Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type o phân lập ở lợn tại việt nam

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh 2.4.5 Phương pháp phát hiện kháng thể LMLM trên lợn bằng ELISA... Virus LMLM có thể gây ra các ổ dịch lớn, tỉ lệ mắc bệnh ca

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN ANH HƯNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP

Ở LỢN TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN ANH HƯNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP

Ở LỢN TẠI VIỆT NAM

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Anh Hưng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện bản luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng

hết mình của bản thân còn có sự tận tình hướng dẫn của PGS TS Nguyễn

Bá Hiên

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến thầy hướng dẫn, người ựã giành

nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tới:

- Ban giám ựốc, tâp thể phòng virus Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc thú y

Trung ương 1

- Tập thể phòng Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý Viện Thú Y Quốc gia

- Khoa Thú Y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

đã tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn

thành luận văn

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ựình,người

thân, bạn bè và ựồng nghiệp - Những người luôn tạo ựiều kiện, ựộng viên,

giúp ựỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và

hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014

Học viên

Nguyễn Anh Hưng

MỤC LỤC

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh

2.4.5 Phương pháp phát hiện kháng thể LMLM trên lợn bằng ELISA

3.1 Nguồn gốc chủng virus lở mồm long móng 40

3.2 Thích nghi chủng virus LMLM type O phân lập trên tế bào

3.3 ðặc tính gây bệnh của virus LMLM type O chủng VP02 phân lập

3.3.2 Xác ñịnh liều gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 45

3.3.3 Gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM type O

3.3.4 Kết quả gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM

3.4 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn 55

3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn bằng phương pháp

3.4.2 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM type O chủng VP02 trên lợn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

OIE : Office International des Epizooties

PD50 : 50% Protective Dose

PID50 : 50% Pig Infective Dose

DANH MỤC BẢNG

1.1 Triệu chứng lâm sàng và ñáp ứng miễn dịch của chuột lang sau

khi gây nhiễm bằng ñường dưới da với các liều khác nhau 18

3.1 Biến ñộng TCID50 của virus LMLM type O chủng VP02 qua 10

3.2 Kiểm tra kháng thể LMLM của lợn trước thí nghiệm 44

3.3 Bố trí gây nhiễm cho lợn bằng chủng virus LMLM type O chủng

3.4 Kết quả gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 47

3.5 Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn sau khi gây bệnh LMLM 48

3.6 Bệnh tích ở lợn sau khi gây nhiễm chủng virut LMLM type O

3.7 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các loại mẫu bệnh

phẩm bằng phương pháp phân lập virus trên tế bào BHK-21 55

3.8 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các mẫu bệnh phẩm

DANH MỤC HÌNH

1.3 Bản ñồ phân bố các chủng virus LMLM từ năm 2010-2013 13

1.4 ðiểm bệnh tích của lợn thí nghiệm sau ngày gây nhiễm và phơi nhiễm 19

3.1 Phả hệ gene VP1 virus LMLM chủng phân lập tại Việt Nam 41

3.2 Diễn biến hiệu giá virus LMLM VP02 qua các lần tiếp truyền

3.4 Biến ñổi lâm sàng và bệnh tích ở chân lợn 49

3.7 Bệnh tích hình thành ở lưỡi (loét và hoại tử) 53

3.8 Bệnh tích hình thành ở lách và màng treo ruột 53

3.9 Diễn biến nhiệt ñộ của lợn trong thời gian gây bệnh thực nghiệm 54

3.11 Kiểm tra sự có mặt của FMDV trong bệnh phẩm, huyết thanh

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở các loài ñộng vật guốc chẵn (trâu, bò, lợn, dê, cừu ), lây lan rất nhanh, rộng, bệnh dễ trở thành ñại dịch gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi Các tổ chức quốc tế và trong nước ñều ñặt vấn ñề phòng và chống bệnh này lên

ưu tiên số một

Bệnh LMLM ñược Tổ chức Thú y Thế giới OIE xếp vào danh mục bảng A, các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc và khai báo bắt buộc khi có dịch Hàng năm, bệnh LMLM gây thiệt hại và làm giảm sản lượng chăn nuôi ở tất cả các nước có dịch bệnh (OIE, TCKHTY, 2000) Bệnh LMLM trực tiếp gây sảy thai khoảng 25% cái chửa, làm giảm 27% sản phẩm thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông cừu (Cục thú y, 2002), (Blancou J., Ozawa Yoshiro, 1995) Phòng chống dịch bệnh LMLM luôn là chính sách của mỗi Quốc gia trên Thế giới

Bệnh LMLM do virus thuộc họ Picornaviridae gây ra, có hướng thượng

bì, gồm 7 serotype: O, A, C, Asia 1, SAT1, SAT2 và SAT3 Trong mỗi serotype còn có nhiều phân type (subtype) do virus thường ñột biến xuất hiện chủng mới, hiện nay người ta ñã xác ñịnh ñược hơn 70 subtype của virus LMLM Các serotype và subtype gây bệnh có triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng không có ñáp ứng miễn dịch chéo, văc xin phòng bệnh chỉ có có khả năng bảo hộ khi phù hợp chủng (có kháng nguyên tương ñồng)

Việt Nam là một nước nằm trong vùng dịch và diễn biến bệnh ngày càng trở lên phức tạp trong thời gian gần ñây Dịch lở mồm long móng ở nước ta hiện nay xảy ra mạnh với nhiều ổ dịch Vào năm 2012 dịch xảy ra trên lợn với ñặc tính nhanh, tỉ lệ chết cao, con vật bệnh chết nhanh làm nhiều nhà chăn nuôi thú y nghĩ ñến 2 vấn ñề: Một là tác nhân thứ phát sau virus lở

mồm long móng Hai là sự xuất hiện của serotype mới với ñộc tính cao Tuy nhiên, Việt Nam chưa tự sản xuất văc xin LMLM, các văc xin hiện dùng ñều ñược nhập từ nước ngoài Do vậy việc nghiên cứu xác ñịnh khả năng gây bệnh, ñặc tính gây bệnh của virus lở mồm long móng tại các ổ dịch ở Việt Nam ñể ñưa ra phương thức phòng thích hợp là một yêu cầu cấp thiết trong tình hình thực tế hiện nay Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type O phân lập ở lợn tại Việt Nam”

2 Mục tiêu của ñề tài:

Xác ñịnh khả năng gây bệnh của chủng virus LMLM type O phân lập thực ñịa

3 Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng trong kiểm nghiệm văc xin lở mồm long móng và ñịnh hướng nghiên cứu khoa học

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh LMLM và tình hình bệnh LMLM trên thế giới

1.1.1 Bệnh lở mồm long móng

1.1.1.1 Căn bệnh

Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease) là bệnh truyền

nhiễm cấp tắnh lây lan nhanh, mạnh và rộng của các loài ựộng vật guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu và loài linh dương Bệnh gây ra do một loài virus hướng thượng bì, có ựặc ựiểm là sốt cao và hình thành những mụn nước ở niêm mạc miệng, móng, vú của gia súc cảm thụ Bệnh LMLM gây bệnh nhẹ ở ựộng vật trưởng thành nhưng gây bệnh nặng ở ựộng vật non (tỷ lệ chết 90 %) (Riemann H, 2008)

