Phân lập và so sánh đặc điểm cấu trúc gen GmDREB2 của một số giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau

Thực trạng này cũng chứng tỏ một điều là diện tích gieo trồng và năng suất đậu tương của nước ta còn thấp so với các nước trong khu vực và trên thế giới.. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu h

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ THU MIỀN

PHÂN LẬP VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC

GEN GmDREB2 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ THU MIỀN

PHÂN LẬP VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC

GEN GmDREB2 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ THỊ THU THỦY

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình công bố của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực chưa từng có ai công bố trong bất

kì công trình nào

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2014

Tác giả

Phạm Thị Thu Miền

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy đã trực tiếp

hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của GS TS Chu Hoàng Mậu,

các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán

bộ khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khích

lệ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2014

Tác giả

Phạm Thị Thu Miền

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cây đậu tương 4

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây đậu tương 4

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương 6

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 7

1.1.4 Đặc điểm hóa sinh của hạt đậu tương 9

1.2 Hạn và khả năng chịu hạn của cây 10

1.2.1 Hạn và ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng 10

1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hóa và cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn 12

1.2.3 Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương 14

1.3 Gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương 15

1.3.1 Các gen chức năng 15

1.3.2 Gen DREB và DREB2 20

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu 29

2.2 Hóa chất - Thiết bị 29

2.2.1 Hóa chất 29

Trang 6

2.2.2 Thiết bị 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp sinh học phân tử 30

2.3.1.1 Thiết kế mồi nhân gen DREB2 30

2.3.1.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30

2.3.1.3 Tổng hợp cDNA 31

2.3.1.4 Khuyếch đại gen DREB2 32

2.3.1.5 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel 33

2.3.1.6 Tách dòng gen và xác định trình tự nucleotid của gen 33

2.3.2 Phương pháp phân tích số liệu 36

2.4 Địa điểm nghiên cứu 36

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Đặc điểm sinh học của các giống đậu tương nghiên cứu 37

3.2 Kết quả phân lập gen DREB2 từ giống đậu tương DT 26 38

3.2.1 Kết quả tách RNA 38

3.2.2 Kết quả nhân bản gen DREB2 bằng phản ứng RT-PCR 39

3.2.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α 41

3.2.4 Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 42

3.2.5 Kết quả tách plasmid 43

3.2.6 Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen DREB2 43

3.3 Kết quả phân tích gen DREB2 44

3.3.1 Cấu trúc gen DREB2 44

3.3.2 So sánh trình tự nucleotide 45

3.3.3 So sánh trình tự protein suy diễn 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

1 Kết luận 53

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Trang 7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

Bp Base pair (cặp base)

Cs Cộng sự

CYS Cystatins

DREB Dehydration Responsive Element Binding

Kb Kilo base

HSP Heat shock protein (protein sốc nhiệt)

LEA Lea Embryogenesis Abundant (protein tích lũy với số lượng lớn ở

giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi) với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)

LTP Lipid transfer protein (protein vận chuyển lipit)

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymeaza)

PC5S Pyroline - 5 - carboxylate synthease (enzym tham gia trong quá

trình tổng hợp proline)

TAE Tris Acetate Ethylendiamin tetraacetic axit

CBF C - repeat binding factor

EREBP Ethylene Responsive Element binding protein

ERF Ethylene Responsive Element binding factor

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 - 2013 8

Bảng 2.1: Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu 29

Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2 30

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng nhân gen DREB2 32

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen DREB2 32

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT 34

Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái của 5 giống đậu tương nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Đặc điểm cấu trúc gen DREB2 ở đậu tương 45

Bảng 3.3 Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen DREB2 của giống đậu tương DT 26 với các trình tự đã công bố 48

Bảng 3.4 Độ tương đồng và độ sai khác về gen DREB2 của giống DT 26 với các giống công bố trên ngân hàng gen 49

Bảng 3.5 Trình tự amino acid của gen DREB2 thay đổi của các giống đậu tương 51

Bảng 3.6 Độ tương đồng và độ sai khác về amino acid của protein DREB2 giống DT 26 với các giống công bố trên Ngân hàng gen 51

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở đậu tương 26

Hình 1.2 Sơ đồ mô tả protein GmDREB2 ở đậu tương 27

Hình 1.3 Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB2 ở đậu tương 27

Hình 1.4 Điểm liên kết với DNA của protein DREB2 27

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 34

Hình 3.1 Hình ảnh 5 giống đậu tương nghiên cứu 37

Hình 3.2 Kết quả nhân gen DREB2 của giống đậu tương nghiên cứu 40

Hình 3.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α 41

Hình 3.4 Sản phẩm colony-PCR nhân gen DREB2 trực tiếp từ các khuẩn lạc được chọn 42

Hình 3.5 Kết quả tách plasmide từ khuẩn lạc trắng 43

Hình 3.6 Trình tự nucleotide của gen DREB2 ở giống đậu tương DT26 44

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide của gen DREB2 của giống DT 26 với các trình tự đã công bố 47

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ giữa các giống 49

Hình 3.9 So sánh trình tự protein DREB2 của DT26 với các trình tự protein đã được công bố 50

Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid trong vùng AP2 của giống đậu tương DT26 với 5 giống đậu tương công bố trên Ngân hàng gen 52

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), là

cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 20% - 40%, dễ tan và chứa hầu hết các loại amino acid, đặc biệt là các loại amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin ) Hàm lượng lipid từ 18 - 20%, có chứa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%) và chỉ số iốt cao, tốt cho việc phòng chống bệnh bướu cổ ở người Trong hạt đậu tương còn có nhiều loại vitamin khác như: Vitamin A, D,

E, PP, K… cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú, cần thiết cho người và động vật [2], [3], [4]

Cây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Các sản phẩm rất quen thuộc của đậu tương như đậu phụ, nước tương, dầu ăn có vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người Các nhà khoa học đã nghiên cứu phát hiện

ra khả năng phòng và điều trị bệnh ung thư, tim mạch trong hạt đậu tương Đặc tính quan trọng nữa của đậu tương, đó là khả năng cải tạo đất do hệ rễ của chúng có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Cùng với thân và lá làm thay đổi tính chất lý, hóa và tăng độ phì nhiêu cho đất Chính vì vậy, trồng đậu tương ngoài việc đem lại hiệu quả kinh tế còn góp phần vào công cuộc cải tạo đất trồng trọt [4]

Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tương được trồng ở 28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực Đồng bằng sông Hồng Đậu tương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân,

vụ hè và vụ đông [3]

Trang 11

Sản lượng đậu tương trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn/ năm Tuy nhiên, ở Việt Nam đậu tương chỉ đạt vài trăm nghìn tấn/ năm Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và chế biến nước ta vẫn phải nhập khẩu đậu tương từ các nước trên thế giới đặc biệt là Mĩ [62] Thực trạng này cũng chứng tỏ một điều là diện tích gieo trồng và năng suất đậu tương của nước ta còn thấp so với các nước trong khu vực và trên thế giới Một trong những nguyên nhân làm sụt giảm năng suất cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng chính là hạn hán [2] Việt Nam nằm trong khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu, hơn nữa nhiều tỉnh miền núi của nước ta có địa hình dốc cho nên tình trạng hạn hán cục

bộ xảy ra rất phổ biến Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì thế hạn xảy ra sẽ làm giảm năng suất của đậu tương [2], [3], [4] Do đó, công tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày càng được quan tâm nghiên cứu

Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định Cho đến nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương [9] Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở đậu

tương đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen DREB

DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ gen sản xuất

protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nói chung

và của cây đậu tương nói riêng Việc nghiên cứu về DREB đã thành công trên các đối tượng như cây Arabidopsis [37], lúa mì [28], thuốc lá [38], hoa cúc [35], hướng dương [23], ngô [47], lúa [24]… Trong phân họ DREB của đậu tương, việc nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy đây là

nhóm gen đa dạng về cấu trúc, chức năng và các tác giả khuyến cáo cần tiếp tục

mở rộng nghiên cứu Công bố đầu tiên về gen DREB2 ở cây đậu tương bởi Chen và cộng sự (2006), với việc phân lập gen DREB2 từ mRNA có kích thước 480bp Theo nhóm nghiên cứu, trong cây đậu tương, gen DREB2 tham gia tích cực vào việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây [22], [54]

Trang 12

Nhằm tìm hiểu đặc điểm cấu trúc của gen DREB2 liên quan đến khả

năng chịu hạn của cây đậu tương, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu

đề tài: “Phân lập và so sánh đặc điểm cấu trúc gen GmDREB2 của một số

giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và so sánh gen DREB2 của giống đậu tương DT 26 với một số

trình tự đã công bố

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập gen DREB2 từ mRNA của giống DT 26 bằng kỹ thuật PCR

- So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 với một số trình tự đã

công bố

- So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen DREB2 với một số trình tự

đã công bố

Trang 13

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu tương

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max L Merill) là một trong những

loại cây trồng được biết đến rất sớm Bằng chứng về lịch sử, địa lý, khảo cổ học đã chỉ ra, đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc, được thuần hóa và trồng làm thực phẩm vào khoảng thế kỉ XVII trước Công nguyên Từ Trung Quốc, đậu tương được đưa sang Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Đông Nam Á và Nam Á qua con đường tơ lụa [4] Ở Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc và miền Đông Nam Bộ Hiện nay, đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội [3], [4]

Về phân loại thực vật học, cây đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên

khoa học Glycine max (L.) Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ

cánh bướm (Papilinoideae) (Hymowitz và Newell, 1981) Các giống đậu tương

trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max (L.) Merill (2n = 40) trong giống phụ

G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) [2], [3]

Về hình thái, cây đậu tương có các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 [2] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần Đó là các u bướu nhỏ bám vào các rễ Nốt sần là kết quả cộng sinh của một số loại vi sinh vật có tên khoa học là

Rhizobium Japonicum với rễ cây đậu tương Trong một nốt sần có khoảng 3-4

tỷ vi sinh vật, mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 -

1000 lần [4] Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định Nito thành đạm

Trang 14

dễ tiêu Bộ rễ phân bố nông, sâu, rộng, hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng [3]

Đậu tương là cây hai lá mầm thân thảo, ít phân cành, dạng bụi Thân cây

có hình tròn, trên thân có nhiều lông tơ có tác dụng giảm thoát hơi nước và chống bệnh Thân non có thể có màu xanh hoặc màu tím, màu sắc thân non có tương quan chặt chẽ tới màu sắc của hoa, thân xanh hoa trắng, thân tím hoa tím Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng

ở phía trên thường dài Thân có nhiều dạng như đứng, bò, nửa bò và leo Đường kính thân thay đổi tùy theo giống và có liên quan chặt chẽ tới tính chống đổ của cây Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác Có giống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành Các cành mọc ra từ chồi ở các nách lá Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùm quả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía trên Các cành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [2], [3], [4]

Đậu tương là cây hai lá mầm nên có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, và lá thật

Lá mầm cung cấp dinh dưỡng cho cây ở thời kì đầu, về sau rụng đi Lá đơn mọc đối là lá thật chưa hoàn chỉnh có khả năng quang hợp cho cây Lá thật hay

lá kép có ba lá chét, nhưng cá biệt cũng có lúc có 4 đến 5 lá chét Phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau, hình dạng của lá thay đổi theo từng giống, những lá nhỏ và dài chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn thường kém [4]

Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ không có mùi, có màu tím, tím nhạt, hoặc màu trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn Một hoa có từ 1800-6800 hạt phấn tuỳ theo giống khác nhau, giống hạt to thì có bao phấn to

và nhiều hạt phấn Hạt phấn thường hình tròn, số lượng và kích thước hạt phấn tuỳ giống khác nhau, giống hạt to thường có hạt phấn to và nhiều hơn so với giống có hạt nhỏ Quả đậu tương thuộc loại quả ráp thẳng hoặc hơi cong, có

