Nghiên cứu kiểu gen SSR và các tính trạng kinh tế của tập đoàn nấm men saccharomyces cerevisiae

Tuy bộ gene của nấm men ựã ựược giải trình tự nhưng chưa có nghiên cứu mang tắnh hệ thống ựiều tra về phân bố các trình tự SSR và mức ựộ ựa hình của từng locus trong các sinh vật này cũn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

CHU THỊ QUỲNH DIỆP

NGHIÊN CỨU KIỂU GEN SSR VÀ CÁC TÍNH TRẠNG KINH TẾ CỦA TẬP ðOÀN

NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học : TS ðẶNG XUÂN NGHIÊM

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác

Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc

Học viên

Chu Thị Quỳnh Diệp

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội để hoàn thành ựược luận văn này tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự ựộng viên, giúp ựỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kắnh trọng tới

TS đặng Xuân Nghiêm, người ựã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks Nguyễn Ngọc Hòa, Ks Nguyễn Ngọc Chỉnh, Ks Nguyễn Khắc Hải, Ks đỗ Hải Quỳnh ựã nhiệt tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý đào tạo sau ựại học, các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ựã tạo mọi ựiều kiện và giúp ựỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ựến gia ựình, bạn bè, những người thân ựã luôn bên tôi, ựộng viên và khuyến khắch tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2013

Học viên

Chu Thị Quỳnh Diệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined PHẦN I: MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 3

1.2.1.Mục ñích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 4

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 4

2.1.2 ðặc ñiểm chính của nấm men 6

2.2 Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu 14

2.3 Giới thiệu về simple sequence repeats (SSRs) 15

2.3.1 Khái niệm 15

2.3.2 Phân loại SSRs 16

2.3.3 Phân bố của SSRs 16

2.3.4 Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs 17

2.3.5 Phân tích trình tự SSRs 18

2.3.6 Vai trò của SSRs 18

2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của ñề tài 20

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Vật liệu 23

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Thiết bị 24

3.2.Mơi trường 26

3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.3.1 Thời gian 27

3.3.2 ðịa điểm 27

3.4 Nội dung nghiên cứu 27

3.4.1 Thống kê tồn bộ các locus SSR của S cerevisiae 27

3.4.2 Khảo sát mức độ đa hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 27

3.4.3 Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men 27

3.5 Phương pháp nghiên cứu 28

3.5.1 Thống kê tồn bộ các locus SSRs của S cerevisiae 28

3.5.2 Khảo sát mức độ đa hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 28

3.5.3 Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men 29

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Thống kê tồn bộ các locus SSR của S cerevisiae 34

4.2 Khảo sát mức độ đa hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 39

4.2.1 Thiết kế mồi cho các locus SSR tiềm năng 39

4.2.2 Khảo sát sự đa hình của 15 locus SSR tiềm năng 41

4.3 Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men 45

4.3.1 Khảo sát đặc điểm hình thái của các isolate nấm men 45

4.3.2 Sự sinh trưởng theo mật độ quang của các isolate nấm men 50

4.3.3 Khả năng tạo sinh khối của các isolate nấm men 55

4.3.4 Khả năng chịu cồn của các isolate nấm men 56

4.3.5 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của các isolate nấm men 59

4.3.6 Khả năng chịu lạnh của các isolate nấm men 61

4.3.7 Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men 63

4.3.8 Khả năng lên men rượu của các isolate nấm men trên môi trường dịch chiết ñu ñủ 67

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70

5.1 Kết luận 70

5.2 ðề nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 81

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Cs Cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid

ISSR Inter-Simple Sequence Repeat (ñoạn giữa của các

trình tự lặp lại ñơn giản) NST Nhiễm sắc thể

OD Optical density (mật ñộ quang)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PGA Poly-γ-Glutamate

PIC Polymorphism information content (hệ số ña dạng

từng locus gene)

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SSRs Simple sequence repeats (trình tự lặp lại ñơn giản)

Tm Melting Temperature (nhiệt ñộ nóng chảy)

To Thời ñiểm bắt ñầu

TS Tiến sĩ

YPD Yeast peptone dextrose

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách 40 isolate nấm men ñược sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2 Các thiết bị sử dụng trong ñề tài 25

Bảng 3 Các hoá chất sử dụng trong ñề tài 26

Bảng 4 Phân bố của SSR trên từng NST của nấm men Saccharomyces cerevisiae. 34

Bảng 5 15 cặp mồi SSR sử dụng ñể nghiên cứu sự ña hình các locus SSR ở

nấm men (S cerevisiae). 40

Bảng 6 Sự ña dạng di truyền của 15 locus SSR ở nấm men 41

Bảng 7 ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các isolate nấm men 46

Bảng 8 Năng suất rượu và pH của dịch lên men rượu từ nấm men trên môi trường dịch chiết ñu ñủ sau 3 ngày lên men 68

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một tế bào nấm men ñang mọc chồi Cell wall (thành tế bào),

Nucleus (nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (ñiểm

mọc chồi) 6

Hình 2.2 Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào A: Hình ảnh các tế bào nấm men S cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men 7

Hình 2.3 Chu kỳ sống của nấm men 9

Hình 4.1 Phân loại các trình tự SSR ở nấm men theo dạng lặp 35

Hình 4.2 Phân loại SSR nấm men theo mức ñộ hoàn hảo 36

Hình 4.3 Phân loại SSR ở nấm men dựa theo chiều dài ñoạn lặp 38

Hình 4.4a Sản phẩm PCR nhân dòng locus SCI.4.1 42

Hình 4.4b ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi SCVI.1.3 43

Hình 4.5 Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 15 trình tự SSR của 40 isolate nấm men Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng (coefficient) 44

Hình 4.6 Sinh trưởng của các isolate nấm men ở 30ºC 53

Hình 4.7 Sinh khối của các isolate nấm men nghiên cứu 55

Hình 4.8 Khả năng chịu cồn của nấm men tại nồng ñộ cồn 10% 58

Hình 4.9 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men tại nồng ñộ ñường 15% 60 Hình 4.10 Khả năng chịu ñông ñá và làm tan Sau khi ñược ñóng băng ở - 20ºC trong 19 giờ, các mẫu ñược làm tan trong nước ở nhiệt ñộ phòng và ñược nuôi trong môi trường YPD lỏng Tỷ lệ sống sót của chủng ñối chứng là 100% 62

Hình 4.11 Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men ở 30ºC, ñộ ẩm 75% 65

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Nấm men có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, lên men rượu bia, bánh mì, protein ñơn bào, làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi, vi sinh vật probiotics có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cho người và vật nuôi, v.v

Có thể nói nó là vi sinh vật quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm và ñồ uống có cồn

Nấm men cũng là vi sinh vật nhân chuẩn ñơn bào (Eukaryote) ñược sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh học tế bào, sinh học phân tử, di truyền học, v.v Chính vì vậy, nấm men là sinh vật nhân chuẩn ñầu tiên ñược giải trình tự toàn bộ

genome vào năm 1996 S cerevisiae ở thể lưỡng bội chứa 16 cặp nhiễm sắc thể, có

kích thước khác nhau từ 200 – 2.200 kb So với các sinh vật nhân chuẩn ña bào khác nấm men có khoảng trên 6000 gen khác nhau mã hoá cho tất cả các phân tử protein ñược tổng hợp trong tế bào và nấm men có bộ gen rất nhỏ gọn (Dujon, 1996) Các chủng nấm men khác nhau với kiểu hình và ñặc tính lên men khác nhau

ñã sớm ñược nhận ra bởi các nhà sản xuất rượu bia và làm bánh mỳ, trước khi chúng ñược phân biệt bởi các nhà di truyền học

S cerevisiae không chỉ ñược sử dụng ñể lên men bánh mỳ mà nó còn ñược

sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm như ñể lên men bia, lên men rượu, sử dụng trong sản xuất rượu vang và sâmpanh, v.v (Nguyễn Lân Dũng và cs.,

2001); trong y học, như việc dùng S cerevisiae ñể sản xuất insulin chữa bệnh tiểu

ñường, hay mới gần ñây người ta nghiên cứu sử dụng nấm men ñể sản xuất văc-xin viêm gan B (Nguyễn Thị Phương Trang và cs., 2007) Càng ngày người ta càng tìm

ra nhiều ứng dụng của S cerevisiae ñể phục vụ cho cuộc sống của con người Trên

thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm men bắt ñầu bằng việc phân lập, phân loại, chọn lựa, lai tạo các chủng nấm men có các tính trạng kinh tế tốt ñể dùng vào sản xuất thực phẩm, ñồ uống có cồn cũng như thức ăn chăn nuôi (Myers và Attfield, 1999; Meric và cs., 1995; Trần Văn Hiếu và cs., 2006; ðậu Ngọc Hào và Phạm Minh Hằng, 2000; ðậu Ngọc Hào, 2000; Lê Thành Tâm, 1996; Lê Thành Tâm và cs.,