Bệnh ghi nhận ở châu Âu (Pháp,Ý, đứcẦ) từ thế kỷ XVII - XVIII, sau

ựó bệnh phát hiện ở khắp toàn cầu (đào Trọng đạt, 2000)

Mặc dù xuất hiện như là một thể bệnh nhẹ, tỷ lệ chết ở gia súc trưởng thành không cao nhưng hậu quả là sư thiệt hại về kinh tế rất trầm trọng Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa, giảm sức kéo, gây sảy thai ở ựộng vật có chửa Virus LMLM có thể gây ra các ổ dịch lớn, tỉ lệ mắc bệnh cao, bệnh có thể lây lan trong phạm vi một nước hoặc khắp các châu lục

1.1.1.2 Hình thái, cấu trúc của virus LMLM

Virus LMLM là loại virus thuộc nhóm Picornavirus, kắch thước 20-30

nm, hình ựa diện có 30 mặt ựều, qua ựược các màng lọc Berkefeld, Chamberland

và Seitz (Văn đăng Kỳ và cộng sự, 2000), (Thái Thị Thuỷ Phuợng và cộng sự, 2006), (Tô Long Thành và cộng sự, 2004) Hạt virus chứa 30% acid nucleic, khoảng 8000 nucleotit, ựó là một ựoạn ARN chuỗi ựơn có khối lượng phân tử là 8.6 KiloDalton Vỏ capsid có 32 ựơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3 và VP4) trong ựó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong

việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), (Saiz JC và cộng sự, 1991)

Bộ gen của virus có chứa ARN mạch ñơn, ñược bao quanh bởi cấu trúc bậc 4 của protein ñể tạo thành một lớp vỏ ña diện (Rueckert, R R, 1996)

Hình 1.1: Bản ñồ bộ gene của vi rút LMLM

(Nguồn: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/98.html)

Vỏ capsid của virus có 32 capsome có hình dạng cân ñối nhau, hạt virus là phân tử ARN Qua kính hiển vi ñiện tử, một hạt virus (virion) có dạng hình tròn, với bề mặt nhẵn, ñường kính khoảng 25nm, trọng lượng phân tử 69KDa, 69% là protein và 31% là ARN (Bachrach, H L, 1968)

Phân tử ARN là ñơn vị gây nhiễm, ñóng vai trò như một ARN thông tin Virion bao gồm 60 bản copy các protein cấu trúc giống nhau là cấu trúc bậc 4 cả protein (VP1 [1D], VP2 [1B], VP3 [1C] và VP4 [1A])

Theo Thomson G.R, 1994, VP1 ñóng vai trò quan trọng nhất trong sinh bệnh học, cũng như là kháng nguyên chính kích thích tạo ra kháng thể chống lại virus LMLM Sự khác nhau về bộ gene là nguyên nhân tạo ra các biến chủng, ñặc biệt thông qua sự ña dạng của phân tử VP1

1.1.1.3 Cơ sở phân loại virus LMLM

Virus LMLM ngoài 7 type (A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 và SAT3)

cơ bản, còn có hơn 70 subtype Một số subtype về mặt dịch tễ học hoàn toàn khác với type bố mẹ vì thế dùng văc xin chỉ hiệu quả khi virus dùng chế văc xin ñồng nhất với virus gây bệnh cho gia súc trong ổ dịch (Tô

Long Thành, 2000) Xét về mặt kháng nguyên, virus LMLM khơng đồng nhất, điều này xảy ra trong các serotype, mà mỗi serotype đĩ cĩ subtype và các biến chủng hoặc các biến chủng này lại khác nhau về mặt huyết thanh học Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhân tạo ra các biến chủng, đặc biệt

là sự đa dạng của phân tử VP1

Việc phân loại virus thường dựa vào kết quả chẩn đốn thơng qua các phản ứng trong phịng thí nghiệm Các phương pháp giám định, phân biệt hay được dùng: Phân lập virus trên mơi trường tế bào, dựa vào kết quả cĩ thể nhận định trong bệnh phẩm nghi cĩ phải là virus LMLM hay khơng Các phương pháp miễn dịch học: ELISA, phản ứng kết hợp bổ thể và một số phản ứng huyết thanh học khác Phương pháp huyết thanh học dùng để xác định subtype đã mang lại nhiều kết quả quan trọng trong quá trình nghiên cứu virus LMLM Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học được sử dụng đều phát hiện kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng khơng phân biệt được đĩ là kháng thể của động vật đã được tiêm văc xin phịng bệnh hay do nhiễm virus

Với sự phát triển của khoa học cơng nghệ, giám định virus LMLM bằng các phương pháp hiện đại được áp dụng Phương pháp giám định bằng cách phân tích protein của virus LMLM xác định đặc tính của chủng, tính đặc hiệu của chủng cũng như tiến hĩa của các biến chủng Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid, xác định trình tự chuỗi poligonucleotid Cơng nghệ phân tích gen được áp dụng nhiều trong cơng tác nghiên cứu khoa học Mullis và cộng sự (1985) phát minh phương pháp PCR và sau đĩ là RT-PCR được sử dụng rộng rãi đã đem lại cuộc cách mạng di truyền học phân tử Kỹ thuật nhân gene cho phép nghiên cứu

và phân tích gen và hệ gen, được áp dụng trong nhiều nghiên cứu về văc xin ADN phịng bệnh LMLM Các đoạn axit amin cĩ khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trung hịa, tái tổ hợp vào ARN của virus dùng trong sản

xuất văc xin Khi ADN tái tổ hợp này ñược dùng như văc xin, gia súc tạo miễn dịch ñặc hiệu chỉ chống lại các protein cấu trúc

Virus LMLM có 2 ñặc tính ñặc biệt liên quan ñến dịch tễ học, ñó là tính

có ña type và tính dễ biến ñổi kháng nguyên, các type tuy gây ra những triệu chứng, bệnh tích giống nhau, nhưng lại không gây miễn dịch chéo (Merial-Pirbright, 2004)

1.1.1.4 Sức ñề kháng của virus LMLM

ðối với ngoại cảnh, sức ñề kháng của virus tương ñối mạnh Với sức nóng virus dễ bị diệt: ñun 60 - 700 C chết sau 5 - 15 phút, ñun sôi 1000C chết ngay Trong tủ lạnh, ở 00C virus sống ñược 425 ngày Virus ñề kháng cao với

sự hanh khô: trong cỏ khô sống 8 - 15 tuần, tổ chức phơi khô sống 7 ngày, trên lông sống 4 tuần Trong phân ủ thành ñống ở lớp sâu 15cm bị diệt sau 7 ngày; sâu 50cm bị diệt sau 9 giờ; ngoài mặt, sau 27 ngày về mùa ñông Trong ñất ẩm ướt virus sống hàng năm