Trang 15

nhiều lông khi chín màu vàng hoặc xám Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả thường từ 2 đến 3 hạt Hạt đậu tương không có nội nhũ

mà chỉ có một lớp mỏng bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn, ôvan, dẹt, bầu dục Vỏ hạt nhẵn có thể có màu vàng đậm, vàng nhạt, xanh hoặc nâu, đen nhưng phổ biến là hạt màu vàng [2], [3]

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng bậc nhất trong các cây lấy dầu Theo thống kê của FAO, cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương trên thế giới tăng gấp 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích [58] Ở Việt Nam, hiện nay đậu tương được trồng trên cả bảy vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất Cây đậu tương chiếm một vị trí khá quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt ở vùng nông thôn khó khăn, kinh tế chưa phát triển Tuy nhiên năng suất đậu tương của nước ta thường thua kém nhiều so với các nước trên thế giới

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp, cây thực phẩm, cây cải tạo đất Với ưu thế ngắn ngày, trồng được nhiều vụ trong năm, có thể trồng thuần, trồng xen, luân canh gối vụ, trồng được nhiều vùng sinh thái khác nhau Vì vậy, sau lúa và ngô, cây đậu tương có vai trò đặc biệt quan trọng trong nền nông nghiệp nhiệt đới [2], [3]

Giá trị về mặt thực phẩm: Đậu tương có hàm lượng protein cao hơn

trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác Trong hạt đậu tương không có thành phần cấu tạo của cholesterol Đậu tương được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Lipid đậu tương chứa thành phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Hạt đậu tương chứa nhiều loại vitamin như: vitamin B1, B2, B6, vitamin E… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa [2]

Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, có các loại cây lấy

dầu quan trọng là đậu tương, bông, lạc, hướng dương, cải dầu, dừa, cọ…Trong

Trang 16

đó, đậu tương là cây cung cấp nguyên liệu hàng đầu cho công nghiệp ép dầu, dầu đậu tương chiếm khoảng 50% dầu thực vật Dầu đậu tương có chỉ số iốt cao, nhiệt độ ngưng tụ từ -15 đến -18oC Đậu tương còn là nguyên liệu quan trọng cho các nghành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo…[2]

Giá trị về mặt nông nghiệp: Trong nông nghiệp đậu tương được sử dụng

làm thức ăn gia súc Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (than, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao, cho nên các sản phẩm phụ như thân, lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Ngoài ra, đậu tương còn có vai trò trong cải tạo đất trồng đem lại hàm lượng đạm cao cung cấp cho cây trồng Điều này có được là do hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây Nhờ khả

năng cố định đạm nên sau mỗi vụ thu hoạch thành phần hóa tính của đất trồng được cải thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng và khu hệ vi sinh vật trong đất cũng tăng Vì vậy, việc luân canh trồng cây đậu tương với các loại cây trồng khác có thể được xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu [2], [3]

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

Đậu tương là một trong những cây trồng mang tính chiến lược đối với những quốc gia có điều kiện phát triển vì có giá trị trao đổi rất cao trên thị trường do nhu cầu sử dụng protein, dầu thực vật, thực phẩm chức năng và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi gia súc ngày càng tăng [3] Đậu tương đứng thứ

4 sau lúa, ngô và lúa mỳ

Trên thế giới, năm 2010 diện tích đậu tương chiếm 102,4 triệu ha, năng suất bình quân 2,58 tấn /ha, sản lượng đạt 264,9 triệu tấn, tăng 9 triệu ha và 46,6 triệu tấn so với năm 2005 [59]

Diện tích đậu tương trên thế giới tập trung chủ yếu ở Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina, Ấn Độ Trong đó, nước Mỹ thường chiếm 1/3 diện tích đậu

Trang 17

tương hằng năm (31 triệu ha) Năng suất và hàm lượng protein là chỉ tiêu phản ánh tiến bộ nghiên cứu về đậu tương trên thế giới Dự báo diện tích trồng đậu tương trên thế giới có thể tăng nhiều vào cuối thập kỷ này do chính sách quản

lý và thương mại của các quốc gia, đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có nhiều quốc gia sử dụng các giống được cải tiến thông qua chỉ thị phân tử và biến đổi gen

Trong khu vực Châu Á, diện tích đậu tương ở Việt Nam đang tăng dần,

đã vượt qua Myanmar và đang đứng thứ 4 sau các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên [59] Ở nước ta, cây đậu tương đã được trồng rất sớm từ khi còn là một cây hoang dại sau đó được thuần hoá và đưa vào trồng như một cây có giá trị kinh tế cao

Trước cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích trồng đậu tương trong cả nước là 30.000 ha, năng suất 410kg/ha Sau cách mạng và trong kháng chiến chống Mỹ, nhà nước chú ý đẩy mạnh sản xuất đậu tương nhưng kết quả đạt được thấp Từ sau năm 1975 trở lại đây, năng suất đậu tương đã tăng đáng kể [59] Theo cục xúc tiến thương mại, sản lượng đậu tương nước ta năm 2011 giảm 14% so với năm 2010, xuống còn 254,2 nghìn tấn [65] Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất cây trồng còn thấp, chi phí sản xuất lại khá cao và công nghệ thu hoạch còn rất lạc hậu Ngoài ra có thể là do dịch bệnh hay do biến đổi khí hậu và hạn hán Tình hình sản xuất đậu tương của nước ta trong những năm gần đây được thể hiện qua bảng 1.1

Bảng 1.1: Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 - 2013

Diện tích (nghìn ha) 190,1 192,1 146,2 197,8 173,6 200 230 Năng suất (tấn/ha) 1,45 1,39 1,46 002 1,46 1,5 1,52 Tổng sản lượng

(Nghìn tấn) 275,5 267,6 213,6 296,9 254,2 300 350

(Nguồn: Tổng Cục thống kê Việt Nam [59])