1989; Nguyễn đình Dũng và cs., 1980) S cerevisiae còn ựược sử dụng ựể biểu

hiện các protein hay enzyme tái tổ hợp phục vụ nhiều mục ựắch khác nhau (Ansen

và cs., 2009; Schoeman và cs., 1999; Trần Văn Hiếu và cs., 2006) Ngày càng nhiều

chủng nấm men S cerevisiae biến ựổi gen với khả năng lên men cao hơn, chất

lượng lên men tốt hơn, thành phần dinh dưỡng quý hơn và sức chống chịu cao, ựặc biệt là khả năng chịu lạnh ựã ựược tạo ra (Nevoigt và cs., 2000; Panadero và cs., 2007; Randez-Gil và cs., 1999)

Trong cùng một ựiều kiện sản xuất, cùng nguyên liệu ựầu vào, rượu hay bánh

mỳ ựược lên men bởi các chủng nấm men khác nhau có thể có chất lượng khác xa nhau (Jubany và cs., 2008) Vì vậy, ựể chọn lựa ựược các chủng nấm men thuần thắch hợp cần thiết phải có một công cụ sinh học phân tử giúp phân biệt giữa các chủng nấm men về các ựặc tắnh sinh học (khả năng sinh trưởng phát triển, kắch thước tế bào, khả năng chống chịu các ựiều kiện môi trường: áp suất thẩm thấu, hạn, lạnh, nhiệt ựộ cồn cao, v.v.) và các ựặc tắnh kinh tế (khả năng làm nở bánh mì, khả năng lên men cồn, v.v.) khác nhau Hầu hết các nghiên cứu so sánh các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong việc phân biệt, kiểm ựịnh các chủng/loài sinh vật về mặt di truyền phân tử ựều có chung nhận ựịnh là phương pháp SSRs là một công cụ hữu ắch, kinh tế, ựáng tin cậy và hiệu quả nhất (Gallego và cs., 2005; Schulle, 2004)

Tuy bộ gene của nấm men ựã ựược giải trình tự nhưng chưa có nghiên cứu mang tắnh hệ thống ựiều tra về phân bố các trình tự SSR và mức ựộ ựa hình của từng locus trong các sinh vật này cũng như mối liên quan kiểu hình SSR với các tắnh trạng kinh tế của nhóm vi sinh vật này; chưa có công bố nào ựưa ra bộ chỉ thị SSR chuẩn ựể kiểm ựịnh các chủng trong một loài

Chắnh vì vậy, với mong muốn dùng chỉ thị phân tử ựể kiểm ựịnh các chủng nấm men sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, hay thức ăn chăn nuôi, chúng tôi chọn ựề tài:

ỘNghiên cứu kiểu gen SSR và các tắnh trạng kinh tế của tập ựoàn nấm men Saccharomyces cerevisiaeỢ.

ðề tài này có thể cung cấp thêm cơ sở về phân tử và phương pháp hữu hiệu

cho việc phân ñịnh các chủng/loài nấm men Saccharomyces cerevisiae, có thể tìm

ra chỉ thị phân tử cho các tính trạng kinh tế của các chủng vi sinh này, giúp cho việc giám ñịnh và ñánh giá men giống, thực phẩm nhanh và hiệu quả hơn

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1.Mục ñích

- Thiết lập một bộ sưu tập các chủng nấm men S cerevisiae

- Nghiên cứu sự ña hình của các locus SSR của nấm men S cerevisiae ñể sử

dụng chúng như những chỉ dấu di truyền phân tử

- Khảo sát các tính trạng kinh tế và tính trạng sinh học của các chủng nấm men nhằm tìm ra mối tương quan (nếu có) giữa kiểu gen SSR với từng tính trạng

có ý nghĩa kinh tế

- Tuyển chọn và bảo tồn các chủng nấm men S cerevisiae có khả năng sinh

trưởng mạnh, có sức chống chịu tốt ñồng thời lên men nhanh và hiệu quả ñể ứng dụng trong công nghệ sản xuất ñồ uống, công nghệ thực phẩm

1.2.2 Yêu cầu

- Thống kê toàn bộ các locus SSR của nấm men dựa vào trình tự của chủng ñã ñược giải mã

- Thiết kế mồi cho các locus SSR tiềm năng và khảo sát mức ñộ ña hình của

các locus ñó, lập bản ñồ SSR của Saccharomyces cerevisiae

- Khảo sát các tính trạng kinh tế và tính trạng sinh học của các isolate nấm men

ðặc ñiểm, hình thái của các isolate nấm men

Sự sinh trưởng, phát triển và năng suất sinh khối

Khả năng chịu cồn

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu

Khả năng chịu lạnh

Khả năng chịu khô hạn

Khả năng lên men rượu

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Từ thời kỳ tiền sử, loài người ñã biết ép nước quả và ngâm hạt ñể làm rượu vang, bia và làm nở bột nhờ quá trình lên men của nấm men Ðường hoặc tinh bột ñược chuyển hoá thành rượu thông qua hoạt ñộng của các enzyme Sự lên men xảy

ra ở nhiệt ñộ trong phòng với nhịp ñiệu bình thường, chậm chạp Nhà bác học Ðức Liebig (1803 - 1873) ñã quan sát thấy một quá trình hóa học xảy ra trong quá trình lên men Không có một lực sống nào tham gia vào quá trình ấy và ông khẳng ñịnh quá trình giống như sự chuyển hóa trong cơ thể sống, nhưng nó xảy ra không có chất sống tham gia (Wilkins, 2004)

Ngay từ thời Leewenhoek, người ta ñã biết nấm men bao gồm những hạt hình cầu nhỏ bé không có dấu hiệu của sự sống Vào những năm 1836 và 1837, các nhà sinh học, trong ñó Schwann, ñã quan sát thấy quá trình nảy chồi ở nấm men tạo nên những hạt cầu nhỏ bé mới là dấu hiệu biểu hiện rõ rệt của sự sống Các nhà sinh học nói nhiều về những tế bào nấm men, nhưng Liebig ñã bác bỏ những nhận ñịnh

ñó (Wilkins, 2004)

Nhà bác học Pháp là Louis Pasteur (1822 - 1895) ñã bảo vệ bản chất sống của nấm men Năm 1856, những người Pháp nấu rượu vang ñã mời ông làm cố vấn Rượu vang và bia bảo quản lâu thường bị chua và gây thiệt hại lớn về kinh tế Các nhà hóa học có thể giúp ñỡ ñược gì không? Pasteur ñã phát hiện ra quy luật khá lý thú là rượu vang và bia ñược bảo quản tốt có chứa những tế bào nấm men tròn, nhỏ Còn khi chất nước ñó bị chua thì những tế bào nấm men bị kéo dài ra Như vậy, có hai loại nấm men: loại tạo thành rượu và loại làm rượu chua dần Ðun nóng nhẹ sẽ giết chết các tế bào nấm men và làm ngừng quá trình gây chua Nếu người ta làm ñúng lúc sau khi ñã hình thành rượu nhưng chưa bắt ñầu có sự gây chua thì có thể bảo quản ñược rượu vang Thực tiễn ñã xác nhận những kết luận của Pasteur là ñúng Khi nghiên cứu quá trình này, Pasteur ñã làm sáng tỏ hai mặt của vấn ñề Thứ nhất, các tế bào nấm men là những cơ thể sống, vì chỉ khi ñun nóng nhẹ là có thể

thủ tiêu khả năng lên men; tế bào vẫn còn lại không bị phá hủy, nhưng trong chúng

sự sống ñã bị hủy diệt Thứ hai, chỉ có những tế bào nấm men sống mới gây ra sự lên men (Wilkins, 2004)

Ngày nay, khi ñã có rất nhiều nghiên cứu về nấm men thì chúng ta biết

Saccharomyces là một chi nấm men ñược sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như bánh mỳ, sản xuất cồn, thực phẩm chức năng, y học, mỹ phẩm, v.v

Saccharomyces có nghĩa là nấm ñường và là loại vi sinh vật ñược sản xuất với quy

mô lớn nhất trên thế giới

Giống (chi) Saccharomyces có khoảng 40 loài ( Van der Walt, 1970) và các

loài ñược biết nhiều do chúng ñược ứng dụng trong việc làm nở bánh mỳ hay trong sản xuất bia, rượu, v.v Chúng hiện diện trong các sản phẩm có ñường, trái cây chín, ñất, phấn hoa, v.v

Các chủng nấm men nghiên cứu có vị trí phân loại như sau:

Trong ñó loài ñược con người sử dụng phổ biến nhất là S cerevisiae

2.1.2 ðặc ñiểm chính của nấm men

a Hình thái bên ngoài

S cerevisiae ña số có hình bầu dục, hình ô van, hình elip Kích thước tế bào theo ñường kính lớn từ 5 - 10 µm và kích thước ñường kính nhỏ từ 1 - 7 µm Kích thước tế bào của nấm men thay ñổi theo ñộ tuổi và mức ñộ ña bội

b Cấu tạo

Nấm men S cerevisiae có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào

thực vật với ñầy ñủ các thành phần cấu tạo như thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ (Rosini và cs., 1982; Burke và cs., 2000)

