Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Nguyễn Ngọc Mai

“Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”

MỞ ĐẦU

Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ hai

sau cellulose Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là N-acetylglucosamine

được liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lượng phân tử cao, không hòa tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác Chitin là thành phần cấu trúc chính trong vỏ và lớp biểu bì của động vật chân đốt, giáp xác, các loài côn trùng và trong thành tế bào của nấm

Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành các sản phẩm

khác nhau như N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose Chitinase có trong

nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống Chitinase được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp như là một tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm soát côn trùng Trong y dược, chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, người ta đã nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhưng chỉ có chitinase do vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt là từ nấm sợi mới có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ và pH

Hiện nay, đối với việc phòng ngừa côn trùng có hại cho cây trồng thì biện pháp biến nhất vẫn là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lượng ngày càng cao, tần suất nhiều đang ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái Với ưu điểm vượt trội về sự thân thiện với con người và môi trường thì thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học đang là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển nền nông nghiệp

bền vững Lecanicillium lecanii là một trong số những chủng nấm entomopathogenic, mà trước đó đã được biết đến rộng rãi như Verticillium lecanii,

nhưng hiện nay được hiểu là một dạng anamorphic trong nhóm Trùng thảo Hầu

hết, entomopathogens đều kí sinh trên cơ thể côn trùng Tuy nhiên, một số

entomopathogens có thể tồn tại trên cây trồng Vì vậy, L lecanii spp có thể có hai vật chủ là côn trùng và thực vật Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây, đặc biệt là rệp Lecanicillium có độc lực rất mạnh đối với một số loài rệp như: rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii) Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp rất được quan tâm trong vấn đề

kiểm soát côn trùng và sâu hại cây

Từ những vấn đề thực tiễn đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase

từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”

Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính

chitinase Đồng thời, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase

Nội dung đề tài:

- Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii bằng cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím)

- Sàng lọc các chủng nấm kí sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao nhất

- Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc

- Xác định tính chất chitinase

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE

1.1.1 Giới thiệu về chitinase

Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, là enzyme thùy phân chitin thành các đơn phân là chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside

giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin

Kí hiệu của chitinase là EC3.2.1.14

Trong đó: 3 → Hydrolase

2 → Glycosylase

1 → Glycosidase

14 → Chitinase Chitinase còn có các tên gọi khác tùy theo xuất xứ của enzyme là chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98]

Chitinase có thể được tìm thấy ở những loài có thành phần cấu trúc chứa chitin như nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật [59] Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào Tùy thuộc vào các loài sinh vật khác nhau mà tổng hợp chitinase với mục đích khác nhau Vi khuẩn tổng hợp chitinase

để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [91]

Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó

Chitin [111]

Chitin [(C8H13O5N)n] là một trong những dạng

polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, được tạo

thành bởi các đơn phân là N-acetylglucosamine liên

kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside Về mặt

cấu trúc , chitin có cấu trúc tương tự như cellulose,

điểm khác biệt duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí

số 2 trên khung carbon của chitin được thay bằng

nhóm hdroxyl (-OH) ở cellulose [71]

từ 14 – 35% so với trọng lượng khô [10] Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế

bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [85]

Các dẫn xuất của chitinase

Chitinase có thể thủy phân một số dẫn xuất của chitin như glycol-chitin,

carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl

chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] và không thủy phân một số cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin

1.1.2 Phân loại chitinase

 Dựa vào phản ứng phân cắt

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase,

N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60]

Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một

cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide Các enzyme này đã được nghiên cứu

từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại

endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78)

Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm

chính là các dimer chitobiose

N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin

từ một đầu cho sản phẩm chính là các nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin

Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [117]

 Dựa vào cấu trúc phân tử

Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20 [60]

Họ Glycohydrolase 18:

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn

có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase

Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer [43] Chúng thủy phân các liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [53] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực

vật (Arabidosis, dưa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…),

virus và động vật [53]

Họ Glycohydrolase 19:

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà chua

(Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông

qua cơ chế nghịch chuyển

Họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của họ Glycohydrolase 18 (A) và

họ Glycohydrolase 19 (B) [118]

 Dựa vào trình tự amino acid

Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [88]:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối

với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu

đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn Chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 –

47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn

chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase

Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật

 Chitinase nấm

Các loài nấm sợi cũng có khả năng tạo ra chitinase Các chủng nấm mốc cho

chitinase cao như Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia và đặc biệt ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus

Tương tự như ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm Chitinase còn giữ vai trò trong hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật

 Chitinase thực vật

Những thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase như thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) Ngoài ra, một số loài tảo biển cũng

là nguồn cung cấp chitinase [41]

Chitinase do thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các loại côn trùng và nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng [44] Người ta đã quan sát thấy chitinase được tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằng chitinase còn có vai trò khác như tham gia vào quá trình hình thành phôi [35]

1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE

1.2.1 Sơ lược nghiên cứu về chitinase

 Nghiên cứu trên thế giới

So với các enzyme như protease, amylase… thì chitinase được nghiên cứu chậm hơn Chitinase lần đầu đầu tiên được mô tả bởi Bernad (1911) về ảnh hưởng

của nhiệt độ đến chitinase và khả năng kháng nấm ở cây hoa phong lan [7] Đối với

vi sinh vật, đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn

Streptomyces nhằm thu nhận chitinase ứng dụng trong việc phá vỡ vách tế bào nấm

[23], [42] Năm 1987, Mark O'Brien và Rita R Colwell đã tiến hành xác định hoạt tính chitinase của 101 chủng vi khuẩn được phân lập từ các nguồn môi trường khác

nhau bằng cách kiểm tra tại chỗ trên giấy lọc với

4-methylumbellifety-N-acetyl-D-glucosamine [84] Henrissat (1991) dựa trên sự tương đồng về trình tự amino acid ở vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong

đó chitinase được chia thành hai họ 18 và 19 [52] Năm 1993, Henrissat và Bairoch

phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium,

endo-N-acetylglucosaminidase Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [53] Những năm gần đây, một số nghiên cứu trên chitinase từ nấm ký sinh côn trùng Năm 1998, Kang và cộng sự (cs) đã tinh sạch và xác định các đặc tính của

chitinase trên nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae [62] Năm 2002,

Tikhonov và cs tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính chitinase từ 2 chủng nấm

Verticillium chlamydosporium và V Suchlasporium [100] Năm 2003, LI và cs

nghiên cứu việc tăng hoạt tính của β-1,3-glucanse và chitinase trong mô sẹo trên

cây bông bằng salicylic acid và sự tác động của độc tính nấm Verticillium dahliae

[74] Năm 2005, Duo-Chuan và cs đã tinh sạch và xác định tính chất của chitinase

từ Talaromyces flavus Laura và cs (2006) tiến hành nghiên cứu sản xuất oligosaccharides bằng enzyme thủy phân chitin là chitinase từ nấm Lecanicillium fungicola [36] Năm 2009, PENG và cs đã nghiên cứu vai trò của protease và chitinase trong quá trình lây nhiễm côn trùng của nấm Verticillium lecanii [89]

Môi trường thích hợp để sản xuất chitinase từ vi khuẩn hay nấm cũng được nghiên cứu rất nhiều trên các loại môi trường lỏng, môi trường xốp… [30], [40], [47], [51], [65], [92]

 Nghiên cứu trong nước

Nhìn chung những nghiên cứu về chitinase ở trong nước vẫn còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng của enzyme này rất là cao Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme

chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp [14] Năm 2004, tác giả Đinh

Minh Hiệp đã nghiên cứu quy trình tách chiết chitinase thu nhận từ nấm mật

Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược

[6] Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu

quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu

enzyme chitinase có hoạt tính khá cao [11] Năm 2010, tác giả Nguyễn Đinh Nga

và cs khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận

từ lá cây khoai lang và từ nấm Trichoderma [8] Năm 2012, Nguyễn Thị Hà đã tối

ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp chitinase

được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ [4]

1.2.2 Ứng dụng của chitinase

 Trong nông nghiệp

Chitinase được sử dụng trong kiểm soát nấm gây bệnh ở thực vật Nhiều loài côn trùng, nấm mốc có thể gây ra nhiều loại dịch bệnh gây hại cho cây trồng và vật nuôi, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp Theo Hirohi Ihui, chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin Khi thực vật

bị nhiễm nấm gây bệnh chứa chitin, các tế bào sẽ bị kích thích sinh ra chitinase và β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh [54] Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalamin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật Vì

chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và côn trùng như 1-(1,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyxin D… Khi áp dụng trên thực vật và động vật, những tác nhân trên có nhiều

ưu thế trong việc diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kế cho

thực vật hoặc động vật có xương sống Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans [34] Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp BG-11 với thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng [24] Chitinase từ Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F Solani, Penicillium ultimum [32]

Ngoài ra, chitinase còn có vai trò trong kiểm soát côn trùng Cơ thể của côn trùng có chứa chitin ở lớp vỏ ngoài và ống tiêu hóa Phần lớn các nấm gây bệnh

côn trùng như Metarhizium anisopliae, Nomurae rileyi, Aschersonia aleyrodis, Verticillium lecanii và một số nấm thuộc bộ Entomophtorales xâm nhập vào cơ thể

sâu bọ, côn trùng dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng Sau đó nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì, phá hủy các mô cơ thể, gây chết côn trùng [15, 84] Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp chitinase của các loài vi nấm này

 Trong y – dược học

Chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine là chất có tiềm

năng rộng lớn trong y dược Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho người Trong y học, người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân kháng các khối u ung thư [68] Chitinase thu nhận từ

Vibrio alginolyticus đã được sử dụng để sản xuất chitopentaose và chitotriose từ cơ

chất chitin huyền phù [82] Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N-acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 [93] Giữa các enzyme thủy phân chitin có thể kết hợp với nhau

để thu nhận những oligomer có chiều dài chuỗi mong muốn Ví dụ, để tạo

chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N-acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao exochitinase và N-acetyl glucosamindase Aloise và cộng sự (1996) nhận thấy khi ủ enzyme chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có

sự hình thành các hexamer [101]

Nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử… tuy nhiên giá thành cao Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng chitinase trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết chồi Do đó có thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh Các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách

sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên

chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao đểnhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh [57], [71]

Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bôi ngoài da chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng Các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác (như

amphotericin B, 5-fluorocytosin, các dẫn xuất azol, allylamines-thiocarbamastes, griseofulvin, bezoic…) nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase Chitinase

có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân Ngoài ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase được ghi nhân là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm so với chỉ dùng chitinase [3], [41]

1.3 NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII

Lecanicillium lecanii thuộc chủng nấm entomopathogenic Lecanicillium spp

có khả năng kí sinh trên hai vật chủ là côn trùng và thực vật [21] Trong tự nhiên,

nấm này kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây trồng L lecanii có phổ

vật chủ rộng gồm côn trùng có cánh, động vật chân đốt, sâu, bướm

độ ẩm và nguồn dinh dưỡng thích hợp sẽ nảy mầm và xâm nhập vào cơ thể côn trùng thông qua lớp biểu bì bên ngoài, giữa các bộ phận trong cơ thể Trong quá trình nảy mầm, bào tử tổng hợp protease, chitinase và lipase giúp các ống mầm xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của côn trùng Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lưu thông qua các chất lỏng của côn trùng và hình thành khối mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng Do đó,

Lecanicillium spp được sử dụng trong việc tạo ra thuốc trừ sâu sinh học với một số

loài côn trùng có hại trên cây trồng

Bào tử nấm Lecanicillium spp rất được quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn trùng và sâu bệnh hại cây trồng Đặc biệt, L lecanii có độc lực rất mạnh đối với một số loài rệp như rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii) [50]

