Quy trình chuyển gen vào tế bào thuốc lá BY2

MỞ ĐẦUVới sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều quy trình sản xuất vắcxin trong thực vật đã được hình thành như dùng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, thực vật

1 MỞ ĐẦU

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều quy trình sản xuất vắcxin trong thực vật đã được hình thành như dùng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, thực vật chuyển gen tạm thời, thực vật nhiễm virus và nuôi cấy

tế bào thực vật Tuy nhiên, việc sản xuất vắcxin trong tế bào thực vật nuôi cấy có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với việc sử dụng cây trồng ngoài tự nhiên như khả năng tạo ra các chất với độ an toàn sinh học cao, ổn định và không có nguy cơ nhiễm bệnh từ bên ngoài

Nuôi cấy tế bào có nhiều dạng khác nhau như nuôi cấy rễ phụ, khối mô chồi,

tế bào cố định và tế bào huyền phù, trong đó nuôi cấy tế bào huyền phù là dạng có khả năng nhất trong việc tạo ra quy trình sản xuất có thể điều khiển được và việc chuyển lên quy mô lớn có thể tiến hành tương đối dễ dàng Ngày nay, tế bào BY-2 đang là dòng tế bào thực vật được dùng rộng rãi nhất cho việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp Bởi BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng từ 80-100 lần trong vòng một tuần Một đặc điểm ưu việt khác nữa là BY-2 đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium

Gen chỉ thị gus thường được sử dụng để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn Đây là gen mã hóa enzyme β-glucuronidase, một hydrolase xúc tác cho quá trình phân giải cơ chất glucuronidase tạo sản phẩm có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững Trong tự nhiên β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật hơn nữa sản phẩm của phản ứng là độc nhất và không độc với

tế bào vật chủ, các phương pháp phân tích sản phẩm đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy và đặc thù, vì vậy gen gus được coi là gen chỉ thị hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.

Để tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào tế bào BY-2, chúng tôi sử dụng vector pCB-GUS ( Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật) để chuyển gen chỉ thị gus vào tế bào thông qua vi khuẩn Agrobacterium Kết quả này sẽ là tiền đề

để tiến hành chuyển vector biểu hiện mang các cấu trúc gen mong muốn.

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58Pgv2260 mang vector pCB301_GUS được sử dụng để kiểm tra qui trình chuyển gen vào BY-2.

- Dòng tế bào BY-2 được cung cấp bởi ………

2.2.Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

a) Các môi trường nuôi cấy:

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Luria-Bertani (LB).

- Môi trường nuôi cấy BY-2: Môi trường Murashige and Skoog (MS) biến đổi

b)Các loại kháng sinh:

- Kanamycin, Cefotaxim, Rifamycin, Carbecillin, Spectinomycine.

c) Một số hóa chất khác:

- Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức), Promega (Đức)

2.2.2 Thiết bị

Máy ly tâm, máy đo pH, tủ cấy vô trùng, bình nuôi cấy, mồi khử trùng, máy nuôi lắc, bộ điện di, máy soi gel, máy chụp ảnh gel, pipet man, máy làm khô DNA (Speed Vac), máy PCR và các máy móc-trang thiết bị khác của phòng Công nghệ

Tế bào Thực vật và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào BY-2

Tế bào thuốc lá BY-2 được nuôi lỏng trong môi trường BY-2 biến đổi với điều kiện nhiệt độ 28° C, trong tối và lắc 120 vòng/phút Thành phần môi trường gồm muối và vitamin MS bổ sung 1 mg/l thiamine, 100 mg/l myo-inositol, 210 mg/l Miller’s KH2PO4, 0,2 mg/l 2,4-D, 30 g/l sucrose, pH được chuẩn về 5,6 bằng KOH Tế

bào được cấy chuyển hàng tuần sang bình môi trường mới với tỷ lệ 01:50 (1ml dịch

tế bào trong 50 ml MS)