Hình 2.1 Một tế bào nấm men ñang mọc chồi Cell wall (thành tế bào), Nucleus

(nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (ñiểm mọc chồi)

Nguồn: http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol

Hình 2.2 Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào A: Hình ảnh các tế bào

nấm men S cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men

Nguồn: http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol

 Thành tế bào: cấu tạo chủ yếu là polysaccharide như glucan, mannan, chitin Trong và ở hai bề mặt thành tế bào có protein, lipoprotein và các enzyme khác nhau Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua ñó các chất dinh dưỡng hòa tan ñi qua thành và màng tế bào vào trong tế bào ñể tham gia quá trình trao ñổi chất trong tế bào

 Nguyên sinh chất: là chất lỏng nhớt, có ñộ nhớt gấp 800 lần so với nước,

có cấu tạo từ các chất protein, lipid và carbohydrate Các quá trình lên men quan trọng nhất ñều xảy ra ở nguyên sinh chất

 Nhân: nhân tế bào nấm men là nhân ñiển hình, có màng nhân, bên trong

là chất dịch nhân có chứa hạch nhân Cũng như nhân tế bào của vi sinh vật bậc cao, nhân tế bào nấm men ngoài DNA còn có protein và nhiều loại enzyme Hạch nhân của

tế bào nấm men không phải chỉ gồm một phân tử DNA như ở vi khuẩn mà ñã có cấu tạo nhiễm sắc thể ñiển hình, có thể thực hiện quá trình phân bào nguyên nhiễm còn gọi

là nguyên phân Quá trình nguyên phân gồm 4 giai ñoạn như ở vi sinh vật bậc cao Số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào nấm men ñơn bội là 16 (Lodder, 1971)

 Ty thể: khác với vi khuẩn, nấm men ñã có ty thể giống như ở tế bào bậc cao, ñó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào Ty thể nấm men có hình bầu dục, ñược bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên Cấu trúc của hai lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất Trên bề mặt của

màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu Các hạt này có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể Trong ty thể còn có một phân tử DNA

có cấu trúc hình vòng, có khả năng tự sao chép Những ñột biến tạo ra tế bào nấm men không có DNA ty thể làm cho tế bào nấm men phát triển rất yếu, khuẩn lạc nhỏ

bé Trong ty thể còn có cả các thành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như ribosome, các loại RNA và các loại enzyme cần thiết cho sự tổng hợp protein Các thành phẩn này không giống với các thành phần tương tự của tế bào nấm men nhưng lại rất giống của vi khuẩn DNA của ty thể rất nhỏ nên chỉ có thể mang mật

mã tổng hợp cho một số protein của ty thể, số còn lại do tế bào tổng hợp rồi ñưa vào

ty thể Người ta ñã chứng minh ñược quá trình tự tổng hợp protein của ty thể Quá trình này bị kìm hãm bởi chloramfenicol giống như ở vi khuẩn, trong khi ñó chất kháng sinh này không kìm hãm ñược quá trình tổng hợp protein ở tế bào nấm men (Lodder, 1971)

 Ribosome: của tế bào nấm men có hai loại: 70S và 80S Loại 80S gồm 2 tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất Một số nghiên cứu ñã chứng minh rằng các ribosome gắn với màng tế bào chất có hoạt tính tổng hợp protein cao hơn Loại 70S là loại ribosome có trong ty thể (Lodder, 1971)

 Không bào: trong không bào có chứa dịch tế bào, trong ñó có muối hòa tan, enzyme và các chất keo Ngoài ra trong không bào còn có chất béo, volutin, glycogen

 Glycogen: hay còn ñược gọi là tinh bột ñộng vật là chất dinh dưỡng dự trữ của nấm men Chất béo không phải là cấu tử nhất thiết phải có trong tế bào Ở những tế bào non, chất béo có rất ít, tế bào càng trưởng thành thì lượng chất béo cũng tăng theo

 Volutin: là dẫn xuất của nucleic acid chứa nhiều phốt pho (Lodder, 1971)

c Sinh sản

S cerevisiae là ñiển hình của nấm dị tản lưỡng cực Dị tản là kiểu có sự lai nhau giữa hai loại tế bào khác nhau như a với α tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội a/α Ở nấm men, trong ñiều kiện bình thường, sự hợp bào và hợp nhân chỉ xảy ra giữa các

tế bào khác nhau về giới tính là a và α do các alen khác nhau của locus MAT quy ñịnh Do có sự tham gia của 2 alen nên gọi là lưỡng cực

Chu trình sống của nấm men gồm hai giai ñoạn có thể chuyển ñổi qua lại Tế bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng ñơn bội Trong cả hai trường hợp,

tế bào mẹ sinh sản dinh dưỡng bằng cách tạo chồi giống hệt nó Thời gian sinh sản hình thành tế bào mới khoảng 30 - 40 phút Tốc ñộ sinh sản của nấm men phụ thuộc vào thành phần và nồng ñộ chất dinh dưỡng của môi trường, nhiệt ñộ, pH và mức

ñộ hiếu khí Nhiệt ñộ thích hợp cho nấm men sinh sản là 29 - 31°C, pH thích hợp vào khoảng 5 - 5,8 ( Bùi ðức Hợi và cs., 2009)

Hình 2.3 Chu kỳ sống của nấm men Budding (bắt ñầu nảy chồi), Haploid α (thể

ñơn bội α), haploid a (thể ñơn bội a), conjugation (sự kết hợp), diploid a/α (thể

lưỡng bội a/α), spore (bào tử)

Nguồn: http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol

Khi một chồi phát triển hoàn chỉnh sẽ tách ra khỏi tế bào mẹ, vị trí chồi rời tế bào mẹ gọi là ñiểm sinh sản hay sẹo Khi gặp ñiều kiện dinh dưỡng không thuận lợi thì các tế bào khác giới sẽ kết hợp lại với nhau tạo thành hợp tử, sau ñó tế bào tiếp hợp lưỡng bội nẩy chồi cho ra một tế bào giống hệt nó và mang 16 cặp NST Trong ñiều kiện môi trường bất lợi, tế bào tiếp hợp giảm phân ñể hình thành 4 tế bào ñơn bội trong ñó 2 tế bào ñơn bội mang gen a và 2 tế bào ñơn bội mang gen α Túi bào

tử này sẽ chờ khi nào môi trường dinh dưỡng thuận lợi ñể phát triển sinh sản theo hình thức nảy chồi (Lodder, 1971) Bào tử nang bền với tác nhân bên ngoài như nhiệt ñộ cao, khô hạn, nhưng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn, chúng thường chết ở nhiệt ñộ 60oC

2.1.3 Yêu cầu về dinh dưỡng và ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng

Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm hai giai ñoạn: chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào và chuỗi các phản ứng hoá học biến ñổi chất dinh dưỡng ñể tổng hợp vật liệu cho tế bào Môi trường dinh dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau Các chất không ñiện

ly như ñường sucrose, rượu, axit hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch tán theo gradient nồng ñộ hay vận chuyển thụ ñộng, do sự khác nhau về nồng ñộ các chất này giữa tế bào và môi trường Các ion tích ñiện trong môi trường như K+, Cl-, Mg2+, Ca2+ và các ion kim loại khác có thể vào tế bào thụ ñộng theo gradient nồng ñộ hay ñược vận chuyển ngược lại gradient nồng ñộ (vận chuyển chủ ñộng) Natri có ý nghĩa rất quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào nấm men Ion Natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả 2 cơ chế: thụ ñộng và chủ ñộng vào tế bào Nấm men mang theo cả sucrose, amino acid ngay

cả khi không có sự chênh lệch nồng ñộ các chất này giữa tế bào với môi trường Kết quả thí nghiệm cho thấy: khi thêm NaCl vào môi trường từ 1 - 1,5%, dẫn ñến quá trình tổng hợp hoạt ñộng tăng, gia tăng hoạt tính sinh sản của nấm men và hiệu suất thành phẩm cao hơn, phẩm chất thành phẩm ñược cải tiến, ñồng thời hạn chế sự phát triển của nấm men lạ (Regine và cs., 1993)

Thức ăn nuôi tế bào nấm men gồm các hợp chất nitơ, hợp chất khoáng, các carbohydrate, vitamin và các chất sinh trưởng (Bùi ðức Hợi và cs., 2009) Trước hết, nấm men tiêu hoá các amino acid sau ñó ñến các sản phẩm thuỷ phân protein, nấm men hầu như không tiêu hoá các protein tự nhiên Các muối luôn là nguồn thức

ăn rất tốt cho nấm men Nấm men tiêu hoá gần như hoàn toàn nitơ của amoniac, còn các nitrite lại gây ñộc cho tế bào nấm men