Năm 2001, Kim và cs đã cho ra một sản phẩm thương mại mang tên Vertalec™

được tạo ra từ bào tử nấm L lecanii [67] Vũ Văn Hạnh và các cs đã phân lập Lecanicillium spp từ rệp đào, có khả năng diệt rệp bông 100% sau 4 – 5 ngày trong

điều kiện phòng thí nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày Các bào tử của nấm này cũng có khả năng diệt rệp đào hại rau cải, dau diếp, ớt 100% sau 5 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm [50] Bên cạnh đó, nấm này cũng đã được chứng minh có hoạt tính chống nấm mốc gây bệnh nấm mốc trên

nhiều loại cây trồng [22], [104] Nấm Lecanicillium spp cũng kí sinh trên nhiều

loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bướm Năm

2006, North và cs đã thử nghiệm và cho ra kết quả Lecanicillium muscarium diệt được khoảng 70% bọ dừa Thripspalmi sau 4 ngày [83] Lecanicillium spp được sử

dụng để tạo chế phẩm diệt bướm trắng Mycotal™ [44], [56], [78] Ngoài ra, loại nấm này cũng có thể kiểm soát giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc [75], [103]

Mặc dù tiềm năng kiểm soát công trùng gây hại cây trồng của nấm

Lecanicillium spp rất lớn nhưng việc nghiên cứu ứng dụng của nấm này để bảo vệ

cây trồng cũng như kết quả đạt được còn rất hạn chế, nhất là ở Việt Nam Hiệu quả

diệt côn trùng của chế phẩm từ Lecanicillium spp cũng như các chế phẩm sinh học

khác còn kém, khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng chiếm tỷ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng

cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium spp là

cần thiết

1.4 ĐỘT BIẾN VÀ CẢI BIỂN CHỦNG

1.4.1 Giới thiệu về đột biến

Đột biến là những thay đổi vật lý trong các gen và nhiễm sắc thể Chúng có thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể được truyền từ một tế bào khác trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc có thể được truyền từ một thế hệ khác đột biến thông qua giáo tử (mầm dòng đột biến) Đột biến có thể được gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trường, từ sự hoạt động hay không hoạt động của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất gây đột biến) hoặc các bức xạ năng lượng cao Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các loài sinh vật, giữa các gen, thời gian và địa điểm Nó có thể gây ra tác động đáng kể không chỉ đối với cá nhân mà còn về sự tiến hóa của các loài Những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể

di truyền cho các đời sau, góp phần thúc đẩy đa dạng sinh học

Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải được sản xuất với chi phí thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất Để đạt được điều này, việc cải thiện thường được thực hiện bằng kỹ thuật đột biến Người ta có thể tạo đột biến bằng

các chất gây đột biến hóa học như N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG),

EMS… hoặc bằng cách chiếu xạ vật lý như tia X, tia γ, tia UV [105]

Sự đột biến các dòng nấm để tạo ra các enzyme công nghiệp khác nhau (lipase, chitinase, cellulose, glucoamylase…) đã được sử dụng rộng rãi

1.4.2 Sự cải biến chủng trên thế giới

Năm 1994, Kuhad và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium oxysporum bằng

tia cực tím, chủng đột biến xử lý với NTG đã làm tăng khả năng tổng hợp Cellulase lên nhiều lần so với chủng tự nhiên [70]

Năm 1998, Kim và cs sử dụng xung điện và hóa chất NTG để cải biến hai

chủng nấm men Saccharomyces diastaticus (ATCC 28339) và Sacharomyces spp

trong sản suất cồn sinh học Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men được ethanol nồng độ cao hơn [64]

Năm 2005, Chand và cs đã tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên nấm sợi bằng NTG kết hợp với ethidium bromide và UV hoặc NTG kết hợp với ethidium bromide Kết quả sàng lọc được chủng đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp cellulose cao hơn nhiều lần so với chủng tự nhiên [31]

Năm 2011, Vũ Văn Hạnh và các cs đã xử lý chủng nấm sợi Aspergillus sp

bằng cách kết hợp tia Rontghen và hóa chất NTG để gây đột biến.Chủng nấm đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp men phân hủy tinh bột sống cellulase tăng lên rất rõ rệt so với chủng tự nhiên [46], [48]

1.4.3 Sự cải biến chủng ở Việt Nam

Năm 2009, Hồ Tuyên và cs đã sử dụng ba phương pháp gây đột biến gồm chiếu tia cực tím (UV) vào bào tử, xử lý hóa chất gây đột biến NTG đối với tế bào trần và các phân đoạn khuẩn ty nhằm nâng cao hoạt tính kháng sinh của

Acremonium chrysogenum Biến chủng tốt nhất thu được có hoạt tính kháng sinh

tăng khoảng 75% so với chủng gốc [17]

Năm 2010, tác giả Nguyễn Quỳnh Uyển và cs đã sử dụng hoá chất gây đột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào của vi

khuẩn Bacillus sp Sau khi gây đột biến bằng NTG và sàng lọc, hai chủng vi khuẩn

đột biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với hoạt độ của chủng gốc đã thu được [18]

Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cs tiến hành thí nghiệm nâng cao độc lực diệt

rệp đào của chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột biến tia UV và

NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Sàng lọc 42 dòng nấm đột biến, trong

đó 2 thể đột biến UV (UV10.4 và UV60.3) và 3 thể đột biến NTG (NTG30.2, NTG50.2 và NTG60.2) diệt 100% rệp muội sau 4 đến 5 ngày phun Độc lực của các thể đột biến tăng từ 10 đến 20% so với kiểu dại [5]

1.5 RỆP VÀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

1.5.1 Tổng quan về rệp hại cây trồng

Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới Chúng phân

bố tập trung ở các vùng ôn đới Ngoài ra, chủng cũng phân bố ở các vùng nhiệt đới

và cận nhiệt với độ đa dạng thấp hơn Có khoảng 4400 loài thuộc 10 họ đã được

biết đến, trong đó phổ biến nhất là họ Aphidae Khoảng 250 loài là loài gây hại nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii), rệp hại ớt (Piper nigrum), rệp ngô (Aphis maydis)…[110] Đồng thời, nó cũng là vật chủ trung gian góp phần làm lây lan

virus từ những cây nhiễm bệnh sang cây lành, làm giảm năng suất cây trồng, gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp Rệp là loài côn trùng thân mềm [25]

