chia dòng sẽ đóng lại khi đưa mẫuvào cột còn trong tiêm chia dòng van khí được mở ra liên tục.

 Tiêm chia dòng là kỹ thuật cơ bản và đơn giản nhất được sử dụng Mẫu sẽ đượcđưa vào buồng tiêm, sau đó hóa hơi nhanh chóng và chỉ một phần nhỏ mẫu hơiđược chuyển vào cột, phần lớn còn lại sẽ theo dòng khí mang ra ngoài theođường khí thải chia dòng và dòng khí làm sạch septum Tiêm chia dòng cónhiều ưu điểm như đơn giản do chỉ cần điều chỉnh sự đóng mở của van chiadòng là có thể điều chỉnh tỉ lệ chia dòng; do mẫu được đưa vào cột rất nhanhnên các mũi sắc ký sẽ hẹp và vì thế độ phân giải của phương pháp sẽ cao Ngoài

ra có thể sử dụng kỹ thuật này để hạn chế pha loãng với các mẫu có nồng độkhá cao; các mẫu có thành phần phức tạp cũng có thể được tiêm vào vì trongbuồng tiêm có lớp bông thủy tinh có thể giữ lại những chất kém bay hơi, bảo vệcột tránh bị dơ Tuy nhiên, do hầu hết lượng mẫu bị thổi ra ngoài nên khôngthích hợp để phân tích các mẫu hàm lượng vết Đồng thời có sự “phân biệt đốixử” đối với các chất có độ bay hơi khác nhau trong mẫu, mẫu càng có phân tửlượng cao thì càng bị thổi ra ngoài nhiều

 Tiêm không chia dòng tương tự tiêm chia dòng, nhưng cổng chia dòng sẽ bịđóng lại trong quá trình mẫu hóa hơi và thổi từ từ vào cột Đầu cột sẽ được đặtnhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 20 - 30oC, do đó toàn bộdung môi và chất phân tích sẽ bị bẫy lại ở đầu cột Sau khoảng 45 - 60 giây,cổng chia dòng sẽ mở ra và tất cả những chất chưa vào cột sẽ bị thổi sạch rangoài Sau đó, chương trình nhiệt sẽ bắt đầu để phân tích tương tự kỹ thuật chiadòng

Ưu điểm lớn nhất của tiêm không chia dòng là nâng cao độ nhạy của phép đo.Lượng mẫu vào cột nhiều hơn từ 20 đến 100 lần so với tiêm chia dòng, vì vậyphù hợp để phân tích hàm lượng vết chất phân tích trong mẫu môi trường, thựcphẩm, dược liệu hoặc mẫu sinh học Tuy nhiên, do nhiệt độ cột ban đầu thườngphải khá thấp nên tốn thời gian hạ nhiệt độ cột dẫn đến thời gian phân tích bịkéo dài Trong sắc ký khí, chất rửa giải đầu tiên nên có nhiệt độ sôi lớn hơndung môi khoảng 30 oC để có thể dễ dàng tách ra khỏi mũi sắc ký của dungmôi

1.3.3 Cột sắc ký

Gồm cột nhồi và cột mao quản Chủ yếu hiện nay dùng cột mao quản Cột sắc

ký mao quản bao gồm ống mao quản bằng silica tinh khiết (fused silica) bọc ngoàibằng một lớp polyimide chịu nhiệt đến 370 - 400 oC hoặc bằng một lớp nhôm chịunhiệt đến 480oC Pha tĩnh được tráng thành trong của ống, thường thông qua phản ứnghóa học (Hình 1-10) Tùy từng cấu tạo và chức năng của cột sắc ký mà chia thànhnhiều loại cột như WCOT, SCOT, PLOT (Hình 1-11) Trong cột mao quản, bề dày củapha tĩnh có ảnh hưởng đến thời gian lưu và dung lượng cột, khi tăng bề dày pha tĩnh sẽtăng theo thời gian lưu và dung lượng cột Dung lượng cột được xác định là lượng mẫulớn nhất có thể tiêm vào cột không làm cột quá tải và vì thế mũi sắc ký không bị biếndạng Chất càng dễ tan vào pha tĩnh có dung lượng cột càng lớn