Nấm men cần thức ăn khoáng có chứa phốt pho, kali, magiê, sắt, v.v các vitamin và chất sinh trưởng ñể một phần tổng hợp trong nội bào, một phần ñể ở

dạng dự trữ Nấm men thường ñược dùng như là nguồn bổ sung ñạm và vitamin vì

nó có tới 50% protein, giàu vitamin B1, B2, B6, pentotenic acid, folic acid, riboflavin, và biotin (Broach và cs., 1991)

Các carbohydrate cần cho nấm men như vật liệu xây dựng nên tế bào cũng như nguồn cung cấp năng lượng Nấm men tiêu hoá các carbohydrate khác nhau Nấm men không tiêu hoá lactose và các polysaccaride cao hơn Chúng chỉ tiêu hoá trực tiếp các ñường ñơn giản (sucrose và maltose ñược thuỷ phân sơ bộ bằng enzyme của nấm men) (Lương ðức Phẩm, 2009)

Năng lượng hóa học cần thiết cho nấm men do sự chuyển hoá ñường trong nội bào cung cấp Nấm men có thể phân huỷ ñường bằng cách hô hấp hiếu khí hoặc lên men rượu

Sự thuỷ phân ñường trong ñiều kiện hiếu khí có thể biểu diễn bằng phương trình:

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + H2O + 2324.103 J

Sự lên men rượu ñược biểu diễn bằng phương trình:

C6H12O6 → 2CO2 + C2H5OH + 117,32.103 J Quá trình phân huỷ ñường ñược biểu diễn một cách ñơn giản như sau:

2.1.4 Sức chống chịu của nấm men

Trong ñời sống ngoài tự nhiên cũng như trong các quy trình lên men nhân tạo, nấm men có khi phải ñương ñầu với các ñiều kiện bất lợi của môi trường như: ñóng băng, tan băng, nồng ñộ ñường cao, sự khô hạn, và các chất oxi hoá mạnh Các ñại phân tử trong tế bào gồm protein, nucleic acid và màng sẽ bị hư hỏng nặng trong các ñiều kiện stress ðiều này dẫn tới việc ức chế sự tăng trưởng của tế bào và khả năng lên men (Shima và Takagi, 2009) ðể tránh các thiệt hại gây chết, các tế bào nấm men cần có nhiều cơ chế chống lại stress, ví dụ như sự cảm ứng stress biểu hiện protein, sự tích tụ các chất chống lại stress hay thay ñổi thành phần của màng bằng việc ñiều chỉnh sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme tương ứng qua sự thúc ñẩy bởi các stress

Các yếu tố về ngoại cảnh ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển của nấm men là: nhiệt ñộ, nồng ñộ oxi hoà tan hay ñộ hiếu khí, pH môi trường, hàm lượng sản phẩm chính tạo ra, thành phần môi trường và các ñiều kiện khác của môi trường nuôi cấy cho sinh trưởng của nấm men nhiệt ñộ tối thích vào khoảng 29oC - 31oC nhưng với lên men lại không hoàn toàn như vậy Nhiệt ñộ lên men ở khoảng 30oC -

35oC, bắt ñầu tích tụ rượu etylic càng sớm, tốc ñộ lên men nhanh và kết thúc sớm nhưng không lên men ñược hết ñường (Lương ðức Phẩm, 2009) Nhiệt ñộ không những chỉ ảnh hưởng tới cường ñộ lên men và sinh trưởng của nấm men mà còn ảnh hưởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm phụ và thứ cấp (Lương ðức Phẩm, 2009) Nhiệt ñộ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm loại này ðiều này không có lợi cho chất lượng của sản phẩm chính Giữa nhiệt ñộ và ñộ hiếu khí có quan hệ chặt chẽ với nhau Nấm men sinh trưởng mạnh mẽ ở khoảng thời gian ñầu của quá trình lên men (sau pha tiềm phát) Trong thời gian này dịch lên men có lượng oxi hoà tan và nhiệt ñộ rất thích hợp cho nấm men sinh trưởng và lên men Nhiệt ñộ quá thấp cũng ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và lên men của nấm men (Baguena và cs., 1991; Almeida và Pais, 1996)

ðộ hiếu khí ñược thể hiện bằng lượng oxi hoà tan trong môi trường, ñơn vị tính là mg O2/lít môi trường Ở ñiều kiện nhiệt ñộ càng cao lượng oxi hoà tan càng thấp Oxi hoà tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản

của nấm men và tạo ñiều kiện cho tế bào nấm men hô hấp Trong môi trường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và ñều hơn, do ñó tế bào nấm men càng ñược tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxi tốt hơn

pH của môi trường có ảnh hưởng tới ñời sống của nấm men, trong quá trình nuôi thì pH giảm dần hay tăng ñộ chua do sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình (Lương ðức Phẩm, 2004)

Khí CO2 cũng như là chất trao ñổi tự nhiên, ở nồng ñộ xác ñịnh nó có thể kìm hãm hoặc thậm chí ñình chỉ sinh sản nấm men (Lương ðức Phẩm, 2004) CO2

cao làm quá trình hô hấp chậm lại

Rượu etylic ñược tích tụ khi nấm men sinh trưởng phát triển và chúng tích tụ càng ngày càng nhiều Hàm lượng rượu cao dần sẽ làm cho nấm men sinh trưởng chậm dần và ñến một nồng ñộ nào ñó có thể sẽ làm cho nấm men dừng hẳn sự phát triển (Burke và cs., 2000)

Thành phần môi trường nuôi cấy và lên men có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của nấm men và trao ñổi chất trong tế bào, ñặc biệt có thể quyết ñịnh cả hiệu suất lên men hoặc chuyển hướng lên men từ sản phẩm này sang sản phẩm khác ðường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất thẩm thấu, áp suất thẩm thấu thường chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hoà tan vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tế bào hào tan vào môi trường Áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tượng khô sinh lý teo chất nguyên sinh dẫn tới nấm men không sinh trưởng ñược và tổng sinh khối giảm, thậm chí tế bào sẽ ngừng phát triển

Nhiều năm trở lại ñây, nấm men ñược phát triển bằng cách sử dụng các kĩ thuật nuôi cấy, sử dụng công nghệ sinh học ñể làm thay ñổi mức ñộ hoạt ñộng trao ñổi chất như quá trình chuyển hoá carbon, chuyển hoá nitơ, cũng như các phản ứng chống lại stress của môi trường (Higgin và cs., 2001; Tanaka và cs., 2006)

2.1.5 Vai trò của nấm men trong ñời sống

S cerevisiae là nấm men không gây bệnh Di truyền học, Sinh học phân tử, Hóa sinh trao ñổi chất, v.v., ñã dùng nó như một sinh vật mẫu trong các thí nghiệm (Dynamac, 1990) Trong nhiều thế kỷ, khả năng sinh ethanol và CO2 của S

cerevisiae ñược lợi dụng ñể sản xuất nước giải khát có cồn, ethanol (Mariam và cs., 2009) và bánh mỳ; ứng dụng nhiều trong y học (Dae-Kyun và cs., 2006); sản xuất thực phẩm chức năng, sản xuất thức ăn chăn nuôi, v.v Ngày nay, khoảng trên 2

triệu tấn S cerevisiae ñược dùng trên toàn thế giới mỗi năm (Glick và Pasternak,

2003) Ngoài vai trò sinh học - công nghiệp quan trọng, S cerevisiae còn là ñối

tượng nghiên cứu có ý nghĩa, ñặc biệt là làm mô hình mẫu ñể nghiên cứu các sinh vật nhân chuẩn khác bao gồm cả con người (Johnson và cs., 1998; Johnson và cs.,

2006) Nhiều gen liên quan tới chu kỳ phân chia tế bào của S cerevisiae tương tự

các gen ở người (Harvey và cs., 1996) Hiểu biết về những gen này ñã giúp phân lập

và mô tả ñặc trưng các gen gây bệnh ung thư ở người (Richardson và cs., 1990;

Whitfield và cs., 2002; George và Gary, 1998) ðồng thời, hệ di truyền của nấm men ñược sử dụng rộng rãi, nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo là công cụ không thể thiếu ñược ñể nghiên cứu tổ chức vật chất của DNA người (Saha và cs., 1998) Tháng 4

năm 1996, S cerevisiae trở thành sinh vật nhân chuẩn ñầu tiên có bộ nhiễm sắc thể

ñược giải mã hoàn toàn, việc này càng làm tăng thêm vai trò của nó trong nghiên

cứu cơ bản (Dujon, 1996) Ngoài việc sử dụng S cerevisiae trong chế biến thực

phẩm, người ta còn sử dụng rộng rãi nó ñể sản xuất các thành phần phân tử của tế bào như lipid, protein (Bigelis, 1985; Stewart và Russell, 1985)