Trong tủy xương dài, phủ tạng có thể sống 40 ngày Trong bắp thịt ñể lâu hay trong quá trình thối xác chết sản sinh ra axit lactic diệt virus trong

24 giờ Nhưng trong thịt ướp lạnh tác dụng thối bị kiềm chế nên virus có thể ñược bảo tồn

Virus ở trong tổ chức, mô, có sức ñề kháng mạnh với các chất sát trùng

có thể giết ñược vi khuẩn khác

Trong thịt ngâm muối, virus còn tồn tại sau 35 - 45 ngày

1.1.1.5 ðộc lực của virus LMLM

Mọi chủng virus LMLM ñều ñược coi là cường ñộc Về mặt lâm sàng, gia súc nhiễm virus LMLM có biểu hiện lâm sàng dưới nhiều mức ñộ khác nhau, từ bệnh rất nghiêm trọng ñến dạng lâm sàng thể ẩn (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

Về mặt ñộc lực của virus, một chủng virus có cùng một ñặc tính kháng nguyên nhưng lần này hoặc nơi này thì chỉ gây bệnh cho lợn, nhưng

lần khác hay nơi khác lại chỉ gây bệnh cho bò hoặc gây bệnh cho cả hai loài ðiều này ñúng với cả 7 type kháng nguyên của virus LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

1.1.1.6 Cơ chế gây bệnh

Thời kì nung bệnh thường từ 1- 3 ngày khi gây bệnh thực nghiệm:

2-7 ngày hoặc 11 ngày khi gây bệnh trong tự nhiên (Tô Long Thành và cộng

sự, 2004)

Virus LMLM thường xâm nhập vào ñộng vật mẫn cảm theo ñường hô hấp hoặc theo vết sước trên da, ñầu tiên chúng nhân lên với số lượng nhỏ tại nơi xâm nhập (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), (Sobrino F., Esteban Domingo, 2001) Vùng yết hầu của ñộng vật nhai lại ñược coi như vùng sinh bệnh ban ñầu của virus LMLM, sau ñó virus LMLM xâm nhập vào tổ chức lympho vùng hầu hay các hạch liên quan rồi ñi vào máu (Donalsson A.I, 2000)

Sau khi vào máu virus ñược ñưa ñến các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quanh mồm, chân, nơi phát sinh các mụn nước Mụn nước dày ñặc sẽ xuất hiện ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm, lưỡi, ñầu vú (Nguyễn Viết Không, 2007) Ở những con non và một số con trưởng thành bị kế phát sang viêm nội tâm mạc, dẫn ñến suy tim và chết (ðăng Văn Kỳ, 2000)

Virus LMLM có thể qua ñường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua

da của vành móng

1.1.2 Dịch tễ học phân tử của virus LMLM

Dịch tễ học phân tử của virus LMLM dựa vào so sánh khác biệt di truyền giữa các virus Cây phân loài (dendrograms) ñã ñược công bố thể hiện liên quan gen di truyền giữa các dòng virus thực ñịa và văc xin của cả bảy chủng huyết thanh dựa vào kết chuỗi lấy từ gen 1D (mã hóa cho protein VP1 của virus) Quá trình khuếch ñại PCR sử dụng enzyme giải mã ñảo ngược (Reverse-transcription PCR – RT-PCR) ARN của virus LMLM, tiếp theo là

nhận diện kết chuỗi nucleotide Nhiều phòng thí nghiệm ñã ñược phát triển các kỹ thuật ñể thực hiện những nghiên cứu này, các phòng thí nghiệm tham chiếu hiện nay có dữ liệu của trên 3000 bộ phận kết chuỗi (OIE, 2005)

Phương pháp ñược khuyến cáo ñể:

(1) Chiết xuất ARN của virus LMLM một cách trực tiếp từ huyễn dịch biểu bì hay từ một mẻ tế bào cấy truyền ít lượt

(2) Thực hiện một RT-PCR cho toàn bộ gen 1D (hoặc chỉ một phần của gen 1D, thì các ñầu 3’ của gen là có ích nhất)

(3) Xác ñịnh kết chuỗi nucleotide của sản phẩm PCR (hay ít nhất 170 nucleotides (thích hợp là 420 ñối với các chủng SAT] ở ñầu 3’ của gen này) Các yếu tố chức năng trong bộ gen ñược chỉ ñịnh bao gồm khu vực không giải mã 5' (5'UTR), vùng mã hóa cho tất cả virus, 3’ là ñoạn kết thúc của bộ gen (3'UTR) và axit polyadenylic (pA) Các mARN giải mã sang một polyprotein ñược xử lý bởi enzyme của virus bao gồm cả 3Cpro Quá trình chuyển dịch từ VP0 vào VP4 và VP2 xảy ra chưa rõ cơ chế

ðến nay theo các tài liệu nghiên cứu, virus gây bệnh LMLM ñược chia thành 7 type là O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, và Asia1 Dưới các type là những biến chủng virus gọi là phân type và hiện nay ñã phát hiện hơn 70 phân type virus Trong số 7 type LMLM, type A là type có tính biến ñổi kháng nguyên lớn nhất Dựa vào phân tích cây phát sinh chủng loại của trình tự gen VP1, type

A ñược chia thành 10 genotype chính (I-X) Tương tự type O ñược chia thành

10 genotype, ký hiệu Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South Asia (ME-SA), Southeast Asia (SEA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East Africa 1 (EA-1), East Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia-1 (ISA-1), và Indonesia-2 (ISA-2) Type Asia 1 ñược chia thành 6 genotypes (I–VI) Những nghiên cứu gần ñây cho thấy có ñồng thời cả 3 serotype O, A, và Asia 1 của virus LMLM ñang lưu hành và gây bệnh trên ñàn gia súc của Việt nam Trong 3 serotype O, A, và Asia 1 của virus LMLM phân lập ñược tại Việt

Nam lại tồn tại rất nhiều phân type (subtype) Cụ thể có ít nhất 3 topotype là Southest Asia (SEA), Cathay, PanAsia thuộc serotype O, 2 phân type là nhóm

4 (group IV) và nhóm 5 (group V) thuộc serotype Asia 1, và 1 phân type là nhóm 9 (genotype IX) thuộc serotype A Như vậy có thể thấy virus LMLM ở Việt Nam rất ña dạng và có ít nhất 6 phân type của virus LMLM ñang lưu hành

và gây bệnh tại Việt Nam (Le et al., 2011), (Le et al., 2010a), (Le et al., 2010b), (Lee et al., 2011)

1.1.3 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới

Bệnh LMLM xuất hiện ở hầu hết các nước trên thế giới Trong khi bệnh ñược xem là ñã thanh toán ở một số quốc gia trong một thời gian nhưng cho ñến nay với phạm vi rộng và tính chất lây lan nhanh của bệnh vẫn

là mối quan tâm hàng ñầu Sau chiến tranh thế giới thứ 2, bệnh xuất hiện ở hầu hết các châu lục Thế giới ñã ghi nhận một ñợt dịch lớn kéo dài từ năm 1981-1985, xảy ra trên phạm vi 80 nước, gây tổn hại kinh tế lớn cho các nước này (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001)