Lớp film pha tĩnh dày 1 - 5 µm thích hợp cho những chất có nhiệt độ sôi thấpnhư hidrocarbon dễ bay hơi hay ở các chất khí Pha tĩnh mỏng (0,1 - 0,5 µm) thích hợpcho những chất có nhiệt độ sôi cao, bay hơi kém Bán kính cột có ảnh hưởng trực tiếplên hiệu năng cột, thời gian lưu, lượng mẫu trên cột Cột có bán kính nhỏ có hiệu năngcao, nhưng dung lượng nhỏ hơn so với cột có bán kính lớn hơn Đường kính trong củacột mao quản khoảng 0,10 - 0,53 mm Thời gian lưu thăng theo chiều dài cột và tỉ lệpha Cột càng dài, càng nhiều đĩa lý thuyết độ phân giải càng cao nhưng thời gian lưucàng tăng làm các peak bị bè rộng ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp Chiều dài

Hình 1-11: Cấu tạo của cột mao quản Hình 1-10: Các loại cột mao quản dùng trong sắc ký

cột cũng ảnh hưởng đến việc tách, khi giảm nhiệt độ sẽ làm tăng thời gian lưu và làmgiảm tốc độ dòng khí Để có thể tách được hỗn hợp các chất có nhiệt độ sôi khác biệtđáng kể cần phải sử dụng chương trình nhiệt độ Ban đầu với nhiệt độ thấp, sẽ tách tốtnhững chất có nhiệt độ sôi thấp, sau đó tăng dần nhiệt độ để tách tiếp những chất cónhiệt độ sôi cao hơn, bằng cách này ta rút ngắn được thời gian lưu và thu hẹp được bềrộng của mũi sắc ký.

Người ta còn phân loại cột theo độ phân cực của pha tĩnh, pha tĩnh không phâncực tách tốt những chất không phân cực, pha tĩnh phân cực tách tốt những chất phâncực Độ phân cực của pha tĩnh được xác định bởi cấu trúc của polymer tạo thành phatĩnh Độ phân cực của pha tĩnh thuộc nhóm polysiloxane tăng lên khi thay nhómmethyl bằng nhóm phenyl hay cyanopropyl hay tăng tỉ lệ nhóm phân cực.Polyethylenglycol có độ phân cực rất cao và được dùng để tách các hợp chất phân cực.Trước khi sử dụng cột ta nên tìm hiểu khoảng nhiệt độ cho phép của cột và tránh nungquá cao sẽ giảm thời gian sử dụng cột

1.3.4 Đầu dò ion hóa ngọn lửa

Đầu dò ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector, FID) nhạy với hầu hết cáchợp chất hữu cơ Tín hiệu không bị ảnh hưởng bởi những biến đổi vừa phải về nhiệt

độ, áp suất và lưu lượng khí Mặt khác, đầu dò FID không bị gây nhiễu bởi những tạpchất thường gặp như CO2 và hơi nước với khoảng tuyến tính của đầu dò có thể lên đến

107 FID bao gồm một bộ phận có thể tạo ra ngọn lửa được đốt bằng hỗn hợp

H2- không khí Khi mẫu chứa các hợp chất hữu cơ tới được ngọn lửa trong môi trườnggiàu hydro sẽ chuyển thành các gốc tự do chứa một nguyên tử carbon Với sự hiệndiện của oxy trong dòng khí, phản ứng giữa CHO+ và H2O được tạo thành trong ngọnlửa tạo thành ion hydronium

Chính ion này và những dạng (H2O)nH+ khác đến được điện cực, cho tín hiệu tỉ lệthuận với lượng ion Như vậy FID sẽ cho tín hiệu không chỉ tỷ lệ thuận với số mol chấtphân tích đến đầu dò mà còn tỷ lệ với số lượng carbon có trong hợp chất (Hình 1-12).Tùy thuộc vào loại carbon mà tín hiệu sẽ khác nhau, carbon trong hydrocarbon nhạyhơn nhiều so với carbon liên kết với các nguyên tử khác như O, N, halogen (carbonyl,carboxyl, alcol, amin)

Hình 1-12: Cấu tạo đầu dò FID

Thuận lợi của đầu dò FID là khoảng tuyến tính rất rộng, đến 107, có khả năngphát hiện đến 10-11 g Carbon/s Ở điều kiện hoạt động bình thường, những dòng cỡ

10-12ampe đều được ghi lại Nhưng khuyết điểm của đầu dò này là phá hủy mẫu, dovậy trong sắc ký khí đa chiều, FID luôn được sử dụng sau cùng