2.2 Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu

Hệ vi sinh vật trong bánh men tham gia các quá trình chuyển hóa cơ chất: Giai ñoạn ñầu vi khuẩn phát triển hình thành các axit hữu cơ (axit hoá dịch ñường trước khi lên men), pH giảm xuống tạo ñiều kiện cho các loài nấm mốc phát triển, nấm men cũng bắt ñầu phát triển (tốc ñộ phát triển yếu hơn nấm mốc) Quá trình

chuyển hóa tinh bột thành ñường: nhờ nấm mốc Aspergillus sp., Rhizopus sp.,

Mucor sp., v.v., tạo ra amylase (α - amylase, glucoamylase) Quá trình chuyển hóa ñường thành rượu nhờ các loài nấm men Saccharomyces (Lương ðức Phẩm, 2004)

Sản phẩm rượu ñã ñược biết ñến từ cách ñây hơn ba thiên niên kỉ Rượu là những hợp chất hữu cơ có một hay nhiều nhóm OH nối với nguyên tử cacbon no (nếu hợp chất có nhóm OH ở nguyên tử cacbon không no của dãy mạch không vòng thì ñược xếp vào loại enol; hợp chất có nhóm OH ở cacbon của vòng thơm ñược xếp

vào loại phenol) Tuỳ theo số lượng nhóm OH có trong phân tử mà phân biệt monol, ñiol, triol và poliol

Trong quá trình sản xuất rượu, tế bào nấm men không có khả năng chuyển hoá hồ tinh bột thành rượu Chúng chỉ có khả năng sử dụng ñường, chuyển ñường thành rượu Vì vậy, sau khi nấu ñể dịch hoá, dịch tinh bột cần ñược chuyển thành ñường trước khi lên men Lên men là giai ñoạn quan trọng cuối cùng và chủ yếu nhất của quá trình sản xuất rượu cồn Trong quá trình này, nấm men thực hiện quá trình thuỷ phân ñường Quá trình lên men do tác ñộng của các tế bào nấm men như sau: ñường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men ñược hấp phụ và khuyếch tán vào bên trong tế bào men ñể chuyển hoá qua các hợp chất trung gian và cuối cùng tạo thành rượu và khí CO2 Rượu và khí CO2 tạo thành ñược khuyếch tán qua màng tế bào ra môi trường bên ngoài Rượu hoà tan trong nước nên tan nhanh vào dung dịch lên men còn CO2 hoà tan kém trong nước nên chúng bị bão hoà trong dung dịch Khi dung dịch ñã bão hoà CO2 thì CO2 tạo thành ñược bám quanh tế bào nấm men và lớn dần lên Lượng CO2 tích tụ lớn ñến mức nào ñó nó thắng khối lượng của tế bào nấm men thì tế bào nấm men ñược bọt khí CO2 kéo dần lên bề mặt dịch lên men Khi lên ñến mặt thoáng, CO2 ñược thoát ra và tế bào nấm men có khối lượng lớn hơn khối lượng riêng dịch lên men ñược lắng xuống Nhờ sự chuyển ñộng lên xuống này mà quá trình lên men ñược tăng cường Sau khi quá trình lên

men kết thúc sản phẩm ñược chuyển qua giai ñoạn chưng cất ñể thu rượu

2.3 Giới thiệu về simple sequence repeats (SSRs)

2.3.1 Khái niệm

Simple sequence repeats (SSRs), còn ñược gọi là các chuỗi lặp ñơn giản, các chuỗi lặp liền kề ngắn = short tandem repeats (STRs) hay các ñoạn ña hình chuỗi ñơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) là nhóm các chuỗi DNA ñơn giản lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20–100 bp SSRs ñược tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, ñặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố ñều trên genome

SSRs có tính ña hình rất cao (ña hình theo chiều dài), là những alen ñồng trội (codominant-alen) bao gồm 2 loại: alen ñồng hợp và alen dị hợp, nó có các tính chất

cần thiết chất cần thiết cho một marker Tần số ñột biến từ 104 - 5.10-6, nó tuân theo ñịnh luật Mendel Vị trí của SSRs trên nhiễm sắc thể có thể ñược xác ñịnh bằng PCR

từ một lượng DNA rất nhỏ Xác ñịnh SSRs PCR trên một loài nào ñó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005)

Ví dụ: SSRs lặp 1 nucleotide (A)11: AAAAAAAAAAA;

SSRs lặp 2 nucleotide (GT)6: GTGTGTGTGTGT;

SSRs lặp 3 nucleotide (CTG)4: CTGCTGCTGCTG;

SSRs lặp 4 nucleotide (ACTC)4: ACTCACTCACTCACTC

2.3.2 Phân loại SSRs

Các SSRs ñược phân loại theo loại chuỗi lặp như sau:

− SSRs hoàn hảo: gồm các chuỗi lặp ñều ñặn (Vd:TATATATATATATATA)

− SSRs không hoàn hảo: có một bp nằm xen giữa các chuỗi lặp (Vd

Trên một bộ genome, SSRs phân bố không ñều vì:

Tần số của chúng khác nhau giữa vùng mã hóa và vùng không mã hóa Do tốc ñộ ñột biến cao nên vùng mã hóa có mật ñộ SSRs thấp hơn so với vùng không

mã hóa Người ta ñã chứng minh rằng, các SSRs với chuỗi lặp là 3 hoặc 6 bp tồn tại với mật ñộ tương ñương ở vùng mã hóa và không mã hóa Tuy nhiên, các SSRs với chuỗi lặp không phải là bội số của 3 thì tồn tại chủ yếu ở vùng không mã hóa Vai trò chức năng của SSRs Các nghiên cứu trên thực vật cho thấy, áp lực chọn lọc tác ñộng khác nhau lên vùng 5’UTR, vùng mã hóa và 3’UTR

Tần số thay ñổi theo ñơn vị phân loại (theo nghĩa số lượng tuyệt ñối các locus SSRs và motif của chuỗi lặp) Ở thực vật, tần số SSRs cao ở thực vật có bộ

gen nhỏ (vd: 0.85% ở cây Arabidopsis) và thấp hơn ở cây có bộ gen lớn (vd: 0.37%

ở ngô) Tần số = 1.07% ở nhiễm sắc thể 22 của người và 0.21% ở tuyến trùng

Caernorhabditis elegans (Hà Viết cường, 2009)

2.3.4 Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs

Có 3 phương pháp ñể phát hiện các trình tự SSRs: phương pháp lai, phương

pháp PCR và phương pháp tin sinh học áp dụng trên các trình tự giải mã

Phương pháp lai: phương pháp lai ghép phân tử cho phép xác ñịnh chính

xác kiểu SSRs bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu SSRs bằng các mẫu dò khác nhau Tuy nhiên, xác ñịnh chiều dài của chúng còn bị hạn chế Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ ñồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc Phương pháp phát hiện nhờ ñồng vị phóng xạ là phương pháp hiệu quả và ñược dùng ñầu tiên là ñồng vị phóng xạ Người ta có thể ñánh dấu vào một ñầu của primer (end-labelling) hoặc ñánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling) Nhưng ngày nay, phương pháp dùng ñồng vị phóng xạ rất ít ñược sử dụng vì nguy hiểm ñến sức khỏe con người và ñòi hỏi việc xử lý chất thải tốn kém Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) rẻ, không ñộc hại nhưng ñộ nhạy cao, ñòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005)

Phương pháp PCR: sử dụng màu huỳnh quang ñể ñánh dấu primer forward

và sử dụng máy giải trình tự tự ñộng Phương pháp này ñược phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide ñể phát hiện sản phẩm PCR ñược ñánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation) Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện ñược bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của ñoạn DNA quan tâm Chất huỳnh quang này ñược gắn vào một ñầu 5’ của cặp mồi, 40 mồi loại này ñủ dùng cho 10000 phản ứng PCR Phương pháp này có hiệu quả rất cao và ñang ñược

sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới Người ta có thể ñánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng ñiện di, kể cả kích thước các ñoạn bằng nhau nhưng chúng ta

vẫn có thể xác ựịnh ựược nhờ màu huỳnh quang khác nhau Kết quả ựược thể hiện trên máy tắnh, nhờ ựó chúng ta có thể xác ựịnh ựược chắnh xác kắch thước của alen, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005)

Phương pháp tin sinh học áp dụng trên các trình tự giải mã: thống kê

trình tự DNA từng nhiễm sắc thể của chủng nghiên cứu ựã ựược giải mã trong ngân hàng gene Từ ựó, số lượng và thành phần các trình tự SSRs của loài sẽ ựược phân tắch bằng phần mềm tin sinh Tandem Repeat Finder (Benson, 1999)

2.3.5 Phân tắch trình tự SSRs

Có nhiều kỹ thuật SSRs khác nhau nhưng phổ biến nhất là PCR sử dụng 2 mồi F và R ựược thiết kế ở một locus bảo thủ ở 2 phắa của của SSRs Như vậy, cặp mồi này có thể ựược áp dụng cho mọi cá thể của loài và tạo ra sản phẩm PCR có kắch thước khác nhau nếu SSRs của các cá thể là khác nhau Tuy nhiên, ựể có ựược

bộ mồi thắch hợp không hề dễ dàng vì SSRs phải ựược phân lập trước (Hà Viết Cường, 2009)

Các bước chắnh trong phân tắch trình tự SSRs bao gồm:

1. Xây dựng thư viện SSRs

2. Xác ựịnh locus SSRs duy nhất

3. Xác ựịnh vùng thắch hợp ựể thiết kế mồi

4. Thử PCR

5. đánh giá và diễn giải các băng

6. đánh giá sản phẩm PCR tạo sự ựa hình

2.3.6 Vai trò của SSRs

Rất nhiều SSRs ựã ựược tìm thấy ở vùng phắa trên của các vùng khởi ựầu sao

mã của vùng mang mã Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền SSRs ựược dùng như một marker di truyền ựể nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản ựồ gen Tuy nhiên, có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự SSRs cũng ựóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố ựiều hòa SSRs ựược tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi ựầu sao mã của vùng mang

mã, và một số ñã ñược tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá Số lượng khác nhau của các ñoạn lặp lại của SSRs ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene

và chức năng của gene Ở một số trường hợp, sự thay ñổi (mất hoặc thêm) các ñơn

vị lặp lại của SSRs cũng làm thay ñổi chức năng hoạt ñộng của promotor Vị trí của SSRs gần hay xa promotor cũng làm hoạt ñộng của promotor thay ñổi Vùng ñiều khiển có chứa SSRs hoạt ñộng như một nhân tố thúc ñẩy quá trình phiên mã và những ñột biến mất ñoạn SSRs ñã làm giảm chức năng của gen

SSRs cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi ñộng của gen, khi trình tự này ñược giải phóng thì gen ñược khởi ñộng và sao mã ðiều này chỉ ra rằng SSRs hoạt ñộng như một yếu

tố ñiều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng ñến quá trình sao mã thông qua ảnh hướng ñến protein bám Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc ñẩy của SSRs và protein bám dính của nó là một chức năng của các ñoạn lặp lại trong một vùng SSRs ñặc biệt nào ñó Như một trình tự mang mã, SSRs ñã ñược tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong SSRs

có thể dẫn ñến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt ñộng của gen, do ñó

có thể ảnh hưởng ñến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể Một số nghiên cứu gần ñây ñã chỉ ra rằng, có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của SSRs ñến hình thái và sự phát triển ở mức ñộ cơ quan ñược tổng kết lại như một yếu

tố chức năng của hệ gen Những tính chất ñặc biệt của SSRs như sự ñột biến ñiểm dẫn ñến những giả thiết cho rằng SSRs có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự ña dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn ña dạng di truyền ñã bị mất trong quá trình chọn lọc,

nó hoạt ñộng như một “núm ñiều chỉnh” mà qua ñó những gen ñặc biệt có thể ñiều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay ñổi ít hay nhiều trong quá trình ñòi hỏi của tiến hóa Do vậy, SSRs là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu ña dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay ñổi của tiến hóa (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005)

Ứng dụng:

− Thiết kế bản ñồ gen trong di truyền

− ða dạng hóa vật liệu di truyền

− Nghiên cứu quần thể

− Chẩn đốn và xác định các bệnh ở người

− Sử dụng cho việc bảo tồn hệ sinh vật trong thiên nhiên

Nhược điểm của phương pháp SSRs:

Quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình

ðể xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dịng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN của genom cĩ chứa SSRs

Các sản phẩm PCR trong phân tích SSRs thường cĩ kích thước nhỏ (một vài trăm bp) và chênh lệch kích thước nhiều khi khơng nhiều dẫn tới phải điện di agarose nồng độ cao (~3 %) hoặc điện di polyacrylamide hoặc phân tích dùng máy sequencer tự động (đắt) (Hà Viết cường, 2009)

2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài

Trên thế giới, nấm men được sử dụng rộng rãi như là một sinh vật mẫu trong các nghiên cứu cơ bản, đặc biệt về Tế bào học, Di truyền học, Sinh học phân tử (Haber, 1998), v.v Bộ gen của nấm men đã được giải trình tự hồn tồn vào năm

1996 (Dujon, 1996) Cho đến nay, gần 5000 trong số khoảng 6000 gen của nấm men đã biết phần nào chức năng Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra các trình tự lặp lại đơn giản (SSRs) của nấm men phân bố trên cả 16 NST (Richard và Dujon, 1996; Field và Wills, 1998; Gallego và cs., 1998; Richard và cs., 1999; Young

và cs., 2000) và cũng cĩ mặt trên ti thể (Skelly và Clark-Walker, 1991) Một vài SSRs được sử dụng thành cơng trong mơ tả đặc điểm và phân biệt giữa các chủng

nấm men S cerevisiae (Couto và cs., 1996; Field và Wills năm 1998; Gallego và

cs., 1998; Hennequin và cs., 2001) Năm 2001, Perez đã phát hiện và sử dụng các

trình tự lặp lại đơn giản trong hệ gen của S cerevisiae như makers phân tử để phân biệt một số chủng S cerevisiae (Perez và cs., 2001)

Nghiên cứu ứng dụng nấm men bắt đầu bằng việc phân lập, phân loại, chọn lựa, lai tạo các chủng nấm men cĩ các tính trạng kinh tế tốt để dùng vào sản xuất thực phẩm, đồ uống cĩ cồn cũng như thức ăn chăn nuơi (Schuller và Casal, 2005; Becker và cs., 2003; Jespersen, 2003), các loại nấm men đột biến gen cĩ nguồn gốc

từ nấm men bánh mỳ (Shima và cs., 1999; Van Dijck và cs., 2000) Cùng với sự

phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, nấm men ñã ñược sử dụng ñể biểu hiện gen, các protein, enzyme tái tổ hợp hay tổng hợp các hợp chất thứ sinh phục vụ nhiều mục ñích khác nhau (Dang và cs., 2007; Nevoigt, 2008; Izawa và cs., 2004;

Wu và cs., 2003) Tuy nhiên, giống như ở các sinh vật khác, cơ chế ñầy ñủ của sự chống chịu các stress của nấm men vẫn chưa hoàn toàn ñược làm sáng tỏ Chủng nấm men toàn năng nhất vẫn còn ñang là mục tiêu của hàng nghìn nhà khoa học trên khắp thế giới

Hiện nay, việc tìm ra các loại nấm men có khả năng chịu lạnh, chịu áp suất thẩm thấu và chịu hạn là rất quan trọng Nhiều nỗ lực ñã ñược thực hiện bằng cách ñưa ra các phương pháp xác ñịnh các chủng nấm men có khả năng chịu ñông lạnh (Oda và cs., 1986), sử dụng công nghệ gen ñể tích lũy trehalose trong các tế bào nấm men ñể tăng khả năng chịu ñông lạnh của tế bào nấm men (Klaassen và cs., 1994; Shima và cs., 1999; Izawa và cs., 2004; Godkin và Catheart, 1949) Năm

2006, Yokoigawa và cộng sự ñã tìm ra giải pháp giúp làm tăng khả năng chịu lạnh của các loài nấm men trong sản xuất bánh mỳ, giúp chúng có khả năng lên men làm

nở bột mỳ nhào sẵn ñể lạnh bằng cách bổ sung thêm Poly-γ-Glutamate (PGA) vào bột nhào ñã có nấm men bánh mỳ bảo quản lạnh ở - 30oC và ñã cho kết quả rất tốt Các chủng nấm men bánh mỳ có khả năng chống lại sự ñông lạnh ñược biết ñến

như: S rosei, S cerevisiae FTY(FRI - 433), S cerevisiae IAM 4274, S cerevisiae KYF 110, S cerevisiae RTY-3 ñã ñược cấp bằng sáng chế ở Nhật Bản và S species

ñược cấp bằng sáng chế ở Mỹ, v.v (Endo, 1998)

Ngoài các chủng nấm men có khả năng chịu ñược lạnh các chủng chịu ñược khô hạn cũng rất ñược quan tâm vì hiện nay việc sản xuất nấm men khô khá phổ biến (Tsaousi và cs., 2008; Bekatorou và cs., 2001) Phương pháp sấy rất phát triển

và sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên, quá trình nhiệt

ñã không ñược áp dụng ñể sản xuất khô các loài vi sinh vật số lượng lớn, do vấn ñề

về tính khả thi và hiệu quả làm giảm khả năng hoạt ñộng của chúng Việc sản xuất

nấm men S cerevisiae ở dạng men ướt thường có chi phí cao Trong những năm

gần ñây, các nhà nghiên cứu ñã tập trung vào nghiên cứu về việc sấy khô chúng Việc phun sấy vi sinh vật, gần ñây ñã ñược báo cáo với cả những vi sinh vật có khả

năng tồn tại tương ựối thấp, thậm chắ ựối với cả vi khuẩn sinh axit lactic (Corcoran và cs., 2004; Desmond và cs., 2002; Gardiner và cs., 2000; Silva và cs., 2002), v.v Qua các nghiên cứu cho thấy, có thể làm tăng khả năng chịu khô hạn trong quá trình sấy bằng cách tăng lượng proline trong tế bào nấm men (Shima và Takagi, 2009) Trước ựây, nấm men chủ yếu ựược sản xuất và ựem ựi tiêu thụ ở dạng ựông lạnh nhưng như vậy chi phắ bảo quản và vận chuyển lại cao Việc sấy khô cũng khá ựơn giản, sau khi nuôi cấy chúng ựược sấy khô ở khoảng từ 30oC - 40oC và ựem ựi ựóng gói với ựộ ẩm của sản phẩm từ 5% - 8% (Koga và cs., 1966; Tsaousi và cs., 2008) Tuy nhiên, chất lượng lên men của chúng sau khi ựược sấy khô phần nào bị ảnh hưởng do trong quá trình sấy Việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm men có khả năng lên men cao sau khi sấy là việc rất cần thiết trong ngành công nghiệp thực phẩm

