NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH TRÊN BỆNH NHÂN LAO PHỔI MỚI MẮC TẠI BỆNH VIỆN LAO VÀ BỆNH PHỔI CẦN THƠ

1. ĐẶT VẤN ĐỀHàng năm có khoảng 3 triệu người chết vì bệnh lao, 9 triệu người mắc bệnh lao mới với một phần ba dân số trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao đã đưa bệnh lao vào danh sách một trong ba loại bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất đó là HIVAIDS, bệnh lao và bệnh sốt rét 8. Bệnh lao do vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) gây ra, đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay 1. Bệnh cảnh lâm sàng của lao rất đa dạng và diễn biến mạn tính. Vai trò của hệ thống miễn dịch trong bệnh lao chính là khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, sự tương tác của các tế bào lympho với đại thực bào mang vi khuẩn lao đóng vai trò quan trọng trong khả năng bảo vệ của cơ thể 2. Các tế bào bạch cầu hay cụ thể là lympho T, các nhóm lympho T4 và T8 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát vi khuẩn lao. Số lượng các tế bào miễn dịch thể hiện sức đề kháng của bệnh nhân khi mắc bệnh lao. Vì vậy việc đánh giá số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân mắc lao sẽ góp phần làm sáng tỏ khả năng đáp ứng của bệnh nhân nhằm cung cấp thêm thông tin cho việc điều trị bệnh lao một cách có hiệu quả. Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự biến đổi các thông số miễn dịch trên bệnh nhân lao phổi mới mắc tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Cần Thơ năm 2013 2014” với mục tiêu như sau: Xác định số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới. Xác định sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với người bình thường (nhóm đối chứng).2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUĐây là một nghiên cứu mô tả cắt ngang2.1. Đối tượngTiêu chuẩn chọnNhóm bệnh: Bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi lần đầu hoặc bệnh nhân đã được chẩn đoán và điều trị lao phổi trước đây nhưng thời gian điều trị dưới 1 tháng đang được điều trị tại Bệnh viện Lao và bệnh phổi Cần Thơ từ tháng 072013 đến tháng 052014. Thuộc hai giới nam và nữ, tuổi trên 15.Nhóm đối chứng: Những người đến khám sức khỏe định kỳ tại bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ có xét nghiệm công thức máu, sinh hóa máu bình thường. Thuộc hai giới nam và nữ, tuổi trên 15.Tiêu chuẩn loại trừ: Những người bị nhiễm HIV hoặc các bệnh nhiễm trùng khác, người có bệnh mạn tính, người đang sử dụng thuốc ức chế miễn dịch và những người không đồng ý tham gia nghiên cứu đều bị loại trừ.2.2. Phương phápCác đối tượng đã chọn được lấy máu tĩnh mạch trong chất chống đông EDTA và xét nghiệm ngay trong 24 giờ. Xét nghiệm công thức máu được thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. Xét nghiệm đếm dòng chảy tế bào được thực hiện tại viện Paster TP Hồ Chí Minh, sử dụng máy Facs Canto II của hãng Becton Dichinson.Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch trực tiếp và đếm dòng chảy tế bào (Flow Cytometry). Phân định tế bào dựa vào sự hiện diên của kháng nguyên bề mặt. Với hệ thống Facs Canto II 6 màu, chúng tôi có thể nhận diện cùng lúc 6 dấu ấn trên màng tế bào (CD45, CD3, CD19, CD1656, CD4 và CD8). Bộ Kit định danh gồm các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khác nhau: CD3FITC; CD16 and CD56PE; CD45PerCPCy5.5; CD4PECy7 ; CD19APC; CD8APCCy7.Số liệu chúng tôi xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 18.0

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

ĐẶNG QUỐC THÁI

NGHIÊN CỨU

SỰ BIẾN ĐỔI CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH

TRÊN BỆNH NHÂN LAO PHỔI MỚI MẮC

TẠI BỆNH VIỆN LAO VÀ BỆNH PHỔI CẦN THƠ

NĂM 2013 - 2014

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ ĐA KHOA

CẦN THƠ - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

ĐẶNG QUỐC THÁI

NGHIÊN CỨU

SỰ BIẾN ĐỔI CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH

TRÊN BỆNH NHÂN LAO PHỔI MỚI MẮC

TẠI BỆNH VIỆN LAO VÀ BỆNH PHỔI CẦN THƠ

NĂM 2013 - 2014

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ ĐA KHOA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

THS DƯƠNG THỊ LOAN

CẦN THƠ - 2014

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Dương Thị Loan người đã dành nhiều thời gian hướng dẫn tận tình, động viên, cung cấp tài liệu, kiến thức quý báo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ, các nhân viên y tế của bệnh viện Lao và Bệnh Phổi Thành Phố Cần Thơ, các anh chị phòng xét nghiệm bệnh viện Đại Học Y Dược Cần Thơ

Tôi xin cám ơn tập thể bộ môn Sinh lý bệnh – Miễn dịch Khoa Y, đặc biệt

là PGS TS BS Trần Ngọc Dung đã giúp đỡ, tạo cơ hội và cung cấp mọi thứ cần thiết, cũng như luôn động viên khích lệ tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn Cám ơn các thầy cô ở các bộ môn thực tập lâm sàng đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể vừa hoàn thành khóa học vừa thực hiện hoàn tất luận văn này

Tôi vô cùng biết ơn cha mẹ, anh chị em trong gia đình đã yêu thương, luôn luôn thông cảm, cùng chia sẽ những khó khăn để tôi có thể yên tâm hoàn thành

và đạt được kết quả tốt trong suốt quá trình học tập

Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp YD – K34, Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

Người thực hiện đề tài

Đặng Quốc Thái

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện nghiêm túc trong suốt quá trình thu thập số liệu tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành Phố Cần Thơ, xét nghiệm xác định các dấu ấn tế bào bằng phương pháp đếm dòng chảy tại viện PASTER Thành Phố Hồ Chí Minh, xét nghiệm công thức máu tại phòng xét nghiệm bệnh viện Đại Học Y Dược Cần Thơ Kết quả nghiên cứu của tôi chưa từng được công bố ở các công trình nghiên cứu khoa học khác

Người thực hiện đề tài

Đặng Quốc Thái

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình và biểu đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam 4

1.2 Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) 5

1.3 Chẩn đoán và điều trị lao phổi mới 6

1.3.1 Chẩn đoán bệnh lao phổi mới 6

1.3.2 Điều trị bệnh lao phổi 6

1.4 Đáp ứng miễn dịch trong lao phổi mới 7

1.4.1 Vai trò của tế bào T-CD4, T-CD8 trong đáp ứng miễn dịch 7

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao 10

1.5 Những nghiên cứu trước đây về số lượng tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1.Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 17