1.4 Giới thiệu về hệ thống nhiệt phân Pyrola 85

Đề tài sử dụng hệ thống nhiệt phân Pyrola 85, được cung cấp từ trường Đại HọcUmea-Thụy Điển, thiết bị này sẽ được kết nối trực tiếp với hệ thống sắc ký khíGC-FID 2010 của hãng Shimadzu

Pyrola 85 là kỹ thuật gia nhiệt điện trở filament (với filament làm từ Platin),được phát triển từ hệ nhiệt phân của Tyden - Ericsson[7,8], gồm hai phần chính là buồngnhiệt phân và bộ điều khiển

 Buồng nhiệt phân (Hình 1-13): bao gồm một lá Platin đặt trong một cuvet bằngthủy tinh Lá Platin sẽ được gia nhiệt bằng hai xung, xung đầu tiên là xung rấtngắn (0 - 100 ms) với cường độ dòng I1 cao để đốt nóng nhanh lá Platin vàxung thứ hai dài hơn (0 - 60 s) với cường độ I2 thấp để duy trì nhiệt độ nhiệtphân Cuvet thủy tinh để cho ánh sáng phát ra từ lá Pt có thể đi đến photodiodequa cáp quang và để ổn định nhiệt độ cho những sản phẩm nhiệt phân không bịngưng tụ cũng như giúp giữ lại các chất không bay hơi vào hệ sắc ký khí Ánhsáng phát ra từ lá Pt phụ thuộc nhiệt độ của nó, hiện tượng này được ứng dụng

để đo nhiệt độ của lá Pt trong quá trình nhiệt phân Khí mang (thường là khí trơnhư He, N2và Ar) được cấp vào hệ Pyrola 85 để chuyển sản phẩm nhiệt phân từbuồng nhiệt phân thông qua một đường dẫn luôn được đốt nóng đến buồng tiêmmẫu của hệ thống sắc ký khí, tránh hiện tượng ngưng tụ Mặt khác, khí mangcòn tạo môi trường trơ trong buồng nhiệt phân tránh các phản ứng oxi hóa thứcấp xảy ra cho các sản phẩm nhiệt phân.

 Bộ điều khiển có vai trò kiểm soát nhiệt độ của buồng nhiệt phân, cung cấpdòng điện dạng xung đến đốt nóng lá Pt, đo ánh sáng phát ra từ lá Pt bằngphotodiod để hiệu chỉnh nhiệt độ nhiệt phân khi thay đổi lá Pt và điều kiện vận

hành Một số hình ảnh của hệ Pyrola 85 trình bày trong Hình 1-14.

Hình 1-13: Sơ đồ hệ thống buồng nhiệt phân

Hình 1-14: (a) Bộ điều khiển (Control unit); (b) Buồng nhiệt phân được gắn trực tiếp trên GC (c) Lá

platin được đặt bên trong cuvet thủy tinh; (d) Vị trí kim tiêm vào GC của hệ Pyrola 85

1.5 Phân tích dữ liệu đa biến (Multivariate Data Analysis, MVDA) [9,10,11]

Để tìm hiểu một hiện tượng, một quá trình trong cuộc sống chung quanh thôngthường người ta cần đo lường rất nhiều tính chất (variable), của đối tượng nghiên cứutại nhiều thời điểm khác nhau trên nhiều mẫu khác nhau (observation) Kết quả là bộ

số liệu (ma trận số liệu) thu nhận được thường rất lớn vì thế người ta không thể hiểuđược bản chất, quy luật, hiện tượng bên trong hay rút ra các thông tin quan trọng nếuchỉ đơn thuần nhìn vào bảng số liệu hoặc tính toán bằng các công cụ toán học đơn giản(Hình 1-15)

Hình 1-15: Bộ dữ liệu đa biến và khó khăn trong việc phân tích các bộ dữ liệu này

Là một trong hai mảng lớn của chemometrics, phân tích dữ liệu đa biến(Multivariate Data Analysis, MVDA) là một lĩnh vực ứng dụng toán thống kê và tinhọc trong hóa học giúp việc phân tích số liệu và rút ra các thông tin có ý nghĩa từnhững bộ số liệu khổng lồ (có thể lên đến vài ngàn biến trên vài ngàn mẫu) MVDAcòn được gọi là phương pháp nhận dạng cấu trúc dữ liệu (pattern recognition) có nhiềuứng dụng rất thú vị Trên thực tế MVDA thường được ứng dụng để giải 3 bài toán cơbản bao gồm (Hình 1-16):

