Ly trích và khảo sát hàm lượng phenol tổng số giống lúa đỏ (châu hạng võ)

Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, chúng có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật.. [10] Hình 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUYẾT RỒNG (Oryza sativa)

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Cần Thơ - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép của ai Dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Phan Thị Bích Trâm Nội dung luận văn

có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí

và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của luận văn

Tác giả luận văn

Lê Thị Kim Tâm

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

  

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

  

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em chân thành cám ơn các Thầy và Cô của Bộ Môn Hóa – Khoa Sư Phạm đã tạo điều kiện cho em được làm luận văn, được học hỏi và tích lũy những kiến thức quý báu trong học tập cũng như trong cuộc sống

Em xin cám ơn Cô Phan Thị Bích Trâm, giảng viên bộ môn Sinh lý và Sinh hóa Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Người đã hướng dẫn tận tình và truyền thụ cho em những kiến thức rất quý báu về chuyên môn và cách làm việc khoa học để đạt kết quả tốt

Cám ơn thầy Nguyễn Trọng Cần, cùng các thầy cô, bộ môn Sinh lý và Sinh hóa

đã giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi để em hoàn thành luận văn

Cuối cùng, em xin cám ơn cha mẹ, bạn bè những người đã luôn bên cạnh ủng hộ

và là chỗ dựa vững chắc giúp em có nghị lực để hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cám ơn !

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát hàm lượng các hợp chất chống oxy hóa thuộc nhóm polyphenol có trong giống lúa Huyết Rồng – một giống lúa truyền thống được dùng ăn kiêng khá phổ biến Các thí nghiệm tìm ra điều kiện ly trích tối ưu như dung môi chiết tách, số lần chiết, tỉ lệ mẫu : dung môi, nhiệt độ và thời gian ly trích Trên cơ sở đó xác định hàm lượng poplyphenol và flavonoid tổng số khi cho lúa nẩy mầm Kết quả nghiên cứu nhận thấy hàm lượng poplyphenol tổng số trong hạt gạo được chiết với methanol ở 40oC trong 3 giờ đạt cao nhất khoảng 45,11 – 45,45 mg GAE/100g lúa Hàm lượng poplyphenol tổng số tăng dần theo thời gian nẩy mầm, đạt cực đại vào ngày thứ 4 của giai đoạn nẩy mầm (66,8 mg GAE/100g lúa), sau đó có xu hướng giảm xuống vào ngày nẩy nầm thứ 5 Đối với hàm lượng flavonid tổng số tăng trong 2 ngày đầu tiên sau khi ủ hạt, đạt cao nhất vào ngày thứ nhất nẩy mầm (5,75 mg QE/100g) Kết quả đề tài làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo về các hoạt chất chống oxy hóa khác có trong giống lúa huyết rồng nhằm chứng minh việc sử dụng loại gạo này trong việc ăn kiêng trị bệnh là có cơ sở khoa học

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG LÚA ĐỎ (HUYẾT RỒNG) 3

2.1.1 Nguồn gốc và thành phần dinh dưỡng 3

2.1.2 Vai trò các thành phần trong gạo huyết rồng 4

2.2 CHẤT OXY HÓA (GỐC TỰ DO) 4

2.2.1 Gốc tự do 4

2.2.2 Nguyên nhân hình thành các gốc tự do 5

2.2.2.1 Gốc tự do nội sinh 5

2.2.2.2 Gốc tự do ngoại sinh 7

2.2.3 Vai trò của các gốc tự do 8

2.2.3.1 Gốc tự do có lợi đối với cơ thể 8

2.2.3.2 Gốc tự do có hại cho cơ thể 9

2.3 CHẤT CHỐNG OXY HÓA 11

2.3.1 Chất chống oxi hóa 11

2.3.2 Một số chất chống oxy hóa thường gặp 12

2.3.2.1 Chất chống oxy hóa không có bản chất enzym 12

2.3.2.2 Chất chống oxy hóa có bản chất enzym 16

2.4 MỐT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC 17

2.4.1 Phenol tổng số 17

2.4.2 Hợp chất flavononid 18

2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT CHỐNG OXY HÓA 18

2.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 18

2.5.2 Các công trình nghiên cứu ở nước ngoài 18

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 PHƯƠNG TIỆN 20

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20

3.2.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu 20

3.2.1.1 Xác định độ ẩm 20

3.2.1.2 Xác định tỉ lệ gạo / lúa 21

3.2.1.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 21

3.2.1.4 Xây dựng đường chuẩn phân tích 23

3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách đến hàm lượng polyphenol 25

3.2.2.1 Mục đích 25

3.2.2.2 Bố trí thí nghiệm 25

3.2.3 Khảo sát hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số trong quá trình nẩy mầm từ giống lúa đỏ 27

3.2.3.1 Mục đích thí nghiệm: 27

3.2.3.2 Chuẩn bị lúa nẩy mầm 27

3.2.3.3 Xác đinh hàm lượng TPC và TFC theo thời gian nẩy mầm 27

3.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 28

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU 29

4.1.1 Độ ẩm và tỉ lệ gạo/lúa 29

4.1.2 Khả năng quét gốc tự do của giống lúa huyết rồng 29

4.1.3 Kết quả các đường chuẩn 30

4.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách hàm lượng polyphenol tổng số 31

4.2.1 Loại dung môi thích hợp chiết tách hợp chất polyphenol 31

4.2.2 Khảo sát lượng dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số thu nhận 32

4.2.3 Khảo sát số lần chiết tách dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol

tổng số 33

4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết tách polyphenol 34

4.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ly trích đến hàm lượng polyphenol 34

4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ FLAVONOID TỔNG SỐ TRONG QUÁ TRÌNH NẢY MẦM GIỐNG LÚA HUYẾT RỒNG 35

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 KẾT LUẬN 37

5.2 KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

Tài liệu tiếng việt 38

Tài liệu tiếng nước ngoài 38

Web 40

PHỤ LỤC 42

PHỤ LỤC 1: HÌNH MẪU THÍ NGHIỆM 42

PHỤ LỤC 2: BẢNG SỐ LIỆU TRUNG BÌNH VÀ KẾT QUẢ THỐNG KÊ 45

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

GABA (Gamma amino butyric acid)

ROS (Reactive oxygen species): gốc hoạt động dạng oxy

RNS (Reactive nitrogen species): gốc hoạt động dạng nitơ

LDL (Low-density Lipoprotein): Lipoprotein tỉ trọng thấp

GSH (Glutathion)

SOD (Superoxid dismutase)

UV- Vis (Ultraviolet Visible Spectrophotometry): Quang phổ tử ngoại – khả kiến

DPPH: 2,2- Diphenyl-1-Picrylhydrazyl

MeOH: Methanol

DMSO: Dimethyl sufoxide

TPC (total phenolic content): Hợp chất phenol tổng số

TFC (total flavonoid content): Hợp chất flavonoid tổng số

GAE (Galic acid equivalents): Tương đương acid gallic

QE (Quercetin equivalents): Tương đương Quercetin

NĐ: Nồng độ

TT: Thể tích

w/v: Tỉ lệ khối lượng mẫu : dung môi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Nguyên nhân hình thành các gốc tự do trong cơ thể 5

Hình 2.2: Tế bào bị gốc tự do phá hủy 9

Hình 2.3: Chất chống oxi hóa có thể trung hòa các gốc tự do 12

Hình 2.4: Hợp chất catechin 13

Hình 2.5: Khung sườn phân tử flavonoid 13

Hình 2.6: Hợp chất quercetin 14

Hình 2.7: Cấu trúc vitamin E 15

Hình 2.8: Cấu trúc vitamin C 15

Hình 3.1: Quy trình chiết các polyphenol trên lúa 25

Hình 3.2 Quy trình phân tích hàm lượng TPC và TFC 28

Hình 4.1 Đường chuẩn acid gallic 30

Hình 4.2: Đường chuẩn quercetin 31

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Giá trị dinh dưỡng cám gạo huyết rồng 3

Bảng 3.1: Xây dựng đường chuẩn acid gallic 23

Bảng 3.2 : Xây dựng đường chuẩn quercetin 24

Bảng 4.1: Độ ẩm, tỉ lệ gạo/lúa 29

Bảng 4.2: Khả năng quét gốc tự do giống lúa huyết rồng 29

Bảng 4.3: Hàm lượng TPC thu nhận với dung môi chiết tách khác nhau 31

Bảng 4.4: Hàm lượng TPC thu nhận với tỉ lệ dung môi chiết tách khác nhau 32

Bảng 4.5 Hàm lượng TPC thu được với số lần chiết tách khác nhau 33

Bảng 4.6: Hàm lượng TPC thu nhận với các nhiệt độ chiết tách khác nhau 34

Bảng 4.7: Hàm lượng TPC thu nhận với các thời gian ly trích khác nhau 34

Bảng 4.8: Điều kiện ly trích tối ưu các hợp chất polyphenol 35

Bảng 4.9: Hàm lượng TPC và TFC theo các giai đoạn nẩy mầm 36

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất oxy hóa còn gọi là các gốc tự do, có thể sinh ra từ các quá trình chuyển hóa trong cơ thể hoặc các tác nhân lý hóa bên ngoài và gây hại cho các tế bào Thông thường, hệ thống các chất chống oxy hoá như vitamin C, E, kẽm, selen…có sẵn trong

cơ thể sẽ trung hòa, vô hiệu hoá các gốc tự do này, giúp “thanh lọc” cơ thể Tuy nhiên, khi các gốc tự do sinh ra quá nhiều và hệ thống chất chống oxy hoá bị suy yếu thì cơ thể sẽ bị nguy hại, gây ra các bệnh nguy hiểm khác như ung thư, xơ vỡ tĩnh mạch, tim mạch, lão hóa và các bệnh nguy hiểm khác Trong trường hợp này, cơ thể cần được bổ sung các chất chống oxy hóa để phòng bệnh, chống lão hoá và tăng cường sức đề kháng để tránh những tổn thương cho tế bào Việc bổ sung chất chống oxi hóa tự nhiên

từ thực vật là rất quan trọng Với nền kinh tế và xã hội phát triển vượt bậc như hiện nay thì người ta bắt đầu chú ý nhiều hơn đến sức khỏe, tuổi thọ và sắc đẹp Đó là lý do chất chống oxy hoá ngày càng được nhắc đến nhiều trong sản xuất và sinh hoạt hằng ngày

Chất chống oxy hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác

Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, chúng có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của các hợp chất phenol tổng số có trong thành phần của cám gạo hoặc hạt gạo nẩy mầm có chứa hàm lượng phenolic tổng số cao hơn rất nhiều so với hạt gạo bình thường [7], [25]

Ở nước ta, giống lúa đỏ Huyết Rồng được sử dụng để ăn kiêng và trị bệnh Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần các chất chống oxy hóa trong loại gạo này hoàn toàn chưa được xác định Vì vậy trong khuôn khổ một luận văn chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Ly trích và khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số trong giống lúa

Huyết Rồng (Oryza sativa)”

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích các hợp chất polyphenol trong gạo đỏ và từ những điều kiện chiết tối ưu tiến hành xác định hàm lượng phenol tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) qua các giai đoạn nẩy mầm

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG LÚA ĐỎ (HUYẾT RỒNG)

2.1.1 Nguồn gốc và thành phần dinh dưỡng

Giống lúa Huyết Rồng còn gọi là lúa đỏ có nguồn gốc truyền thống ở vùng đất ngập mặn được trồng nhiều ở huyện Vĩnh Hưng, Long An và được sử dụng trong dân gian làm thức ăn kiêng Đây là giống lúa mùa 6 tháng, được canh tác một vụ duy nhất trong năm vào mùa mưa, bắt đầu từ tháng 5-6 âm lịch Do có nguồn gốc từ lúa hoang, giống lúa huyết rồng có những đặc điểm nổi bật về sức sống bền bỉ, lấn át cả cỏ dại,…

Vì vậy việc sử dụng phân bón, thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu trong quá trình canh tác được giảm tối đa, đem lại một sản phẩm nông nghiệp sạch, phù hợp với xu thế tiêu dùng hiện nay Giống lúa cho hạt gạo có chất lượng cao, khả năng chống chịu khí hậu

và kháng bệnh tốt

Gạo Huyết Rồng có màu nâu đỏ, bẻ đôi hạt gạo vẫn còn màu đỏ bên trong Đây chính là loại gạo càng ngày càng có nhiều người chọn vì những giá trị dinh dưỡng mà

nó mang lại mặc dù giá thành cao hơn gấp 2-3 lần gạo trắng trên thị trường

Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

Gạo Huyết Rồng giữ lại lớp cám chứa nhiều dưỡng chất quan trọng với hàm lượng cao như : Vitamin E, B1, B3, B6, Mg, Mn, chất xơ, chất sắt,…là nguồn dinh dưỡng tốt cho cả cơ thể và tế bào da

Bảng 2.1: Giá trị dinh dưỡng cám gạo huyết rồng

Thành phần Khối lượng/100g

2.1.2 Vai trò các thành phần trong gạo huyết rồng

Lớp vỏ mỏng của hạt lúa huyết rồng nếu được đem tách cám có tác dụng làm giảm cholesterol Màu đỏ của hạt chứa sắt có tác dụng bổ máu, cần nhiều ở người cao tuổi vốn giảm yêu cầu về đạm nên có xu hướng ít ăn thịt đỏ, đồng thời rất cần cho phụ

nữ mang thai và trẻ em Chính vì giá trị dinh dưỡng cao nên một số nhà máy đã sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại thực phẩm như bột trẻ em, thực phẩm chức năng dành cho người ăn kiêng

Gạo huyết rồng chứa nhiều GABA (Gamma amino butyric acid) là chất cần thiết cho sự dẫn truyền thần kinh trung ương giúp phục hồi trí nhớ ở người mắc bệnh Alzheimer, Parkinson Chất này cũng làm lành khối u ở gan, tổn thương thận ở chuột GABA cũng giúp điều hoà huyết áp, lượng đường trong máu [28]

Các vitamin nhóm B, gamma-oryzanol, protein, các phức hợp carbohydrate, crôm, polysaccharide, hemicellulose, chất béo, chất xơ, các tocopherol, các tocotrienol và các chất chống oxy hóa (polyphenol, flavonoid, ) ở trong gạo đều đóng vai trò quan trọng và tích cực trong việc chuyển hóa glucose trong cơ thể Đặc biệt các nghiên cứu gần đây còn chứng tỏ các hợp chất polyphenol còn có khả năng diệt một số gốc tự do có hại trong cơ thể

Một tập hợp các chất kháng oxy hóa cao và rất giàu các chất dinh dưỡng của lớp cùi gạo đã làm cho gạo trở thành một thực phẩm rất tốt trong việc giải độc hàng ngày

2.2 CHẤT OXY HÓA (GỐC TỰ DO)

2.2.1 Gốc tự do

Gốc tự do là những phân tử hay những mảnh vỡ của phân tử có một điện tích đơn

lẻ ở quỹ đạo vòng ngoài Do sự có mặt của điện tích này mà các gốc tự do có một thuộc tính đặc biệt là có khả năng oxy hóa rất cao Gốc tự do luôn luôn được sinh ra trong cơ thể con người Ví dụ như hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virut bị

tế bào bạch cầu tiêu diệt trong cơ thể, hoặc hiện tượng hô hấp trong tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở gan đều là các hoạt động sinh ra gốc tự do Việc thừa các gốc tự do cũng chính là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh về lão hóa, ung thư và các bệnh liên quan

Gốc tự do là nguyên nhân chính gây ra những nguy hiểm đến sức khỏe của chúng

ta Để kiểm soát tốt nhất sức khỏe và tránh được bệnh tật, chúng ta phải kiểm soát được các gốc tự do để tránh sự tích tụ các gốc tự do trong cơ thể Trong lĩnh vực y khoa hiện nay, vấn đề được đề cập nhiều nhất là tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng các chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khoẻ cho con người

2.2.2 Nguyên nhân hình thành các gốc tự do

Gốc tự do hình thành trong cơ thể sinh vật có thể xuất phát từ chính các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào sinh vật được gọi là gốc tự do nội sinh, gốc tự do được hình thành do các yếu tố bên ngoài như thuốc, chất phóng xạ, ô nhiễm môi trường, hoặc các yếu tố có liên quan được gọi là gốc tự do ngoại sinh [10]

Hình 2.1: Nguyên nhân hình thành các gốc tự do trong cơ thể

2.2.2.1 Gốc tự do nội sinh

Các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể do những chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào, diệt khuẩn trong quá trình thực bào, quá trình tổn thương của các tế bào Chúng ta có thể mô tả quá trình hình thành các gốc tự do Ban đầu oxy nhận một điện

tử tạo ra gốc superoxyde (O2•–), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxyde (O2•–) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2

Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) Bên cạnh đó còn có gốc dạng nitơ hoạt động (RNS: Reactive nitrogen species) RNS được bắt nguồn từ NO thông qua phản ứng với (O2 ●⁻) để hình thành ONOO-, được sinh ra trong quá trình khử tế bào Có thể được mô tả bằng một ví dụ sau:

Chúng ta biết bộ phận chuyển hóa các chất bổ dưỡng và oxy thành năng lượng có tên gọi là ti thể Tại nơi này các chất bổ dưỡng gồm glucose, protein, lipid và oxy được chuyển hóa thành năng lượng hóa học có tên là ATP ATP là năng lượng hóa học duy

nhất mà cơ thể có thể sử dụng cho tất cả các phản ứng sinh hóa trong cơ thể Trong

quá trình chuyển hóa này các chất gốc tự do cũng được sản xuất ra Kết quả là bộ phận chế tạo ra năng lượng là ti thể bị hư hại, và tệ hại hơn nữa là DNA của ti thể cũng bị tổn thương và toàn bộ cơ thể có thể bị suy sụp nếu không có sự tiếp viện của các chất chống oxy hóa thì hậu quả sẽ đưa đến các bệnh lý như bệnh tim mạch, ung thư, phong

tê thấp, lú lẫn, [33]

Các enzym oxy hóa

Nhiều hệ thống enzym có thể tạo ra các gốc tự do bao gồm: xanthin oxidase prostaglandin synthase, NADPH oxidase, nitrit oxide synthase (NOS), lipoxydase, aldehyd oxidase, và amino acid oxidase Enzym myeloperoxidase (MPO) được tạo ra

do sự hoạt hoá bởi bạch cầu trung tính, sử dụng hydrogen peroxid để oxy hóa ion Clthành hợp chất HOCl có khả năng oxy hóa mạnh [19]

, từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ Tuy nhiên, một phần các gốc tự do sẽ thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm Như vậy trong các hội chứng viêm đã hình thành các gốc tự do dưới xúc tác của enzym NADPH oxidase [19]

Ion kim loại chuyển tiếp

Sắt và đồng đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra gốc tự do gây tổn thương cho tế bào và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình peroxid lipid Các ion kim loại chuyển tiếp tham gia trong phản ứng Haber-Weiss tạo ra OH● từ O2 ● -

và H2O2 (phản ứng 1.2 và 1.3) Phản ứng này làm tăng thêm sự oxy hóa những phân tử không phải là enzym như epinephrin và glutathion hình thành O2 ●⁻ và H2O2 từ OH●

2.2.2.2 Gốc tự do ngoại sinh

Thuốc

Nhiều loại thuốc chữa bệnh có thể tạo ra nhiều gốc tự do khi có sự hiện diện của oxy Những loại thuốc này gồm có kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung thư như bleomycin, anthracyclin (adriamycin) và loại thuốc cản trở sự phát triển tế bào có hoạt động của chất tiền oxy hóa Những gốc là dẫn xuất của penicillamin, phenylbutazon, acid fenamic và aminosalicylat, hợp chất của sulphasalazin có thể ức chế protease, làm giảm acid ascorbic và làm tăng nhanh sự peroxide hóa lipid [21]

Sự bức xạ

Xạ trị làm tổn thương mô mà nguyên nhân là do các gốc tự do Bức xạ điện từ (tia X, tia gamma) và những bức xạ hạt (electron, photon, neutron, alpha và hạt beta) tạo ra những gốc tự do nguyên thủy bằng việc chuyển năng lượng của chúng cho thành phần của tế bào như nước Những gốc này có thể phản ứng với oxy hòa tan trong dịch

tế bào để hình thành ROS

Khói thuốc

Những chất oxy hóa trong khói thuốc đóng vai trò chính gây tổn thương đường

hô hấp Những chất này làm giảm các chất chống oxy hóa trong tế bào phổi in vivo bởi

cơ chế liên quan đến stress oxy hóa Khói thuốc có một lượng lớn những chất như aldehyd, epoxid, peroxid và những gốc oxy hóa khác mà chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công phế nang Bên cạnh đó khói thuốc chứa các gốc tự do bền trong nhựa thuốc như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và hydroquinon Sự xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở

mô phổi của những người hút thuốc Sắt trong thể này phản ứng với hydrogen peroxide hình thành gốc hydroxyl gây nguy hiểm cho tế bào Những người hút thuốc

có số lượng bạch cầu trung tính cao hơn do đó góp phần nâng cao nồng độ của gốc tự

do [18]

Những phân tử vô cơ

Việc hít vào những phân tử vô cơ như bụi (amiăng, thạch anh, silical) có thể dẫn đến tổn thương phổi mà nguyên nhân gián tiếp có thể là gốc tự do Việc hít các hạt amiăng gắn liền với nguy cơ tăng chứng xơ hóa phổi, u trung biểu mô, và ung thư biểu

mô (do hít không khí ô nhiễm vào phổi) Những hạt silical cũng như hạt amiăng bị thực bào bởi các đại thực bào phổi Những tế bào này sau đó bị vỡ ra giải phóng protease và những hợp chất trung gian khác khởi phát quá trình viêm dẫn đến việc tăng các gốc tự do và ROS Hơn nữa các sợi amiăng có sắt và sắt có thể kích thích hình thành gốc tự do là hydroxyl

Những nguyên nhân khác

Do các yếu tố bên ngoài tác động như ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine, thuốc trừ sâu, dung môi hữu cơ, chất gây mê, khói và nhóm hydrocacbon thơm và ngay cả oxi cũng là nguyên nhân tạo ra các gốc tự do nguy hiểm cho tế bào

2.2.3 Vai trò của các gốc tự do

2.2.3.1 Gốc tự do có lợi đối với cơ thể

Ở nồng độ thấp hoặc trung bình, ROS và RNS cần thiết cho quá trình trưởng thành của cấu trúc tế bào và có thể được xem như một loại “vũ khí” nhằm bảo vệ cơ thể Thực bào (bạch cầu trung tính, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân) giải phóng các gốc tự do để tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập gây bệnh như là một cách để bảo vệ cơ thể chống lại bệnh Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, giúp cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt dễ dàng [26]

Ví dụ: Quá trình khử oxygen tạo thành nước trong quá trình hô hấp:

Tương tự như chất chống oxy hóa, một số gốc tự do ở mức thấp được tín hiệu phân tử, tức là nó có trách nhiệm để bật và tắt gen Một số các gốc tự do chẳng hạn như oxit nitric và superoxide được sản xuất với số lượng rất cao bởi các tế bào miễn dịch virus và vi khuẩn độc Một số các gốc tự do tiêu diệt các tế bào ung thư Nhiều loại thuốc ung thư thực sự được thiết kế để tăng sản xuất các gốc tự do trong cơ thể

2.2.3.2 Gốc tự do có hại cho cơ thể

Bên cạnh những mặc có lợi, gốc tự do còn có tác dụng không tốt đối với cơ thể, liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên [22]

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí, rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được [12]

Các gốc tự do phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da và hậu quả

là những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc Kích hoạt gen sinh ung thư Ức chế hệ miễn dịch cơ thể gây bất hoạt hàng rào phòng thủ bảo vệ cơ thể Kích hoạt các chất sinh ung hoặc

tiền sinh ung, khởi động những phản ứng hóa học có thể gây ung thư Làm tổn thương

màng tế bào và bất hoạt cơ chế nhận diện của cơ thể chống lại sự hình thành và phát triển của các tế bào bất thường [32]

Hình 2.2: Tế bào bị gốc tự do phá hủy

Trong tiến trình lão hóa, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác

sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự lão hoá và

sự chết của các sinh vật Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Quá trình peroxid hóa lipid

Sự oxy hóa được biết đến nhiều nhất là ảnh hưởng của các gốc tự do

và ROS đến sự peroxid hóa lipid Màng tế bào giàu acid béo chưa bão hòa nên dễ bị tấn công bởi tác nhân oxy hóa, quá trình này gọi là sự peroxid hóa lipid Đây là tiến trình mà các gốc tự do lấy điện tử từ lipid trong màng tế bào và nó đặc biệt nguy hiểm

do tiến trình này là một phản ứng dây chuyền

Quá trình này kết thúc khi 2 gốc

tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc tác dụng với chất chống oxy hóa như vitamin E để tạo thành sản phẩm lipid alcohol và gốc tocopherol Quá trình peroxyd hóa màng tế bào còn xảy ra khi cơ thể thiếu oxy, chuỗi hô hấp tế bào không tạo thành ATP để bơm Ca2+ ra ngoài màng tế bào Khi nồng độ Ca2+ trong tế bào tăng

sẽ hoạt hóa các protease, protease sẽ hoạt hóa xanthin oxidase làm tăng nhanh các gốc

tự do phá huỷ màng tế bào [34]

Việc làm hư hại lipid thường được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp làm ảnh hưởng đến tính linh động của màng dẫn đến một số bệnh như đái tháo đường, bệnh trên hệ tim mạch

Làm hư hỏng protein [15]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy protein là phần chính của tế bào bị gốc tự do hydroxyl tấn công Kết quả của sự tấn công này là tạo thành sản phẩm hydroperoxid trên protein:

PrOO•+ PrH → PrOOH + Pr• (1.12)

So với các ROS thì protein bị peroxid hóa có thời gian tồn tại dài hơn do đó chúng có thể khuyếch tán trong tế bào và mô vì thế chúng có thể phản ứng với các phân tử protein khác và khơi mào cho phản ứng dây chuyền (phản ứng 1.11) Protein hydroperoxid có thể khơi mào cho nhiều phản ứng nguy hiểm cho tế bào như oxy hóa lipid, phản ứng với methionin, bất hoạt glutathion reductase và liên kết chéo với ADN Các protein bị hư hại bởi gốc tự do dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể Ví dụ, sự hư hại các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các enzym (bản chất là protein) khi bị tổn hại sẽ không hoạt động hiệu quả để xúc tác các phản ứng sinh hóa trong cơ thể Các enzym sẽ không được sửa chữa phục hồi vì nồng

độ các gốc tự do cao, tình trạng này dần dần làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể tạo ung thư

Sự phá hủy ADN

Các gốc tự do dễ dàng tấn công ADN thông qua việc tấn công vào nhóm đường deoxyribose và base nitơ của nhóm purin và pirimidin hình thành thể đột biến Sản phẩm của đột biến gen do gốc tự do gây ra được tìm thấy nhiều trong mô ung thư Như vậy, gốc tự do ảnh hưởng đến đoạn ADN ở vị trí đặc biệt nào đó hoặc đến một đoạn gen làm cho gen đó thoát khỏi hệ thống sửa chữa trước khi sự sao chép xuất hiện dẫn đến đột biến gen Đồng thời, các tổn thương do gốc tự do gây ra cũng làm cho ADN sao mã không chính xác làm cho tế bào ung thư được hình thành hoặc làm kiệt quệ năng lượng của tế bào dẫn đến hoại tử mô [23]

2.3 CHẤT CHỐNG OXY HÓA

2.3.1 Chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển

sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá

hủy tế bào sinh vật Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi

các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng

Chất chống oxy hóa hệ thống phòng thủ nhằm loại bỏ các gốc tự do, và giảm

thiểu việc hình thành chúng Bản chất của chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Do đó, hệ thống các chất chống

oxi hóa tồn tại để đối phó với phân tử đã bị hư hỏng nhằm mục đích bảo vệ sức khỏe cho con người

Hình 2.3: Chất chống oxi hóa có thể trung hòa các gốc tự do

Khi còn trẻ các chất chống oxy hóa được sản xuất nhiều và rất mạnh, đủ để trung hoà, trừ khử các chất gốc tự do Nhưng sau tuổi 40 thì cơ thể con người sản xuất ra không đủ lượng chất chống oxy hóa để đối phó với các gốc tự do Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng

Ngoài ra, các chất chống oxy hóa còn có thể tạo hợp chất vòng càng cua với ion kim loại như Fe3+,Cu2+, Ni2+, Mn2+, các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa

Hệ thống các chất chống oxy hóa này gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid dismutase đặc biệt là vitamin C, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A), khoáng chất selen "nội sinh" có sẵn trong cơ thể, xúc tác các phản ứng khử

để vô hiệu hoá gốc tự do giúp cơ thể khoẻ mạnh [35]

2.3.2 Một số chất chống oxy hóa thường gặp

2.3.2.1 Chất chống oxy hóa không có bản chất enzym

Chất chống oxy hóa không có bản chất enzym là những hợp chất do cơ thể sinh

ra hoặc các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật gồm có các nhóm vitamin C, vitamin E, polyphenol, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpen, carotenoid…

Hợp chất phenol tổng số hay polyphenol (TPC) [36]

Polyphenol là hợp chất có tính chống oxi hóa rất cao, thông qua sự ức chế các gốc tự do Thuật ngữ "phenolic" hoặc "polyphenol" có thể được xác định chính xác thành phần hóa học là một chất mà trong thành phần hóa học có mang một vòng thơm (phenol) hoặc nhiều hơn (polyphenol) nhóm hydroxyl Dựa vào đặc điểm này người ta chia làm ba loại:

Nhóm các hợp chất phenol từ C6 – C1: phenol

Nhóm các hợp chất phenol từ C6 – C3: acid cafeic

Nhóm các hợp chất phenol từ C6 – C3 – C6 : Catechin, flavonoid

Với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với gốc tự do

đó tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng có thể tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do

O

OH

OH OH

HO

OH Hình 2.4: Hợp chất catechin

Các polyphenol được chú ý đến do đặc tính oxi hóa của chúng Chúng có khả năng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thường chứa trong ti thể Polyphenol có khả năng tạo phức bền với kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc tác các kim loại này Đồng thời các hợp chất polyphenol còn có khả năng nhận các gốc tự do và từ đó làm dập tắt các quá trình tạo ra các gốc tự do

Theo một số nghiên cứu hiện nay thì các hợp chất polyphenol có khả năng bảo vệ

cơ thể chống lại căn bệnh ung thư và bệnh tim, và một số các bệnh liên quan do sự thừa một lượng lớn các gốc tự do, là do chúng có mặt khắp nơi trong một loạt các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật được dùng rất phổ biến hiện nay

O

O

Hình 2.5: Khung sườn phân tử flavonoid

Do có cấu trúc gần giống với α- tocopherol nên chúng có thể thay thế cho nhau trong một số hệ thống Bên cạnh tính chống oxy hóa, chúng còn có khả năng ức chế một số enzym Nhiều loại enzym trong số này là các enzym oxy hóa khử như cyclooxygenase, lipoxygenase, và NADPH oxydase Flavonoid còn có khả năng chống ung thư một cách hiệu quả mặc dù cơ chế chính xác của tác động này vẫn chưa được hiểu rõ Mỗi flavonoid đều có những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ nhau Quercetin là một flavonoid phổ biến nhất, nó là xương sống cho nhiều loại flavonoid khác như rutin, quercitrin Những dẫn xuất này khác nhau bởi phần nhánh gắn vào khung quercetin [38]

O

O

OH OH

OH OH

HO

Hình 2.6: Hợp chất quercetin

Ở cấp độ tế bào, một trong những đặc tính hữu ích nhất của flavonoid –trung hòa các gốc tự do – là nhờ vào cấu trúc hóa học cũng như sự liên kết chặt chẽ của nó với màng tế bào, flavonoid bảo vệ LDL chống lại sự oxy hóa ở giai đoạn khởi đầu của sự peroxyd hóa lipid Nhờ vậy mà flavonoid có thể bảo vệ tế bào chống lại các tổn thương do các gốc tự do một cách rất hiệu quả

Như vậy, khả năng chống oxy hóa của flavonoid là do:

Trung hòa các gốc tự do và làm chậm đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxid hóa lipid

Tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp do đó ngăn chặn sự peroxid hóa lipid

Ức chế việc tạo ra các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzym như xanthin oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase…

Cơ chế phản ứng với gốc tự do:

Các A• được tạo thành ở (1.17) (1.18) khác các gốc tự do RO2• và RO• vì chúng không có khả năng lấy H+ từ các acid béo không no hay các hợp chất khác trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục quá trình oxy hóa Các sản phẩm tạo ra (1.19) (1.20) là những sản phẩm bền và kết quả là chuỗi phản ứng của gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn

H và R2, 3 được thay thế nhóm metyl

Vitamin E có khả năng ngăn sự oxy hóa cholesterol dạng LDL và các chất mỡ khác, nâng cao tính miễn dịch, vitamin E chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường 1 hydro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxyl (LOO•) để biến gốc tự do này thành hydroperoxyd không gây phản ứng (LOOH) Phản ứng như sau:

LOO• + Tocopherol-OH —› LOOH + Tocopherol-O•

Trong quá trình phản ứng, tocopherol (tocopherol-OH) bị chuyển hóa thành gốc tocopheryl (tocopherol-O•) bền do đó chấm dứt những phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc Vitamin E có nhiều trong rau xanh, các loại hạt có dầu, hoa quả và mầm ngũ cốc như mầm luá mạch, ngô đậu Đặc biệt vitamin E cũng có trong các sản phẩm từ động vật như gan, lòng đỏ trứng, bơ với hàm lượng khá cao

Vitamin C (Acid ascorbic)

HO

H HO

Hình 2.8: Cấu trúc vitamin C

Acid ascorbic có trong tất cả tế bào sống của động, thực vật Nó có nhiều trong hoa quả tươi như cam chanh, quýt, trong quả dâu, quả dưa hấu, các loại rau xanh như bắp cải, xà lách, rau muống, Trong thức ăn có nguồn gốc động vật hàm lượng acid ascorbic thấp và có nhiều nhất ở gan thận

Acid ascorbic bị oxy hóa cho acid dehydroascorbic giúp dạ dày dễ hấp thu sắt do khử Fe3+ thành Fe2+ và sau đó dễ dàng hấp thụ ở ruột [1]

Fe3+ + ascorbic → Fe2+ + dehydroascorbic

Bên cạnh đó, vitamin C hoạt động như một chất chống oxy hóa trong môi trường nước của cơ thể – cả nội bào lẫn ngoại bào Vitamin C cũng hoạt động cùng với các enzym chống oxy hóa khác như GSH-Px, catalase và SOD Ngòai ra, vitamin C có thể phục hồi và tái tạo vitamin E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể, nên nó tăng cường hiệu lực chống oxy hóa của vitamin E:

Gốc tocopherol (TO•)+ Vitamin C (AscH -)

→ tocopherol (TOH) + gốc ascorbyl (Asc•-) Các tổn thương oxy hóa cholesterol dạng LDL đóng vai trò trung tâm trong sự hình thành xơ vữa động mạch Vitamin C ngăn chặn hữu hiệu sự oxy hóa LDL ngay cả đối với người hút thuốc lá, giúp tạo thành collagen ở da, tu sửa mô trong cơ thể và tham gia trong một số phản ứng oxy hoá khử Các chỉ định khác như phòng cúm, chóng liền vết thương, phòng ung thư

Glutathion

Glutathion (GSH) là một chất chống oxy hóa nội sinh phổ biến có phân tử lượng thấp GSH là một tripeptid gồm các acid amin như acid L-γ-glutamic, L-cystein và L-glycin Hoạt tính chống oxy hóa của GSH được thể hiện theo 2 cách:

GSH có hydrogen linh động nên có thể khử các gốc tự do bằng cách cho hydrogen cho các gốc tự do Gốc tự do GS• mới hình thành sẽ dimer hóa tạo thành hợp chất GSSG bền vững:

GSH đóng vai trò là chất cho điện tử trong các phản ứng được xúc tác bởi enzyme GSH peroxidase và GSH-Px nhằm phân hủy các hợp chất peroxid hữu cơ và

vô cơ độc hại

GSH rất quan trọng trong việc chống oxy hóa ở não, đây là bộ phận của cơ thể có các chất chống oxy hóa như SOD, catalase và GSH-Px ở nồng độ rất thấp Sự bất thường của GSH trong não là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh Parkinson Ngoài ra, GSH còn phản ứng với NO trong não tạo S–nitrosoglutathion làm giảm tác hại của NO lên tế bào thần kinh [29]

2.3.2.2 Chất chống oxy hóa có bản chất enzym

Đây là hệ thống chống oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sống Tế bào sống luôn bị tổn hại bởi các gốc tự do sinh ra trong các quá trình sinh lý như quá trình hô hấp và các quá trình bệnh lý Vì vậy, một hệ thống chống oxy hóa nội sinh để bảo vệ tế bào là điều cần thiết Hệ thống

đó bao gồm các enzym như sau:

Superoxid dismutase

Superoxid dismutase (SOD) hiện diện ở hai vị trí trong tế bào, SOD hiện diện trong ti thể có cofactor là mangan (Mn – SOD), SOD hiện diện trong bào tương có 17 cofactor là đồng và kẽm (Cu, Zn – SOD) SOD ở trong dịch tế bào chỉ có đồng tham gia vào quá trình xúc tác, kẽm chỉ tham gia vào sự ổn định enzyme SOD có nồng độ cao nhất ở gan, thận và hồng cầu, xúc tác superoxid thành H2O2 [17]

Hydrogen peroxid được tạo thành là chất nguy hiểm trong tế bào vì nó có thể chuyển thành gốc hydroxyl (trong phản ứng Haber – Weiss) là một trong những gốc nguy hiểm nhất cho tế bào

Glutathion peroxydase (GSH-Px)

Enzym phân hủy H2O2 ở các tế bào của động vật có vú chủ yếu là GSH-Px Glutathion (GSH) là cofactor của enzym GSH-Px Ngoài ra trong trung tâm hoạt động của nó có chứa selen, vì thế enzym này là một nhân tố chống oxy hóa mạnh gặp chủ yếu trong bào tương, nó ngăn cản việc hình thành các gốc tự do tạo thành trong các quá trình tổng hợp diễn ra trong cơ thể, xúc tác sự khử hóa H2O2, các hydro peroxid và peroxid hữu cơ

GSH: Glutathion dạng khử

GSSG (glutathiondisulfide): Glutathion dạng oxy hóa

Dạng oxy hóa phục hồi nhờ glutathion reductase (GR)

GSH-Px hoạt động khi H2O2 ở nồng độ thấp, khi H2O2 ở nồng độ cao catalase sẽ hoạt động Khi H2O2 còn lại rất ít, catalase không còn tác dụng thì GSH-Px được hoạt hóa và xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 Điều này rất quan trọng vì phản ứng với GSH-Px đòi hỏi phải có cơ chất là GSH, còn phản ứng với catalase thì không cần GSH, vì thế tiết kiệm được glutathione cho cơ thể [30]

2.4 MỐT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

2.4.1 Phenol tổng số

Đo màu UV- Vis: Bằng cách sử dụng phương pháp Folin-Ciocalteu Đo độ hấp

phụ của mẫu ở bước sóng 765 nm Sử dụng acid gallic như một tiêu chuẩn để xác định hàm lượng

Phương pháp phân tích HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao): Với pha động là dung

dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong phân tích) [16]

2.4.2 Hợp chất flavononid

Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc flavonol và dịch

chất ít tạp chất

Đo màu UV-Vis: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo

phức màu với AlCl3, muối titan…

VD: Tạo phức màu với AlCl3

Phương pháp: Tiến hành ly trích các hợp chất flavonoid bằng kỹ thuật phù hợp

Sau đó dùng thuốc thử AlCl3 trong methanol để tiến hành định lượng

Nguyên tắc: các hợp chất flavonoid có thể tạo phức màu với cation Al3+ Dung dịch có màu vàng nhạt hấp thụ ở bước sóng 415 nm

Phương pháp phân tích HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao): Với pha động là dung

dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong phân tích)

2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT CHỐNG OXY HÓA

Các nghiên cứu về hợp chất chống oxy hóa ngày càng đa dạng trên các đối tượng khác nhau như trà xanh, cám gạo, thực phẩm lên men từ đậu nành hoặc từ hạt ngũ cốc nẩy mầm Chúng được chiết xuất thành các dạng khác nhau như cao chiết hoặc dạng dung dịch được sử dụng rộng rãi bổ sung vào sản phẩm đồ uống, các loại thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc nhằm đáp ứng nhu cầu sức khỏe cho con người trong thời đại nền kinh tế phát triển

2.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

Một số công trình nghiên cứu về loại hợp chất polyphenol đặc biệt trong lá trà, cây rau má, lá sakê trong các trường đại học và các nhà máy sản xuất [3], [5]

Viện nghiên cứu khoa học Việt Nam cũng đã có những công trình nghiên cứu về polyphenol ứng dụng trong công nghệ hóa dầu

Một số các sinh viên của trường đại học kỹ thuật Công nghệ TP.HCM cũng tiến hành khảo sát hàm lượng polyphenol trên lá xakê cũng như những yếu tố ảnh hưởng kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol cao hơn cả hàm lượng khi chiết với lá trà tươi

Năm 2005, viện Công nghệ thực phẩm TP Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài cấp bộ: “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol từ trà xanh Việt Nam” Đề tài đã được nghiệm thu và đạt kết quả xuất sắc

Nguyễn Ngọc Hồng và các cộng sự (2010) nghiên cứu tác dụng của cao chiết Râu mèo chống lại sự gây độc trên tế bào gan [2]

2.5.2 Các công trình nghiên cứu ở nước ngoài

Công trình nghiên cứu của Rao và cộng sự đã tiến hành khảo sát hàm lượng chất chống oxy hóa trong thành phần cám gạo Njavara có nguồn gốc từ Ấn Độ với hàm

lượng các chất chống oxy hóa khá cao như polyphenol (3,2- 12,4 mg GAE/g), flavonoid (1,68-8,5 mg QE/g) [25]

Năm 2011, Shao Yafang, và các cộng sự đã tiến hành định lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của các hạt gạo có kích thước cực kì nhỏ và kết quả là các hạt gạo có kích thước nhỏ thường có hàm lượng polyphenol cao, flavonoid và khả năng chống oxy hóa hơn hạt có kích thước bình thường hay lớn [27]

Năm 2010, Umarat Srisawat và các cộng sự đã tiến hành xác định các hợp chất phenolic, flavonoids và các hoạt chất chống oxy hóa khác trong dịch chiết xuất từ gạo thái hồng và gạo trắng bằng cách hòa tan bột gạo trong nước, đun nóng ở 60-75 °C khoảng 15-30 phút Sau đó, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc, tiến hành pha mẫu đo quang phổ và xác định hàm lượng Kết quả cho thấy rằng hàm lượng polyphenol và flavonoid của gạo có chứa sắc tố màu sẽ cao hơn so với giống gạo trắng [31]

Otilia Bobis và các cộng sự cũng tiến hành khảo sát các chất chống oxy hóa có trong mật ong với hàm lượng polyphenol là khá cao khoảng 116,45 mg GAE/100g mật ong Một số nghiên cứu khảo sát hàm lượng flavonoid tổng số và chất chống oxy hóa

có chứa trong một số thực vật nhiệt đới như bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ, cà rốt, rau dền đỏ,

củ cải trắng, cỏ tranh và nghệ bằng phương pháp ngâm dầm Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng flavonoid tổng số đã được khảo sát cao nhất trong ớt đỏ (0,939 mg/g)

và thấp nhất đã được quan sát thấy trong rau dền đỏ (0,066 mg/g) Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) xác định hàm lượng 5 thành phần quan trọng thuộc nhóm flavonoid là quercetin, catechin, kaempferol, apigenin và rutin Kết quả cho thấy một tiềm năng của các hợp chất flavonoid và chất chống oxy hóa trong ớt đỏ, nguồn

bổ sung nhiên liệu cho các nhà máy.[9], [6]

Fahad A.J.và cộng sự tiến hành định lượng polyphenol chứa trong lá và thân của

ba loại rau mùi, rau mùi tây và bạc hà được trồng ở Ả Rập bằng phương pháp đo quang phổ Các chất chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của ba loại thảo mộc này được đánh giá đều chứa nhóm phenolic và chất chống oxy hóa cao Lá bạc hà cho thấy hàm lượng phenol tổng số là cao nhất Tuy nhiên, hàm lượng phenol tổng số chiết xuất

từ lá cây rau mùi, bạc hà và ngò tây đều cao hơn so với những loài thực vật có cùng

họ Bên cạnh đó nghiên cứu cho thấy các loại thảo mộc được trồng ở Ả Rập là nguồn cung cấp các hợp chất phenolic tổng số cao cho các nhà máy [13]

Vì vậy, việc bổ sung các chất chống oxy hóa từ thực vật là vô cùng có lợi, những nghiên cứu trên góp phần chứng minh hầu hết các loài thực vật đều có chứa một lượng các chất chống oxi hóa có lợi cho cơ thể Đây sẽ là những nguồn nguyên liệu dồi dào cho các nhà máy trong tương lai

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 PHƯƠNG TIỆN

Phương tiện

Thời gian và địa điểm tiến hành:

- Phòng sinh hóa – khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng

- Muối natri cacbonat (Na2CO3), muối Nhôm (III) clorua (AlCl3), nước cất

- Dimethyl sulphoxide (DMSO)

- Acid galic, quercetin

- Methanol, etanol, acetone, hexan

Nguyên tắc: Sử dụng sức nóng để làm nước bốc hơi khỏi nguyên liệu Sự chênh

lệch về khối lượng mẫu trước và sau khi sấy chính là khối lượng nước có trong mẫu nguyên liệu