Hình 1.5: Cấu tạo ngoài của rệp

[116]

Cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng) và được bao bọc bởi một bộ khung kitin Nó có kích thước từ 1 – 10 mm, cơ thể hình bầu dục có mầu xanh lá cây, đen, nâu, hồng hoặc không màu Rệp có ba cặp chân phân đốt, mắt kép, 1 cặp râu, có cánh (dạng màng) hoặc không có cánh [55]

Ở rệp có cả hai kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính Nhiều loại có sự thay đổi giữa kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính khá phức tạp Sự thay đổi giữa hai kiểu để sinh ra trứng hoặc ấu trùng, thay đổi giữa cây chủ thân gỗ và cây chủ thân thảo

Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với sự thay đổi cây chủ [75]

Kẻ thù tự nhiên của rệp gồm có bọ rùa ăn rệp, rong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, các loài nấm kí sinh côn trùng

(entomopathogenic) như Entomophthora, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và L lecanii [28], [110]

1.5.2 Tình hình rệp hại cây trồng

 Trên thế giới

Mỗi năm thế giới phải chi trả hàng triệu dollar Mỹ cho công tác phòng trừ rệp hại Rệp gây hại trên nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải

Theo thống kê của Tatchell (1989), rệp phá hoại nhiều loại cây trồng ở vương quốc Anh Sản lượng bị thiệt hại thường ở mức 4 – 10% và có thể lên đến 46% ở cây đậu Ước tính giá trị thiệt hại lên đến 70 triệu bảng Anh [98]

Bảng 1.1: Tình hình thiệt hại ở một số cây trồng do rệp ở Anh [98]

Loại cây Rệp gây hại Dạng gây hại Sản lượng bị thiệt

hại (%)

Lúa mì đông Sitobion avenae

Metopolophium dirhodum

Phá hoại Phá hoại

9,7 – 12,5

13 Lúa mạch đông Rhopalosiphum padi Truyền bệnh 0 – 86

Lúa mạch xuân Metopolophium dirhodum Phá hoại 8,8

Củ cải đường Myzus persicae Truyền bệnh 6,5

Khoai tây Macrosiphum euphrobiae

Myzus persicae

Phá hoại Phá hoại

5,7 4,4

Các loại đậu Aphis fabae Phá hoại 16,4 – 46,3

Đậu Hà Lan Acyrthosiphon pisum Phá hoại 8,0 – 15,8

Cây hoa bia Phorodon humuli Phá hoại 9,2

Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại 75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành Số trường hợp bị rệp quấy phá

đã tăng lên hơn 1000% trong vòng 4 năm qua Nạn rệp lan tràn ở xứ sở này chỉ là một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi năm [107]

Rệp bông (A.gossypii) kí sinh trên 700 loại cây trồng khác nhau trên toàn thế

giới, bao gồm nhiều cây quan trọng như dưa hấu, dưa chuột, bí xanh, bí ngô, ớt,

cam và quýt Một trong những cây chủ mà A gossypii phá hoại nhiều nhất là cây

bông vải Theo Xia (1997), sản lượng bông hàng năm ở Trung Quốc bị thiệt hại 10 – 15% và chủ yếu do rệp bông [59] Năm 2012, sản lượng bông của Trung Quốc là 7,3 triệu tấn [115] thì con số thiệt hại có thể lên đến 0,73 – 1,095 triệu tấn

Ở phía đông của miền Trung Ấn Độ, Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) cùng với

M persicae và Brevicoryne brassicae là ba loại rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea) Trong đó L erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại

35,4 – 91,3 % sản lượng [26], [95] Theo nghiên cứu của Patel và cs ( 2004), nếu

không có biện pháp bảo vệ, L erysimi có thể gây thiệt hại 80,6 – 97,6% [87] Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cs (2011) đã chỉ ra rằng, M persicae và Brevicoryne brassicae cũng gây thiệt hại 75,1- 81,9% sản lượng cải dầu ở Multan,

Punjab, Pakistan [90]

Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do

truyền virus gây bệnh A craccivora truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [61], [80] M persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp

truyển bệnh virus gây bệnh rụng lá ở khoai tây [79],[ 97] Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [99] Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy hiểm đối với cây lương

thực Diuraphis noxia ( rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa

mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng sự ( 2010), năng suất

lúa mì có thể bị giảm 7,9 – 34,2 % do D noxia phá hoại [20]

Như vậy với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cẩu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết Biện pháp kiếm soát rệp

và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỉ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp Cho đến nay, đây vẫn là biện pháp được sử dụng chủ yếu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển

 Ở Việt Nam

Trung tâm Tin học và Thống kê (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đã đưa ra “Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12 tháng 5 năm 1012 ngành Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn” Ở lúa, tổng diện tích nhiễm rầy tăng 18% so với năm 2011, trong đó diện tích nhiễm nặng tăng 123% so với năm 2011, diện tích bị cháy rầy không đáng kể Diện tích nhiễm rầy tăng mạnh tại các tỉnh phía Bắc, với diện tích nhiễm tăng 38% so với năm 2011 Riêng vụ đông xuân diện tích nhiễm tăng 4,79 lần so với cùng vụ năm trước [109]

Rệp sáp bột hồng có tên khoa học Phenacoccus manihoti, được phát hiện ở

Việt Nam vào tháng 06/2012 tại Tây Ninh Diện tích nhiễm lúa đó là 78,5 ha (tập trung ở huyện Dương Minh Châu, Tân Châu và thị xã Tây Ninh) Đến 06/2013, diện tích nhiễm là 884,1 ha (tại huyện Tân Châu, Châu Thành, Thị xã Tây Ninh, Dương Minh Châu, Tân Biên, và Hòa Thành) [2]