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 18

2.2.2 Mẫu nghiên cứu 18

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.4 Phương pháp thu thập số liệu 20

2.2.5 Phương pháp hạn chế sai số 25

2.2.6 Xử lý số liệu và phân tích kết quả 25

2.3 Đạo đức nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu 27

3.1.1 Đặc điểm về giới tính 27

3.1.2 Đặc điểm về nhóm tuổi 28

3.1.3 Đặc điểm lâm sàng của nhóm bệnh nhân lao phổi mới 29

3.2 Số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới 29

3.2.1 Số lượng bạch cầu chung và các loại bạch cầu ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 29

3.2.2 Số lượng các tế bào lympho T (CD3), lympho B (CD19) và NK (CD16/56) nhóm bệnh nhân lao phổi mới 32

3.2.3 Số lượng các tế bào dưới nhóm lympho T (T-CD4, T-CD8) ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 35

3.3 Sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với nhóm đối chứng 36

3.3.1 Sự khác biệt về số lượng bạch cầu chung và các loại tế bào bạch cầu 36

3.3.2 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho T (CD3) 37

3.3.3 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho B (CD19) 38

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41

4.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu 41

4.1.1 Đặc điểm về giới tính 41

4.1.2 Đặc điểm về nhóm tuổi 42

4.1.3 Đặc điểm lâm sàng 43

4.2 Số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới 44

4.2.1 Số lượng bạch cầu chung và các loại bạch cầu ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 44

4.2.2 Số lượng các tế bào lympho T (CD3), lympho B (CD19) và NK (CD16/56) nhóm bệnh nhân lao phổi mới 45

4.2.3 Số lượng các tế bào dưới nhóm lympho T (T-CD4, T-CD8) ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 47

4.3 Sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với nhóm đối chứng 48

4.3.1 Sự khác biệt về số lượng bạch cầu chung và các loại tế bào bạch cầu 48

4.3.2 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho T (CD3) 49

4.3.3 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho B (CD19) 50

4.3.4 Sự khác biệt về số lượng tế bào NK (CD16/56) 51

4.3.5 Sự khác biệt về số lượng tế bào T-CD8 và T-CD4 52

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AND Acid Deoxyribo Nucleic

AFB Acid Fast Bacillus

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome APC Antigen Presenting Cell

27

Bảng 3.2 Nhóm tuổi trong nhóm đối chứng và nhóm bệnh nhân lao phổi mới 28 Bảng 3.3 Số lượng bạch cầu chung ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 30

Bảng 3.4 Tỉ lệ bạch cầu chung trong nhóm bệnh nhân lao phổi mới 30

Bảng 3.5 Số lượng các loại bạch cầu ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 31

Bảng 3.6 Số lượng các loại tế bào bạch cầu theo giới tính 31

Bảng 3.7 Số lượng các tế bào lympho T (CD3), lympho B (CD19) và NK (CD16/56) ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 33

Bảng 3.8 Số lượng các tế bào lympho T (CD3), lympho B (CD19) và NK (CD16/56) theo giới tính 33

Bảng 3.9: Số lượng tế bào T-CD4, T-CD8 ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới 35

Bảng 3.10 Số lượng tế bào T-CD4, T-CD8 theo giới tính 35

Bảng 3.11 Sự khác biệt về số lượng bạch cầu chung và các loại tế bào bạch cầu của nhóm bệnh nhân lao phổi mới với nhóm đối chứng 37

Bảng 3.12 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho T (CD3) của nhóm bệnh nhân lao phổi mới với nhóm đối chứng 37

Bảng 3.13 Sự khác biệt về số lượng tế bào lympho B (CD19) của nhóm bệnh nhân lao phổi mới với nhóm đối chứng 38

Bảng 3.14 Sự khác biệt về số lượng tế bào NK (CD16/56) của nhóm bệnh nhân lao phổi mới với nhóm đối chứng 38

Bảng 3.15 Sự khác biệt về số lượng tế bào T-CD4, T-CD8 của nhóm bệnh nhân lao phổi mới với nhóm đối chứng 39

Bảng 3.16 Tỉ lệ phần trăm nhóm tế bào T-CD4 ở nhóm bệnh nhân lao phổi 39

Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh lao trên thế giới năm 2012 (WHO, 2013) 4

Hình 1.2 Các dấu ấn phân biệt màng tế bào 8

Hình 1.3 Hai kiểu đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 12

Hình 1.4 Mối tương quan qua lại giữa tế bào T-CD4+ và ĐTB 13

Hình 2.1 Máy đếm tế bào dòng chảy tế bào FACS CANTO II 22

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân lao phổi mới 29

Biểu đồ 3.2 Số lượng các loại tế bào bạch cầu theo nhóm tuổi 32

Biểu đồ 3.3 Số lượng các tế bào lympho T (CD3), lympho B (CD19) và NK (CD16/56) theo nhóm tuổi 34

Biểu đồ 3.4 Số lượng tế bào T-CD4, T-CD8 theo nhóm tuổi 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hàng năm có khoảng 3 triệu người chết vì bệnh lao, 9 triệu người mắc bệnh lao mới với một phần ba dân số trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao đã đưa bệnh lao vào danh sách một trong ba loại bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất đó là HIV/AIDS, bệnh lao và bệnh sốt rét [40] Và "bệnh lao đang quay trở lại với tương lai" (WHO, 1993) do sự xuất hiện của đại dịch HIV/AIDS, sự nghèo đói

và phân hóa giàu nghèo, tình trạng di dân và sự xuống cấp của hệ thống y tế do chiến tranh, khủng hoảng kinh tế, thiên tai Do vậy, công tác phòng chống và điều trị lao đã trở thành một Chương Trình Y tế Quốc gia ở Việt Nam (11/1994) với sự quan tâm của Đảng và Nhà nước ta

Bệnh lao do vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) gây ra, đã được biết

rõ từ hơn một thế kỷ nay Bệnh lao lây lan rất nhanh, đặc biệt là ở những người suy giảm miễn dịch Ngày 24 tháng 3 năm 2007 Tổ Chức Y Tế Thế Giới và Hiệp Hội Bệnh Lao Thế Giới đã cảnh báo “bệnh lao đã có ở một nơi thì sẽ có ở mọi nơi”, “bệnh lao không biên giới”, không một quốc gia nào có thể đảm bảo “giữ sạch cho riêng mình” Mặc dù lao là một bệnh dễ chữa nhưng hiện nay trên thế giới đã xuất hiện nhiều chủng trực khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh trong cộng đồng, đe dọa gây bệnh cho hàng triệu người Bệnh cảnh lâm sàng của lao rất đa dạng và thường diễn biến mạn tính