Để chuẩn hóa điều kiện phát triển của tế bào huyền phù BY-2 phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ tế bào ban đầu đến năng suất tế bào Chúng tôi thiết lập 5 công thức nuôi cấy khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5 bằng cách lấy lần lượt 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5

ml tế bào ban đầu đem nuôi lắc trong 50 ml môi trường lỏng ở 28˚C trong tối (tương ứng với các tỷ lệ : 1:100 ; 1:50 ; 1:33,3 ; 1:25 ;1:20) Sự tăng trưởng của tế bào được xác định bằng hàm lượng (tính theo gam) thu được khi đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút 10 ml của mỗi bình nuôi cấy trong ống Falcon 15 ml trong

10 phút và loại bỏ dịch

2.3.2 Chuyển gen vào tế bào BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium

 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58Pgv2260 mang vector pCB301_GUS:

Quá trình này gồm các bước như sau:

- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung các kháng sinh: rifamycine (50mg/l), kanamycin (50mg/l), nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C 48 giờ.

- Chọn một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2 ml

LB lỏng (có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc như khi nuôi ở môi trường LB đặc) Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 28˚C qua đêm.

- Chuyển 0.5ml dịch huyền phù đã nuôi qua đêm sang 50ml LB lỏng (không chứa kháng sinh) để nuôi phục hồi trong 4h Sử dụng vi khuẩn A tumerfaciens có mật độ đạt OD 600 khoảng 1.0 để biến nạp.

 Chuẩn bị tế bào thuốc lá BY-2

Ba ngày trước khi chuyển đổi, bắt đầu cấy chuyển: chuyển 1 ml tế bào BY-2 sang 100 ml môi trường mới, nuôi trong tử lắc ở 28˚C trong tối.

 Đồng nuôi cấy

Lấy 5 ml tế bào BY-2 vào mỗi đĩa petri Bổ sung 5 µl acetosyringone (20μg/ml) vào đĩa, lắc nhẹ nhàng Acetosyringone là một hợp chất dễ bay hơi

của phenol, có khả năng cảm ứng với các gen vir trong Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens - đây là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen Tiếp đến, bổ sung 100 ml dịch khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen Dán Parafilm và ủ ở 25°C trong hai ngày

 Rửa khuẩn và chọn lọc tế bào chuyển gen

Hai ngày sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành rửa khuẩn như sau:

- Sử dụng pipette 1ml, cắt đầu côn tránh làm tổn thương tế bào, hút tế bào BY-2 từ mỗi đĩa petri vào ống fancon 15ml

- Thêm 5-7 ml MS vào mỗi ống để đạt 14-15ml và đảo nhẹ Sau 15 phút để lắng, nhẹ nhàng hút bỏ phần dịch bên trên Tiếp tục thêm MS và lặp lại các bước rửa với MS 3 lần Tiếp tục rửa với môi trường MS bổ sung 500mg/l cefotaxime 2 lần Thêm MS/cefotaxime đến 12 ml rồi đảo nhẹ nhàng.

- Lấy 1 ml của các tế bào đã rửa sạch trải lên một đĩa Petri chứa 50 ml môi trường MS bổ sung 500 mg/l cefotaxime để loại bỏ các tế bào Agrobacterium (không chọn lọc) và 1 ml lên MS bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin để chọn lọc Dàn đều tế bào trên mặt thạch và phơi 5-10 phút trong box cấy đến khi tế bào bám đều lên mặt thạch Dán Parafilm và ủ ở 25°C

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau lên hiệu quả chuyển gen

• Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến hiệu quả chuyển

gen

Để xác định nồng độ vi khuẩn Agrobacterium thích hợp chúng tôi tiến hành thử nghiệm các lượng dung dịch khuẩn có OD 600 = 1.0 từ 100 μl, 150μl, 200μl, 250μl đến 300μl Sau 2 ngày đồng nuôi cây, tiến hành rửa khuẩn và xác định hiệu quả chuyển gen sau 3 tuần Hiệu quả chuyển gen được xác định bởi số lượng dòng tế bào trên môi trường chọn lọc

• Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả

chuyển gen:

Đồng nuôi cấy theo quy trình chuyển gen trên Sau khi biến nạp, thời gian đồng nuôi cấy thay đổi ở các đĩa khác nhau từ 1, 2, 3 và 4 ngày Rửa khuẩn và xác

định hiệu quả chuyển gen sau 3 tuần Hiệu quả chuyển gen được xác định bởi số lượng dòng tế bào trên môi trường chọn lọc.

• Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến hiệu quả

chuyển gen:

Đồng nuôi cấy theo quy trình chuyển gen trên Sau khi biến nạp, thay đổi nhiệt độ đồng nuôi cấy ở các đĩa khác nhau:17°C, 25°C, 27°C, 30°C, 33°C, 37°C Sau

2 ngày, tiến hành rửa khuẩn và xác định hiệu quả chuyển gen sau 3 tuần Hiệu quả chuyển gen được xác định bởi số lượng dòng tế bào trên môi trường chọn lọc

2.3.3 Tôi ưu hóa quá trình chuyển gen thông qua gen chỉ thị Gus

i Phương pháp xác định biểu hiện của gen GUS

Thu mẫu từ các cụm tế bào phát triển trên môi trường chọn lọc Đối với những tế bào được chuyển cấu trúc pCB_GUS, biểu hiện của gen gus được kiểm tra bằng nhuộm trong dung dịch X-gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7; 10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5mM X-glucuronide) Mẫu tế bào BY-2 được ngâm trong dung dịch X-gluc và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37°C, thời gian ủ từ 24- 48 giờ.

Sau thời gian ủ, mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng Sau đó, mẫu được đưa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát và chụp ảnh.

3 KẾT QUẢ

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ tế bào ban đầu đến năng suất và chất lượng tế bào BY-2

Thí nghiệm cho thấy sự sinh trưởng của tế bào BY-2 phụ thuộc rõ rệt vào nồng độ tế bào ban đầu đem nuôi cấy Trong đó công thức 5 với nồng độ pha loãng so với môi trường là 1:20 đã đạt tới pha tăng trưởng cấp số nhân sau 5 ngày và đạt sinh khối lớn nhất là 1.206 g/ml sau 9 ngày nuôi cấy.

Bảng 1 Sự tăng trưởng của tế bào BY-2 sau 10 ngày nuôi cấy.

Công

thức

Ngày

1 (g/ml) 2 (g/ml) 3 (g/ml) 4 (g/ml) 5 (g/ml)

2 0.002 0.005 0.003 0.002 0.010

Do vậy, tỷ lệ 1:20 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2 Chuyển gen vào tế bào BY-2.

Thí nghiệm chuyển gen gus vào tế bào được lặp lại 2 lần, mỗi lần thu được 15 cụm tế bào/đĩa petri Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng được thiết lập bằng cách đặt các tế bào không chuyển gen lên môi trường MS có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc Toàn bộ tế bào không chuyển gen được đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh đều vàng dần và chết Trong khi đó, trên môi trường chọn lọc, sau khoảng 1 tuần, bắt đầu quan sát được những cụm tế bào màu trắng và không

có sự khác biệt đáng kể trên các lô tế bào chuyển gen và không chuyển gen, chứng tỏ quá trình tái sinh tế bào thuốc lá thiết lập trong thí nghiệm này có hiệu quả

Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu quả chuyển gen

chuyển gen

Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn

Tỉ lệ pha loãng 1: 50 1: 33,3 1: 25 1:20 1:1:16,7

Số dòng sống

Kết quả trong Bảng 2 cho thấy rằng với nồng độ khuẩn là 200μl trong 5ml tế bào BY-2, thí nghiệm biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, số dòng tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc là 20, các cụm tế bào phát triển tốt, đồng đều.