Trang 18

Theo Ngô Thế Dân và cộng sự, (1999), thì cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương: Vùng Đông Nam bộ có diện tích lớn nhất (26,2% diện tích đậu tương cả nước), Miền núi Bắc bộ 24,7%, Đồng bằng sông Hồng 17,5%, Đồng bằng sông Cửu Long 12,4% Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 80% diện tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên [2] Ở nước ta, đậu tương chủ yếu được trồng theo vụ là vụ xuân, vụ

hè, vụ hè thu, vụ đông và vụ đông xuân Trong đó, đậu tương được trồng nhiều vào vụ đông xuân

Những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học

và các loại đậu tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương địa phương có năng suất thấp nhưng lại có chất lượng hạt cao

và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như: nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn Như vậy sẽ tạo ra một cơ hội rất lớn cho việc phát triển sản xuất đậu tương trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài

1.1.4 Đặc điểm hóa sinh của hạt đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần chủ yếu là protein, gluxit, lipid, các vitamin

và các chất khoáng [2], [3] Tuy nhiên, nói đến đậu tương người ta quan tâm chủ yếu đến protein và lipid Hàm lượng protein trong hạt đậu tương chiếm tỷ

lệ cao Thực tế cho thấy, tuy bị ảnh hưởng bởi kiểu gen và điều kiện canh tác nhưng hàm lượng protein của đậu tương vẫn lớn hơn hàm lượng protein của các loài thực vật khác Nó được dự trữ trong các bào quan và có chức năng duy nhất là cung cấp nguồn amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt, protein dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là albumin và globulin

Dựa vào hệ số lắng người ta chia protein của hạt đậu tương thành 3 loại: legumin, vixilin, enzyme và chất ức chế enzyme có bản chất protein Trong hạt đậu tương, protein dự trữ chiếm 70% tổng số protein Ngoài ra là các enzyme, các chất ức chế protease và lectin Thành phần của protein gồm có albumin

Trang 19

(9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin- protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [2], [3]

Protein của cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng được coi là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, chúng chứa tất cả các amino acid không thay thế, cần thiết cho cơ thể người [9] Một điều đáng quan tâm là hàm lượng lyzin ở đậu tương rất cao so với protein từ loại ngũ cốc khác, nhưng hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như metionin, cystein còn thấp

Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hòa tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzene, toluene, ete dầu hỏa… Lipid còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt vitamin E, ngoài ra trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như hydrat cacbon, muối khoáng, acid nucleic, kích tố sinh trưởng [2], [3]

Tóm lại, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao, giá trị của nó được đánh giá đồng thời về cả hàm lượng protein và lipid Trong đó, hàm lượng protein dự trữ là yếu tố quyết định làm cho đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và gia súc Ngoài ra, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có màu đen

1.2 Hạn và khả năng chịu hạn của cây

1.2.1 Hạn và ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật Hạn cũng có thể được định nghĩa là sự thiếu lượng nước do mưa hoặc nước tưới trong thời gian dài dẫn đến sự cạn kiệt độ ẩm trong đất gây nên sự tổn thương cho cây trồng Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương vì thiếu hụt nước gọi là tính chịu hạn Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn [7], [9]

Trang 20

Ảnh hưởng của hạn đến cây trồng có thể phân biệt thành hai mức độ đó

là tế bào và cơ thể Ở mức độ tế bào, hiện tượng hạn xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định của chu kỳ sống thực vật như trong quá trình tạo hạt, hạt phấn, bào tử và không làm ảnh hưởng đến tế bào,

mô của cây Đây là quá trình biến đổi trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền Trong giai đoạn hình thành hạt tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên Khả năng này đạt cực đại ở thời kỳ hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ, gió…[6]

Đối với mức độ cơ thể, hạn gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và mất mùa Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào Các thành phần thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết khí hậu chính là những yếu tố bất lợi đối với cơ thể thực vật [6], [7]

Có hai loại hạn do môi trường tác động đến thực vật là hạn đất và hạn không khí Hạn đất thường xảy ra ở những vùng khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, trong đó đất phù sa giữ nước tốt nhất, cát giữ nước kém nhất Hạn tác động mạnh lên bộ rễ của cây trồng Trong thời kì gieo hạt và nảy mầm hạt, lượng nước trong đất không đủ sẽ gây ra héo mầm, có thể hủy hoại toàn bộ; Hạn không khí thường xảy ra ở những vùng gió, nóng và nhiệt độ cao Loại hạn này thường tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận

mô, tế bào khác [6], [7]

Như vậy, hạn tác động lên cây trồng theo hai hướng chính làm tăng nhiệt

độ cây và làm mất nước trong cây Nước vừa là nguyên liệu vừa là môi trường

để các phản ứng trao đổi chất xảy ra Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến năng suất cây, nếu thiếu nước nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trưởng của cây [7], [9]

Trang 21

Những tác hại của hạn đối với thực vật được thống kê bao gồm những biểu hiện sau: Thứ nhất hệ thống keo nguyên sinh chất bị biến đổi mạnh Bởi vì hạn làm thay đổi tính chất lý hóa và làm tăng độ nhớt của chất nguyên sinh, làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng thủy hóa và tính đàn hồi của keo nguyên sinh Hạn cũng làm thay đổi đặc tính hóa keo từ trạng thái sol rất linh động sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động,

cản trở các hoạt động sống

Thứ hai biểu hiện ở quá trình trao đổi chất, hạn làm đảo lộn hoạt động tổng hợp khi đủ nước và chuyển sang phân giải khi thiếu nước Quá trình phân giải chính là phân giải protein và nucleic acid, kết quả là giải phóng và tích lũy

NH3 gây độc cho cây và có thể làm cho cây chết

Thứ ba, hạn dẫn đến hoạt động sinh lý bị kìm hãm Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp vì khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp có thể phân hủy,

ức chế sự tổng hợp diệp lục, lá bị héo khô rồi chết làm giảm diện tích quang hợp Sự vận chuyển sản phẩm quang hợp ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn Thiếu nước sẽ làm tăng hô hấp vô hiệu, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh ra nhiệt là chính