Châu Âu:

Dịch LMLM xảy ra vào nhưng năm 1951 - 1954 ở Tây ðức, Hà lan,

Bỉ, Lucxembourg, Pháp, Anh, Ý, Áo, ðan Mạch, Thụy ðiển, Na Uy và Ba Lan (Tô Long Thành và cộng sự, 2005)

Trong 5 năm 1981-1985, có 804 ổ dịch tại 12 quốc gia do virus type O,

A và C gây ra (Thái Thị Thủy Phượng, 2008)

Năm 2001, dịch LMLM lại khởi phát từ Anh, có mức ñộ nghiêm trọng

ñã xảy ra ở Anh dẫn ñến việc tiêu huỷ trên 10 triệu bò và cừu Việc này ñã ảnh hưởng ñến cả tình hình chính trị và sinh hoạt bình thường của nước Anh (hoãn bầu cử trong thời gian một tháng, huỷ bỏ các hoạt ñộng thể thao vui chơi giải trí) ðến tháng 8 năm 2007, bệnh LMLM lại xuất hiện tại hai trang

trại vùng Surrey của Anh (Foot and Mouth Disease confirmed in cattle, in

Surrey", DEFRA, 2007-08-03), sau ñó lan sang Pháp, Hà Lan, Ireland qua còn

ựường vận chuyển gia súc (Văn đăng Kỳ và cộng sự, 2001), (Hoàng Văn Năm, 2002)

Cho ựến nay, hầu hết các nước Châu Âu ựều ựược công nhận là ựã thanh toán ựược bệnh và nhiều quốc gia thuộc liên ựoàn Châu Âu ựã ngừng

sử dụng văc xin LMLM

Châu Mỹ:

Bệnh xuất hiện lần cuối cùng ở Canada vào năm 1952, Mexico năm

1954 Tại nước Mỹ ựã xảy ra 9 vụ dịch từ 1870 ựến 1929 Nước này ựã công

bố hoàn toàn hết dịch vào năm 1929 Một số nước thuộc Trung Mỹ, Newzealand, Panama ựược xem là chưa từng có dịch bệnh LMLM, (Hoàng Văn Năm, 2002), (Health Inspection Service United States Department of Agriculture, 1991)

Ở Nam Mỹ tại một số nước an toàn dịch như Paraguay, Argentina thì dịch do virus LMLM type O và A ựã tái bùng phát vào những năm 2000-2002 (Mattion, N et al, 2004) Dịch vẫn lưu hành và gây thiệt hại kinh tế ở Bolivia (Rushton, J, 2008)

Trong năm 2005- 2006 xảy ra các vụ dịch ở Argentina, (type O), Brazil (type O)

Châu Phi

Tình trạng bệnh LMLM ở các nước Châu Phi là không rõ ràng do không tiến hành ựiều tra hoặc ựiều tra rất ắt Hầu hết các quốc gia ở Tây, Trung và đông Phi có khả năng xuất hiện dịch (Hoàng Văn Năm, 2001)

Ở Châu Phi dịch chủ yếu do 3 type: SAT1, SAT2, SAT3 gây ra, riêng type C gây bệnh thiệt hại nặng tại Kenia và Ethiopia (1984-1985) Năm

1989, theo OIE, dịch LMLM ựã xảy ra ở 53 nước ở các châu Á, Âu, Phi và Nam Mỹ (Thái Thị Thủy Phượng, 2008)

Ở tây Phi type O lưu hành rộng rãi, dịch xảy ra dịch ở các nước Gambia, Senegal, Uganda, Tanzania Malawi, và Kenia Năm 1999 dịch từ Mali theo

ựường vận chuyển bò qua Sahara lan ựến Algeria, Marocco và Tunisia Virus LMLM type SAT2 lưu hành ở Uganda, Zambia và Kenia, SAT1 có ở Kenia (OIE, 2005)

Năm 2001, virus LMLM type O xuất hiện ở Kenya, Mauritania, Uganda và Senegal Trong tháng 1/2001 tại Swaziland xuất hiện một ổ dịch

do virus LMLM type SAT1 gây ra trên bò ở miền bắc vùng Hhohho theo dọc biên giới Nam Phi, trong một vùng an toàn dịch LMLM từ lâu ở Swaziland Trong tháng 2/2001, xuất hiện một ổ dịch do virus LMLM type SAT2 ở một quận của tỉnh Mhana, phắa bắc của Nam Phi Zimbabue thống kê có 18 ổ dịch

do virus LMLM type SAT2 gây ra từ tháng 8 ựến tháng 10 năm 2001 tại các tỉnh Metabeland và Masvingo (Hoàng Văn Năm, 2001)

Năm 1998, Campuchia, Lào, Thái Lan thông báo có các ổ dịch type Asia1 (Hoàng Văn Năm, 2000)

Năm 2001, dịch xảy ra tại Thổ Nhĩ Kỳ với các ổ dịch type O, A và Asia1 Ổ dịch do virus type Asia1 cũng ựược báo cáo ở Iran, Afganistan, Georgia và Azerbaijan (Hoàng Văn Năm, 2001)

Cuối năm 1999 ựầu 2000, hàng loạt ổ dịch ựã nổ ra ở các nước đông

Á Các nước bị ảnh hưởng của dịch lần lượt là Trung Quốc năm 1999 và tiếp

ựó đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mongolia và một phần đông nước Nga

Hình 1.3 Bản ñồ phân bố các chủng virus LMLM từ năm 2010-2013

(Nguồn: http://www.fao.org/fileadmin/user upload/eufmd/docs/FMD monthly

Năm 2009, ñã có 21 tỉnh có dịch LMLM trên trâu, bò và lợn, số mắc ở trâu là 1.439 con, bò là 1.768 con và lợn là 238 con Những tỉnh có số trâu bò lợn mắc và tiêu hủy nhiều là Kon Tum, Quảng Bình, Quảng Ngãi, Sơn La…

Năm 2010, dịch xảy ra ở 30 tình trên cả nước trên trâu, bò và lợn; số trâu, bò mắc bệnh là 7.111 con, số lợn mắc bệnh là 743 con

Năm 2012, dịch xảy ra trên 7 tỉnh với tổng số trâu, bò, lợn dê mắc bệnh

là 3.317 con

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam

Năm 2003, Hồ đình Chúc cùng cộng sự ựã dùng phản ứng ELISA với kit 3ABC ựể phát hiện kháng thể của trâu bò mang virus LMLM, phân biệt với kháng thể do văc xin LMLM tạo nên (Hồ đình Chúc và cộng sự, 2003)