Ở nước ta, từ cuối những năm 60 ựến giữa những năm 90 của thế kỷ trước ựã

có khá nhiều nghiên cứu cơ bản về di truyền các tắnh trạng chống chịu của nấm men (đậu Ngọc Hào, 2000; Lê Thành Tâm, 1996; Nguyễn Văn Hưng và Lê đình Lương, 1990; Nguyễn Văn Hưng, 1990; Lê đình Lương và cs., 1988) và các nghiên

cứu ứng dụng nhằm sử dụng các loại nấm men trong ựó chủ yếu là S cerevisiae

trong công nghiệp thực phẩm, ựồ uống có cồn, thức ăn chăn nuôi, sản xuất protein, enzyme và kháng nguyên tái tổ hợp ở quy mô khác nhau (Trần Văn Hiếu và cs., 2006; Lê đình Lương và cs., 1988; Lê Thành Tâm và cs., 1989) Tại khoa Sinh của trường đại học Tổng hợp, GS TS Lê đình Lương và cộng sự ựã tạo ra các chủng nấm men mới bằng các phương pháp lai và dung hợp tế bào trần (Lê Thành Tâm và cs., 1993) Tại trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Lưu Thị Phương và cs ựã khảo sát giới tắnh và các tắnh trạng sinh học và chống chịu của các chủng nấm men bánh

mì (Saccharomyces cerevisiae), ựưa ra các chủng nấm men tốt có thể sử dụng ựể

sản xuất men giống phục vụ sản xuất bánh mỳ ở quy mô công nghiệp (Lưu Thị

Phương và cs., 2011) Năm 2012, Nguyễn Hữu Thanh và cs ựã phân lập ựược 128

chủng từ bánh men rượu ở đồng Bằng Sông Cửu Long, trong ựó phát hiện ựược một số chủng chịu nhiệt, chịu cồn, sinh bào tử và lắng tốt, không sinh H2S (Nguyễn

Hữu Thanh và cs., 2012) đây là những tiền ựề quý giá cho các nghiên cứu có hệ thống tiếp theo nhằm sử dụng nấm men vào mục ựắch kinh tế khác nhau

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 đối tượng nghiên cứu

40 isolate nấm men S cerevisiae ựược phân lập và thu thập từ 9 tỉnh trong

nước: Bắc Giang, Buôn Ma Thuật, Cao Bằng, Hà Nội, đồng Nai, Thanh Hóa, Sơn

La, Thái Bình, Hưng Yên; và từ 5 nước khác: đức, Nga, Pháp, Trung Quốc, Thái Lan (bảng 1)

Bảng 1 Danh sách 40 isolate nấm men ựược sử dụng trong nghiên cứu

1 SaBG1 Men cổ truyền Bắc Giang 1

2 SaBG2 Men cổ truyền Bắc Giang 2

3 SaBG3 Men cổ truyền Hiệp Hòa-Bắc Giang

4 SaBMT1 Hoàng Sơn Buôn Ma Thuật

5 SaBMT2 Hoàng Sơn Buôn Ma Thuật

6 SaBMT3 Nàng Hương Buôn Ma Thuật

12 SaDN Mauripan đồng Nai-ViệtNam

13 SaHN1 Men cổ truyền đông Anh-HN

14 SaHN2 Men cổ truyền đông Anh-HN

15 SaHN3 Men cổ truyền đông Anh - Hà Nội

16 SaHN4 Men rượu Hà Nội (An đào)

17 SaHT1 Men rượu Hà Nội (Mỹ đức)

18 SaHT2 Men rượu Hà Nội (Mỹ đức)

19 SaKDK1 Kinh đô (khô) Hưng Yên

20 SaKDK2 Kinh đô (khô) Hưng Yên

21 SaKDU1 Kinh đô (ướt) Hưng Yên

22 SaKDU2 Kinh đô (ướt) Hưng Yên

23 SaN1 paлpbiллnteлb tecta Nga

25 SaP1 SaF-Instant-SI.Lesaffre Pháp

26 SaP2 SaF-Instant-SI.Lesaffre Pháp

27 SaP3 SaF-Instant-SI.Lesaffre-men bánh mì Pháp

28 SaSL Men ngô Sơn La

29 SaTB1 Phú Hải Thái Bình

30 SaTB2 Hương Thơm Thái Bình

31 SaTB3 Men công nghiệp Thái Bình

32 SaTB4 Men rượu công nghiệp-Hương Lúa Thái Bình

33 SaTH1 Men cổ truyền Hoằng Hóa-Thanh hóa

34 SaTH2 Men cổ truyền Hoằng Hóa-Thanh hóa

35 SaTL Bánh mỳ Thái Lan

36 SaTQ Bánh mỳ Trung Quốc

37 SaVSH1 Rip432 Viện Sinh học nông nghiệp

38 SaVSH2 Rip187 Viện Sinh học nông nghiệp

39 SaVSH3 M2 Viện Sinh học nông nghiệp

40 SaVSH4 M3 Viện Sinh học nông nghiệp

3.1.2 Thiết bị

Các dụng cụ thiết bị của phòng thắ nghiệm bộ môn Công nghệ vi Sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Thiết bị bao gồm:

Bảng 2 Các thiết bị sử dụng trong ñề tài

xuất

Bộ chụp ảnh và xử lý hình ảnh sau ñiện di Bio - Rad Laboratories Mỹ

Cân kĩ thuật ñộ chính xác 0.01 g Mettler Toledo Thuỵ Sỹ Cân phân tích ñộ chính xác 0.1 mg Mettler Toledo Thuỵ Sỹ Kính hiển vi phóng ñại 1000 lần Leica Trung Quốc

Máy cất nước Hamilton Anh

Máy ño pH METTLER TOLEDO Switzerland Máy ño quang phổ tử ngoại và khả kiến Lamda - Scientific Australia Máy khuấy từ gia nhiệt VELP Italy/Châu Âu Máy lắc thường JSR Hàn Quốc Máy li tâm lạnh 13000 vòng/phút Hettich ðức

Máy sản xuất ñá lạnh cho thí nghiệm Evermed Italy

Máy vortex VELP Italy/Châu Âu Nồi hấp HVE - 50 Hyrayama Nhật Bản

Tủ ấm JSBI – 150C JSR Hàn Quốc

Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật Memmert ðức

Tủ cấy vô trùng JSR Hàn Quốc

Tủ lạnh sâu Operon Hàn Quốc

Tủ sấy dụng cụ JSR Hàn Quốc

Tủ sinh trưởng JSR Hàn Quốc

3.1.3 Hóa chất

Bảng 3 Các hoá chất sử dụng trong ñề tài

1kb DNA-Ladder Invitrogen ðức

Enzyme Taq polymerase MIX Qiagen Mỹ

Ethidium bromide Sigma Mỹ

Loading buffer Invitrogen ðức

Yeast extract Merck ðức

3.2 Môi trường

Môi trường nuôi S Cerevisiae:

Thành phần 1 lít môi trường YPD lỏng (yeast peptone dextrone):

Thành phần 1 lít mơi trường YPD lỏng trong thí nghiệm chịu áp suất thẩm thấu: 5% đường:

3.4 Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Thống kê tồn bộ các locus SSR của S cerevisiae

3.4.2 Khảo sát mức độ đa hình của các locus SSR nấm men bằng PCR

3.4.3 Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men

a. Khảo sát đặc điểm, hình thái của các isolate nấm men

b. Sự sinh trưởng theo mật độ quang

c. Khả năng tạo sinh khối

d. Khả năng chịu cồn

e. Khả năng chịu áp suất thẩm thấu

f Khả năng chịu lạnh

g. Khả năng chịu khơ hạn

h. Khả năng lên men rượu trên mơi trường dịch chiết đu đủ

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Thống kê toàn bộ các locus SSRs của S cerevisiae

Trình tự DNA của từng nhiễm sắc thể của các chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae SC288 (Goffeau và cs., 1996) ñã ñược công bố trên ngân hàng gene Từ ñó, số lượng và thành phần các trình tự SSR của loài ñược phân tích bằng phần mềm Tandem Repeat Finder (Benson, 1999) ñược cung cấp tại ñịa chỉ http://tandem.bu.edu/trf/trf.html