 Khái quát về bộ dữ liệu: đây là bước đầu tiên trong quá trình khảo sát,phương pháp phân tích thành phần chính (Principle Componetnt Analysis,PCA) cho phép người ta đánh giá khái quát về các mẫu khảo sát, xemchúng có tính chất gần nhau không, có mẫu nào lệch xa các mẫu còn lại(điểm lệch, outlier), có sự hình thành các nhóm nhỏ hay không và biến nàoảnh hưởng đáng kể đến sự phân nhóm ấy,…

 Phân loại, phân biệt giữa các nhóm trong bộ dữ liệu: nếu có sự phân nhóm

rõ nét, PCA có thể được dùng để xây dựng mô hình cho từng nhóm giúpchúng ta có thể tiên đoán một mẫu mới có thuộc nhóm mẫu vừa xác lập haykhông Bên cạnh PCA, phương pháp bình phương cực tiểu từng phần chomục đích phân loại (Partial Least Square Discrimination Analysis,PLS - DA) là công cụ đặc hiệu dùng cho mục đích này

 Xây dựng mô hình hồi quy giữa hai bộ dữ liệu X và Y Đây là giai đoạncuối của quá trình phân tích dữ liệu cho phép tìm mối quan hệ định lượnggiữa các biến số của một ma trận X (biến dự đoán, predictor) và các biến sốcủa một ma trận Y (biến đáp ứng, response) Thí dụ trong một quy trình sảnxuất người ta theo dõi nhiều thông số của quá trình sản xuất và dự đoánmột số tính chất của sản phẩm như chất lượng, năng suất của sản phẩm,…Hiện nay nhiều phần mềm đã được xây dựng để thực hiện các nhiệm vụ này(Matlab, SPSS, STATISTICA, SIMCA,…) giúp cho việc ứng dụng MVDA ngày càngtrở nên thuận lợi và dễ dàng hơn đặc biệt cho các đối tượng không chuyên như các nhàkhoa học của các lĩnh vực khoa học thực nghiệm như sinh học, hoá học, y học, vật lý,môi trường,…

Hình 1-16: Ba ứng dụng cơ bản của MVDA từ trái sang phải (1) Khái quát bộ dữ liệu, (2) Phân loại

và (3) Mô hình hoá quan hệ giữa khối dữ liệu X và khối dữ liệu YKhi thực hiện MVDA cần thực hiện các bước cơ bản sau[10]:

 Xác định mục tiêu phân tích

 Chọn lựa đối tượng và các đặc tính để khảo sát

 Đo đạc các biến số của các mẫu/ đối tượng đã lựa chọn

 Xử lí thông tin thu được, trình bày kết quả dưới dạng đơn giản dễ hiểu

1.5.1 Phương pháp phân tích thành phần chính (Principle Component Analysis, PCA) [10,11]

1.5.1.1 Giới thiệu

Khái niệm PCA được Karl Pearson đưa ra năm 1901 và được sử dụng trongphân tích dữ liệu đa biến như một công cụ khai thác dữ liệu và dự đoán mô hình Một

bộ dữ liệu đa biến được biểu diễn dưới dạng một ma trận bao gồm N dòng đại diện cho

N đối tượng khảo sát (mẫu) như hợp chất hóa học, các loại phản ứng, thời điểm,… và

K cột là các biến đại diện cho đặc tính của mẫu, có thể là tín hiệu phổ IR, UV, NMRhay sắc kí đồ, nhiệt độ, áp suất,… đo được trong quá trình khảo sát

Dữ liệu đa chiều của một ma trận gồm N dòng và K cột có thể được thể hiệndưới dạng N điểm trong không gian K chiều (Hình 1-17) Chúng ta có thể quan sát sựphân bố các điểm ấy khi K khá nhỏ (K < 3) nhưng không thể thực hiện được khi