Theo báo cáo của Chi cục Bảo vệ thực vật – tỉnh Quảng Trị, hiện nay tổng diện tích sắn bị nhiễm rệp sáp bột hồng trên địa bàn tỉnh hơn 120 ha, trong đó, tại

huyện Hướng Hóa, diện tích bị nhiễm lên đến 96 ha, tỷ lệ hại phổ biến 3 – 20%, nơi cao 40 – 50% [115]

1.5.3 Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học

Thuốc trử sâu hóa học từ lâu đã được sử dụng để phòng trừ sâu hại Mặc dù

nó có thể dập tắt ngay nạn sâu hại cây trồng, tuy nhiên nó lại là con dao hai lưỡi khi

sử dụng Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học làm phá hủy môi trường sống xung quanh

và trực tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe của người nông dân Ngoài ra, nó còn gây chết đối với một số loài sinh vật như chim chóc, tôm, cá và cả những côn trùng có lợi như bọ rùa, ong kí sinh…[16] Để hạn chế tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, con người có xu hướng sử dụng các chế phẩm, thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học có thể có nguồn gốc từ các loại thảo dược, các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) hay các chất được tách chiết từ sinh vật như protein, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật

Theo EPA, Hoa Kỳ (2011), thuốc diệt côn trùng được chia thành 3 nhóm chính [118]:

Nhóm 1: Thuốc diệt hại có nguồn gốc từ vi sinh vật: thành phần hoạt lực là

các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus hoặc động vật nguyên sinh) Chúng dùng để kiểm soát nhiều loại gây hại khác nhau như côn trùng, cỏ dại Ví dụ như độc tố của

vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) được dùng làm thuốc diệt côn trùng sinh học

thuộc nhóm này

Nhóm 2: Các yếu tố bảo vệ được chuyển vào thực vật (Plant incorporate

protectants – PIPs) gồm các chất thực vật không sản xuất được, nhưng do nhận được gene ngoại lai nên thực vật có khả năng sản sinh ra để tự bảo vệ Gene mã hóa cho protein độc tố của Bt là một điển hình, hay được sử dụng để chuyển vào thực vật [106]

Nhóm 3: Các chất diệt hại hóa sinh: là các hợp chất kiểm soát dịch hại bằng

cơ chế không độc Nhóm này có thể là các pheromone giới tính ức chế trưởng thành giới tính, ức chế sự giao phối của côn trùng từ đó kiểm soát dịch hại hoặc là các chất được chiết từ thực vật có khả năng dẫn dụ, bẫy côn trùng

Thuốc diệt côn trùng sinh học mặc dù có một số nhược điểm như giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực không mạnh bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện ngoại cảnh Nhưng bên cạnh đó, nó có những

ưu điểm vượt trội so với hóa chất về thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người Chế phẩm sinh học có tác dụng chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số loài côn trùng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số loài sâu bọ, các loài kí sinh và các sinh vật có ích khác Do vậy, hệ sinh thái không bị xáo trộn, đảm bảo sự bền vững của đất trồng trọt Các chế phẩm này, không chỉ tiêu diệt lứa côn trùng đang phá hoại mà còn lây nhiễm từ thế hệ này snag thế hệ khác, từ đó kéo dài thời gian sử dụng, làm giảm chi phí Các chế phẩm chính là các cơ thể sống hoặc có nguồn gốc từ các cơ thể sống nên dễ bị phân hủy thành các chất không độc, không làm ô nhiễm đất, nước, không khí

1.5.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng

 Trên thế giới

Sự đóng góp đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh vật

là của Mechnikoff (1879) và Karassilnikor (1888), khi lần đầu tiên trình bày các

nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae để

diệt côn trùng gây hại ngũ cốc và củ cải đường Năm 1914, lần đầu tiên d’ Herelle thử nghiệm kiểm soát côn trùng bằng vi khuẩn Cho đến năm 2011, có khoảng 195 yếu tố diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã được đăng kí với 780 sản phẩm khác nhau [112] Trên thế giới hiện đã có nhiều chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm kí sinh côn trùng được thương mại hóa Theo thống kê của de Faria và

cộng sự (2007), có ít nhất 12 loài (hoặc dưới loài) nấm được ứng dụng để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng [38]

Beevicide và LarvoEnd là hai trong số các sản phẩm thương mại chứa bào tử

nấm Beaveria bassiana Đích tác dụng là sâu đục thân, sâu đục quả, bọ trĩ, sâu cuốn lá và bướm đêm TermoENd chứa M anisopliae, tác dụng lên mối, kiến, bọ

cánh cứng hại mía, ấu trùng hại rễ cây và ruồi quả Grubkill và Bioter là chế phẩm chứa đồng thời nấm kí sinh trùng và vi khuẩn, tác dụng lên các côn trùng chích hút,

sâu đục thân và côn trùng thân cứng Biomite chứa hỗn hợp V lecanii và một số kí

sinh vật khác, tác dụng lên ve bét phá hoại mùa màng ENomita và Azaguard Tech

là các chất được chiết từ thực vật ENomita chứa furoflavone được chiết từ cây Karanjin, tác dụng lên ve bét và côn trùng chích hút Azaguard Tech là chế phẩm

chiết từ hạt neem (Azadirachta indica), tác dụng lên hơn 400 loài côn trùng khác

nhau, trừ côn trùng có lợi Các chất này giúp kiểm soát sự sinh trưởng và do đó kiểm soát số lượng côn trùng

B thuringensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm soát côn

trùng sớm nhất Chế phẩm từ Bt bắt đầu được sử dụng để diệt côn trùng từ năm

1920 Năm 2007, Ahmad và cộng sự đã so sánh khả năng diệt rệp của Bt với một

số hóa chất tổng hợp Kết quả cho thấy, Bt làm giảm 70% số lượng rệp, xấp xỉ với hiệu quả của các hóa chất này [19]

Kim và cộng sự (2001) sử dụng B.bassiana và V.lecani để kiểm soát rệp bông A.gosypii Kết quả cho thấy, chủng B.bassiana CS-1 diệt được 50% rệp sau khoảng