3.5.2 Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR

a. Thiết kế mồi bằng tiện ích của Workbench 3.2

Trình tự mồi ñược thiết kế trong vùng trình tự chặn 2 ñầu của mỗi locus SSR, sử dụng phần mềm Primer3 ñược cung cấp trực tuyến bởi ñại học California, San Diego (http://workbench.sdsc.edu/) Chiều dài của mồi ñược thiết kế trong khoảng 18-25 nucleotide (nu), và các vùng trình tự ñược thiết kế sao cho không xuất hiện cấu trúc bậc 2 cũng như các chuỗi lặp ñơn ðồng thời, mồi ñược thiết kế sao cho tỉ lệ GC nằm trong khoảng 40-60% và Tm khoảng 55oC Bên cạnh ñó, mồi cho các chỉ dấu ISSR cũng ñược thiết kế theo cách tương tự

b Phản ứng PCR kiểm tra sự ña hình ở các locus SSR

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ polymerase)

là một trong những phương pháp ñược sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985, ñược giới thiệu lần ñầu tiên tại hội thảo thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986, và ông ñã ñược nhận giải thưởng Nobel hoá sinh học vào năm 1993

Nguyên tắc của phương pháp PCR là dựa vào ñặc tính hoạt ñộng của DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt về hoạt ñộng tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Như vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai ñầu của một trình tự DNA ta sẽ tổng hợp ñược ñoạn DNA nằm giữa hai mồi ñó Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng ñoạn DNA riêng biệt ðây thực sự là phương pháp thuận lợi cho việc xác ñịnh sự

có mặt của một gen nào ñó trong tế bào với ñộ chính xác cao

Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích 25 µl, gồm 1 µl DNA khuơn; 2,5µl đệm PCR 10x (100 mM Tris-HCl pH 8; 500 mM KCl; 25 mM MgCl2); 0,5 µl mồi; 1 U Taq polymerase Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được lập trình như sau: 95ºC trong 5 phút (1), 94ºC trong 30 giây (2), 49oC- 57oC (nhiệt độ này phụ thuộc vào từng mồi nghiên cứu) trong 1 phút 30 giây (3), 72ºC trong 1 phút 30 giây (4) và

35 chu kỳ lặp lại từ (2) đến (4); (5) 72ºC trong 5 phút và sau đĩ giữ lạnh ở 4ºC

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,5% ở 100V trong 50 phút, nhuộm trong ethidium bromide và soi dưới đèn UV để chụp ảnh

c Phân tích kết quả

Dựa trên kết quả điện di sản phẩm PCR, các băng trên gel được xác định và quy ước (0) khơng cĩ băng và (1) cĩ băng Hệ số tương đồng di truyền Jaccard trong NTSYSpc phiên bản 2.1 được sử dụng để phân tích đánh giá mối liên hệ về mặt di truyền giữa các chủng nấm men (Rohlf, 1988) Kết quả được phân tích các băng sản phẩm PCR dùng để phân tích độ tương đồng và vẽ sơ đồ hình cây về mức

độ tương đồng di truyền

Phân tích kết quả và tìm mối liên hệ giữa các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men với kiểu hình SSR

3.5.3 Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập đồn nấm men

a Khảo sát đặc điểm hình thái của các isolate nấm men

Các đặc điểm nuơi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc; hình thái tế bào nấm men (Lương ðức Phẩm, 2009)

Quan sát khuẩn lạc của các isolate nấm men trên mơi trường YPD agar: bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc, mép khuẩn lạc

Quan sát tế bào: nhằm xác định hình dạng, 5 µl mẫu và 5 µl glycerol 87% được hút lên lam kính và khuấy đều, đậy lamen lại đem quan sát dưới kính hiển vi

b Sự sinh trưởng của các isolate nấm men theo mật độ quang

Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy đo quang phổ được sử dụng rộng rãi Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp thụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch cĩ vật chất lơ lửng ðể đánh giá tốc độ phát triển của

nấm men ta có thể ño sự tăng sinh khối qua giá trị OD Tất cả các thí nghiệm ñược

ño ở bước sóng trong khoảng 580 nm ñến 660 nm

Tiến hành:

ðo OD (λ = 620 nm) các mẫu nấm men ñược nuôi lắc 1 ngày ñể xác ñịnh lượng mẫu cần cho vào môi trường nuôi ño tốc ñộ sinh trưởng ñể OD ban ñầu của các mẫu này là bằng nhau Mỗi một mẫu ñược cho vào 70 ml môi trường ñược ñựng trong lọ ñã hấp sẵn và lắc ñều ñem ño OD ở To (thời ñiểm bắt ñầu) với dung dịch chuẩn là môi trường YPD lỏng Sau khi ño xong ñem nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và 2 tiếng ño 1 lần với nồng ñộ pha loãng thích hợp sao cho OD luôn nằm trong khoảng từ 0,1 ñến 0,5 ñể ñảm bảo trị số OD và số tế bào trong dịch ño là

tỷ lệ tuyến tính (Lưu Thị Phương và cs., 2011)

c Khả năng tạo sinh khối của các isolate nấm men

Nấm men ñược cấy trải trên môi trường thạch YPD Sau 48h, các tế bào từ một khuẩn lạc ñơn cho vào 5 ml YPD lỏng và nuôi ở 30˚C Sau 48h, sinh khối nấm men ñược ly tâm 4000 rpm trong 5 phút Năng suất sinh khối nấm men ñược tính bằng số gam sinh khối nấm men/ lít môi trường

d Khả năng chịu cồn của các isolate nấm men

Cồn ñược tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại là chất ñộc kìm hãm các nấm men Khả năng chịu cồn của nấm men là khả năng phát triển và hoạt ñộng của nấm men khi nuôi cấy ở nồng ñộ cồn cao

Dựa trên lượng sinh khối các isolate nấm men thu ñược khi ñược nuôi trên môi trường YPD với nồng ñộ cồn 10% trong 48 giờ nuôi, mức ñộ chịu cồn của các isolate nấm men ñược xác ñịnh

e Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của các isolate nấm men

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men S cerevisiae là một tính trạng rất

ñáng ñược quan tâm vì nó liên quan tới ứng dụng ñặc thù trong sản xuất bánh mỳ như

sử dụng làm bánh mỳ ngọt, bánh ngọt, v.v., hay sản xuất sinh khối nấm men

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men ñược xác ñịnh dựa trên sinh khối thu ñược của các isolate nấm khi ñược nuôi trên môi trường YPD với nồng ñộ ñường 5% và 15% ở giai ñoạn sau 48h nuôi

f Khả năng chịu lạnh của các isolate nấm men

Khả năng chịu lạnh của nấm men là một ñề tài rất rộng (Holmes và Hoseney,

1987; Hino và cs., 1987) Khả năng sống sót và chất lượng lên men tốt của nấm men S

cerevisiae bị ảnh hưởng bởi chu kỳ ñóng băng - tan băng, tuổi tế bào nấm men, hàm lượng ñường trong bột, hàm lượng protein, bộ khung của bột nhào (Hsu và cs., 1979),

hiệu quả chung phụ thuộc vào mỗi chủng nấm men (Hino và cs., 1987)

Yokoigawa và cs ñã làm thí nghiệm chịu lạnh của nấm men bánh mỳ bằng cách ñể chúng ở - 20oC trong 3 ngày sau ñó làm tan băng ñá ở 30oC trong 10 phút Nấm men sau khi bị ñóng băng và làm tan băng ñược nuôi trong môi trường YPD lỏng rồi ñược ño OD tại λ = 620 nm ðồng thời, các mẫu nấm men cũng ñược nuôi với nồng ñộ pha loãng thích hợp trên ñĩa thạch ở 30oC trong 48 giờ

Tỷ lệ sống sót ñược tính toán từ số lượng các tế bào sống trước và sau khi ñóng ñá và tan ñá

Do:

Thực tế khi tiến hành thí nghiệm cho thấy, trước pha ổn ñịnh trung bình sau nuôi lắc 2 giờ ở 200 vòng/phút, 30oC với môi trường YPD thì số lượng tế bào tăng gấp ñôi

OD từ 0,1 ñến 0,5 thì chỉ số OD và số tế bào là tuyến tính (Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà, 2009)

OD bằng 1 tương ñương với khoảng 1,5.107 tế bào (Xiao, 2005)

Giả sử: Tổng số tế bào của mẫu là a

Số tế bào sống là x

Số tế bào chết là y

Ta có phương trình sau: x + y = a

Sau 2 giờ tổng số tế bào của mẫu là: 2x + y <=> 2x + (a – x)

Nếu coi thời gian nuôi là t (t = 2, 4, 6, 8, 10) thì số tế bào sống tương ứng với khoảng thời gian ñó là: 2t/2.x

Tổng số tế bào là: 2t/2.x + (a – x) <=> (2t/2 – 1)x + a (1)

Từ công thức (1) ta có thể tính ra x ( số tế bào sống sót)

Tỷ lệ số tế bào sống là: x/a.100%

Tỷ lệ số tế bào chết là: (a – x)/a.100%