Kỹ thuât RT-PCR ựã ựược áp dụng trong chẩn ựoán, ựịnh type virus LMLM Năm 2004, Tô Long Thành và cộng sự ựã phân lập thành công virus LMLM trên tế bào BHK-21 Sử dụng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi chung 1F/1R ựặc hiệu cho 7 type của virus LMLM gây bệnh LMLM và cặp mồi P33/P38 ựặc hiệu cho type O ựã ựược xác ựịnh virus LMLM phân lập ựược là virus LMLM type O (Tô Long Thành và cộng sự, 2004)

Năm 2005, Nguyễn Viết Không và cộng sự, bằng phương pháp RT-PCR lần ựầu tiên phát hiện type Asia1 tại Khánh Hòa (Nguyễn Viết Không và cộng

sự, 2006)

Năm 2006, Thái Thuỷ Phượng và Lê Thanh Hoà ựã tách dòng, giải trình tự và phân tắch chuỗi gene từ các mẫu bệnh phẩm từ bò lai và lợn đồng Tháp ựã phát hiện ra topotype khác biệt của virus LMLM

Năm 2006, ở nước ta xác ựịnh có 3 type virus LMLM: O, A, Asia1 (Tô Long Thành và cộng sự, 2006)

Các ổ dịch LMLM do serotype O gây ra từ 2005- 2007 chủ yếu là do: Virus LMLM serotype O_Cathay chỉ gây bệnh trên lợn; Virus LMLM serotype O_SEA-May98 gây bệnh cho cả trâu, bò và lợn Giai ựoạn 2008-

2012 hầu hết các ổ dịch LMLM xảy ra do type O Cuối năm 2008 type A xuất hiện tại tỉnh Nghệ An

Năm 2012, kết quả giám sát lâm sàng và giải trình tự gene ựể giám sát

biến ñổi virus cho thấy mẫu virus trong 49 ổ dịch tại 22 tỉnh, thành phố trải ñều khắp trong cả nước thuộc type O Pan-Asia

1.3 Một số ñặc tính của virus LMLM

1.3.1 ðặc tính nuôi cấy

1.3.1.1 Nuôi cấy virus ÊLMLM trên môi trường tế bào

Virus LMLM là virus có tính hướng thượng bì, nên nhiều tác giả ñã nuôi cấy chúng trên da của thai lợn, thai bò còn sống (giữ thai sống bằng phương pháp nhân tạo)

Mô ñộng vật nuôi cấy thích hợp nhất với virus LMLM là thượng bì lưỡi

bò trưởng thành Lưỡi bò tươi thu thập ngay sau khi giết mổ bò, bảo quản ngay trong lạnh 20C - 30C không quá 8 ngày Virus LMLM phát triển ở thượng bì gây nhiễm hình thành mụn nước; các mảnh thượng bì lưỡi có mụn nước là vât liệu chứa virus ñược dùng ñể tiếp ñời hoặc thu virus ñể chế văc xin Virus LMLM có thể giữ nguyên ñộc lực sau khi tiếp ñời virus trên mô thượng bì lưỡi bò sau vài chục lần, phương pháp thường ñược dùng ñể nhân virus chế văc xin vô hoạt

Nuôi cấy virus LMLM trên môi trường tế bào, tốt nhất là tế bào lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có ñộ nhạy tương ñương, như tế bào thận của chuột Hamster non gọi tắt là tế bào BHK Sau khi cấy virus LMLM vào các môi trường tế bào này ñể tủ ấm 370C trong 24, 48, 72 giờ trong ñiều kiện có 5% CO2, virus sẽ làm huỷ hoại tế bào nuôi (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001)

Loeffer và Frosch ñã nghiên cứu về ñặc tính nuôi cấy virus ngay từ khi phát hiện ra virus LMLM Nhiều tác giả ñã nuôi cấy virus LMLM trên da của thai lợn, thai bò còn sống hoặc tiêm virus LMLM vào phúc xoang chuột nhắt con, tính kháng nguyên của virus này không thay ñổi, có khả năng gây bệnh

và tạo miễn dịch ñối với bò khi ñã tiếp 20 ñời qua chuột nhắt trắng và thường dùng ñể chế văc xin nhược ñộc

Môi trường tế bào là ñược lấy từ tuyến yên của bò hoặc lợn, thận bê hoặc cừu non, hoặc các dòng tế bào có ñộ mẫn cảm

Viện Pirbright trong năm 1973 ñã nuôi cấy 140 chủng virus LMLM, gần 120 chủng này ñã sinh trưởng phù hợp trong môi trường BHK-21

1.3.1.2 ðộng vật cảm thụ

Bệnh LMLM chủ yếu là của loài nhai lại và lợn Loài vật ăn thịt và người ít mắc bệnh hơn Ngựa và loài một móng là ñộng vật không cảm nhiễm (Donalsson A.I, 2000), (Mattion, N et al, 2004), (Thomson G.R, 1994) ðộng vât non mẫn cảm hơn ñộng vât trưởng thành

Trâu và bò là những loài dễ mắc bệnh nhất (Cục thú y, 2003) trong ñó

bò có tỷ lệ nhiễm và mức ñộ trầm trọng cao hơn trâu, sau ñó ñến lợn, cừu, dê Trong số các giống bò, bò lai ñược nuôi dưỡng tốt khoẻ mạnh thường dễ nhiễm bệnh hơn Bệnh thường xảy ra ở trâu bò rồi lây sang lợn (trừ chủng virus chỉ nhiễm cho lợn) (Saiz JC và cộng sự, 1991), virus LMLM chủng Cathay chỉ gây bệnh cho lợn Cừu có mức cảm nhiễm thấp nhưng giữ vai trò mang trùng quan trọng; virus thường cư trú ở vùng hầu Cừu có thể mang trùng tới năm tháng và duy trì sự nhân lên với mức ñộ thấp của virus

ðộng vật nhỏ (tiểu gia súc) như cừu có mức cảm nhiễm thấp và giữ vai trò quan trọng trong việc mang trùng Trong phòng thí nghiệm: Có thể gây bệnh cho bê, chuột nhắt trắng, chuột xám, thỏ, chuột lang

Người cũng có thể nhiễm virus LMLM tuy hiếm Tổn thương do tác ñộng của virus cũng hiếm khi xảy ra (trừ trường hợp trẻ em), không gây thành

bệnh rõ rệt và nếu có cũng ở thể rất nhẹ, thoáng qua Người ta ñã tìm thấy

virus ở niêm mạc mũi của người tiếp xúc với bò bệnh tới 28 giờ sau khi tiếp xúc Khẩu trang và mặt nạ không ngăn cản ñược sự có mặt của virus ở dịch mũi của người (Văn ðăng Kỳ và cộng sự, 2001)

1.3.2 Gây bệnh thực nghiệm:

Có thể tiêm huyễn dịch bệnh phẩm nghi có virus LMLM vào nội bì lưỡi bò, chưa mắc bệnh và chưa tiêm phòng văc xin LMLM Mụn nước sẽ xuất hiện ñặc trưng trên các con bò này sau 24 - 48 giờ