Vai trò của hệ thống miễn dịch trong bệnh lao chính là khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, sự tương tác của các tế bào lympho với đại thực bào mang vi khuẩn lao đóng vai trò quan trọng trong khả năng bảo vệ của cơ thể Các tế bào bạch cầu hay cụ thể là lympho T, các nhóm lympho T4 và T8 đóng

vai trò quan trọng trong việc kiểm soát vi khuẩn lao Số lượng các tế bào miễn dịch thể hiện sức đề kháng của bệnh nhân khi mắc bệnh lao Vì vậy việc đánh giá số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân mắc lao sẽ góp phần làm sáng tỏ khả năng đáp ứng của bệnh nhân nhằm cung cấp thêm thông tin cho việc điều trị bệnh lao một cách có hiệu quả Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi thực hiện

đề tài “Nghiên cứu sự biến đổi các thông số miễn dịch trên bệnh nhân lao

phổi mới mắc tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Cần Thơ năm 2013 - 2014” với

mục tiêu như sau:

1 Xác định số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới

2 Xác định sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với người bình thường (nhóm đối chứng)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2013 có khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm lao và 1,3 triệu người tử vong do lao [3] Hiện nay, bệnh lao vẫn là một trong số các bệnh nhiễm trùng gây tử vong cao nhất tại các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam Đặc biệt nguy hiểm là sự xuất hiện các chủng lao kháng thuốc

Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh lao trên thế giới năm 2012 (WHO, 2013)

Năm 2012, ước tính có khoảng 8,7 triệu trường hợp nhiễm lao mới trong đó

có khoảng 500.000 trẻ em và 2,9 triệu trường hợp là phụ nữ, cứ khoảng 100.000 dân thì có 125 trường hợp mắc lao mới Châu Á và châu Phi là 2 khu vực có dân

số nhiễm lao cao nhất (Châu Á: 59%, Châu Phi: 26%) [40] Năm quốc gia có tỉ

lệ nhiễm lao cao nhất gồm: Ấn Độ (2 triệu – 2,5 triệu), Trung Quốc (0,9triệu - 1,1 triệu), Nam Phi (0,4 triệu – 0,6 triệu), Indonesia (0,4 triệu – 0,5 triệu ), Pakistan (0,3 triệu – 0,5 triệu) [40] Đông Nam Á là khu vực chiếm hơn 1/3 tổng

số trường hợp mắc bệnh lao [6]

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (WHO, 2013) Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm Mỗi năm, Việt Nam có khoảng 130.000 người mắc lao mới, 170.000 người mắc lao lưu hành, khoảng 3.500 người mắc lao đa kháng thuốc và đặc biệt có đến 18.000 người tử vong do bệnh lao [3] Riêng tại Cần Thơ, trong năm 2009, bệnh viện Lao và bệnh phổi TP Cần Thơ thống kê cho thấy tỷ lệ bệnh lao mới là 167,5/100000 dân Năm 2010 tỷ lệ bênh lao mới tăng lên 185/100000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) là 42/100000 dân [11] Chương trình Chống lao quốc gia mỗi năm phát hiện khoảng 100.000 bệnh nhân lao và đã chữa khỏi cho 92%

số bệnh nhân này Những người mắc bệnh lao trong cộng đồng không được chẩn đoán đang là vấn đề cần quan tâm [9] Theo đó, tới năm 2015 Việt Nam phấn đấu giản 50% số bệnh nhân mắc và tử vong do bệnh lao so với năm 2000 Cụ thể, đến hết 2015 phấn đấu giảm số người mắc lao trong cộng đồng xuống dưới

187/100.000 người, giảm số người chết do bệnh lao xuống dưới 18/100.000

người [3], [40]

1.2 Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)

Mycobacterium tuberculosis là một loài vi khuẩn gây bệnh trong chi Mycobacterium và là tác nhân gây bệnh của hầu hết các ca bệnh lao, đặc biệt là

lao phổi [12] Lần đầu được phát hiện ra vào năm 1882 bởi Robert Koch, M

tuberculosis có một lớp phủ sáp trên bề mặt tế bào, chủ yếu là mycolic acid, làm

cho các tế bào khó thấm nước hơn và kháng ancol-acid Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của nó: nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được gọi là "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt là AFB) Nó không được phân loại gram dương hay gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan Đây là vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxy [5] Trực khuẩn lao có hình dạng hình que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn yếu

và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần, nhưng nó chỉ có thể phát triển

trong sinh vật ký chủ M tuberculosis phân chia sau mỗi 15 - 20 giờ, rất chậm so

với các vi khuẩn khác [5]

Khi ở trong phổi, trực khuẩn lao bị bắt giữ bởi các đại thực bào phế nang, nhưng chúng không thể tiêu hóa vi khuẩn Thành tế bào của nó ngăn cản sự hợp nhất của các thể thực bào với một lysosome, nó không ngăn sự hợp nhất của các túi chứa đầy chất dinh dưỡng Do đó, các vi khuẩn lao sử dụng chất dinh dưỡng

và phân chia không được kiểm soát trong các đại thực bào Các vi khuẩn mang gen UreC, ngăn ngừa quá trình axit hóa của các thể thực bào Các vi khuẩn né tránh sự tiêu diệt của đại thực bào bằng cách trung hòa các chất trung gian nitơ phản ứng [10], [35]

1.3 Chẩn đoán và điều trị lao phổi mới

1.3.1 Chẩn đoán bệnh lao phổi mới

Định nghĩa bệnh nhân lao mới: là bệnh nhân chưa từng dùng thuốc kháng lao hoặc đã dùng thuốc kháng lao dưới 1 tháng

Lao phổi gồm có 2 thể bệnh: lao phổi AFB (+) và lao phổi AFB (-)

1.3.1.1 Chẩn đoán lao phổi có AFB (+)

- Tối thiểu có 2 tiêu bản (+) từ 2 mẫu đàm khác nhau

- Có 1 tiêu bản (+) và có hình ảnh tổn thương nghi ngờ trên phim Xquang

- Có 1 tiêu bản (+) và nuôi cấy (+)

Riêng đối với người bệnh HIV(+) cần có ít nhất 1 tiêu bản xét nghiệm đàm

AFB(+) được coi là lao phổi AFB(+) [6]

1.3.1.2 Chẩn đoán lao phổi AFB (-)

- Kết quả xét nghiệm (-) ít nhất 6 mẫu đàm khác nhau ở 2 lần thăm khám cách nhau 2 tuần đến 1 tháng và có tổn thương nghi ngờ lao trên phim Xquang được bác sĩ chuyên khoa tuyến tỉnh kết luận