K ≥ 4

Hình 1-17: Điểm i trong không gian 3 chiều

Vai trò của PCA là làm giảm đáng kể số chiều một tập dữ liệu đa chiều mà vẫn

có khả năng mô tả gần đúng nhất sự phân bố của các mẫu, nhờ đó ta có thể nghiên cứuchúng Mỗi chiều trong không gian mới ứng với một số biến ảo mới, mỗi biến ảo kýhiệu là PC (PC1, PC2, PC3,…) là tổ hợp tuyến tính của các biến số ban đầu Các mẫutrong không gian K chiều trước đây được chiếu lên các mặt phẳng của không gian tạobởi các biến ảo mới PC1 và PC2 hay PC2 và PC3 hoặc một không gian 3 chiều củaPC1, PC2 và PC3 Như vậy ta có thể quan sát được sự phân bố của các mẫu để tìm ramối tương quan giữa chúng với nhau và giữa các mẫu với các tính chất (biến số), từ đócung cấp cái nhìn tổng quát nhất, đánh giá sơ bộ về bộ dữ liệu thu được

1.5.1.2 Các bước tiến hành trong PCA

Các bước tiến hành trong PCA bao gồm:

Xử lý sơ bộ dữ liệu (giá trị của biến số) thu được, xây dựng hệ toạ độ mới vớicác trục là những biến ảo (cấu tử chính, PC) biễu diễn các mẫu trên hệ trục toạ độ mớithường là mặt phẳng hay không gian 3 chiều (biểu đồ score) song song với việc nàyPCA còn cho phép xây dựng một biểu đồ gọi là biểu đồ loading thể hiện mối tươngquan giữa các biến và mức độ đóng góp của từng biến vào các biến ảo mới (PC), cuốicùng là xác định số PC cần thiết

 Xử lý sơ bộ dữ liệu (data pre - treatment)

Có hai phương pháp thường được sử dụng nhất để xử lý sơ bộ giá trị của cácbiến số là hiệu chỉnh phương sai bằng 1 (unit variance) và hiệu chỉnh điểm trung bình

về 0 (mean - centering) Bước xử lý này nhằm mục đích ngăn chặn trường hợp cácbiến có sự thay đổi lớn về giá trị sẽ lấn át ảnh hưởng của các biến có giá trị thay đổi ít

hơn và giúp việc biểu diễn sự phân bố của mẫu trên hệ trục tọa độ mới được dễ dànghơn.

 Hiệu chỉnh phương sai của các biến số bằng 1 (unit variance)

Phương pháp này áp dụng trong trường hợp khi các biến số có khoảng phân bốchênh lệch nhau nhiều Vì thế khi biểu diễn trên hệ trục toạ độ có cùng thang đo ta chỉthấy được sự khác biệt của những biến phân bố trên khoảng rộng Quá trình chuẩn hoáphương sai được thực hiện bằng cách tính độ lệch chuẩn Sk đối với mỗi biến số (mỗicột của ma trận) sau đó nhân các giá trị của biến với 1/Sk Với cách làm như thế tất cảcác biến sẽ có phương sai bằng 1

 Hiệu chỉnh điểm trung bình về 0 (mean - centering)

Trước hết, tính giá trị trung bình của các biến và biểu diễn trong hệ trục tọa độ.Điểm này nằm chính giữa tập hợp (điểm màu đỏ trên Hình 1-18) Sau đó dời hệ trục

để điểm trung bình trùng với gốc tọa độ

Hình 1-18: Đồ thị biểu diễn cách hiệu chuẩn điểm trung bình về 0 (mean - centering)

 Xác định cấu tử chính (PC), biểu đồ score và biểu đồ loading

Cấu tử chính (PC) là một vector đi qua gốc toạ độ của không gian K chiều banđầu, PC trở thành một trục toạ độ của không gian mới trong PCA khi nó mô tả được sựphân bố lớn nhất của mẫu, ở gần các điểm mẫu nhất nghĩa là ứng với tổng bìnhphương khoảng cách từ hình chiếu của các điểm trên trục toạ độ đó PC là nhỏ nhất.Mỗi điểm mẫu khi được chiếu lên trục toạ độ PC sẽ có toạ độ ti trên trục này (đó chính