Có thể dùng chuột lang (2 - 7 ngày tuổi) ñể gây bệnh bằng cách khía

da bàn chân Nếu bệnh phẩm có virus LMLM thì sau 24 – 48 giờ, tại vết khía da nổi mụn nhỏ, màu ñỏ, có thủy thũng, chuột có thể nhiễm trùng toàn thân và chết

1.3.2.1 Gây nhiễm trên chuột lang:

Eslampanah và cộng sự (2010), ñã tiến hành gây nhiễm trên chuột lang Thí nghiệm tiến hành với virus type O liều chuẩn ñộ 106 - 106,5TCID50ñược tiêm vào bề mặt ñệm trong chân phải chuột lang Mẫu ñược thu thập từ các cơ quan khác nhau như: tim, phổi, gan, lá lách và tuyến tụy, niêm mạc lưỡi, biểu mô ở ñệm chân và hạch bạch huyết vào các ngày 2, 4, 14, 30 và 60 ngày sau gây nhiễm Bệnh phẩm virus LMLM ñược nuôi cấy trên các môi trường phân lập Qua nghiên cứu cho thấy biểu mô ở ñệm chân, lưỡi và phổi

là nơi phát hiện virus LMLM Virus ñược phát hiện nhiều nhất ở ngày 4 và ngày 14 sau gây nhiễm Kết quả cũng chỉ ra rằng, không phát hiện virus ở bất

kỳ cơ quan nội tạng nào sau 30 và 60 ngày gây nhiễm

Richard C Knudsen, ñã nghiên cứu triệu chứng lâm sàng và ñáp ứng miễn dịch khi gây bệnh trên chuột lang Virus LMLM type A12, chủng 119, ñược gây nhiễm cho chuột lang bằng nhiều ñường khác nhau

Mụn nước xuất hiện trên lưỡi và ñệm lòng bàn chân 1 ngày sau khi gây nhiễm ở những vị trí này Tuy nhiên, khi gây nhiễm bằng ñường dưới da hoặc chủng trên da, phải ñến 3 ñến 4 ngày sau mới phát hiện mụn nước Kháng thể trung hòa ñược phát hiện ở thời ñiểm 3 ngày sau gây nhiễm; Phản ứng quá mẫn và phản ứng ở da ñược phát hiện ở ngày 4 sau gây nhiễm Bất kể liều

lượng virus gây bệnh, ñường tiêm chủng, mức ñộ nghiêm trọng của bệnh hoặc thời gian bắt ñầu triệu chứng lâm sàng của bệnh, chuột lang bị gây nhiễm ñều

có phản ứng ñáp ứng miễn dịch tương tự

Bảng 1.1 Triệu chứng lâm sàng và ñáp ứng miễn dịch của chuột lang sau

khi gây nhiễm bằng ñường dưới da với các liều khác nhau

ðộ dày của da (mm x 10 -1 ) (b) Chuột lang

Liều gây nhiễm (PFU)

Mụn nước (a)

Kháng thể trung hòa

a: Mụn nước phát triển ở 3 ñến 4 ngày sau gây nhiễm:

++: Mụn nước xuất hiện trên tất cả bốn chân bao phủ trên 50% bề mặt bàn chân; +: Mụn nước xuất hiện trên tất cả bốn chân bao phủ ít hơn 50% bề mặt bàn chân;

±: Mụn nước nhỏ trên bàn chân phía sau nhưng không có tổn thương khác;

-: Không phát hiện tổn thương trên bất kỳ chân nào

b Kiểm tra phản ứng của da và kháng thể trung hoà (PD 50 ) ở 25 ngày sau gây nhiễm 1.3.2.2 Gây nhiễm trên bò và lợn:

J.K.Oem và cộng sự (2008), ñã tiến hành gây bệnh trên bò và lợn bằng chủng virus type O (O/SKR/AS/2002) phân lập tại ổ dịch ở Hàn Quốc năm

2002 Giống virus chuẩn ñộ với liều 107 TCID50/ml ñược tiêm cho 4 bò Holstein (250-300kg/con) tại 6 ñiểm dưới da (1ml/ñiểm), bò ñược nuôi cách

ly riêng từng con Một lợn Yorkshine (25-30kg/con), cũng ñược gây nhiễm cùng nguồn virus tại 8 ñiểm dưới da ở lòng bàn chân phía trước (40µl/ ñiểm) Sau ñó ñược nhốt chung với 5 lợn không gây nhiễm

ðộng vật ñược theo dõi triệu chứng lâm sàng, máu, dịch mũi, và dịch hầu họng ñược thu thập từ ngày 0 ñến ngày 14 sau gây nhiễm (DPI) hoặc sau phơi nhiễm (PED), sau ñó lấy mẫu cách 7 ngày/lần cho ñến tuần thứ 6

Với bò, tại 1 ngày sau gây nhiễm, một bò có hiện tượng rỉ nước ở 5 trong

6 ñiểm tiêm; ngày thứ 2 dịch tiết nhiều hơn ở vị trí tiêm và lở loét bắt ñầu xuất hiện, bắt ñầu có hiện tượng sốt Ngày thứ 3, năm vị trí tiêm bị tổn thương, vết loét có hình bầu dục ðến ngày thứ 4, vết loét vẫn còn nhưng nhiệt ñộ ñã giảm, không còn thấy mụn nước Triệu chứng ở các vị trí tiêm sẽ hết vào ngày thứ 8 sau gây nhiễm Ba bò còn lại không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng hoặc các tổn thương mụn nước trong suốt quá trình thí nghiệm

Hình 1.4: ðiểm bệnh tích của lợn thí nghiệm sau ngày gây nhiễm

và phơi nhiễm

Lợn 61: ñược gây nhiễm bằng virus LMLM O/SKR/AS/2002

Lợn 62 – 65: không gây nhiễm, cho tiếp xúc

Với lợn, 1 ngày sau gây nhiễm, các vị trí tiêm tái nhợt, sang ngày thứ 2, mụn nước bắt ñầu phát triển trên tất cả bàn chân và xuất hiện cả rìa phải lưỡi ðến ngày thứ 3, mụn nước tăng sinh mạnh, lợn gây nhiễm ñược giết, mổ khám ñể kiểm tra bệnh tích tại ngày thứ 4 sau gây nhiễm, khi các triệu chứng bệnh tích ñã biểu hiện rõ Với ba lợn cho tiếp xúc cho thấy tổn thương ở chân sau 3 ngày phơi nhiễm ðến ngày 7, tổn thương ở mức rất cao; lợn có biểu hiện sốt trên 400C ở ngày 6 sau phơi nhiễm

Bệnh lây lan quanh năm, nhưng thường xảy ra vào những tháng mưa phùn,

ẩm ướt, ánh sáng dịu của mùa xuân và ñầu hè (từ tháng 2 ñến tháng 4) (Phạm Sĩ Lăng và cộng sự, 2001)