- Kết quả xét nghiệm (-), nuôi cấy (+)

Riêng đối với người bệnh HIV(+) chỉ cần ≥ 2 tiêu bản đờm AFB(-), điều trị

kháng sinh phổ rộng không thuyên giảm, có hình ảnh Xquang phổi nghi lao và bác sĩ chuyên khoa quyết định là lao phổi AFB (-) [6]

1.3.2 Điều trị bệnh lao phổi

Hiện nay ở nước ta có 3 phác đồ được sử dụng để điều trị lao phổi [6],

[17]

- Lao phổi mới: 2SRHZ/6HE

- Lao phổi thất bại, tái phát: 2SRHZE/1RHZE/5R3H3E3

- Lao trẻ em, phụ nữ có thai: 2RHZ/4RH

1.4 Đáp ứng miễn dịch trong lao phổi mới

1.4.1 Vai trò của tế bào T-CD4, T-CD8 trong đáp ứng miễn dịch

1.4.1.1 Nguồn gốc và quá trình phát triển của tế bào T-CD4, T-CD8, lympho T (CD3)

Tế bào gốc sinh máu trong tủy xương sinh ra tế bào gốc định hướng lympho

và dòng tủy Từ tế bào gốc định hướng dòng lympho chúng lại phân chia thành hai nhóm chính: tế bào B progenitor và T progenitor Các tế bào này tiếp tục biệt hóa thành các tế bào lympho trưởng thành gồm lympho B, tương bào, lympho T-CD4, lympho T-CD8 để thực hiện các chức năng sống riêng biệt

Khi qua tuyến ức, lympho T bị giữ lại nhờ sức hoá ứng động rất lớn của chất thymotaxin do chính tuyến ức tiết ra Thoạt đầu nó “định cư” ở vùng vỏ tuyến ức, được sinh sản, biệt hoá và trưởng thành tại đây sau đó di cư vào vùng tuỷ tuyến ức, tiếp tục chín và tung ra máu để “định cư” lần 2 ở các cơ quan bạch huyết như hạch, lách, niêm mạc Trong quá trình phát triển, các tế bào lympho

T có nhiều sự thay đổi về dấu ấn màng và thụ thể bề mặt, tạo ra hai nhóm tế bào

T là αβ-T và γδ-T Khi rời tuyến ức, chúng có tới trên 80% là cặp gen αβ-T, các cặp gen γδ-T rất ít (dưới 20%) Sau đó, αβ-T tạo ra hai dưới nhóm T-CD4 và T-CD8 tại tuyến ức T-CD4 và T-CD8 có chức năng khác nhau nhưng liên quan với nhau rất mật thiết, tuy nhiên T-CD4 đóng vai trò quyết định chi phối toàn bộ hoạt động của các tế bào miễn dịch [14]

Hình 1.2 Các dấu ấn phân biệt màng tế bào (Nguồn http://en.wikipedia.org/wiki/File:Cluster_of_differentiation.svg)

1.4.1.2.Chức năng tế bào T-CD4, T-CD8 trong đáp ứng miễn dịch

Tế bào T-CD4 là một phân nhóm quan trọng nhất của tế bào lympho T Chức năng chính của nó là nhận biết kháng nguyên lạ và điều hòa hệ thống miễn dịch của cơ thể [14]

- Chức năng nhận biết kháng nguyên:

Tế bào T-CD4 có vai trò quan trọng bậc nhất trong nhận biết kháng nguyên ngoại sinh Khi các kháng nguyên này xâm nhập vào cơ thể, hầu hết bị đại thực bào bắt giữ, cắt thành những mảnh peptid thẳng và hiện lên bề mặt tế bào nhờ các phân tử MHC lớp II Phân tử này được gắn kết đặc hiệu với phân tử CD4 trên bề mặt tế bào T-CD4 nên các thụ thể của T-CD4 mới có điều kiện nhận diện kháng nguyên do MHC lớp II trình ra bề mặt đại thực bào Khi có sự nhận diện kháng nguyên ngoại lai thông qua phức hợp TCR-HLA lớp II-peptid lạ sẽ tạo sự khuếch đại tương tác hai chiều giữa đại thực bào và tế bào lympho T-CD4 Đại thực bào tiết ra IL-1 để hoạt hóa T-CD4 T-CD4 đã được hoạt hóa sẽ tiết IFN-γ kích thích ngược lại làm cho đại thực bào trở thành các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) tốt hơn

Các kháng nguyên nội sinh có bản chất là các peptide bất thường được tổng hợp bởi các tế bào của cơ thể bị nhiễm vi trùng hoặc từ các tế bào của cơ thể bị ung thư, được nhận diện bởi tế bào T-CD8 thông qua phân tử MHC lớp I Nhưng lúc này, T-CD8 chưa có khả năng loại trừ ngay kháng nguyên mới nhận diện mà còn phải chờ sự “giúp đỡ” từ tế bào T-CD4 hoạt hóa thì mới phát huy được khả năng “tiêu diệt” tế bào đích của mình Tóm lại, khi có kháng nguyên vào cơ thể, tùy theo bản chất kháng nguyên mà có các loại tế bào nhận diện khác nhau như đại thực bào, tế bào T-CD4, T-CD8, lympho B Tuy nhiên, tất cả chỉ dừng lại ở bước nhận diện, chưa thể có đáp ứng miễn dịch xảy ra nếu không có

sự tương tác từ tế bào T-CD4 hoạt hóa [14]

- Chức năng điều hòa miễn dịch:

Đây là giai đoạn diễn ra ngay sau khi nhận biết kháng nguyên Sự hoạt hóa của tế bào T-CD4 thể hiện ở chỗ, các cytokin IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ mà nó tiết ra tác động lên một loạt các tế bào khác, mà trước hết là lên bản thân T-CD4,

rồi T-CD8, lympho B, TDTH Kết quả là các tế bào T-CD4 phát triển mạnh mẽ, các đại thực bào, tế bào lympho B, tế bào T-CD8, tế bào NK được hoạt hóa và đồng loạt trở thành các tế bào thực thi Đại thực bào hoạt hóa sẽ có khả năng thực bào và trình diện kháng nguyên tốt hơn Tế bào lympho B dưới tác dụng của IL-2, IL-4, IL-5 sẽ hoạt hóa thành các tương bào sinh kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể chống lại vi khuẩn xâm nhập Tế bào T-CD8 được hoạt hóa bởi IL-2 và IFN-γ do T-CD4 tiết ra sẽ có khả năng tiêu diệt tế bào đích, là những tế bào bị nhiễm vi trùng hay tế bào ung thư