là khoảng cách từ hình chiếu đến gốc toạ độ), ti được gọi là score Thông thường nếuchỉ dùng một PC thì không đủ khái quát sự phân bố của mẫu Do đó cần phải xây dựngthêm PC khác: PC2 có phương sai lớn thứ hai sau PC1 và trực giao với PC1 tương tựvới các PC thứ n Cứ 2 PC sẽ tạo thành một mặt phẳng Chúng ta có thể quan sát đượccấu trúc của bộ dữ liệu (sự phân bố của các điểm mẫu trong không gian K chiều) thôngqua hình chiếu của chúng trên các mặt phẳng tạo bởi 2 PC mặc dù không hoàn toànchính xác như phân bố thực tế (Hình 1-20 a và Hình 1-20 b) Nhiệm vụ của phần mềm

là giúp ta xây dựng được các mặt phẳng ấy, hay nói cách khác tìm ra các PC Biểu đồthể hiện sự phân bố của các hình chiếu trên mặt phẳng mới của PCA được gọi là biểu

đồ score Sử dụng biểu đồ score cho phép nhận diện các mẫu có tính chất tương tựnhau (nằm gần nhau) và các mẫu có tính chất khác biệt hẳn khi chúng nằm cách xa;các mẫu này gọi là điểm lệch (outlier)

Hình 1-19: Thể hiện sự thay đổi của các biến sau khi xử lý sơ bộ dữ liệu (hiệu chỉnh phương sai bằng

1 và giá trị trung bình bằng 0)

Hình 1-20: (a) PC1 và PC2 trong không gian; (b) Mặt phẳng tạo bởi PC1 và PC 2

Thí dụ khi so sánh các nước châu Âu về thói quen ăn uống, biểu đồ score chothấy có sự phân nhóm khá rõ: các nước Bắc Âu (Swe, Fin, Nor, Den), các nước Nam

Âu (Por, Aus, Ita, Spa) và các nước nằm ở trung tâm châu Âu (Bel, Swi, Fra, Ger)

Ngoài ra biểu đồ score giúp phát hiện các mẫu đặc biệt “khác thường” còn gọi làđiểm lệch Một điểm lệch mạnh khi nó nằm ngoài elip Hotelling T2, đây là vùng giớihạn với độ tin cậy 99 % hay 95 % Sự hiện diện của các điểm lệch ảnh hưởng đến môhình xây dựng cho bộ dữ liệu, làm cho mô hình lệch về phía chúng (Hình 1-22) Thôngthường các điểm lệch không được mô tả tốt bởi mô hình

Hình 1-21: Biểu đồ score biễu diễn phân bố tập quán ăn uống của 16 nước châu Âu.

Trong đó Thụy Điển (Swe), Đan Mạch (Den), Phần Lan (Fin), Na Uy (Nor), Bỉ (Bel),

Đức (Ger), Anh (Eng), Áo (Aus), Ý (Ita), Tây Ban Nha (Spa), Bồ Đào Nha (Por),

Pháp (Fra), Hà Lan (Hol)

Hình 1-22: Điểm lệch mạnh của tập hợp mẫu nghiên cứu

Bên cạnh biểu đồ score, biểu đồ loading khi được xếp chồng lên biểu đồ scorecòn cho biết những biến nào ảnh hưởng đến sự phân bố của các mẫu Trong thí dụ ở(Hình 1-23), rau, cá đông lạnh và bánh mì dòn là những thực phẩm rất đặc trưng củadân Bắc Âu, trong khi tỏi và dầu olive được tiêu thụ nhiều ở các nước Nam Âu Ngoài

ra các điểm nằm gần nhau thì có mối tương quan thuận nghĩa là biến này tăng thì biếnkia cũng tăng theo và ngược lại; trong khi các biến đối xứng nhau qua gốc toạ độ sẽbiến thiên ngược chiều (như tỏi và chất tạo ngọt)

 Xác định số cấu tử chính (PC) cần thiết để xây dựng mô hình

Mục tiêu của PCA là giảm số chiều của bộ dữ liệu để quan sát và nghiên cứu

Số lượng cấu tử chính PC cần phải đủ để mô tả gần nhất bộ dữ liệu nhưng không nênquá lớn Hai đặc điểm cần lưu ý của một mô hình xây dựng cho một bộ dữ liệu là:

 Mức độ mô tả bộ dữ liệu của mô hình sao cho gần với thực tế nhất(goodness of fit) R2 là thông số được dùng để đánh giá đặc điểm này Khi số