Cuối cùng làm quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật bị kìm hãm Thiếu nước thì đỉnh sinh trưởng không tiến hành phân chia được, quá trình giãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trưởng chậm Do đó, nước được xem là yếu tố rất nhạy cảm trong sự sinh trưởng của tế bào Thiếu nước cũng ảnh hưởng đến quá trình phân hóa hoa và đặc biệt là quá trình thụ tinh Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt bị lép

1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hóa và cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn

Khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nước thì sẽ sử dụng các cơ chế khác nhau để có thể sinh trưởng và thích ứng với môi trường Các cơ chế này khá đa dạng có thể chia làm ba cơ chế chủ đạo: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn, cơ chế tránh hạn, cơ chế chống chịu hạn [8], [9]

Trang 22

Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra Các giống đậu tương ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế trên để thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước Thường thì các giống có tính chín sớm, bắt đầu nở hoa vào cuối tháng tư và tạo quả trong tháng 5, vì thế mà chúng có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước xảy ra từ tháng sáu đến tháng tám [9]

Đối với cơ chế tránh hạn, các giống đậu tương có khả năng duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận khác nhau của cây Như vậy, quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài rất thấp [9]

Khả năng chống chịu của thực vật dựa trên cơ chế điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự biến đổi thành tế bào Theo Bohnert và Jensen (1996), trong môi trường thiếu nước cực đoan các cơ chế liên quan đến sự giữ nước của ba vùng tế bào như: (i) Cơ chế ngăn cản ion, thải ion và biến đổi thành tế bào (vùng ngoại bào và vùng tế bào); (ii) Cơ chế điều chỉnh áp suất thẩm thấu, khử các gốc tự do, thay đổi tính chọn lọc, tăng cường bơm proton, điều tiết trao đổi nước…; (iii) cơ chế dự trữ ion Ca++ và Na+, thải ion K+, duy trì thế năng proton, điều chỉnh áp suất thẩm thấu

Tùy vào mức độ cực đoan của môi trường mà khả năng chịu hạn của thực vật biểu hiện khác nhau như [9]: Giảm diện tích lá và rút ngắn thời gian sinh trưởng để sử dụng nước một cách hợp lý trong điều kiện thiếu nước; Tăng khả năng đâm sâu của bộ rễ để tận dụng nguồn nước ở tầng sâu đảm bảo tương ứng cho nhu cầu thoát hơi nước của lá; Duy trì sức trương của tế bào thông qua khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu để bảo vệ các chồi non khỏi bị khô hạn trong điều kiện mất nước cực đoan; Kiểm soát mức độ thoát hơi nước trên bề mặt lá thông qua điều tiết độ mở của khí khổng

Trang 23

Tính chịu hạn của cây trồng được hình thành trong quá trình tiến hóa tự nhiên dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh, hạn hán Đối với bất kỳ điều kiện bất lợi nào của tự nhiên mà ở đó sự sống còn có thể tồn tại và phát triển được thì sẽ phải có những kiểu gen thích ứng có khả năng chống chịu được ngoại cảnh đó [7] Ngày nay, trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ tìm được gen liên quan đến tính chịu hạn

1.2.3 Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương

Trong các giống cây trồng lấy hạt thì cây đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh, có nhu cầu về nước cao hơn các loài cây khác Đó chính là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 - 530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương khá cao 50%, trong khi đó ở Ngô chỉ

là 30%, lúa là 26% [2], [3]

Nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy rằng, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: sự phát triển của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia làm hai nhóm [7]: Nhóm thứ nhất, chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây Và nhóm thứ hai, chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây

Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua hơn, còn

ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể

Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có những thành công khi nghiên cứu sâu hơn tính chịu hạn của cây đậu tương ở mức phân tử Maitra và

Trang 24

Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá cây đậu tương khi

bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA nhóm D -

95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn [39] Misaka và cộng sự (1996), đã nghiên cứu phân lập thành công cDNA của gen mã hóa cho cystatin từ cây đậu tương Đoạn cDNA này có kích thước 1175 nucleotide với trình tự mã hóa có chiều dài 737 nucleotide bắt đầu từ vị trí 48 đến 785 mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 245 amino acid [41] Jinn và cộng sự (1997) đã nghiên cứu về sHSP nhóm 1 (15 - 18 kDa), đã nhận thấy chúng tăng lên lượng lớn trong mầm đậu tương dưới tác động của nhiệt độ được tìm thấy dưới cấu trúc dạng hạt trong nguyên sinh chất và trong nhân cùng với protein bị biến tính [29]

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen về khả năng chịu nóng chịu hạn ở cây đậu tương Năm 2009, Nguyễn Thúy Hường và cộng sự đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ mRNA với kích thước

2148 bp và phân tích đặc điểm của gen P5CS phân lập từ cây đậu tương Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp proline ở thực vật trong những điều kiện do hạn và mặn gây nên giống đậu tương địa phương của nhóm nghiên cứu Chu Hoàng Mậu và cộng sự (2008) [9]

1.3 Gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương

1.3.1 Các gen chức năng

Một hướng nghiên cứu phát triển mạnh trong những năm gần đây đó là tìm hiểu chức năng của gen, làm căn cứ để cải thiện hệ gen của sinh vật theo hướng có lợi cho con người Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chống chịu hạn của thực vật gồm nhiều loại Một số loại thường được nghiên cứu gần đây như: HSP và môi giới phân tử, LEA, LTP, P5CS, CYS,…

Nhóm HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử

HSP có hầu hết ở các loại thực vật như: lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu, hành, tỏi…HSP là protein được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện bất lợi

do môi trường như nóng, khô, muối cao Bình thường, HSP xuất hiện trong

Trang 25

quá trình sinh trưởng của các giai đoạn biệt hóa mô và cả trong thời kỳ sinh trưởng của thực vật [29] HSP được chia làm 6 nhóm khác nhau dựa vào khối lượng phân tử là: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5 Trong đó, HSP70 và HSP60 có đại diện của chất môi giới phân tử (MGPT - gọi là chaperonin) Môi giới phân tử (MGPT) hay chaperone được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1978 khi Laskey và các đồng nghiệp mô tả tính chất của nucleoplasmin, protein nhân có tính acid Protein môi giới phân tử là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, nhưng có cùng chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới tổng hợp từ bước đầu tiên đến bước cuối cùng, ngay từ trong ribosome; chuyển protein qua màng; duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein; ngăn chặn sự hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc đúng; khởi đầu cho sự phân giải protein bị biến tính Như vậy, protein môi giới phân tử có chức năng rất quan trọng khi các tế bào gặp điều kiện cực đoan, nhất là sốc nhiệt [7]