Trong điều kiện sinh lý bình thường, các tế bào T-CD4 sẽ điều khiển và chi phối hoạt động miễn dịch một cách hiệu quả nhất làm cho cơ thể luôn ở trạng thái cân bằng Tế bào T-CD4 tiết ra các cytokin thích hợp giúp cho sự sinh sản

đủ mức của các tế bào thực thi, giúp chúng hoạt hóa vừa đủ để loại trừ kháng nguyên Sự hoạt hóa của T-CD4 sẽ được kiểm soát nhờ chính các sản phẩm và hiệu quả của tế bào thực thi Ví dụ khi lượng kháng thể đủ cao, lượng TNF đủ lớn sẽ có hiện tượng ức chế ngược kìm hãm sự tăng tiết quá mức [14] Như vậy, chúng ta thấy rõ một điều là tế bào T-CD4 đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể Vì một bệnh lý nào đó mà T-CD4 bị thiếu hụt sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng không những chỉ ở đáp ứng miễn dịch tế bào mà còn cả đáp ứng miễn dịch dịch thể, hậu quả làm cho cơ thể không có sức chống đỡ bệnh tật

và do đó dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội hay ung thư mà điển hình nhất đó

là trong trường hợp nhiễm HIV/AIDS

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao

Có 2 loại đáp ứng miễn dịch là đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào Trong đáp miễn dịch dịch thể, tế bào B tiết ra kháng thể để ngăn chặn nhiễm trùng và loại bỏ các vi khuẩn ngoại bào Trong miễn dịch qua trung

gian tế bào, tế bào T hoạt hóa đại thực bào để tiêu diệt vi khuẩn đã bị ăn vào bên trong tế bào này hoặc tế bào T gây độc trực tiếp tiêu diệt tế bào đã bị nhiễm khuẩn Vi khuẩn lao là một vi khuẩn nội bào do đó đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò vô cùng quan trọng trong miễn dịch chống lao, còn vai trò của đáp ứng miễn dịch dịch thể rất ít

1.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Hình thái miễn dịch này có tầm quan trọng rất lớn đến mức hiện nay một số tác giả coi miễn dịch dịch thể chỉ là một khía cạnh của nó mà thôi Khi đại thực bào trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T thì chúng tiếp nhận thông qua các receptor tương tự như globulin miễn dịch, nhưng chỉ có phần hoạt động kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên là lộ ra khỏi bề mặt tế bào còn chân vẫn cắm vào màng tế bào vào tận nguyên sinh chất Sự kết hợp kháng nguyên ngay trên bề mặt làm chúng được hoạt hóa và kích thích tế bào tiết ra những hoạt chất lymphokin Tế bào lympho T trở thành những tế bào hoạt hóa có các chức năng khác nhau như tế bào được mẫn cảm, tế bào độc, tế bào quá mẫn chậm…, một số nhỏ trở thành tế bào trí nhớ Các lymphokin đóng vai trò quan trọng trong tương tác và điều hòa miễn dịch cũng như trong viêm đặc hiệu [10] [17]

Các thí nghiệm Koch, Landsteiner-Chase và Lurie đã chứng minh rằng khi

bị nhiễm BK, cơ thể vừa sản xuất kháng thể đặc hiệu chống BK vừa tạo ra các tế bào lympho đặc hiệu với BK Kháng thể không có khả năng tiêu diệt BK khi bị tái nhiễm vì BK ký sinh bên trong tế bào nên chúng né tránh được tác dụng của kháng thể Chỉ có hoạt động của các tế bào lympho T đặc hiệu phối hợp với ĐTB

đã tiêu diệt BK khi cơ thể tái nhiễm

Như vậy khi phản ứng với các quần thể kháng nguyên, cơ thể ngoài việc tạo

ra các kháng nguyên đặc hiệu còn có khả năng sản xuất ra các tế bào T đặc hiệu

với quần thể kháng nguyên Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu do tế bào T phụ trách được gọi là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Kiểu một do tế bào CD4 thực hiện tác động lên chức năng nuốt và giết của ĐTB thông qua các lymphokine (kiểu quá mẫn muộn) Kiểu hai do tế bào T-CD8 thực hiện giết trực tiếp các tế bào đích (kiểu gây độc trực tiếp) [10], [17]

T-Hình 1.3 Hai kiểu đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Nguồn: http://image.doko.vn/htmr/tl/1/7/9/7/1/9/4/images/1797194015.jpg)

- Với kiểu 1: Các tế bào T-CD4 có khả năng nhận dạng các QĐKN ngoại lai thông qua hiện tượng giới thiệu kháng nguyên bởi tế bào trình diện KN như ĐTB CD4 đóng vai trò thụ thể nhận dạng phân tử MHC lớp II trên bề mặt tế bào trình diện KN Để nhận dạng QĐKN ngoại lai, tế bào T-CD4+

có thụ thể riêng gọi là thụ thể của tế bào T dành cho KN Hai thụ thể này phải đồng thời nhận

diện phối tử của nó là phân tử MHC lớp II và peptide KN Hiện tượng này được gọi là nhận dạng kép Sau khi nhận dạng được QĐKN, trên bề mặt tế bào T-CD4+ xuất hiện nhiều thụ thể để tiếp nhận Interleukin 2 (IL-2) do chính các tế bào T-CD4+ tiết ra Khi đã có đủ hai kích thích: một là sự nhận dạng QĐKN, hai

là kích thích của IL-2, tế bào T-CD4+

sẽ được hoạt hoá và trở thành các tế bào

TH1 tiết ra các cytokine có tác dụng chiêu mộ và hoạt hoá các ĐTB Dưới tác dụng của các cytokine do tế bào TH1 tiết ra, các ĐTB di chuyển đến nơi có tương tác giữa tế bào T-CD4+

và KN, chúng được hoạt hoá bởi IFN- làm cho ĐTB không những nuốt nhiều mà còn phân huỷ hay tiêu diệt được các VSV hoặc tế bào nhiễm VSV mà chúng ăn vào Các cytokine như yếu tố MIF hay IL-4 còn kìm chân ĐTB tại chỗ không cho ĐTB đã nuốt kháng nguyên di tản đi nơi khác

có tác dụng khu trú ổ nhiễm trùng

Hình 1.4 Mối tương quan qua lại giữa tế bào T-CD4+

và ĐTB (Nguồn http://www.doko.vn/tai-lieu/dap-ung-mien-dich-qua-trung-gian-te-bao-1797194)