PC càng lớn thì R2 càng tiến về 1

 Khả năng dự đoán của mô hình được đánh giá bằng thông số Q2, Q2 tăngdần khi tăng số PC nhưng sau đó lại giảm Q2được tính toán bằng phươngpháp kiểm tra chéo (Cross Validation, CV) Việc kiểm tra thực hiện như sau,

từ dữ liệu chia làm G nhóm và lần lượt xoá bỏ từng hàng hoặc từng cột rồidựng một mô hình mới để dự đoán những dữ liệu đã được xoá bỏ, so sánhvới giá trị thực

Để một mô hình có ý nghĩa thực tế, người ta không chỉ quan tâm đến R2 mà cả

Q2, nói cách khác khi quyết định số lượng PC cần thiết cho một mô hình cần phải cânđối giữa Q2 và R2, R2 lớn nhưng Q2 cũng phải lớn (Hình 1-24) Biểu thức để tính toán

R2 và Q2 được trình bày trong phụ lục 2

Hình 1-23: Biểu đồ loading của 20 loại thực phẩm thường sử dụng của người châu Âu.

Trong đó Tỏi (Garlic), Dầu olive (Olive_oil), Chất tạo ngọt (Sweetner), Bánh mì dòn

(Crisp_Brea), Cá đông lạnh (Fro_Fish)

Hình 1-24: Sự phụ thuộc Q2 và R 2 theo số cấu tử PC

1.5.2 Phương pháp bình phương cực tiểu từng phần (PLS) [11]

Phương pháp bình phương cực tiểu từng phần (Partial Least Square, PLS) rađời từ năm 1975 với mục đích tìm mối liên hệ giữa hai ma trận dữ liệu X và Y dướidạng một mô hình tuyến tính đa biến Trong hoá học, các mối quan hệ định lượngthường xây dựng trên một nền tảng lý thuyết, thí dụ như định luật hấp thu ánh sángLambert - Beer cho phép xác định nồng độ chất phân tích dựa vào phương trình

A =.l.C Tuy nhiên khi chưa có một cơ sở lý thuyết để mô tả hiện tượng hay khi hệthống bị tác động bởi quá nhiều yếu tố, PLS cho thấy là một phương pháp rất hiệu quả

để xây dựng mối quan hệ dựa vào sự tuyến tính “regularity” của chính dữ liệu

Hình 1-25: Chức năng xây dựng quan hệ định lượng giữa hai bộ dữ liệu X (biến dự đoán) và Y (biến

đáp ứng)Các lĩnh vực ứng dụng chính của PLS trong nghiên cứu, đời sống và sản xuấtbao gồm:

 Xây dựng mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính (Quantitative

Structure - Activity Relationship, QSAR) Thí dụ, trong quá trình tìm ra một

loại thuốc mới, phương pháp QSAR được sử dụng để xác nhận cấu trúc hoá

học nào đã gây ra hiệu ứng ức chế mạnh trên đối tượng nghiên cứu và tạo íttác dụng phụ nhất.

 Xây dựng mô hình toán học (tương tự như xây dựng đường chuẩn trongphương pháp trắc quang thông thường) để xác định nồng độ các cấu tửtrong một hệ đa cấu tử dựa vào sự biến đổi của nhiều biến Thí dụ như sửdụng độ hấp thu của hỗn hợp nhiều cấu tử tại nhiều bước sóng, có thể vàitrăm đến vài ngàn bước sóng của cả một vùng phổ rộng, để xác định hàmlượng của các cấu tử trong hỗn hợp Trường hợp này ứng dụng khi phổ hấpthu của các cấu tử chồng lấp lên nhau trên toàn bộ vùng phổ khảo sát

 Theo dõi hoạt động (một số thông số) của một quy trình sản xuất để dựđoán chất lượng, năng suất sản phẩm nhằm tối ưu hoá quy trình

 Ngoài ra một ứng dụng không kém phần lý thú của PLS là để phân loại thí

dụ phân biệt các nhóm trong tập hợp mẫu lớn hay xác nhận một mẫu cóthuộc một nhóm đã biết hay chưa Phương pháp này có tên gọi là phươngpháp bình phương cực tiểu từng phần - phân tích biệt thức (Partial LeastSquare - Discrimination Analysis, PLS - DA)

Tóm lại, mục đích của PLS trong hóa học nói chung và hóa phân tích nói riêng

là dùng các biến độc lập ban đầu của mẫu để dự đoán nhanh, chính xác và định lượngcác biến phụ thuộc như chất lượng, độ không tinh khiết của sản phẩm, sản lượng, loạisản phẩm,…