Công trình nghiên cứu đầu tiên về MGPT ở thực vật liên quan đến enzyme riboluasebisphosphas caboxylase/ oxygenase (Rubisco) Rubisco xúc tác phản ứng tổng hợp chất hữu cơ từ CO2 tự do trong quá trình quang hợp Để tạo cấu trúc không gian đúng cho Rubisco cần một loại protein đặc hiệu gắn với những tiểu đơn vị chính của phức chất này (Rubisco binding protein - RBP) RBP chính là MGPT [25]

MGPT chia thành hai nhóm sau: HSP 70 là nhóm MGPT có hoạt tính ATP - ase và có tính bảo thủ cao Trong điều kiện cực đoan HSP có thể ngăn chặn sự co cụm và kết tụ protein; HSP 60 (Chaperonin) là loại protein cấu tạo

từ các tiểu đơn vị có khối lượng 60 kDa và cũng có hoạt tính ATP - ase [25]

Ở cây đậu tương, gen HSP60 đã được nghiên cứu bởi nhóm tác giả Yang

và cộng sự (2008) đăng kí trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số EU036414,

có kích thước là 498 bp [54] Cũng năm 2008, Lei và cộng sự đã phân lập gen

được GmHSP70 có kích thước 1683bp [30]

Trang 26

Nhóm HSP 8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính proteinase và thực hiện chức năng phân giải protein nhưng không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây độc cho tế bào [7]

Các nhóm HSP100, HSP90 đều có tính bảo thủ cao và có hoạt tính ATPase Một số tìm thấy trong tế bào bình thường nhưng phần lớn chúng sinh

ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, nóng, lạnh Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá protein biến tính

Trong tế bào thực vật, HSP tập trung thành các hạt sốc nhiệt HSG (Heat Shock Granules) Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, các hạt HSG gồm các hạt HSP và mRNA Các HSP gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình bị stress nóng Sau sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [7], [29], [30]

Nhóm LEA (Late embryogenesis abundant protein - protein tích lũy với

số lượng lớn để hình thành phôi)

Protein LEA được tổng hợp và tích lũy trong mầm hạt ở giai đoạn cuối khi mất nước tham gia bảo vệ giữ nguyên vẹn cấu trúc của mầm khi mất nước, ngăn chặn protein trong tế bào khỏi kết tụ và biến tính khi gặp điều kiện cực đoan [55] Loại protein này trên thực tế không có trong phôi mầm hạt chưa chín

và mầm non Nhưng sự xuất hiện của chúng thường gắn liền sự gia tăng hàm lượng ABA nội bào trong quá trình hình thành hạt, đặc biệt giai đoạn hạt chín

Bray (2000) đã chia protein LEA thành 5 nhóm chính: protein D19; LEA2-D11; LEA3-D7; LEA4-D95 và LEA5-D113 Các protein này giống nhau có sự tồn tại của những vùng bảo thủ cao và các tính chất khác bảo đảm cho chúng thực hiện các chức năng chống chịu hạn Những đặc điểm nổi bật trong cấu trúc phân tử của protein LEA là giàu amino acid ưa nước, không

Trang 27

LEA1-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chứa Cysteine và Tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt Nó thực hiện các chức năng như cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu [7], [45]

Trong đó, nhóm LEA2-D11 còn gọi là dehydrin được nghiên cứu kĩ hơn

cả Dehydrin có khả năng bền nhiệt và có thể giữ nguyên vẹn cấu trúc không bị thay đổi trong dung dịch nước ở nhiệt độ đến 1000

C Cấu trúc phân tử của chúng giàu gốc Gly và Lys, không có gốc Cys và Trp Dehydrin có chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước Năm 2005, Porcel và cộng sự đã phân lập gen LEA-D11 ở cây đậu tương và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số AJ704824, kích thước 641 bp [45]

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Trần Thị Phương Liên và cộng sự, (2003), đã phân lập gen Dehydrin ở đậu tương và đã đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ583799, kích thước là 681 bp [49]

Nhóm Protein vận chuyển lipid (LTP - Lipid Transfer Protein)

LTP thuộc họ gen pathogenesis - relate là protein có liên quan tới đặc tính chịu khô hạn ở thực vật, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển photpholipid giữa các màng Khi bị stress hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước Bên cạnh

đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress môi trường (muối, hạn) LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2) Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại proline [35]

Gen LTP đã được phân lập ở cây đậu xanh và công bố trên ngân hàng gen bởi tác giả Liu và cộng sự (2004), về việc nghiên cứu phân lập gen LTP1

Trang 28

và LPT2 từ mRNA ở cây đậu xanh với kích thước tương ứng 576 bp và 687 bp, đăng kí trên ngân hàng gen với mã số AY300806 và AY300807 [35]

Ngoài ra, gen LTP còn được phân lập ở cây lúa (Oryza sativa) [42]

Nhóm P5CS (Pyroline - 5 - carboylate synthetase - Enzyme có vai trò trong quá trình tổng hợp proline)

Enzyme này xúc tác cho hai phản ứng đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp proline và giữ vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa sự sinh tổng hợp proline thực vật [26], [58] Các nghiên cứu cho thấy enzyme này được sử dụng

để điều khiển hàm lượng proline thích ứng và tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu; bảo vệ cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme khác nhau; chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và bất hoạt các gốc oxy tự do P5CS là enzyme hai chức năng và có cấu trúc gồm hai domain xúc tác của hai enzyme là glutamin kinase và glutamic seminaldehyde synthase [6], [26]

Ở cây đậu tương, Porcel và cộng sự (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI, mã số là AJ715851, kích thước là