 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến

hiệu quả chuyển gen

Sau 3 tuần để tế bào phát triển trên môi trường đặc, chúng tôi nhận thấy:

- Lô 1-Đồng nuôi cấy 1 ngày: tế bào phát triển được trên môi trường chọn lọc rất ít, mối đĩa chỉ có 1-2 cụm tế bào phát triển tốt.

- Lô 2- Đồng nuôi cấy 2 ngày: tế bào phát triển hơn so với lô 1, song kém hơn nhiều so với lô 3.

- Lô 3- Đồng nuôi cấy 3 ngày: tế bào phát triển tốt hơn cả so với các lô thí nghiệm còn lại, cụm tế bào to đồng đều.

- Lô 4- Đồng nuôi cấy 4 ngày: xuất hiện các cụm tế bào có màu vàng, có hiện tượng nhiễm khuẩn trở lại.

 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

Sau 3 tuần để tế bào phát triển trên môi trường đặc, chúng tôi nhận thấy:

- Ở nhiệt độ 33˚C, 37˚C, các tế bào không phát triển được mà bị chết, vàng.

- Ở nhiệt độ 30˚C, tế bào phát triển rất ít, xuất hiện 2-3 cụm /1 đĩa.

- Ở các nhiệt độ: 17˚C, 25˚C, 27˚C, các tế bào phát triển tốt, trong đó ở 25˚C tế bào phát triển tốt hơn cả.

Từ các kết quả nghiên cứu nhằm chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào tế bào thuốc là BY-2 thông qua Agrobacterium cùng với kết quả các thí nghiệm bổ sung, chúng tôi đề ra quy trình chuyển gen vào tế bào thuốc là

BY-2 như sau:

- Thiết lập tế bào thuốc lá BY-2 bằng cách chuyển 1 ml tế bào BY-2 sang

100 ml môi trường mới, nuôi trong tử lắc ở 28˚C trong tối 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy.

- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium đạt OD600 = 1

- Đồng nuôi cấy: Lấy 5 ml tế bào BY-2 vào mỗi đĩa petri Bổ sung 5µl acetosyringone (20μg/ml) vào đĩa, lắc nhẹ nhàng Bổ sung 200 ml dịch khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen Dán Parafilm và ủ ở 25°C trong hai ngày.

- Sau 2 ngày tiến hành rửa khuẩn.

Hình 1 Kết quả chuyển gen vào tế bào BY-2

A Tế bào đối chứng trên môi trường không chọn lọc

B-F: Tế bào trên môi trường chọn lọc

B 1 ngày sau khi rửa khuẩn

C 1 tuần sau khi rửa khuẩn

D 2 tuần sau khi rửa khuẩn

E Tế bào chọn lọc được chuyển sang đĩa môi trường mới (chọn lọc lần 2 )

F Dòng tế bào đã chọn lọc nhiều lần sau 3 tuần nuôi cấy

3.1.3 Phân tích sơ bộ tế bào chuyển gen gus bằng nhuộm tế bào

Lấy cụm tế bào thuốc lá sinh trưởng trên môi trường chọn lọc có chứa kanamycine, ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc Sau 24 - 48h mẫu nhuộm được quan sát trên kính hiển vi soi nổi, Những dòng tế bào chuyển gen

có biểu hiện màu xanh đặc trưng của gus như trong Hình 2.

Hình 2 Biểu hiện gen gus trên tế bào BY-2

Các tế bào chuyển gen mang màu xanh đặc trưng của gus.

Như vậy, với quy trình chuyển gen như trên chúng tôi đã thu được các

tế bào chuyển gen với hiệu suất khá cao (10%) Những kết quả này là tiền đề

cho thí nghiệm tiếp theo nhằm tạo tế bào thuốc lá BY-2 mang gen cần nghiên cứu.