Bệnh LMLM có xu hướng giảm dần vào các tháng khô nóng Tuy nhiên nếu xuất hiện nguồn bệnh lần ñầu và ñộc lực virus cao thì dịch vẫn phát

ra mạnh và lây lan rộng kể cả các tháng mùa hè

1.4.3 Khả năng lây lan

Mức ñộ lây lan của bệnh LMLM là rất nhanh Trong một thời gian ngắn sự lây lan diễn ra rất nhanh và rộng khắp, trong vòng vài tháng cả một châu lục có thể bị lây bệnh (vụ dịch năm 1985 ở châu Âu) (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

1.4.4 Tỉ lệ ốm và chết

Tỷ lệ tử vong ở ñộng vật trưởng thành thấp nhưng tỷ lệ tử vong ở ñộng vật non có thể lên tới 100%, ñộng vật non chết chủ yếu do viêm cơ tim nặng

dẫn ñến suy tim và chết (Alexandersen S, 2008)

Theo số liệu thống kê bệnh LMLM, lợn mắc bệnh tỷ lệ chết có thể lên tới 20-50%, ñại gia súc tỷ lệ chết không cao (Văn ðăng Kỳ và cộng sự, 2000)

1.4.5 ðường truyền lây

Bệnh có thể truyền lây qua sự tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp giữa các con vật với nhau

Truyền lây trực tiếp qua nước bọt khi nhốt chung chuồng hay thả chung gia súc ở ñồng cỏ và ở nơi tập trung gia súc (chợ, triển lãm)

Truyền lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, máng nước, nền chuồng, dụng cụ chăn nuôi bị nhiễm virus, chân tay, quần áo người chăn nuôi

Sự lây truyền chính của virus LMLM thông qua ñường không khí Nhìn chung virus LMLM xâm nhập thông qua ñường hô hấp ðộ ẩm, tốc ñộ và hướng gió là tác nhân quan trọng trong việc lây truyền bệnh Nếu theo gió trên mặt nước bằng phẳng có thể lên tới 200km, trên mặt ñất bằng phẳng có thể ñược gió ñưa ñi xa tới 100km (Cục thú y, sổ tay dịch bệnh ñộng vật) Các chất bài tiết ở súc vật ốm có vai trò gieo rắc mầm bệnh (như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mũi, nước mắt) và thịt của gia súc ốm cũng làm truyền bệnh ñi xa Trong các chất do súc vật ốm bài tiết ra có vẩy và màng niêm mạc mụn loét chứa rất nhiều virus

Bệnh LMLM có thể truyền theo con ñường cơ học thông qua chó, mèo,

gà, chim, thú hoang giã

Triệu chứng ở trâu bò:

Thời gian nung bệnh từ 2-5 ngày Trâu bò bị bệnh sốt cao 400C-410C, dáng ñiệu mệt mỏi, bỏ ăn, run rẩy, giảm sản lượng sữa trong 2-3 ngày, chảy

nước dãi màu trắng như bọt xà phòng, nước bọt lúc ñầu chảy ra ít và trong,

ñến khi mụn nước vỡ thì nước bọt chảy ra nhiều, có khi thành ñống to, ñi khập khiễng Mụn nước xuất hiện ở niêm mạc miệng, má, lưỡi, bờ lợi, phía trong mũi, núm vú, kẽ và viền móng

Các biến chứng do nhiễm trùng kế phát có thể xảy ra làm cho bệnh càng trầm trọng hợn, loét sâu niêm mạc lưỡi, bong sừng, móng hoặc ñể lại di chứng móng biến dạng Bê, nghé non có thể chết ngay trong khi chưa xuất hiện các triệu chứng ñiển hình do bị viêm cơ tim (Cục thú y, 2007), (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Triệu chứng ở dê, cừu

Triệu chứng bệnh LMLM ở dê cừu là không ñiển hình, tổn thương nhẹ thường chỉ thấy các vết loét ở vùng lợi Những tổn thương ở chân không rõ ràng Mất sữa là triệu chứng ñặc trưng nhất ở cừu và dê cho sữa Dê và cừu non cũng dễ bị chết khi nhiễm virus

Triệu chứng ở lợn

Lợn ñi lại khó khăn, khập khiễng, hoặc không muốn di chuyển, hay nằm hoặc ngồi bằng khớp chân trước Lợn sốt cao 400C - 41°C, ủ rũ, kém ăn, chảy nhiều nước bọt màu trắng Mụn mọc ở quanh mũi, sống mũi, niêm mạc miệng,

kẽ móng, ñầu vú hay quanh bầu vú Sau vài ngày mụn vỡ tạo thành các vết loét,

kẽ móng nứt, long móng có khi mất móng, da ñỏ loét Ở ñầu vú lợn nái ñang nuôi con cũng có mụn nước (Baillre Tindall, 1985) Bệnh gây chết với tỉ lệ cao

miệng, gờ vành mĩng, kẽ ngĩn, da vú v.v…và hiện tượng lở mồm, long mĩng (Nguyễn Tiến Dũng, 2000) Khi mổ động vật, ta cĩ thể gặp các bệnh tích sau:

- Mặt ngồi của tim cĩ vết xuất huyết thành vệt như da hổ, gọi là “tim hổ” (Nguyễn Tiến Dũng, 2000) Nếu con vật sống sĩt thì thấy tim bị co giãn,

to và mềm nhũn Trên vết cắt cơ tim xuất hiện vết sọc với những nốt vàng rải rác nổi rõ trên phần cơ tim bình thường (Cục thú y, 2003)

- Ngồi biến đổi ở tim, con vật cịn cĩ những biến đổi sau (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2002) Viêm khí quản và viêm phổi, lách sưng to và cĩ đốm sẫm, cĩ mụn nước kèm theo tụ huyết, xuất huyết ở niêm mạc đường tiêu hố như lợi, mép chân răng, thực quản, dạ múi khế, ruột non v.v

vú, con vật tiết nhiều nước bọt nhiều, cĩ biểu hiện què, sản lượng sữa giảm

Việc chẩn đốn lâm sàng thường bị nhầm với các bệnh khác như: viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước lợn, bệnh dịch tả trâu bị, bệnh tiêu

chảy do virus của bị Ở trâu bị mắc bệnh, việc chẩn đốn thơng qua triệu chứng lâm sàng tương đối chính xác, nhưng ở lợn thì cần phải chẩn đốn phân biệt với các bệnh mụn nước (A.I Donaldson, 2000), (Alexandersen, S

Tiêm cho chuột: Dùng chuột nhắt trắng 2-7 ngày tuổi và thuần chủng,

khía gan bàn chân chuột, bơi huyễn dịch bệnh phẩm lên vùng da bị khía Nếu bệnh phẩm cĩ chứa virus LMLM, sau 12 giờ sẽ nổi vết đỏ, cĩ thuỷ thũng và đau ở chỗ khía (Tơ Long Thành, 2000)