Khi ĐTB được hoạt hoá để tiêu diệt VSV chúng cần giải phóng nhiều enzyme của lysosome để tiêu diệt VSV Vì quá nhiều enzyme được giải phóng nên cũng gây tổn thương cho mô lân cận Vì vậy hiện tượng này được gọi là quá mẫn Quá trình hoạt hoá tế bào T-CD4+, chiêu mộ các ĐTB đến chỗ có KN, hoạt hoá ĐTB cần có một khoảng thời gian từ 48 - 72 giờ nên hiện tượng này được gọi là quá mẫn muộn, khác với quá mẫn tức khắc diễn ra sau vài phút đến vài giờ

do tác động của KT và dị nguyên trên bề mặt tế bào mast và BC ái kiềm Quần thể tế bào TH1 tham gia vào quá trình này còn được gọi là các tế bào T quá mẫn muộn (TDTH)

- Với kiểu 2 : Tế bào T-CD8 có khả năng nhận dạng các QĐKN nội tại thông qua hiện tượng giới thiệu kháng nguyên bởi tế bào đã nhiễm vi khuẩn CD8 đóng vai trò thụ thể nhận dạng phân tử MHC lớp I trên bề mặt tế bào nhiễm

vi khuẩn Để nhận dạng QĐKN nội tại, tế bào T-CD8+

có thụ thể riêng gọi là thụ thể dành cho KN Thụ thể này sẽ gắn vào peptide KN do phân tử MHC lớp I trình diện (hiện tượng nhận dạng kép) Sau khi nhận dạng được KN, trên bề mặt

tế bào T-CD8 xuất hiện nhiều thụ thể để tiếp nhận Interleukin 2 do các tế bào T

hỗ trợ tiết ra Khi đã có đủ hai kích thích: một là sự nhận dạng KN, hai là kích thích của IL-2, tế bào T-CD8trở nên hoạt hoá và biệt hoá thành tế bào lympho T gây độc có khả năng trực tiếp giết tế bào khác Tế bào T gây độc sẽ tìm kiếm, tiếp cận tế bào đích rồi giải phóng các thành phần có trong các hạt trong bào tương của mình về phía tế bào đích Các thành phần này gồm có perforin có tác dụng tạo ra lỗ thủng trên màng tế bào đích và granzyme có tác dụng chui sang tế bào đích, tác động lên bộ gen di truyền của tế bào này làn đứt gẫy ADN đẩy tế bào đích vào chu trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis)

Qua nghiên cứu miễn dịch trong lâm sàng, con người đã ứng dụng vào thực tiễn như huyết thanh chẩn đoán, miễn dịch trị liệu, miễn dịch phòng bệnh [17]

1.4.2.2 Đáp ứng quá mẫn muộn trong bệnh lao

Phản ứng tăng quá mẫn muộn trong bệnh lao bắt đầu sau 6h, tăng dần và đạt mức tối đa 48 - 72h, hay còn gọi là miễn dịch bệnh lý [8]

- Phản ứng da với Tuberculin

+ Cách làm: dùng tuberculin (kháng nguyên được coi là đặc hiệu cho BK) tiêm 5-10 đơn vị vào trong da mặt trước cánh tay Đọc kết quả sau 72 giờ Nếu phần cứng nổi lên tại nơi tiêm có đường kính trên 5 mm thì được xem như phản ứng có kết quả dương tính [7], [8]

+ Ý nghĩa: Phản ứng được dùng để đánh giá xem cơ thể đã có đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào chống BK hay chưa Nếu dương tính nghĩa là đã có đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào chống BK, như vậy là tốt vì cơ thể đã

có cơ chế chống BK nếu tái nhiễm [17] Nếu âm tính nghĩa là cơ thể chưa có đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào chống BK, như vậy là không tốt vì cơ thể chưa có cơ chế bảo vệ nếu bị nhiễm BK Tuy vậy khi phản ứng dương tính mạnh thì nó còn gợi ý rằng có thể đang có BK hoạt động trong cơ thể [17]

1.5 Những nghiên cứu trước đây về số lượng tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi

- Tác giả Al Majid FM (2008), nghiên cứu tại Ả Rập Saudi trên 54 bệnh nhân lao phổi và 25 người bình thường làm nhóm đối chứng cho kết quả số lượng tế bào ở bệnh nhân lao phổi như sau: lympho T (CD3) là 1091,9 ± 321,4 (TB/µL), tế bào lympho B (CD19) là 192,3 ± 132,8 (TB/µL), tế bào NK (CD16/56) là 410,7 ± 286 (TB/µL), tế bào T-CD4 là 639,8 ± 285 (TB/µL) và T-CD8 là 609 ± 233,5 (TB/µL) Khi so sánh các tế bào giữa nhóm bệnh và nhóm

đối chứng cho kết quả: số lượng lympho T (CD3) và T-CD4 giảm ở nhóm bệnh,

số lượng NK (CD16/56) tăng ở nhóm bệnh, T-CD8 và lympho B (CD19) không khác biệt giữa hai nhóm [19]

- Nghiên cứu của tác giả Jesus Hernandez và cộng sự (2010), nghiên cứu tại

Mỹ trên 17 bệnh nhân lao phổi, nhóm đối chứng 17 người bình thường cho kết quả: số lượng tế bào lympho B (CD19) nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng, số lượng lympho T (CD3), T-CD4 và T-CD8 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm đối chứng [28]

- Nghiên cứu của Setareh Davoudi và cộng sự (2008), nghiên cứu tại Iran trên 26 bệnh nhân lao phổi, nhóm đối chứng 16 người khỏe mạnh cho kết quả: T-CD4 và T-CD8 ở bệnh nhân lao phổi lần lượt là 695,42 ± 409,77 (TB/µL) và 556,2 ± 267,42 (TB/µL) Số lượng T-CD4 và T-CD8 ở nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng [34]

- Nghiên cứu của D.S.S Rodrigues và cộng sự (2002) ở Mỹ, trên 20 bệnh nhân lao phổi, so sánh với nhóm đối chứng 18 người bình thường cho kết quả số lượng T-CD4 và T-CD8 ở nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng [21]

- Tác giả Nadeem Afzal và cs (2010), tại Paskitan, nghiên cứu trên 39 bệnh nhân lao phổi, so sánh với nhóm đối chứng 38 người bình thường cho kết quả ở nhóm bệnh: trung bình bạch cầu chung là 8,1 ± 3,3 (10^9/L), trung bình bạch cầu lympho 1,92 ± 0,73 (10^9/L), trung bình bạch cầu mono 0,8 ± 0,33 (10^9/L), trung bình bạch cầu hạt 5,3 ± 0,82 (10^9/L) Khi so sánh số lượng tế bào bạch cầu chung giữa nhóm bệnh lao phổi với nhóm đối chứng thì kết quả không tìm thấy sự khác biệt (p > 0,05) [30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm bệnh: những bệnh nhân mắc lao phổi mới đang được điều trị tại bệnh viện Lao và Bệnh phổi Cần Thơ