4 ngày phun và sau 5 ngày diệt được 64 – 75% Chủng V.lecanii CS-625 diệt rệp

tốt hơn, diệt được 50% rệp chỉ sau 2,3 – 2,7 ngày và diệt được 97 – 100% sau 5

ngày V.lecanii cũng được sử dụng để kiểm soát ruồi trắng Trialeurodes

và 35oC bởi chủng V.lecanii CS-626 [67]

Vu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium spp Phân lập

từ rệp M.persicae để kiểm soát M persicae và A gossypii [51] Trong một nghiên cứu khác, Kim và cộng sự (2008) đã sử dụng L attenuatum CNU-23 để kiểm soát

M persicae Trong phòng thí nghiệm, L attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp

sau 3,7 ngày phun và 80% sau 7 ngày phun Khi thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà kính, chủng nấm này diệt được 72 – 97% rệp sau 12 ngày phun [66]

 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng của vi sinh vật Năm 1995, GS TS Phạm Thị Thuỳ đã ứng dụng rộng rãi thuốc trừ

sâu sinh học virus và vi nấm Metarhazium trừ châu chấu hại ngô mía ở Bà Rịa -

Vũng Tàu Năm 2005, Phạm Thị Thùy và cộng sự đã nghiên cứu hoàn thiện công

nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm sử dụng Beauveria và Metarhizium để phòng

trừ sâu hại đậu tương và đậu xanh [13] Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2007) đã

nghiên cứu khả năng diệt sâu khoang hại rau cải của M.anisopliae Kết quả chủng

nấm này diệt được trên 70% sâu khoang sau 7 ngày phun [9]

Năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được công nhận và đăng ký Đến năm 2005 đã có 57 sản phẩm các loại, đến 6 tháng đầu năm 2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký Nâng tổng số có 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đó có 300 lọai thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh Một số sản phẩm tiêu biểu như [114]:

- Nguồn gốc vi khuẩn, xạ khuẩn: Điều chế từ nấm có sản phẩm thuốc trừ sâu

sinh học VIBAMEC với hoạt chất Abamectin được phân lập từ quá trình lên men

Steptomyces avermitilis Diệt trừ được sâu vẽ bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ

phấn Ngoài ra trong nhóm này còn có Vivadamy, Vanicide, Vali… có hoạt chất là

Validamycin A, được chiết xuất từ Streptomyces hygroscopius Đây là nhóm thuốc

trừ bệnh có nguồn gốc kháng sinh đặc trị các bệnh đốm vằn trên lúa, bệnh nấm

hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, bông vải…

- Nguồn gốc nấm: Các chế phẩm từ nhóm nấm có nấm đối

kháng Trichoderma vừa có tác dụng đề kháng một số nấm bệnh gây hại trên bộ rễ

cây trồng nhƣ: bệnh thối rễ hay bệnh héo chậm

- Nguồn gốc virus: Tiêu biểu là nhóm sản phẩm chiết xuất từ virus

Nucleopolyhedrosisvirus (NPV) Đây là lọai virus có tính rất chuyên biệt, chỉ lây

nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng rất hiệu quả trên một số cây trồng nhƣ bông, đậu đỗ, ngô, hành, nho …

Tuy nhiên, nhìn chung hiện nay việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại ở Việt Nam chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng nấm L lecanii 85 (chủng tự nhiên – Le85) được phân lập từ đồng

ruộng

Chủng nấm L lecanii Ne180.7 là chủng đột biến từ Le85 bằng cách sử dụng

Ethyl methanesulfonate (EMS) kết hợp với NTG cho độc lực diệt rệp cao nhất so với chủng tự nhiên

Hai chủng nấm này do phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

Các hóa chất dạng tinh khiết như: MgSO4, KNO3, KH2PO4, (NH4)2SO4, KMnO4, HCl, NaOH……cao nấm men, pepton, cao thịt; các dung môi, axit, kiềm, methanol, iso – butanol, ethanol

Một số nguyên liệu khác như gạo trấu, cám gạo, lõi ngô, bột ngô, bột đậu tương, khoai tây, vỏ tôm, vỏ cua, vỏ dứa được thu mua và thu thập tại khu vực Hà Nội

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PDB (Potato dextrose broth) cải tiến: 20% dịch chiết khoai tây,

2% glucose (w/v), 0,05% KNO3

Môi trường PDA (Potato dextrose agar): thành phần giống môi trường PDB

nhưng có bổ sung thêm 2% agar

Môi trường lỏng sinh chitinase: 0,05% KH2PO4; 0,1% MgSO4; 0,5% pepton; 0,1% chitin

2.1.4 Dung dịch đệm

Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch và đệm

Dung dịch NTG 100mg NTG trong 1ml đệm 0,2M citrat pH5

Đệm citrat 0,2M acid citric; 0,2M trinatri citrate; pH 3 ~ 6

Đệm phosphate 1M K2HPO4, 1M KH2PO4, pH 7 ~ 8

Đệm Glycine – NaOH 0,2M glycine; 0,2M NaOH; pH 9 ~ 10

Khoáng crapek 0,3% NaNO3; 0,1% KH2PO4; 0,05% KCl; 0,05% MgSO4;

0,001% FeSO4; pH 7,3 ± 0,2

2.1.5 Thiết bị thí nghiệm

Các thí nghiệm được sử dụng thuộc phòng Các chất chức năng sinh học và Phòng thí nghiệm trọng điểm thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.2)

Ngoài ra còn một số dụng cụ thí nghiệm khác như: bình nón, ống nghiệm, ống đong, cốc đong, đĩa petri, bình pyrex, đầu côn, …

Bảng 2.2: Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng

Buồng đếm hồng cầu Neubauer Đức

Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

mm2 và chiều cao 1/10 mm

- Phương pháp tiến hành:

Buồng đếm và lamen được lau sạch bằng cồn, thấm khô trước khi cho dịch tế bào vào Lamen được đặt trên buồng đếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen Sau đó dùng pipet hút một ít dịch tế bào đã được lắc đều trước và chấm vào cạnh của lamen Làm nghiêng buồng đếm để dịch tràn láng vào buồng đếm Để từ 3 đến 5 phút, buồng đếm có chứa dịch được đưa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 40, thị kính 10 Đối với mẫu đếm quá đặc không thể đếm được chính xác thì phải pha loãng trước khi đếm, đảm bảo mật độ tế bào không quá lớn (lớn hơn 200 tế bào trong một ô lớn) và nhân

hệ số pha loãng khi tính kết quả Đếm ít nhất 5 ô lớn số lượng tế bào nấm, lấy trị số

trung bình

- Phương pháp tính kết quả:

Số tế bào trên một ml mẫu phân tích (N) được tính như sau:

N (tế bào/ml) = (a x K) / V

Trong đó: a: Số tế bào trung bình trong một ô lớn

V: Thể tích một ô lớn 4 x 10-6ml K: Hệ số pha loãng

Vậy N (tế bào/ml) = (a x K) / (4 x 10-6) = 0,25 x a x K x 106

Hình 2.1: Cách đếm tế bào trong buồng đếm [115]

 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy chan

Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cấy chan trên bề mặt đĩa giúp ta xác định được số tế bào sống

- Phương pháp tiến hành:

Hình 2.2: Phương pháp cấy chan trên bề mặt đĩa thạch [115]

Môi trường PDA được đem đi hấp khử trùng làm tan thạch, sau đó đỏ vào đĩa petri đã khử trùng khoảng 10 – 15ml môi trường và để nguội Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân 10-1, 10-2…với tỷ lệ 100µl mẫu : 900µl Tween 80 0,05% Từ nồng

độ pha loãng mình cần, hút 100µl dịch pha loãng vào bề mặt thạch, bổ sung thêm 10µl kháng sinh ampicillin 1‰ Dùng que chan, chan đều hỗn hợp trên bề mặt thạch đến khô Sau 3 ~ 5 ngày, đem ra đếm số lượng bào tử mọc trên đĩa thạch

2.2.2 Quy trình tạo chitin từ vỏ tôm, vỏ cua

Phương pháp tách chitin từ vỏ tôm, vỏ cua được làm theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) [12]

- Phương pháp tiến hành:

Trong dứa có rất nhiều bromelain – enzyme thủy phân protein, đồng thời còn

có nhiều axit hữu cơ Do vậy, dịch ép bã dứa rất thích hợp để loại bỏ cả protein và các chất khoáng trong quá trình thu nhận chitin từ vỏ tôm, vỏ cua

Quy trình tách chiết chitin được tiến hành như sau: 100g vỏ tôm, vỏ cua sẽ được hòa vào 300ml dịch chiết enzyme (nước ép bã dứa) Thay dịch enzyme 2 lần vào sáng và chiều trong một ngày Xử lý liên tục bằng dịch chiết enzyme trong khoảng 1 tuần Rửa sạch và thu cặn Quá trình này sẽ loại bỏ hết lượng khoáng trong vỏ tôm, vỏ cua Thử lại với dung dịch HCl 1,2N nếu không thấy sủi bọt là được Sau đó, lượng protein trong vỏ tôm, vỏ cua sẽ được xử lý 2 lần với dung dịch

NaOH 2% (hoặc 1%) ở 900C trong 45 phút, sau đó rửa sạch bằng nước máy đến pH trung tính Sản phẩm thu được là chế phẩm chitin thô còn chứa các chất màu Các chất màu trong chế phẩm được tẩy đầu tiên bằng xử lý với dung dịch thuốc tím (KmnO4) 0,1% trong 15 phút, rửa sạch với nước máy Tiếp đó, xử lý với dung dịch oxalic acid (C2H2O4) 1% ngâm trong 1 đến 2 giờ cho đến khi sản phẩm có màu trắng thì lấy ra, rửa sạch với nước máy Sau đó đem chế phẩm đi phơi khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, sẽ thu được chế phẩm chitin sạch

2.2.3 Phương pháp đột biến bằng NTG

- Cơ chế:

NTG là chất hóa học được sử dụng trong thực nghiệm như là một chất gây ung thư và gây đột biến Trong các thí nghiệm sinh học, NTG là tác nhân đột biến hiệu quả cao nhất đối với vi sinh vật Do vậy, nó thường được sử dụng làm chất gây đột biến phổ biến hiện nay NTG có công thức hóa học là C2H5N5O3 Đột biến

do NTG gây ra là đột biến điểm Nó hoạt động bằng cách gây ra sự alkyl hóa, thêm nhóm methyl hoặc ethyl trên các base tạo ra sự thay đổi khi kết cặp của các base gây ra sự kết cặp sai Khoảng 90% các đột biến hầu như chỉ xảy ra khi nhóm alkyl được thêm vào ở O6

của guanine tạo thành O-6-alkylguanine Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine Kết quả sinh ra đột biến đồng hoán GC thành AT trong lần sao chép tiếp theo Trong một số rất ít các trường hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn

- Phương pháp tiến hành:

Chủng nấm Ne180.7 là chủng nấm đột biến từ chủng gốc ban đầu Le85 sẽ được nuôi nhân giống trong môi trường PDB Sau khoảng thời gian từ 3 – 5 ngày, khi dịch bào tử đạt khoảng 108 CFU/ml, hút 2ml dịch bào tử đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu bào tử và loại dịch Bổ sung 0,5ml dung dịch NTG và vontex đều Ủ bào tử trong dịch NTG ở các khoảng thời gian khác nhau 30

phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút Sau mỗi khoảng thời gian, hút lần lượt 100µl dung dịch bào tử , ngay lập tức đem đi ly tâm 10000 vòng/phút để thu lại bào tử và loại hóa chất Sau đó rửa bào tử bằng nước cất 2 lần, rồi bổ sung thêm 100µl nước muối sinh lý