Nuơi cấy trên tế bào: Các tế bào nhạy cảm với virus LMLM bao gồm tế

bào tuyến giáp trạng bị sơ cấp, tế bào thận cừu sơ cấp, thận bê hoặc thận lợn sơ cấp các tế bào dịng, ví dụ như tế bào thận chuột Hamster một ngày tuổi (BHK-21), sau 24 giờ nếu bệnh phẩm cĩ virus LMLM thì sẽ thấy bệnh tích tế bào (Tơ Long Thành, 2000)

Tiêm động vật cảm thụ: Tiêm vào nội bì lưỡi bị (bị khơng nằm trong

phạm vi ổ dịch, chưa được tiêm phịng văc xin), sau 24 giờ nếu xuất hiện mụn nước ở chỗ tiêm, khi mụn nước tạo ra các vết loét thì kết luận gia súc bị bệnh

1.6.2.2 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học

* Chẩn đốn bằng phản ứng kết hợp bổ thể

Nguyên lý của phản ứng: Phản ứng kết hợp bổ thể dùng hai hệ thống:

Hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể

- Hệ thống dung khuẩn gồm: huyết thanh kháng 1 trong 7 type virus LMLM đã được diệt bổ thể và huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn đốn

- Hệ thống dung huyết gồm: hồng cầu cừu và huyết thanh miễn dịch kháng hồng cầu cừu đã được diệt bổ thể ở 560C trong 30 phút

- Bổ thể là huyết thanh chuột lang tươi

Huyết thanh miễn dịch của từng type được chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch Tiêm văc xin LMLM của từng type virus LMLM khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột) hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau đĩ lấy máu, chắt huyết thanh cĩ chứa kháng thể

Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong mơi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bị hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dịng tế bào cĩ độ nhạy tương đương, khi

tế bào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tích tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm vơ trùng, kết quả được đánh giá dựa trên cở sở cĩ hay khơng hiện tượng dung huyết

Theo Tơ Long Thành (2000), tĩm tắt nguyên lý phản ứng: kháng huyết thanh của một trong 7 type virus LMLM được pha lỗng trong dung dịch đệm veronal theo bậc 1,5; bắt đầu từ độ pha lỗng 1/16, thể tích dùng trong phản ứng là 25µl Thêm vào 50µl cĩ chứa 3 đơn vị bổ thể, sau đĩ thêm 25ml huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn đốn Cuối cùng thêm 25ml dung dịch hồng cầu đã pha lỗng Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể là nghịch đảo độ pha lỗng của huyết thanh tạo nên dung huyết 50% Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể lớn hơn 36 được coi là phản ứng dương tính

Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thơng thường được dùng để phát hiện bệnh LMLM, vì đơn giản, cho kết quả nhanh, chính xác và ít tốn kém

* Chẩn đốn bằng phản ứng ELISA

Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym khơng bị rửa trơi, enzym sẽ phân hủy cơ chất tạo nên màu, khi so sánh màu trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng (Nguyễn Như Thanh, 2002)

Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): Dùng kháng thể gắn

enzym để xác định kháng nguyên nghi cố định trên đĩa chuyên dụng

Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Dùng kháng nguyên

chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi

ELISA là một phản ứng chẩn đốn nhanh dùng cho bệnh LMLM cũng như giám định serotype của virus LMLM

* Chẩn đốn bằng phản ứng trung hịa virus

Nguyên lý: Virus LMLM khi xâm nhập vào cơ thể kích thích cơ thể sản

sinh kháng thể dịch thể đặc hiệu Sự kết hợp giữa kháng thể dịch thể đặc hiệu

và virus LMLM làm cho virus LMLM bị trung hồ, mất khả năng lây nhiễm Phản ứng trung hịa virus được thực hiện trên mơi trường tế bào tổ chức thận lợn hoặc thận cừu, hoặc tế bào mẫn cảm BHK-21, được nuơi trong các đĩa nhựa lỗ nhỏ Kháng thể nghi là huyết thanh của gia súc bệnh được xử lý ở nhiệt độ 560C trong 30 phút

Trong chẩn đốn bệnh LMLM, phản ứng trung hịa dùng kháng nguyên chuẩn là 7 serotype virus LMLM sống để xác định kháng thể nghi là huyết thanh của con vật nghi mắc bệnh

ðể xác định type gây bệnh, cho huyết thanh cần chẩn đốn vào 7 ống nghiệm, sau đĩ cho vào mỗi ống nghiệm từng type virus LMLM đã biết với hiệu giá virus đã được xác định là 100TCID50 một lượng tương đương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 37ºC trong vịng 1 giờ Sau

đĩ dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy lỗ nhựa đã nuơi cấy tế bào để đánh giá khả năng trung hịa của huyết thanh Sau khi đã xác định được type virus gây bệnh, tiếp tục pha lỗng huyết thanh nghi và làm phản ứng tương tự để xác định hiệu giá kháng thề cĩ khả năng trung hịa virus (Tơ Long Thành, 2000)

Phản ứng trung hịa rất cĩ gí trị trong các trường hợp bệnh diễn ra ở thể nhẹ, khơng cĩ điều kiện lấy mẫu bệnh phẩm là mụn nước mà lấy máu để tìm

ra kháng thể

1.6.2.3 Chẩn đốn bằng phương pháp PCR

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm

1985 ðây là phương pháp tạo dịng invitro cho phép khuyếch đại một vùng ADN đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và khổng lồ mà khơng cần đến việc tách và nhân dịng Với những ARN virus thì trước tiên cần thực hiện phản ứng sao chép ngược nhờ men sao chép ngược RT để chuyển ARN thành cDNA Sau

đĩ tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thơng thường (Tơ Long Thành

Mồi là những đoạn ADN ngắn (thường cĩ độ dài từ 6-30 nucleotid) cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của ADN sợi khuơn, enzyme ADN polymarase sẽ kéo dài mồi để tạo thành sợi ADN mới ðể khuyếch đại một trình tự ADN xác định thì phải cĩ được thơng tin về trình tự gen của nĩ đủ để tạo mồi chuyên biệt Một cặp mồi gồm cĩ một mồi xuơi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer)

Trong kỹ thuật RT-PCR, trước hết thơng tin di truyền của các ARN virus

cần được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase để cĩ thể nhân gen đặc hiệu trong PCR

Phương pháp RT-PCR cho phép xác định type của virus LMLM ðây là phương pháp chẩn đốn cho kết quả nhanh, chính xác với độ nhạy cao và ngày càng được sử dụng rộng rãi đối với bệnh LMLM ở Việt Nam cũng như trên thế giới

Sau khi tiêm văc xin mức độ bảo hộ tốt nhất thường được ghi nhận ở

bị là từ 21-28 ngày sau khi tiêm, nhưng cĩ một số trường hợp đỉnh cao này lại quan sát thấy ở ngày 14 sau khi tiêm (Nguyễn Như Thanh, 2001), (Tơ Long Thành và cộng sự, 2006)

1.7.2 Phịng bệnh khi cĩ dịch xảy ra

Khi dịch bệnh LMLM xảy ra, phải thực hiện các biện pháp chống dịch, khai báo cĩ dịch và cơng bố dịch, khoanh vùng ổ dịch