831 bp [47] Tại Việt Nam, gen P5CS được Nguyễn Thị Thúy Hường và cộng

sự phân lập năm 2009 với kích thước 2148 bp từ mRNA [44]

Nhóm Cystatin (CYS)

Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine protease Cystatin được phân bố ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật cho thấy đây là nhóm chất đóng vai trò quan trọng với sự tồn tại, sinh trưởng và phát triển của sinh vật [11], [41], [52] Đối với cystatin thực vật, các gen có kích thước không giống nhau, ví dụ ở Lạc gen cystatin được phân lập từ một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý bởi một số tác nhân khác nhau, song đều có kích thước 461 bp [11] và mã hóa cho phân tử protein gồm 98 amino acid Khi thực vật gặp hạn, cystatin protease hiện diện như những protease tham gia vào quá trình thủy phân protein dự trữ Protein CYS của mọi

Trang 29

loài thực vật đều có trình tự tripeptid bảo thủ là FAV (Phenylalanin - alanin - valin) ở gần đầu NH2 và 1 dipeptid bảo thủ ở gần đầu COOH là PW (Phenylalanin - tyrosin) Các trình tự bảo thủ được ghi nhận rất quan trọng với việc kết hợp với enzyme mà chúng ức chế hoạt động Hiện nay, cystatin được chia thành 3 họ nhỏ là họ cystatin-1 có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, họ cystatin-2, có khối lượng phân tử khoảng 13 - 24 kDa và họ cystatin-3 có khối lượng phân tử lớn hơn 60 - 120 kDa Sự phân loại này dựa vào sự tương tự về trình tự cấu trúc cơ sở, khối lượng phân tử, số lượng các cầu nối disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào [11], [41]

Ở đậu tương, Misaka và cộng sự (1996), đã nghiên cứu phân lập thành công cDNA của gen mã hóa cho cystatin Đoạn cDNA này có kích thước 1175 nucleotide với trình tự mã hóa có chiều dài 737 nucleotide bắt đầu từ vị trí 48 đến 785 mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 245 amino acid (mã số trên ngân hàng NCBI là BAA19608) [41]

1.3.2 Gen DREB và DREB2

Mọi gen trong tế bào được biểu hiện mạnh hoặc yếu dưới sự điều khiển của các yếu tố phiên mã - TF (transcription factor) Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật nhưng chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật [5] Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã là có hai vùng hoạt động (domain): (1) Vùng hoạt hoá các protein chức năng (activation domain) và (2) vùng liên kết (binding domain) với các trật tự DNA đặc hiệu (cis-acting element) trên vùng khởi động gen (promoter) Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện các gen chức năng tăng cường tính chịu hạn phân loại dựa vào trật tự DNA đặc hiệu mà chúng liên kết Vùng khởi động gen của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự DNA đặc hiệu, phổ biến là ABRE (ABA responsive element

Trang 30

- yếu tố đáp ứng ABA) và DRE/ CRT (Dehydration responsive element/ C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng hạn), NAC, MYB với chức năng tương ứng là điểm bám của các nhân tố phiên mã biểu hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA [55]

TF là các protein có khả năng nhận biết các trình tự cis - yếu tố điều hòa

sự phiên mã đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã Yếu tố cis chứa

trình tự hộp GC là một trình tự dài 11 bp (5’- C/AACACGTGGCA - 3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho các tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase [23], [55] Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có chức năng trong việc phản ứng với điều kiện cực đoan nhờ các motif (tiết tấu trình tự) có khả năng gắn với DNA như bZIP, MYB, MYC…Các yếu

tố cực đoan tác động lên TF, TF hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với DNA tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trường đến việc tổng hợp hoocmon như ABA, sau đó hoạt hóa các TF [23] Phần lớn các protein cảm ứng với ABA được xếp vào nhóm RAB Một số gen có thể biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA Trong đó, DRE (Dehydration Responsive Element) là yếu tố điều hòa không phụ thuộc ABA Yếu tố DRE phản ứng với sự mất nước có trình tự dài 9 bp nằm trên promoter là TACCGACAT [22] Trong đó, vùng quan trọng nhất của tiết tấu trình tự DRE

là vùng lặp lại giàu C (CRT - C repeat) với trình tự là CCGAC Các yếu tố protein gắn với trình tự DRE (DRE binding proteins - DREBs) ở vùng promoter đã được nghiên cứu và phân lập Những protein này chứa các vùng bảo thủ như các protein EREBP (ethylene responsive binding protein - tham gia biểu hiện ethylene) và AP2 (Apetala2 - tham gia vào quá trình biểu hiện ở thực vật có hoa) Các protein này còn được ký hiệu là nhân tố gắn với CRT (CRT binding factor - CBF) Chúng phản ứng rất nhanh với trạng thái cực đoan, trước khi xuất hiện lượng ABA đáng kể [23], [29] Protein AP2 là protein điều hòa thực vật đóng vai trò trong việc kiểm soát sự phát triển của thực vật

Trang 31

DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là họ gen tổng hợp

protein được tìm thấy trong thực vật khi gặp điều kiện bất lợi như hạn, mặn và lạnh Các nhà khoa học cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình kích hoạt nhanh hoạt động của các gen tham gia chống lại các

điều kiện bất lợi từ môi trường [22], [32] DREB đã được các nhà khoa học trên

thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như hoa cúc [35], hướng dương [23], ngô [47], lúa [24]…

và đã thu được nhiều kết quả trong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường Ngoài ra, các nhà khoa học

Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu giải trình tự gen DREB trên các đối tượng cây trồng khác nhau như Arabidopsis [37], lúa mì [28], thuốc lá

[38]…và so sánh trình tự gen của các loài cây trồng với hoang dại thấy rằng sự sai khác giữa chúng Từ đó, họ nghiên cứu tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao hơn nhờ phương pháp chuyển gen

Ở cây Arabidopsis trên cơ sở số lượng và sự giống nhau của các miền

gắn vào DNA, 145 nhân tố phiên mã được phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen),