1.5.2.1 Các bước cơ bản trong PLS

Khác với PCA, mỗi mẫu được biểu thị bởi hai điểm trong hai vùng không gianứng với các biến của ma trận X và ma trận Y Tương tự như PCA, PLS sẽ tìm ra haikhông gian ít chiều hơn cho cả X và Y để biểu thị các điểm (mẫu), mô hình này ngoàiviệc mô tả sự phân bố của mẫu một cách gần đúng nhất còn có nhiệm vụ xác lập mốitương quan giữa vị trí các điểm trong hai vùng không gian của biến dự đoán và biếnđáp ứng (Hình 1-26) Trước khi tính toán bằng PLS, các biến ban đầu trong ma trận X

và Y cùng đi qua các bước hiệu chỉnh như trong PCA là hiệu chỉnh phương sai bằng 1

và hiệu chỉnh điểm trung bình về 0 (xem mục 1.5.1.2.)

t1, t2, t3 và u1, u2, u3 là toạ độ của hình chiếu của các mẫu trong hai vùng khônggian X và Y xây dựng bởi PLS Đối với thành phần PLS thứ nhất, quan hệ giữa biến t1

và u1 của mẫu thứ i được biểu diễn bởi phương trình ui1 = ti1 + hi1, với hi1 là số dư Để

đánh giá mối tương quan giữa X và Y người ta dựng biểu đồ ui1 theo ti1, nếu có mốitương quan chặt chẽ, các điểm sẽ nằm trên đường chéo, nếu mối tương quan lỏng lẻo,các điểm phân tán chung quanh đường chéo này (Hình 1-27) Thông thường mức độphân tán càng tăng khi thứ tự của thành phần PLS càng tăng, nghĩa là phần tử PLS thứnhất đã giải thích phần lớn ảnh hưởng của X trên Y so với thành phần thứ hai và tương

tự cho thành phần thứ 3

Hình 1-26: Khái quát về PLS

Hình 1-27: Mức độ chặt chẽ trong mối tương quan giữa X và Y giải thích bởi thành phần PLS thứ

nhất (trái) và PLS thứ hai (phải)

Sự đóng góp của các biến gốc ban đầu vào các biến ảo của mô hình PLS đượcthể hiện qua các thông số gọi là trọng số (weight) Trọng số của các biến X và Y được

ký hiệu tương ứng là w* và c Khi biễu diễn các trọng số w* và c trên cùng một đồ thị

ta thu được biểu đồ trọng số (weight plot) tương tự biểu đồ loading của PCA, nó phảnánh đồng thời mối quan hệ giữa tất cả các biến trong cả X lẫn Y Như vậy nhìn vàobiểu đồ trọng số ta có thể dự đoán nên thay đổi các biến X theo chiều hướng nào đểthu được giá trị mong muốn của biến Y Thí dụ biểu đồ trọng số Hình 1-28 cho thấyảnh hưởng của các nguyên liệu thành phần (mica, glass, amtp, crtp) tạo nên một loạivật liệu mới có 14 tính chất cơ lý khác nhau (st1, st2, st3,… st6; wrp1, wrp2,… wrp8).

Có thể thấy rằng tăng thành phần của glass trong hỗn hợp sẽ tăng giá trị của các biếnst1, st2, st4 và st6 vì chúng nằm gần nhau và cùng 1 phía của biểu đồ

Tương tự PCA, số thành phần PLS cần thiết để xây dựng mô hình cho mối quan

hệ giữa các biến X và Y được xác định dựa trên sự cân đối giữa tính tương thích củacác mô hình với giá trị thực nghiệm của các biến (R2) và khả năng dự đoán của nó(Q2) Một mô hình tốt khi có cả R2 và Q2 cao

Đối với bài toán phân loại như mục tiêu của đề tài, biến dự đoán X sẽ là thôngtin về các sản phẩm thu được từ quá trình nhiệt phân sâm, còn biến Y là một biến giả,dùng để định danh các nhóm sâm đã biết trước (tuổi, loài, chất lượng,…) Lưu ý trongtrường hợp này các biến Y không có giá trị số học, không thể làm các phép tính vớichúng

Hình 1-28: Thí dụ về biểu đồ trọng số trong PLS