- Nhóm đối chứng: người bình thường khám sức khỏe định kì tại bệnh viện Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

2.1.2.1 Nhóm bệnh nhân mắc lao phổi mới

- Bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi lần đầu hoặc bệnh nhân đã được chẩn đoán và điều trị lao phổi trước đây nhưng thời gian điều trị dưới 1 tháng

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Loại trừ những đối tượng đạt tiêu chuẩn chọn nhưng kèm theo một trong các tiêu chuẩn sau:

- Những người bị nhiễm HIV hoặc các bệnh nhiễm trùng khác

- Những người có bệnh mạn tính

- Những người đang sử dụng thuốc ức chế miễn dịch

- Những người không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 07/2013 đến tháng 05/2014, mẫu máu của nhóm bệnh và nhóm đối chứng được thu thập tại phòng xét nghiệm của Bệnh viện Lao và bệnh phổi Cần Thơ và phòng xét nghiệm của bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Mẫu nghiên cứu

- Chi phí thực hiện đề tài cao vì các xét nghiệm đắt tiền

- Chọn mẫu thuận tiện với cỡ mẫu ≥ 30 đạt độ tin cậy ≥ 95%

2.2.2.2 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu thuận tiện ngẫu nhiên không xác suất

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

2.2.3.1 Đặc điểm của bệnh nhân mắc lao phổi mới

(a) Nhóm tuổi tính theo năm và được phân ra 3 nhóm tuổi là dưới 30 tuổi,

từ 30 đến 60 tuổi và trên 60 tuổi

(b) Giới tính: nam hoặc nữ

(c) Triệu chứng lâm sàng: ho khan; ho có đàm; ho ra máu; sụt cân; sốt nhẹ

về chiều; ra mồ hôi trộm; đau ngực; khó thở; rale ở phổi; kém ăn, mệt mỏi; triệu chứng khác

(d) Cận lâm sàng giúp chẩn đoán:

- Soi đàm trực tiếp tìm AFB: có hay không?

- Cấy đàm tìm BK: có hay không?

2.2.3.2 Xác định số lượng các tế bào miễn dịch

Các tế bào miễn dịch bào gồm:

- Các loại tế bào bạch cầu: bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu hạt

- Các tế bào lympho: lympho T (CD3), lympho B (CD19), NK (CD16/56), CD4, T-CD8

T-(a) Sử dụng xét nghiệm công thức máu để xác định số lương bạch cầu chung, bạch cầu lympho, bạch cầu mono và bạch cầu hạt

- Bạch cầu chung là tất cả các loại bạch cầu trong máu ngoại vi bao gồm bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu hạt

- Bạch cầu lympho là loại bạch cầu chuyên biệt cho hệ miễn dịch, bao gồm lympho T, lympho B và NK

- Bạch cầu mono là bạch cầu đơn nhân, khi trưởng thành nó có thể biệt hóa thành đại thực bào tại các mô khác nhau của cơ thể

- Bạch cầu hạt được đặc trưng bởi các hạt nhuộm màu khác nhau trong tế bào chất dưới kính hiển vi quang học Có ba loại bạch cầu hạt: bạch cầu trung tính (neutrophil), bạch cầu ái kiềm (basophil) và bạch cầu ái toan (eosinophil) (b) Sử dụng xét nghiệm đếm dòng chảy tế bào với kít xét nghiệm của hãng BD

để xác định số lượng CD3, CD4, CD8, CD19 và CD16/56

- Phân tử CD3: Nó có mặt ở mọi tế bào lympho chín Vai trò của nó là tiếp xúc với kháng nguyên trên phân tử MHC của tế bào trình diện tương ứng và truyền đạt tín hiệu vào trong nguyên sinh chất của tế bào lympho T

- Phân tử CD4: Đó là một monome có 4 khu vực nằm bê ngoài tế bào CD4

là đặc trưng của dưới nhóm quần thể tế bào lympho T hỗ trợ và được dùng như

là phối tử với các phân tử MHC lớp II, nó cũng là receptor cho HIV

- Phân tử CD8: Được hình thành bởi 2 chuỗi α và β nối lại với nhau bằng 1 dây đồng hóa trị CD8 đặc trưng cho dưới nhóm quần thể tế bào lympho T độc CD8 là phối tử với phân tử MHC lớp I

- CD19: Có ở tất cả các tế bào lympho B trừ tương bào

- CD16/56: Có mặt ở các tế bào Natural Killer (NK)

2.2.3.3 Xác định sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với người bình thường

So sánh kết quả về số lượng các tế bào miễn dịch của nhóm bệnh nhân lao phổi mới và nhóm đối chứng, tính mức ý nghĩa (p) theo phép toán thống kê, kết luận sự khác biệt về số lượng các tế bào miễn dịch ở hai nhóm

2.2.4 Phương pháp thu thập số liệu

2.2.4.1 Phương tiện nghiên cứu

- Dụng cụ, thiết bị:

+ Giấy, bút, phiếu điều tra

+ Ống tiêm 5ml, gòn, cồn

+ Ống đựng máu có chứa chất chống đông EDTA

+ Máy đếm tế bào dòng chảy FACS CANTO II

+ Pipette, đầu tip phù hợp với pipet

+ Máy lắc vortex

- Lấy mẫu và bảo quản mẫu:

+ Lấy máu, ly trích

+ Bảo quản máu bệnh nhân ở nhiệt độ -20o

C

- Xử lí mẫu máu chứa các tế bào lympho

- Phân loại các tế bào lympho bằng phương pháp đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) thông qua việc xác định các dấu ấn đặc trưng của tế bào lympho khác nhau

2.2.4.3 Cách lấy mẫu

- Sử dụng ống lấy mẫu có chất chống đông EDTA (Ethylene di-amine acetic acid) Chất chống đông EDTA phù hợp với các xét nghiệm công thức máu

tetra-và phân tích các tế bào máu vì nó bảo quản hình thái tế bào tốt nhất

- Ghi ngày giờ lấy mẫu, mã số hoặc họ tên, tuổi, giới tính của bệnh nhân trên nhãn của ống đựng máu

- Vị trí lấy máu: tĩnh mạch cánh tay

- Dụng cụ lấy máu: bằng bơm kim tiêm (21-23G)