Dịch bào tử được pha loãng với Tween 80 0,05% ở các nồng độ 10-1, 10-2,… ,

10-9 rồi cấy chan trên đĩa petri có chứa môi trường PDA có bổ sung ampicillin với nồng độ 1‰ Các đĩa nấm được nuôi ở 260C trong khoảng thời gian 3 – 5 ngày thì đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch Nhặt ngẫu nhiên khuẩn lạc trên đĩa thạch

Bảng 2.3: Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG

Tia UV có thể tạo ra đột bến giữa 2 vòng pyrimidine (cytosine hoặc thymine)

để tạo nên 2 liên kết dimer giữa chúng Thông thường, tia UV hay tạo ra cầu nối dimer giữa các nhóm cytosine ở gần nhau Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine thay vì guanine được bổ sung vào sợi mới Qua quá trình sao chép DNA, thể dại (CC) chuyển thành thể đột biến (TT) Mặc dù, các đột biến điểm dimer cytosine trên DNA có thể được sửa bởi hệ thống của tế bào nhưng không thể hết Kết quả là cặp GC (tự nhiên) chuyển thành AT (đột biến) sau khi chiếu tia UV

- Phương pháp tiến hành:

Chủng Ne180.7 được đem nuôi lắc ở 280C trong bình nón chứa môi trường PDB Sau khoảng 3 – 5 ngày, dịch bào tử sẽ được hút ra và đem đi đếm, bào tử đạt khoảng 108 CFU/ml Hút ra 2ml dịch bào tử, đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong

10 phút ở 40C, thu bào tử và loại dịch nổi Bào tử sau khi ly tâm, được bổ sung thêm 0,5ml dung dịch NTG, đổ ra bề mặt đĩa petri Bật tia UV (50W), khoảng cách

từ nguồn UV đến đĩa khoàng từ 25 – 30 cm Sau các khoảng thời gian khác nhau gồm 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút, ta lần lượt hút ra 100µl Sau

đó, xử lý tương tự như đối với tạo đột biến bằng NTG

Bảng 2.4: Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG + UV

2.2.5 Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase

Từ các dòng đột biến, chọn ra một dòng đột biến có hoạt tính chitinase cao trong môi trường xốp Ta sẽ sử dụng dòng đột biến này để nuôi và tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase thích hợp cho dòng đột biến này

- Các yếu tố tối ưu bao gồm:

Cơ chất: gạo, cám gạo, lõi ngô, bột ngô, gạo và cám gạo (1:1, w/w), gạo và lõi ngô (1:1, w/w), gạo và bột ngô (1:1, w/w), cám gạo và lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo

và bột ngô (1:1, w/w), lõi ngô và bột ngô (1:1, w/w)

Tỷ lệ cơ chất (trong trường hợp cơ chất tối ưu là hỗn hợp 2 chất): 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2

Độ ẩm được xét trong khoảng từ 20% đến 70% v/w (với khoảng cách 10%)

Độ ẩm được tính bằng lượng nước cho vào trên tổng thể tích chung của cơ chất và nước

Nhiệt độ cho lên men xốp: 260C, 280C, 300C và 370C

Xét pH tối ưu cho môi trường lên men xốp từ pH 3 – 10 bằng cách sử dụng dải pH của các đệm citrat (pH 3 – 6), đệm phosphate (pH 7 – 8) và đệm Glycine – NaOH (pH 9 – 10)

Nồng độ chitin (%) bổ sung vào môi trường lên men xốp là 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 5% so với khối lượng cơ chất

Nguồn Nito bổ sung vào với nồng độ 0,1%/g cơ chất, bao gồm nguồn nito hữu

cơ (cao nấm men, cao thịt, bột đậu tương, pepton) và nguồn nito vô cơ (NH4Cl,

N-acetyl-Hình 2.3: Cơ sở hóa học của phản ứng định lượng đường khử

Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo đơn vị quốc tế do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) Một đơn vị chuẩn của enzyme (1UI) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1µmol chitin sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1UI = 1µmol sản phẩm = 1µmol cơ chất (10-6mol)/phút

 Chuẩn bị

- Dung dịch đường chuẩn: Pha dung dịch glucosamine chuẩn có nồng độ

10µmol/ml Từ dung dịch glucosamine 10µmol/ml, pha loãng thành các dung dịch glucosamine khác có nồng độ từ 1, 2, …, 10µmol/ml

- Thuốc thử DNS: Cân 5g DNS và 300ml nước cất vào cốc đong, khuấy đều từ

từ cho tan hết ở 500C Bổ sung thêm 8g NaOH Cuối cùng cho thêm 150g potassium sodium tartrate (C4H4KNaO6), khuấy đều cho tan hết Bổ sung thêm nước định mức đủ 500ml Sau đó để nguội, đổ sang chai tối, tránh ánh sáng

- Thu dịch enzyme thô: Đối với môi trường lỏng, hút 2 ml dịch đem đi ly tâm

12000 vòng/phút, thu dịch nổi Đối với môi trường xốp, bổ sung thêm nước cất sau

đó đem đi lắc trong 2 – 3 giờ Hỗn hợp sau khi lắc sẽ được lọc qua giấy lọc để thu dịch thô, đem tiếp đi ly tâm 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút để thu dịch enzyme thô

 Lập đường chuẩn glucosamine

Từ dãy nồng độ glucosamine đã pha sẵn, bổ sung thêm 100µl DNS vào mỗi ống Đun sôi 5 phút (có đậy nắp), sau đó làm lạnh dần đến nhiệt độ phòng Thêm vào 1,8ml nước cất, độ pha loãng là 20 lần, đo mật độ quang ở bước sóng 540nm Xây dựng đường chuẩn glucosamine với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồng độ glucosamine Phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y =

ax + b với y = OD540nm; x = [glucosamine] (µmol/ml) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel

Dựa vào kết quả ở bảng phụ lục 1, ta dựng đường chuẩn glucosamine bằng phần mềm Microsoft Excel

Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn Glucosamine

y = 0.064x - 0.012 R² = 0.992

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Công thức xác định hoạt tính là: