Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

LỜI CẢM ƠN   Để hoàn thành đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ Quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc kí lỏng ghép khối phổ, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học hỏi

Giáo viên hướng dẫn:

TS Nguyễn Thị Thu Thủy

Th.S Lê Bảo Ngọc

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959

Lớp: Sư phạm Hóa học K35

Cần Thơ, 2012

LỜI CẢM ƠN   

Để hoàn thành đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ Quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc kí lỏng ghép khối phổ, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích, thiết thực từ quý thầy

cô và bạn bè Với tấm lòng trân trọng và biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

 Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học – Khoa Sư Phạm đã trực tiếp hướng dẫn tôi Cô đã tận tình giúp đỡ, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp

 Cô Lê Bảo Ngọc – Giám Đốc Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM chi nhánh Cần Thơ đã giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để tôi hoàn thành đề tài

 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM chi nhánh Cần Thơ, đặc biệt là các anh trong tổ Sắc Ký đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ những kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện phân tích mẫu

 Tập thể các thầy cô Bộ môn Hóa - Khoa Sư Phạm đã truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm giảng dạy quý báu trong suốt bốn năm qua

 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tập thể các bạn lớp Sư phạm hóa khóa 35 đã luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẻ những khó khăn, vất vả trong suốt thời gian qua

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Lâm Thùy Dương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

Th.s Lê Bảo Ngọc

2 Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959

Lớp Sư phạm Hóa học K35

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN: - Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

- Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” 3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959 Lớp Sư phạm Hóa học K35 4 Nội dung nhận xét: a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN: - Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

- Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013

Cán bộ phản biện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I MỤC LỤC V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT X DANH MỤC HÌNH XI DANH MỤC BẢNG XII TÓM TẮT NỘI DUNG……… XIII

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

II MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 1

III GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI 2

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

V CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 2

PHẦN II: NỘI DUNG 3

A CƠ SỞ LÍ THUYẾT……… 3

I GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH[3],[4],[11] 3

1 Định nghĩa 3

2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm 3

3 Cơ chế tác động của chất kháng sinh 3

4 Phân loại chất kháng sinh 4

II GIỚI THIỆU VỀ QUINOLONE[3],[4],[7],[8],[10],[11],[12] 4

1 Khái quát 4

2 Phân loại Quinolone 5

3 Công thức cấu tạo 5

4 Tính chất acid - base nhóm quinolone: 5

III CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN[3],[4],[6],[12],[14] 6

1 Ciprofloxacin: 6

2 Enrofloxacin: 7

3 Tác dụng điều trị của Enrofloxacin và Ciprofloxacin 8

3.1 Ciprofloxacin 8

3.2 Enrofloxacin 8

4 Tác hại và liều lượng cho phép của Enrofloxacin, Ciprofloxacin 8

IV SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO[2],[3],[4],[5],[13] 10

1 Khái niệm 10

2 Phân loại 10

2.1 Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC) 10

2.2 Sắc ký hấp phụ 10

2.3 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC) 10

2.4 Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC) 10

3 Ưu nhược điểm của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 10

4 Các đại lượng đặc trưng của sắc kí lỏng hiệu năng cao 11

4.1 Thời gian lưu 11

4.2 Hệ số phân bố 11

4.3 Hệ số dung lượng 12

4.4 Hiệu năng 12

4.5 Độ chọn lọc α 13

4.6 Số đĩa lí thuyết (N) và chiều cao (H) của đĩa lí thuyết trong cột sắc ký 13

4.7 Độ phân giải (Rs) 13

5 Các bộ phận của máy sắc kí lỏng hiệu năng cao 14

5.1 Bình chứa dung môi giải ly cột 14

5.2 Bộ khử khí (Degasse ) 16

5.3 Bơm cao áp 16

5.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 16

5.5 Cột sắc ký 17

5.5.1 Khái niệm 17

5.5.2 Phân loại 17

5.6 Đầu dò 17

5.7 Bộ phận ghi nhận tín hiệu 18

5.8 In dữ liệu 18

6 Giới thiệu về đầu dò khối phổ – đầu dò MS ba tứ cực 18

6.1 Bộ tạo ion 19

6.2 Bộ tách khối 19

6.3 Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực 21

6.4 Bộ dò ion (detector) 22

V MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỌ QUINOLONE[3],[4],[6],[8],[10] 22

1 Phương pháp trắc quang 22

2 Phương pháp Elisa 23

2.1 Giới thiệu chung 23

2.2 Nguyên liệu 23

2.3 Hướng dẫn an toàn 23

2.4 Bảo quản và lưu trữ 24

2.5 Nguyên tắc thử 24

2.6 Kết quả 24

3 Phương pháp điện hóa 25

4 Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD 25

5 Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang 25

6 Phương pháp HPLC – đầu dò MS 26

7 Phương pháp xác định dư lượng enrofloxacin, ciprofloxacin trong thịt gà, cá tra bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) 26

7.1 Nguyên tắc 26

7.2 Thiết bị – hóa chất 26

7.3 Qui trình xử lí mẫu 28

7.4 Điều kiện phân tích bằng LCMS 28

7.5 Dung dịch chuẩn 29

7.6 Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của enrofloxacin và ciprofloxacin 29

7.7 Xác định hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp trên mẫu thực tế như cá diêu hồng, cá basa, thịt gà 29

B THỰC NGHIỆM 31

I XÂY DỰNG CÁC YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM 31

1 Nguyên tắc 31

2 Dụng cụ và thiết bị 31

3 Hóa chất 31

4 Cách tiến hành 32

4.1 Yêu cầu chung 32

4.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 32

4.2.1 Chuẩn dung dịch gốc Co (100ppm): 32

4.2.2 Chuẩn trung gian 32

4.2.3 Chuẩn làm việc: 32

4.3 Chọn lọc các yếu tố phân tích bằng LC-MS 33

4.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 33

4.3.2 Khảo sát độ lặp lại 36

4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 39

4.3.4 Khảo sát độ đúng 40

4.3.5 Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp 41

4.4 Thu mua mẫu 41

4.5 Tiến hành phân tích mẫu 41

II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

1 Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin 42

2 Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Ciprofloxacin 43

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

I KẾT LUẬN 45

II KIẾN NGHỊ 45

PHỤ LỤC 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High performance liquid chromatography

LC Liquid chromatography

GC Gas chromatography

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

ppm Parts per million

ppb Parts per billion

MS Mass spectroscopy

UV Ultraviolet

UV-VIS Ultraviolet- Visible

MLOD Method limit of detection

MRM Multiple reaction monitoring

Rpm Revolutions per minute

RSD Relative standard deviation

ESI Electrospray ionization

APCI Atmospheric pressure chemical ionization

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone 5

Hình 2 Cân bằng acid base của nhóm acidic quinolone 6

Hình 3 Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolone 6

Hình 4 Công thức cấu tạo của ciprofloxacin 7

Hình 5 Công thức cấu tạo của enrofloxacin 7

Hình 6 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 11

Hình 7 Sơ đồ hệ thống HPLC 14

Hình 8 Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent 20

Hình 9 Sự phân mảnh diễn ra ở Q2 20

Hình 10 Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực 21

Hình 11 Phức tạo thành giữa Fe(III) với ciprofloxacin (λmax =430nm) 22

Hình 12 Đường chuẩn enrofloxacin 34

Hình 13 Đường chuẩn của ciprofloxacin 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Một số dung môi và tính chất của chúng 15

Bảng 2 Tóm tắt cách xác định một số quinolone bằng phương pháp điện hóa 25

Bảng 3 Kết quả dựng đường chuẩn của enrofloxacin 33

Bảng 4 Kết quả dựng đường chuẩn của ciprofloxacin 34

Bảng 5 Chương trình gradient 37

Bảng 6 Điều kiện MS 38

Bảng 7 Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn enrofloxacin 38

Bảng 8 Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn ciprofloxacin 39

Bảng 9 Kết quả khảo sát độ đúng đối với enrofloxacin 40

Bảng 10 Kết quả khảo sát độ đúng đối với ciprofloxacin 40

Bảng 11 Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp 41

Bảng 12 Số liệu thu mua mẫu 41

Bảng 13 Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin 42

Bảng 14 Những mẫu bị phát hiện dư lượng Enrofloxacin 42

Bảng 15 Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh ciprofloxacin 43

Bảng 16 Những mẫu bị phát hiện nhiễm ciprofloxacin 43

TÓM TẮT NỘI DUNG

Sử dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản để đề phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, giúp sản lượng và chất lượng của các mặt hàng thủy sản ngày càng được nâng cao Tuy nhiên, những hậu quả do nó gây cũng không ít Trong những năm gần đây, do việc lạm dụng chất kháng sinh mà một số lô hàng của Việt Nam xuất khẩu sang thị trường Nhật Bản, Mĩ bị trả về do phát hiện có dư lượng các chất kháng sinh vượt quá giới hạn cho phép, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng Vấn đề nghiên cứu và áp dụng các phương pháp tiên tiến để phân tích xác định, đánh giá dư lượng kháng sinh sao cho vừa hiệu quả vừa phù hợp với điều kiện thực tế ở nước ta là rất cần thiết

Đề tài “ KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH HỌ QUINOLONE

TRONG TÔM CÁ BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS-MS”

được thực hiện với mục đích đánh giá được tình hình dư lượng chất kháng sinh họ Quinolone ở các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ, giúp cho người dân cảnh giác hơn đối với việc sử dụng các sản phẩm từ tôm, cá, đồng thời kết quả thu được sẽ là thông tin

bổ ích đến người nuôi trồng thủy sản giúp họ sử dụng hợp lí các chất kháng sinh trong quá trình nuôi, giảm thiệt hại cho các doanh nghiệp xuất khẩu thủy sản Do thời gian và điều kiện có giới hạn nên đề chỉ mới khảo sát được 2 chất kháng sinh thuộc họ quinolone

là enrofloxacin và ciprofloxacin Nội dung thực hiện:

 Bước 1: Thu mua mẫu ở một số chợ trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ

 Bước 2: Xử lý mẫu: mẫu sau khi đồng nhất được tách chiết bằng dung môi HCOOH/acetonitril, thổi khô và cô cạn bằng MeOH/H2O 1:1

 Bước 3: Tiến hành phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS-MS

Sau khi tiến hành thu mua và phân tích 48 mẫu tôm, cá được bán trên địa bàn thành phố Cần Thơ đã thu được kết quả như sau:

 Trong 24 mẫu tôm, có 0% nhiễm ciprofloxacin, 2/24 (8,33%) mẫu nhiễm enrofloxacin từ 6,08-7,02ppb, không có mẫu nào vượt quá giới hạn tối đa cho phép

 Trong 24 mẫu cá, có 3/24 (12,5%) mẫu ciprofloxacin từ 0,64-2,05ppb nhưng vẫn còn trong giới hạn cho phép (10ppb), có 6/24 (25%) mẫu nhiễm enrofloxacin từ 1,28-17,76ppb, trong đó có 2 mẫu vượt quá giới hạn cho phép (10ppb)

PHẦN I: MỞ ĐẦU

I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Ở nước ta, nghề nuôi trồng thủy hải sản phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành một trong những ngành kinh tế chủ lực của đất nước, theo thống kê tổng giá trị xuất khẩu thủy sản năm 2012 đạt khoảng 6,2 tỷ USD, với 2 mặt hàng chủ lực

là tôm và cá tra Tuy nhiên trong thời gian gần đây một số lô hàng của Việt Nam xuất sang thị trường Nhật Bản, Mỹ phát hiện dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin (họ

quinolone) Do người nuôi lạm dụng kháng sinh trong quá trình nuôi, làm ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm khả năng cạnh tranh của thủy sản Việt Nam Chính vì vậy ngày 16/1/2012, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đã ban hành Thông tư số 03/2012/TT – BNNPTNT bổ sung các chất Cypermethrin, Deltamethrin và Enrofloxacin vào danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản Trước tình đó các doanh nghiệp xuất khẩu tôm

và Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (NAFIQAD) đã tăng cường công tác kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thành phẩm tôm và tôm nguyên liệu, xuất phát từ nhu cầu trên nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” ở địa bàn thành phố Cần Thơ, nhằm giúp người dân cảnh giác hơn trong việc sử

dụng các sản phẩm từ tôm, cá và làm giảm thiệt hại cho doanh nghiệp xuất khẩu thủy hải sản

II MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài được thực hiện với mong muốn đánh giá được phần nào tình trạng dư lượng chất kháng sinh trong một số loại thủy sản ở thành phố Cần Thơ, từ đó giúp người tiêu dùng biết được mức độ an toàn của chúng, đồng thời kết quả thu được sẽ là thông tin bổ ích gửi đến người nuôi thủy sản, giúp họ ý thức hơn trong quá trình sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi, tránh ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm khả năng cạnh tranh của thủy sản Việt Nam

III GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI

Khảo sát dư lượng kháng sinh họ quinolone trên một số mẫu tôm, cá ở khu vực thành phố Cần Thơ thời gian từ 3/2012 đến 4/2013

Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ khảo sát một số loại dư lượng đang được sử dụng rộng rãi như: ciprofloxacin, enrofloxacin

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Tôi đã sử dụng các phương pháp

nghiên cứu khoa học

- Điều tra

- Tổng kết kinh nghiệm (đọc tài liệu và tham khảo từ những nghiên cứu trước)

- Tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm

Trong điều kiện thí nghiệm của đề tài, tôi sử dụng kỹ thuật Sắc kí lỏng ghép khối phổ bằng phương pháp QQQ_LC/MS/MS( Ref: Journal of Chromatography A, 1088 (2005))

V CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

o Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm hiểu và nghiên cứu tài liệu, xây dựng đề cương

(3-2012)

o Giai đoạn 2: Tiếp tục nghiên cứu tài liệu, tiến hành các thí nghiệm tại Trung tâm

dịch vụ phân tích thí nghiệm TP Hồ Chí Minh, chi nhánh Cần Thơ (3-2012 đến 2012)

9-o Giai đoạn 3: Thu thập mẫu và tiến hành phân tích mẫu ở Cần Thơ cũng như

Đồng bằng sông Cửu Long (10-2012 đến 12-2012)

o Giai đoạn 4: Thu thập và xử lí số liệu thu được, tổng kết và viết bài (1-2013 đến

4-2013)

Nơi thực hiện đề tài: PTN Trung Tâm Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm TP Hồ Chí Minh

chi nhánh Cần Thơ (CASE Cần Thơ)

PHẦN II: NỘI DUNG

2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm, nhưng chủ yếu là do các nguyên nhân sau:

 Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do thức ăn tiếp xúc môi trường có chứa kháng sinh

 Do sử dụng thường xuyên kháng sinh: Mục đích kích thích tăng trọng, phòng bệnh mùa dịch bệnh, chữa bệnh

 Nhằm kéo dài thời gian bảo quản, tránh hư hỏng cho thực phẩm

3 Cơ chế tác động của chất kháng sinh

Khi một chất kháng sinh được đưa vào cơ thể, nó sẽ giết chết các vi khuẩn gây bệnh Kháng sinh diệt trùng bằng nhiều cách:

 Ức chế sự thành lập vách tế bào: Ngăn cản sự tổng hợp thành của tế bào vi trùng như penicillin, cephalosporin, vancomycin

 Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào

 Ức chế sự chuyển hóa của vi trùng như sulfamides, trimethoprim,…

 Ức chế tổng hợp protein của vi trùng tetracycline, aminoglycosides, macrolides,…

 Ức chế sự tổng hợp và hoạt động của acid nucleic như flouroquinolones và rifampicin

4 Phân loại chất kháng sinh

 Nhóm β lactam các Penicillin: Penicilin, Methicilin, Ampicilline, Amoxicilline,

Cloxacilline, Sultamicillin, Piperacilline, Imipenem

 Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin

 Nhóm Quinolon: Acid nalidixic, lomefloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin,

ofloxacin, levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Pefloxacin, Sparfloxacin

 Nhóm 5- nitro- imidazol: Clotrimazole, Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole,

Miconazole, ornidazole

 Nhóm Sulfamid: Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfasalazin

II GIỚI THIỆU VỀ QUINOLONE[3],[4],[7],[8],[10],[11],[12]

1 Khái quát

Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm trùng

ở người và động vật Mục tiêu chính của chúng là enzyme DNA gyrase của vi khuẩn cụ thể là tại topoisomerase II Quinolone có thành phần hóa học là dẫn xuất của acid nalidixic

Phần lớn các thuốc quinolone sử dụng trên lâm sàng là thuộc fluoroquinolones - nghĩa là nhóm quinolone có gắn thêm nguyên tử fluorine dính vào vòng trung tâm, điển hình ở vị trí số 6

2 Phân loại Quinolone

Thuốc quinolone được phân chia thành các thế hệ dựa trên phổ tác dụng lên vi khuẩn của chúng:

 Thế hệ thứ nhất: Cinoxacin, Flumequine, Oxolinic acid, Piromidic acid, Pipemidic acid, Rosoxacin…

 Thế hệ thứ hai: Ciprofloxacin, Enoxacin, Fleroxacin, Lomefloxacin, Nadifloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Pefloxacin, Rufloxacin…

 Thế hệ thứ ba: Balofloxacin, Gatifloxacin, Grepafloxacin, Levofloxacin, Moxifloxacin, Pazufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin,…

 Thế hệ thứ tư: Clinafloxacin, Garenoxacin, Gemifloxacin, Sitafloxacin, Trovafloxacin, Prulifloxacin,…

 Thế hệ mới đang phát triển: Ecinofloxacin

3 Công thức cấu tạo:

Công thức cấu tạo chung của hợp chất Quinolones là vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn xuất của Quinolone gồm các hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn nhóm alkyl hoặc aryl, vị trí thứ 6: có thể gắn thêm F, vị trí 2, 6, 8: có thể gắn thêm một nguyên tử N

N

1 23 4 5

6

8 7

OH

OO

Hình 1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone

4 Tính chất acid - base nhóm quinolone:

Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base Dựa vào pKa

có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl quinolone (PQ)

 Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9.Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion Thường AQ gồm những

Hình 2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone

 Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5.5 – 6.6 và pKa2

khoảng 7.2 - 8.9 Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid

X

OR

N

NR

N

NR

N N

OH

O O

F

NH

Hình 4 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylene chloride Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa

Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9

3 Tác dụng điều trị của Enrofloxacin và Ciprofloxacin

và các phủ tạng nên tiêu diệt mầm bệnh nhanh

4 Tác hại và liều lượng cho phép của Enrofloxacin, Ciprofloxacin

Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic mà kháng sinh nhóm fluoroquinolone được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai, và khuyến cáo là không nên dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống

- Làm thương tổn sự phát triển sụn và khớp chịu lực của động vật non nên có thể gây

hại cho sự phát triển xương khớp của thai nhi và trẻ em tuổi trưởng thành

- Gây đau cơ, viêm dây thần kinh, đặc biệt là các dây chằng, nghiêm trọng nhất là làm đứt gót chân Achill Hay gặp ở người già vì dây chằng vốn bị suy yếu

- Ảnh hưởng không tốt đến thần kinh gây nhức đầu, mệt mỏi, mất ngủ, kích động, run rẩy Hiếm gặp hơn là gây co giật, lo âu, trầm cảm, ác mộng, ảo giác hoặc xuất hiện trạng thái tâm thần Người có tiền sử bệnh tâm thần dễ gặp các hiện tượng này

- Gây một số phản ứng nghiêm trọng: phù mặt, phù thanh quản, khó thở đe dọa tính mạng Người có cơ địa dị ứng dễ bị tai biến này

- Cũng như các kháng sinh phổ rộng khác, việc lạm dùng liều cao làm cho ciprofloxacin tiêu diệt hết các vi khuẩn có lợi, gây mất cân bằng sinh thái vi khuẩn trong

cơ thể Trong thực tế, sau khi dùng một liều mạnh ciprofloxacin điều trị khỏi nhiễm khuẩn hô hấp, trẻ có thể bị tiêu chảy do rối loạn vi khuẩn đường ruột

Sự tồn lưu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh nhóm fluoroquinolone

là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này

Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ (FDA: Food and Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn lưu kháng sinh nhóm fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản Ở châu Âu, EU đã đưa ra giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng

thuốc trong thực phẩm cung cấp cho con người vào những năm 1990 Trong “Council directive 96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò,

heo, gia cầm (gà, vịt) là 30ppb; trong sữa bò là 100ppb

Theo quyết định số: 2864/QĐ-BNN-QLCL của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn qui định chỉ tiêu kiểm tra về chất lượng, an toàn thực phẩm đối với lô hàng thủy sản xuất khẩu: giới hạn cho phép của enrofloxacin, ciprofloxacin trong tôm nuôi, cá tra, basa và sản phẩm chế biến từ tôm nuôi, cá tra, basa

+ Thị trường EU: 100μg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)

+ Thị trường Hàn Quốc: 100μg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)

+ Thị trường Liên Bang Nga: 0,1 mg/kg (tổng 2 chỉ tiêu)

+ Thị trường Canada: Không cho phép (MRL = 1ppb)

+ Thị trường Nhật Bản: Không cho phép (MRL = 10ppb)

IV SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO[2],[3],[4],[5],[13]

1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

+ Pha thường (Normal phase: NP-HPLC),

+ Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC),

2.3 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)

2.4 Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)

- Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)

- Trong 4 loại này, loại thứ 4 là chỉ để tách các chất có phân tử lượng lớn hơn 1000 đvC

3 Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ưu điểm: HPLC có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân

cực gần nhau Vì vậy có thể tách được các đồng phân và đồng đẳng của nhau Các đầu dò trong HPLC có độ nhạy cao (đầu dò UV; đầu dò huỳnh quang và điện hóa) cho phép xác định đến nồng độ cỡ ppb (đầu dò MS) Phương pháp này cho độ tách tốt (các chất nhồi trong cột có kích thước rất nhỏ), cột tách có thể sử dụng nhiều lần; khả năng thu hồi mẫu

cao vì hầu hết các đầu dò không phá hủy mẫu; lượng mẫu cho phép bơm vào cột lớn (lớn hơn so với phương pháp sắc ký khí).Tính đến nay, số lượng các chất được xác định trên HPLC là rất lớn

Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền, thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu

4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký lỏng hiệu năng cao

4.1 Thời gian lưu

Là thời gian được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rữa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

tR thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khí tách ra ngoài cột

tO thời gian để một chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột (thời gian lưu chết)

t’R thời gian lưu hiệu chỉnh của một cấu tử t’R = tR –tO

Hình 6 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 4.2 Hệ số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân

bố (partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh, CM: nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích Nếu K nhỏ thì chất di chuyển nhanh; K lớn, chất di chuyển chậm Thông thường K ≥ 1 để chất có ái lực với pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau

4.3 Hệ số dung lượng

Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột người ta sử dụng một hệ số quan trọng gọi là hệ số dung lượng k’, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng:

M S M

M

S S

V

V K V C

V C

.' 

Trong đó VS: thể tích pha tĩnh, VM: thể tích pha động

k’ phải lớn hơn 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không quá lớn vì lúc đó thời gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu Khoảng k’ lý tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp chúng ta có thể chấp nhận k’ trong khoảng từ 0,5-20

4.4 Hiệu năng

Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của cấu tử trên cột Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lí thuyết của cột N càng lớn hiệu năng tách của cột càng lớn

2

2 1

2

55,5

t H

Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn

O R

t t

t t k

2

''

Cấu tử 1 tách khỏi cấu tử 2 khi đó phải có k’2 ≠ k’1 Điều đó có nghĩa khi giá trị α ≠ 1, cấu tử 1 và 2 tách khỏi nhau trong quá trình sắc kí Giá trị α càng khác 1 thì 2 cấu tử tách được ra khỏi nhau càng tốt

4.6 Số đĩa lí thuyết (N) và chiều cao (H) của đĩa lí thuyết trong cột sắc ký

Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lí thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lí thuyết (H) Cột sắc kí được coi như có N tầng lí thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lí thuyết đươc định nghĩa như là một khu vực của

hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giũa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lí thuyết được tính theo các công thức:

Trong đó: W: chiều rộng ở đáy peak

Chiều cao H này được xác định theo công thức :

Với L là chiều cao của cột sắc kí

RB RA s

W W

t t R



Rs = 1: hai peak chồng lập nhau khoảng 4%

Rs ≥ 1,5: hai peak tách hoàn toàn ra khỏi nhau

5 Các bộ phận của máy sắc kí lỏng hiệu năng cao

Hình 7 Sơ đồ hệ thống HPLC

Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột

Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ

dò cụ thể

5.1 Bình chứa dung môi giải ly cột

Hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ hai bình chứa dung môi Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh Bình luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở để bình luôn thông với khí trời Trong bình có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc kí, ở đầu này có gắn ống lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng

 Dung môi dùng cho HPLC:

Máy HPLC thường sử dụng hỗn hợp 2 loại dung môi hoặc 4 loại dung môi Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được điều khiển bằng hệ thống điều khiển Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình, đưa vào hợp phối trộn

He

Bình chứa

dung môi

Bộ khử khí

Hộp trộn dung môi

Máy bơm

Van nhiều cổng

Nơi chích mẫu vào

Cột bảo vệ Cột sắc ký

Đầu dò (Detector) Sắc ký đồ

Máy in

Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm (pha trong nước), metanol, acetonnitril hoặc hỗn hợp các loại trên Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung môi sử dụng phải trong suốt đối với bước sóng mà đầu dò UV đang hoạt động để phát hiện mẫu chất

Lưu ý :

Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các peak tạp

trong quá trình phân tích thì:

- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC, không có lẫn bụi bẩn Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử không khí và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích

Bảng 1 Một số dung môi và tính chất của chúng

Tên dung môi Nhiệt độ sôi

(oC)

Độ nhớt (mN.S.m-2)

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm

sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

 Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

5.3 Bơm cao áp

Vai trò: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay

cả khi thành phần pha động thay đổi

Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ nhớt pha động, kích thước pha tĩnh

5.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection)

Có 2 cách đưa mẫu vào trong cột : tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động

5.5 Cột sắc ký

5.5.1 Khái niệm

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm đường kính trong 2,1 – 4,6 mm, cột sắc ký được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ đường kính ≤ 5µm

5.5.2 Phân loại

Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân tách dưới đây:

- Cột pha thường: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp phụ của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt phân cực gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH)

- Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không phân cực Vật liệu thường dùng

là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là: Octa -Si-(CH2)7CH3C8, Octadecyl-Si-(CH2)17CH3C18, Phenyl-Si-(C6H5)2C6H5, Aminopropyl-Si-(CH2)3NH2 NH2

- Cột trao đổi ion

- Cột sắc ký gel

5.6 Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng

độ nhất định của chất phân tích

A = k.C Trong đó:

A: tín hiệu đo được Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; cường độ phát xạ cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,

C: Nồng độ chất phân tích

k : hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360nm để phát hiện UV

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là loại đầu dò thông dụng nhất

- Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên

và các dẫn xuất có huỳnh quang

- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất

- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

- Đầu dò ampe kế (Amperometric detector)

- Đầu dò LC – IR

- Đầu dò LC – MS (đầu dò khối phổ)

Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ: có hai nhiệm vụ chính

lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

5.8 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

6 Giới thiệu về đầu dò khối phổ – đầu dò MS ba tứ cực

Các bộ phận chính của đầu dò MS là: bộ tạo ion (ionizer); bộ tách khối (mass analyser); bộ dò ion (detector)

6.1 Bộ tạo ion

Với hệ thống sắc kí lỏng MS - ba tứ cực của Agilent có 4 nguồn tạo ion đó là: ESI, APCI, APPI, MMI Trong nội dung của bài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai kỹ thuật APCI (ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển) và ESI (ion hóa tia điện)

Đặc điểm của hai kỹ thuật này:

6.2 Bộ tách khối

Hiện nay có ba kỹ thuật tách có thể thực hiện MS/MS: kỹ thuật bẫy ion và kỹ thuật

ba tứ cực, kỹ thuật TOF (Time-Of-Flight, thời gian bay) Trong đề tài này tôi sử dụng thiết bị có kỹ thuật ba tứ cực, gồm các bước sau:

+ Các ion được hình thành từ sự ion hóa phân tử hóa chất tạo nên khối phổ MS của hóa chất, tách ra và cô lập thành một loại ion nhất định

+ Phân mảnh ion cô lập

+ Đưa những mảnh ion đó vào bộ dò đầu dò để từ đó tạo ra khối phổ MS của các ion đã cô lập ta có khối phổ MS/MS

Bộ phân tích khối ba tứ cực (triple quadrupole – triple quad)

Đường đi của ion cần phân tích được tóm tắt như sau: Sau khi các ion được hình thành và đi vào bộ tách khối, tại Q1: áp một thế cố định để chỉ những ion mẹ cần phân tích mới đủ bền để đi thẳng tới Q2 Tại Q2: ion mẹ sẽ bị đập ra thành nhiều mảnh ion nhỏ Tất cả các ion này được đưa vào Q3 Tại Q3: lại áp một thế xác định để chọn các ion con cần phân tích

 Dạng đơn giản

 Ba tứ cực

Hình 8 Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent

Hình 9 Sự phân mảnh diễn ra ở Q2

6.3 Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực

Với cấu trúc của ba tứ cực cho phép ta ghi tín hiệu theo những chế độ khác nhau:

Hình 10 Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực + Full scan: đầu dò sẽ nhận tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion của tất cả

các chất trong quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ scan thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ

+ SIM (selected ion monitoring): đầu dò sẽ nhận một số mảnh ion đặc trưng của chất

cần phân tích Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

Với kỹ thuật này, tất cả ion đều bị loại, chỉ còn ion muốn định lượng tồn tại và đi vào đầu dò, để ghi nhận, những ion khác kể cả ion tạp đều bị loại nên dùng để định lượng trong phân tích dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, thủy hải sản được

+ Production: đầu dò sẽ cung cấp toàn bộ mảnh phổ của ion mẹ ban đầu Thông

thường người ta sẽ áp thế đập phá tại ion mẹ sao cho ion mẹ vẫn còn lại khoảng 10%

+ MRM (multiple reaction monitoring): Ion mẹ được chọn lọc tại Q1, đập tại Q2,

nhưng đến Q3 các ion này sẽ được loại hết chỉ giữ lại một hoặc hai loại ion con đặc trưng sinh ra từ ion mẹ và đưa vào đầu dò để phát hiện

Chọn một ion để định lượng và loại bỏ hết các ion còn lại, như vậy đã loại bỏ được hai lần nhiễu nền: S giảm, N giảm nhiều hơn nên tỉ lệ S/N tăng Việc định lượng bằng kỹ thuật này có độ chọn lọc tốt cho hợp chất

6.4 Bộ dò ion (detector)

V MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỌ QUINOLONE[3],[4],[6],[8],[10]

Họ quinolone là họ thuốc kháng sinh liều cao dùng để điều trị các bệnh đặc hiệu

do đó họ thuốc này tương đối phổ biến hiện nay, có nhiều phương pháp định lượng lại các loại thuốc cũng như xác định sự đào thải các hợp chất này qua các mẫu sinh học

1 Phương pháp trắc quang

Nguyên tắc: Dùng một số ion kim loại như Fe(III), Cu(II), Cd(II), Mn(II)…để tạo

phức với nhóm quionlone Các quinolones xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính tuân theo định luật Lambert – Beer từ 3-10 ppm, nhiều phổ màu của nhóm quinolones được xác định dựa vào phản ứng tạo phức Đo cường độ bước sóng của phức tạo thành bằng máy trắc quang Lập đồ thị biểu diễn cường độ hấp thu của chất tại bước sóng đó theo những nồng độ khác nhau

Hình 11 Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax =430nm)

Ưu điểm: Phương pháp này sử dụng thiết bị đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp nên

được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất hữu cơ

Nhược điểm: Độ chọn lọc không cao, độ nhạy kém, phân tích các chất ở nồng độ cao

2 Phương pháp Elisa

2.1 Giới thiệu chung

Đây là một phương pháp xét nghiệm để phát hiện chất kháng sinh enrofloxacin của nhóm quinolone Phương pháp này thích hợp dùng để định tính hoặc định lượng những mẫu bị nhiễm enrofloxacin như nước, cá, động vật có vỏ

2.2 Nguyên liệu:

 Mẫu trắng: là mẫu tôm không chứa nhóm kháng sinh quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS) tại phòng thí nghiệm phân tích thực phẩm - Bộ môn khoa học thực phẩm – Khoa Thú y – Đại học Liege, Vương quốc Bỉ

Dung dịch kháng sinh chuẩn:

 Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)

 Dung dịch gốc 1mg/ml: hòa tan trong methanol có NH4OH 2M Dung dịch dung củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1mg/ml) bằng nước cất Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9g NaCl, 7,78g

Na2HPO4.2H2O và 0,75g KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất)

 Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl; 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất)

 Kit Elisa phân tích quinolone: 10 bộ kit thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie – CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp

2.3 Hướng dẫn an toàn

Dung dịch chuẩn trong bộ kit này chứa một lượng nhỏ enrofloxacin, dung dịch nền được thêm vào tetramethylbenzidine và axit sunfuric loãng Vì thế, cần tránh tiếp xúc, nếu bị dính vào da hay mắt phải rữa kĩ với nước

2.4 Bảo quản và lưu trữ

Bộ kit Elisa nên được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-80C Trước khi sử dụng, phải mang

ra ngoài để chúng đạt tới nhiệt độ phòng (20-250C) Thuốc thử có thể được sử dụng đến ngày hết hạn in trên hộp

2.5 Nguyên tắc thử

Phương pháp Elisa trực tiếp dựa trên sự nhận ra enrofloxacin bởi một kháng thể đặc hiệu Enrofloxacin khi hiện diện trong mẫu và enzyme enrofloxacin (gồm hapten và Enzyme) sẽ cạnh tranh trực tiếp với nhau để kết hợp với kháng thể đặc hiệu đã được phủ lên các giếng nhỏ Sau đó rửa và thêm dung dịch chất nền, một tín hiệu màu sẽ xuất hiện, cường độ của tín hiệu màu xanh sẽ tỉ lệ nghịch với nồng độ của enrofloxacin hiện diện trong mẫu Phản ứng màu dừng lại sau một thời gian qui định và màu sẽ được đánh giá bởi một quang kế Nồng độ của mẫu được xác định bằng phương pháp nội suy, sử dụng đường chuẩn đã xây dựng trong mỗi lần chạy

Ưu điểm: Có thể nhận biết được nhiều chất hữu cơ và vô cơ, thao tác nhanh và đơn

giản, có thể làm với khối lượng mẫu lớn, mẫu không cần làm tinh sạch như phương pháp sắc kí, phương pháp có khả năng phát hiện các quinolones trong tôm với độ đặc hiệu 100% Hay nói cách khác nếu mẫu thực sự âm tính thì 100% kết quả phân tích sẽ là âm tính

Nhược điểm: độ tin cậy không cao (có thể gặp trường hợp dương tính giả) do có thể

có những sai sót trong quá trình xử lí mẫu, điều kiện bảo quản không được đảm bảo

2.6 Kết quả

Trong tổng số 90 mẫu phân tích, 9 mẫu tôm bị nhiễm quinolone (tỷ lệ nhiễm 10%) Đặc biệt, tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb Điều đáng quan tâm là tất

cả các mẫu có nồng độ dư lượng lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb đều phát hiện được bằng phương pháp ELISA Riêng mẫu được phát hiện nhiễm enrofloxacin ở nồng độ 0,4 ppb bằng phương pháp LC-MS/MS thì phương pháp ELISA không phát hiện được Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì nồng độ nhiễm bé hơn ngưỡng phát hiện của phương pháp (0,7ppb)

3 Phương pháp điện hóa

Do có ba N trong phân tử nên các hợp chất thuộc họ quinolone xác định được bằng các phương pháp điện hóa nhờ sóng xúc tác hiđro Người ta không xác định được rõ ràng là N nào tham gia vào quá trình nhận H+ nhờ đôi e tự do trên N nhưng vị trí các peak thường trong khoảng 1,4 – 1,5V cho thấy quá trình này là sóng xúc tác H

Tài liệu tóm tắt cách xác định một số quinolone bằng phương pháp điện hóa theo bảng sau:

Bảng 2 Tóm tắt cách xác định một số quinolone bằng phương pháp điện hóa

Chất Dung dịch nền Phương pháp Điện cực làm việc Enrofloxacin,

Sparfloxacin,

Fleroxacin

Britton-Robinson buffer, pH 4 –11,98 DCP, DPP

Điện cực giọt thủy ngân

Fleroxacin Britton-Robinson

buffer, pH 8,5

DCP, DPP, AdSV

Điện cực giọt Hg treo (HMDE) Ofloxacin B.R buffer, pH 4,1–10,3 DCP, DPP Hg-electrode

DCP (Direct Current Polarography): Cực phổ trực tiếp

DPP (Differential Pulse Polarography): kĩ thuật xung vi phân

AdSV (Adsorptive Stripping Voltammetry): phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ

4 Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD

Nguyên tắc: Do cấu trúc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin có khả năng hấp thu

bước sóng tử ngoại nên có thể dùng phương pháp HPLC - đầu dò UV ở bước sóng 275nm

Đường chuẩn: 10 1000 ng/g

LOD: 10 ng/g cho cả hai chất

5 Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang

Nguyên tắc: mẫu sẽ được kích thích với nguồn sáng có bước sóng là 276nm, sau đó sẽ

phát xạ ra bước sóng 442nm; đo cường độ chất ở bước sóng này theo nồng độ, từ đó tính nồng độ của mẫu

Đường chuẩn: Ciprofloxacin, Enrofloxacin: 1 - 500 ng/g