- Thể tích máu lấy: 2ml

- Đảo ngược ống nhẹ nhàng 8 - 10 lần

- Để ống máu thẳng đứng trên giá, bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh nắng trực tiếp

2.2.4.4 Quy trình xử lý mẫu máu chứa các tế bào lympho

- Đánh dấu mã số mẫu máu vào ống BD Trucount

- Dùng pipette hút 20µL thuốc thử BD Multitest 6-color cho vào ống Trucount

- Dùng pipette hút 50 µL máu có chất chống đông vào ống

- Đậy nắp ống và lắc nhẹ trộn đều hổn hợp dung dịch Ủ ống 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-25o

Hình 2.1 Máy đếm tế bào dòng chảy tế bào FACS CANTO II

2.2.4.5 Quy trình căn bản sử dụng máy đếm dòng chảy tế bào

- Khởi động máy: chuẩn bị dung dịch nạp mẫu bao gồm các bước chuẩn bị dung dịch đệm, bật máy và chọn phần mềm tương thích, rửa máy khởi động và đuổi khí trong hệ thống buồng đếm

- Chuẩn máy: thông thường các hãng khác nhau có thể sử dụng các hóa chất tinh khiết để chuẩn máy Chuẩn máy có thể được sử dụng để cân chỉnh các kênh thu nhận tín hiệu huỳnh quang hoặc có thể đánh giá độ chính xác của pipette (FacsCount, Guava) Nếu máy đạt các tình trạng tốt thì tiến hành xử lý và phân tích mẫu

- Xử lý mẫu: mẫu máu toàn phần với thể tích xác định theo từng quy trình

cụ thể sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện quần thể tế bào lympho T-CD4 Tùy loại sinh phẩm được sử dụng mà kết quả thu nhận có thể có các giá trị về phần trăm lympho T-CD4, số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 hoặc

cả hai Trong một quy trình chuẩn, mẫu chứng nội được sử dụng để đánh giá toàn bộ quy trình, đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm Mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng phải được đưa vào phân tích đầu tiên và được đánh giá kết quả trước khi phân tích mẫu bệnh nhân

- Ly giải hồng cầu: hồng cầu trong mẫu nhuộm sẽ được ly giải trước khi đưa vào phân tích bằng các dung dịch ly giải theo bộ sinh phẩm Sau khi ly giải hồng cầu, mẫu có thể được đưa vào phân tích ngay hoặc ở một số quy trình hai máy thì có thể tiến hành trung hòa và loại bỏ mảnh vỡ tế bào thông qua rửa bằng dung dịch đệm PBS với tỉ lệ 1:1

- Chạy, phân tích mẫu và ghi nhận kết quả: các quy trình một máy với bộ sinh phẩm theo máy thường được tiến hành phân tích tự động và không cho can thiệp Tuy nhiên trong các trường hợp mẫu bất thường về hình thái cũng như

mức độ nhuộm màu huỳnh quang, kỹ thuật viên cần nắm rõ các vấn đề về kỹ thuật cũng như các chiến lược tạo cổng và chọn lọc quần thể để tránh sai sót có thể xảy ra Trong một số hệ thống máy, kỹ thuật viên phải tự phân tích và phân vùng quần thể để thu kết quả

- Rửa và tắt máy: sau quá trình chạy mẫu thì việc rửa máy là hết sức quan trọng, nó giúp loại bỏ những mảng bám phát sinh trong quá trình chạy giúp hạn chế tắc nghẽn hệ thống dung dịch lỏng Dung dịch rửa máy thường đi kèm theo

bộ sinh phẩm thường có bản chất là chất tẩy nhẹ như Javel, sau quá trình rửa bằng chất tẩy thì máy bắt buộc phải rửa lại bằng nước cất để tránh bị ăn mòn

Sơ đồ nghiên cứu

NHÓM BỆNH NHÓM ĐỐI CHỨNG

Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ…

Lấy máu cho vào ống đựng có chứa sẵn chất chống đông EDTA

Phân tích mẫu bằng phương pháp Flow Cytometry

KẾT QUẢ

Xét nghiệm tổng phân

tích công thức máu

- Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ…

- Dấu hiệu lâm sàng

- Dấu hiệu cận lâm sàng

- Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 18.0 for windows

- Biến phân phối chuẩn bao gồm bạch cầu chung, bạch cầu lympho, bạch cầu hạt, CD3, CD4, CD8, CD16/56

- Biến phân phối không chuẩn là số lượng bạch cầu mono và CD19

- Dùng thuật toán giá trị trung bình, trung vị, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất để mô tả độ tuổi, số lượng các tế bào miễn dịch của đối tượng nghiên cứu

- Dùng phép kiểm định giá trị trung bình Independent sample T cho biến phân phối chuẩn và kiểm định Mann – Whitney U cho biến phân phối không chuẩn để so sánh số lượng các tế bào miễn dịch của nhóm bệnh với nhóm đối chứng

- Dùng kiểm định ANOVA cho biến phân phối chuẩn và kiểm định Kruskal – Wallis cho biến phân phối không chuẩn so sánh số lượng các tế bào giữa các nhóm tuổi

- Trình bày kết quả bằng bảng, biểu đồ

2.3 Đạo đức nghiên cứu

Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, công tác lấy máu được thực hiện bởi nhân viên y tế có kinh nghiệm đúng nguyên tắc vô trùng Đối tượng được lấy 2ml máu vào buổi sáng trước ăn Lượng máu mất đi

không ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân Kết quả xét nghiệm công thức máu được gửi trả cho bệnh nhân miễn phí, kết quả xét nghiệm CD cũng được gửi trả nếu bệnh nhân có yêu cầu

Các thông tin về cá nhân người bệnh được giữ bí mật

Các kết quả nghiên cứu nhằm xây dựng các chỉ tiêu miễn dịch, làm sáng tỏ khả năng đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân nhằm cung cấp thêm thông tin cho việc điều trị bệnh lao một cách có hiệu quả, quá trình thực hiện an toàn, chúng tôi tin rằng nghiên cứu này không vi phạm các vấn đề y đức

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu

- Nhóm đối chứng có 18/33 người là nữ giới chiếm 54,5%, có 15/33 người

là nam giới chiếm 45,5%, tỉ lệ nam/nữ của nhóm đối chứng là 0,83

- Nhóm lao phổi mới có 25/31 bệnh nhân là nam giới chiếm tỷ lệ là 80,6%, trong khi chỉ có 6/31 bệnh nhân là nữ chiếm 19,4%, như vậy nam giới xấp xỉ gấp

4 lần nữ giới (tỷ lệ nam/nữ là 4,17)