RAV (6 gen), DREB (56 gen), ERF (còn gọi là EREBP, 65 gen) và nhóm gen

khác (4 gen) Trên cơ sở tương tự và đặc tính cấu trúc của chuỗi amino acid, 10

họ gen DREB (kí hiệu từ DREB2 đến DREB11) được phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB4 và DREB5; nhóm thứ hai gồm

W5, DREB6, DREB7 và DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm

thứ tư gồm có DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và

ERF2 [37], [50] Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện

hạn và hoạt hoá các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn của thực vật

Tuy nhiên, biểu hiện của các gen DREB2A và DREB2B không làm tăng tính kháng hạn của các cây Arabidopsis chuyển gen, điều này chứng tỏ nhóm gen

này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua quá trình phosphoryl hóa

để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [27] Gen DREB2A được thay đổi cấu

Trang 32

trúc để loại bỏ 30 amino acid tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra

dạng DREB2ACA Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển gen Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn Các phân tích sử dụng kỹ thuật DNA microarray và Northern blot đã chứng minh là gen DREB2ACA điều

khiển sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [27], [37]

Ở lúa (Oryza sativa L.) gen DREB, kí hiệu là OsDREB, Dubouzet và cộng sự (2003), đã nghiên cứu phân lập 5 họ gen DREB: OsDREB1A,

OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D và OsDREB2A Biểu hiện của OsDREB1A và OsDREB1B được gây ra bởi lạnh, còn biểu hiện của OsDREB2A được gây ra bởi hạn và muối cao Qua biểu hiện của OsDREB1A

trong Arabidopsis chuyển gen làm tăng khả năng chịu hạn, mặn và lạnh Các

phân tích sử dụng kỹ thuật ADN microarray và Northern blot đã chứng minh là

OsDREB1A rất hữu ích trong việc tạo cây một lá mầm biến đổi gen có khả

năng chịu hạn hán, mặn và lạnh Gen OsDREB1A (được đăng kí trên Ngân

hàng gen Quốc tế với mã số AF300970) có chiều dài 909 nucleotide, gồm phần

mã hóa gen có chiều dài 720 nucleotide mã hóa 240 amino acid, phần không

mã hóa đầu 5’ có chiều dài 80 nucleotide và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều dài 109 nucleotide [24]

Ở Ngô (Zea May), Quin và cộng sự (2007), đã phân lập gen ZmDREB2A

có chiều dài 1283 bp gồm phần mã hóa gen có chiều dài 954 bp mã hóa cho

318 amino acid, phần không mã hóa gen đầu 5’ có chiều dài 400 bp và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều 204 bp [47]

Diaz-Martin và cộng sự (2008), đã phân lập gen DREB2 từ mRNA của cây hướng dương (Helianthus annuus) và công bố trên ngân hàng gen quốc tế

với mã số AY508007 có kích thước 1301 bp, mã hóa cho 314 amino acid [23]

Javad và cộng sự (2009) đã phân lập 4 gen DREB từ mRNA đặc trưng của bốn giống lúa mì Alvand, Bayat, Darab1 và Shahi ở Iran và đã công bố

Trang 33

trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số lần lượt là FC556845, FC556846, FC556847, FC556850 có kích thước là 500 bp, với sự tương đồng

về trình tự gen của bốn giống này khá cao là 99% Nghiên cứu protein suy luận của các gen này, cho thấy, chúng có chứa vùng AP2 với ba chuỗi β - sheet và một đường xoắn ốc, gồm 57 amino acid bảo tồn vị trí valine thứ 14 và glutamic thứ 19 [28]

đã công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EU727158

699 bp, mã hóa cho 232 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 59

amino acid [38] Các tác giả này cũng đã phân lập gen DREB2 từ mRNA ở cây

thuốc lá và công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EU727156 có kích thước là 648 bp, mã hóa cho 215 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 59 amino acid [38]

Liu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc (Dendranthema vestitum, kí hiệu DvDREB2A) DvDREB2A được phân lập có

chứa một khung đọc mở (open reading frame - ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366

amino acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự

Trong đó, trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP với các điểm gắn DNA gần khu vực N Trong một phân tích, protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố DRE (AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải phóng

lacZ Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị ảnh

hưởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, độ mặn cao Như vậy, gen

DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trường [35]

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu ở cây đậu tương về protein DREB và

thu được thành quả nhất định cho khoa học như: Liu và cộng sự (2005) đã

nghiên cứu phân lập gen DREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước 819

bp, mã hóa cho 272 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 60 amino acid và được công bố trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số DQ055133 [36]

Trang 34

Chen và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở

cây đậu tương với kích thước là 927 bp; Cao và cộng sự (2008), phân lập và nhận dạng GmGβ1 liên quan tới protein GmDREB5 trong đậu tương [18]

Li và cộng sự đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb và

GmDREBc) từ cây đậu tương và cho rằng mỗi phân tử protein của các gen này

chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [32] Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước của tế bào

Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb có khả năng kích hoạt quá trình phiên

mã còn GmDREBc lại không có khả năng này Các protein GmDREBa và

GmDREBb trong lá của cây đậu tương được tổng hợp bởi tác động của muối,

hạn, mặn và lạnh

Năm 2009, nhóm tác giả Charlson và cộng sự nghiên cứu phân lập gen

DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước là 705 bp với mã số

FJ965342 trên Ngân hàng gen Quốc tế [20], [21]

Ở Việt Nam, Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự, (2008), đã nghiên

cứu phân lập gen DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước 705 bp

với mã số đăng kí trên Ngân hàng gen Quốc tế HE647689 [45]

Tsui-Hung Phang và cộng sự, (2008), đã tổng kết phân họ DREB ở đậu tương bao gồm các gen biểu hiện không phụ thuộc vào ABA là GmDREBa,

GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [51]

Chen và cộng sự (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trường có

xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và ABA Sự biểu hiện của

GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy cao hơn của hàm lượng

proline [25] Đối với cây đậu tương, chức năng kích hoạt và phiên mã của gen

GmDREB2 là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chống

chịu và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	1,1 MB