NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN BỆNH

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, được sự đồng ý của Khoa Thú Y, trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội và Bộ mơn Bệnh lý, chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ QUỲNH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR

ðỂ CHẨN ðOÁN BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ QUỲNH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR

ðỂ CHẨN ðOÁN BỆNH

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Thú y, trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Nguyễn Thị Lan và TS Nguyễn Bá Hiên ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

ðồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô trong bộ môn Bệnh

lý, các anh chị ñang công tác tại Phòng thí nghiệm trung tâm trường ðH Nông nghiệp Hà Nội, gia ñình và bạn bè ñã giúp tôi thực hiện ñề tài này Tôi xin cảm ơn các chủ trang trại, các hộ chăn nuôi ở các tỉnh Bắc Giang, Thái Bình, Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập các mẫu bệnh phẩm ở ñịa phương

Cuối cùng, tôi xin kính chúc toàn thể các Thầy, Cô trong khoa Thú y cùng gia ñình luôn mạnh khỏe và công tác tốt

Hà Nội, ngày 30 tháng 07 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Quỳnh Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

Phần I: MỞ ðẦU 1

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 3

2.1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 3

2.1.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam 6

2.2 HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH 7

2.2.1 Phân loại 8

2.2.2 Cấu trúc virus 9

2.2.3 Sức đề kháng 11

2.3 HIỂU BIẾT VỀ BỆNH DO PORCINE CIRCOVIRUS GÂY RA 11

2.3.1 Lồi mắc bệnh 12

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh 13

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13

2.3.4 ðường xâm nhập 14

2.3.5 Cơ chế sinh bệnh 14

2.3.6 Triệu chứng lâm sàng 15

2.3.7 Bệnh tích 16

2.3.8 Chẩn đốn 18

2.3.9 Phịng và kiểm sốt bệnh 20

Phần III: ðỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

3.3 NGUYÊN LIỆU 23

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.4.1 Phương pháp quan sát 24

3.4.2 Phương pháp mổ khám 25

3.4.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản 25

3.4.4 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể 25

3.4.5 Phương pháp PCR 28

3.4.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 30

3.4.5.2 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 31

3.6 Xử lý số liệu 33

Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 KẾT QUẢ XÁC ðỊNH MỘT SỐ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 34

4.2 BỆNH TÍCH ðẠI THỂ CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 38

4.3 TỔN THƯƠNG VI THỂ CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 42

4.4 KẾT QUẢ PCR MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 49

Phần V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 51

5.1 KẾT LUẬN 51

5.2 ðỀ NGHỊ 51

Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vacxin phòng bệnh 22

Bảng 3.1 Cặp mồi ñặc hiệu với ñoạn gen ORF1 của PCV2 24

Bảng 3.2 Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR 31

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen ORF1 của PCV2 32

Bảng 4.1 Nguồn gốc các lợn sau cai sữa trong nghiên cứu 34

Bảng 4.2 Triệu chứng lâm sàng của lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 35

Bảng 4.3 Biến ñổi bệnh tích ñại thể của lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 39

Bảng 4.4 Biến ñổi bệnh tích vi thể một số cơ quan lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 43

Bảng 4.5 Kết quả phản ứng PCR 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc virus PCV2 9

Hình 2.2 Mô hình các bước của phản ứng PCR 30

Hình 4.1 Lợn còi cọc, lông xù 37

Hình 4.2 Lợn tiêu chảy, phân màu nâu 37

Hình 4.3 Sưng hạch bẹn nông 37

Hình 4.4 Lợn chậm lớn 37

Hình 4.5 Lợn bị viêm da 37

Hình 4.6 Lợn biểu hiện thở khó 37

Hình 4.7 Gan sưng, tụ máu 41

Hình 4.8 Phổi xuất huyết 41

Hình 4.9 Hạch màng treo ruột sưng 41

Hình 4.10 Ruột xuất huyết 41

Hình 4.11 Thận sưng, xuất huyết 41

Hình 4.12 Hạch lympho sưng, xuất huyết 41

Hình 4.13 Gan sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46

Hình 4.14 Thâm nhiễm tế bào viêm ở gan lợn mắc PCV2 ( H.E 40X ) 46

Hình 4.15 Lách xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46

Hình 4.16 Tim sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46

Hình 4.17 Phổi lợn mắc PCV2 sung huyết nghiêm trọng ( H.E 10X ) 46

Hình 4.18 Viêm phổi kẽ ( H.E 40X ) 46

Hình 4.19 Hạch lympho sung huyết 47

Hình 4.20 Thâm nhiễm tế bào bạch cầu ái toan và tế bào khổng lồ ở hạch ( H.E 40X ) 47

Hình 4.21 Tế bào khổng lồ ở lách 47

Hình 4.22 Thận xuất huyết 47

Hình 4.23 Tế bào khổng lồ nhiều nhân ở hạch lympho ( H.E 40X ) 47

Hình 4.24 Ruột thâm nhiễm tế bào viêm 47

Hình 4.25 Kết quả ñiện di sản phẩm phản ứng PCR 49

Phần I

MỞ đẦU

Ngành chăn nuôi ngày càng phát triển và giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế đặc biệt ngành chăn nuôi lợn ựã có nhiều thay ựổi ựáng kể, ựáp ứng nhu cầu thực phẩm của người dân Chăn nuôi lợn ựã trở thành nguồn thu nhập quan trọng và là một trong những ngành nghề góp phần dịch chuyển

cơ cấu nền kinh tế nông nghiệp Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi, kéo theo ựó là sự gia tăng về tình hình dịch bệnh, trong ựó có bệnh do circovirus gây ra

Circovirus có 2 type porcine circovirus type 1 (PCV1) và porcine circovirus type 2 (PCV2) PCV1 không có tắnh gây bệnh, PCV2 ựược xem là tác nhân gây hội chứng còi cọc sau cai sữa ở lợn (PMWS - post weaning multisystemic wasting syndrome) đã có rất nhiều nghiên cứu về virus này, trong ựó có các nghiên cứu tìm hiểu kiểu gen của PCV2 ở các nước trên thế giới Các nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2006); T.Opriessnig

và cs (2008) ựã xác ựịnh trình tự nucleotide của PCV1 và PCV2 tương ựồng nhỏ hơn 80% và tương ựồng về aminoacid nhỏ hơn 70% ựồng thời cũng xác ựịnh ựược PCV2 có rất nhiều subtype khác nhau như PCV-2a, PCV-2b, PCV-2c, PCV-2d và PCV-2e Circovirus không phải là một virus mới đây là một virus rất phổ biến trong chăn nuôi lợn từ trước tới nay, thậm chắ có những ựàn lợn tuy biểu lộ dương tắnh với Circovirus nhưng chẳng bao giờ thấy biểu hiện của bệnh

Tỷ lệ nhiễm PCV2 rất cao, có thể chiếm 90 - 100%, nhưng tỷ lệ lợn mắc bệnh PMWS ựiển hình lại rất thấp, chỉ khoảng 5 - 15% Tuy nhiên PMWS không chỉ do Circovirus gây ra, dù nó ựược xem là một yếu tố cần thiết và PCV2 không chỉ liên quan tới PMWS, gần ựây người ta sử dụng thuật ngữ

Ộbệnh ựồng hành với porcine circovirusỢ (Porcine Circovirus Associated

Disease - PCVAD) để chỉ tất cả các bệnh liên quan tới PCV2 xảy ra trên lợn bao gồm: PMWS, phức hợp bệnh hơ hấp trên lợn (PRDC), viêm phổi hoại tử tiến triển trên lợn (PNP), bệnh tiêu chảy, hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS - Porcine Dermatitis and Nephoropathy Syndrome)

Cho đến nay, PCV2 cĩ mặt tại hầu hết khắp các quốc gia trên thế giới, trong đĩ cĩ Việt Nam Tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Việt Nam tương đối cao và tăng qua các năm Nguyễn Tiến Hà (2008) kiểm tra 1073 mẫu huyết thanh lợn đực giống và lợn nái ở 8 tỉnh thành phía Nam trong các năm 2000-2006; tỷ lệ huyết thanh dương tính chiếm 38,9% năm 2000 và 96,47% năm 2006 Tại miền Bắc các nghiên cứu về Circovirus vẫn cịn hạn chế Bệnh do Cirovirus gây ra gần đây mới được quan tâm nên việc nghiên cứu tìm hiểu bệnh cĩ ý nghĩa quan trọng, gĩp phần bổ sung lý luận về bệnh và vào quá trình chẩn đốn, phịng và trị bệnh đạt hiệu quả, giảm thiệt hại do bệnh gây ra

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, được sự đồng ý của Khoa Thú Y, trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội và Bộ mơn Bệnh lý, chúng tơi thực hiện

đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc Circovirus (PCV2) và ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đốn bệnh”

Mục đích nghiên cứu của đề tài

- Làm rõ các đặc điểm triệu chứng lâm sàng, bệnh lý đại thể, vi thể của một số cơ quan trên lợn mắc PCV2

- Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đốn bệnh

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 2.1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

Từ tháng 5 - 2003 ñến tháng 8 - 2005 Zong và cs ñã tiến hành thu thập ngẫu nhiên 1250 mẫu huyết thanh và các mẫu mô lợn nghi nhiễm PCV2 bao gồm: lách, gan, hạch lympho từ 6 quận huyện ở Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang

Sử dụng phương pháp ELISA ñã phát hiện thấy 40% mẫu huyết thanh dương tính với PCV2 ðồng thời, bằng phương pháp PCR trên các mẫu mô cho thấy tại Hàng Châu ñang lưu hành ngoài chủng PCV2 Trung Quốc còn lưu hành rộng rãi các chủng PCV2 khác trên thế giới như: Hà Lan, Canada, Mỹ, ðức

và Vương Quốc Anh

Năm 2010, Long và cs ñã sử dụng phương pháp PCR-RELP ñã xác ñịnh ñược 19 chủng PCV2 ñang lưu hành tại Trung Quốc chia làm 3 kiểu gen trong ñó kiểu PCV-2d là kiểu gen mới và kiểu gen PCV-2a, PCV-2b là hai kiểu gen phổ biến tại Trung Quốc

Năm 2010, Jun và cs ñã gây nhiễm trên 48 chuột chủng Côn Minh cho thấy virus nhân lên trong chuột, chuột chết sau 7, 14, 28 và 42 ngày gây nhiễm tương ứng Bằng phương pháp PCR tìm thấy kháng thể trong huyết thanh chuột gây nhiễm, virus PCV2 trong mô lympho chuột Tổn thương vi thể do PCV2 tập trung và gây suy giảm chức năng các hạch lympho, thỉnh thoảng thấy hoại tử tế bào lympho, vỏ não và hành tủy ở những con chuột ñược gây nhiễm

Năm 1998 những trường hợp ñầu tiên của PMWS ñược mô tả ở Thái Lan nhưng có nghiên cứu chỉ ra ñã phát hiện PMWS trên lợn từ năm 1993 Dựa vào phương pháp PCR khảo sát sơ bộ tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Thái Lan là

10% Phân loại các chủng PCV2 dựa trên nucleotide 262-267 của các trình tự ORF2 phát hiện tại Thái Lan PCV2 ñang tồn tại một subtype mới là PCV2e

Shibahara và cs (2000) chứng minh rằng sự suy giảm tế bào lympho với

cơ chế apoptosic tế bào lympho B là do PCV2 Họ cho rằng một số cơ quan dung giải tế bào là do cơ chế này Như vậy, PCV2 kích thích sự phát triển của hội chứng gầy mòn trên lợn con sau cai sữa (PMWS) bằng cơ chế gây suy

Theo Kwang năm 2009 phương pháp nested-PCR (nPCR) nhạy hơn phương

pháp PCR thông thường gấp 104 lần nPCR ngoài giúp phân biệt 2 loại virus PCV1 và PCV2 còn giúp phân biệt trong trường hợp nhiễm kép khác

Từ năm 2008, Hàn Quốc bắt ñầu sử dụng vacxin phòng circovirus ðến nay, kết quả cho thấy ñã giảm về số lợn nái phải loại bỏ cũng như lượng kháng sinh phải dùng Ước tính giúp tăng khoảng 518 triệu USD hàng năm cho tổng số lợn ở các trang trại của Hàn Quốc

Theo Steven D.Sorden và cs (1999) xét nghiệm PCR tại 17 trại, cho biết

34 lợn còi nghi mắc hội chứng PMWS ñộ tuổi 6-20 tuần tuổi ñều dương tính PCV2 Kết quả PCR cho thấy 65% các mẫu mô dương tính PCV2 với tỉ lệ dương tính ở các mô khác nhau, cao nhất ở hạch lympho sưng lớn (100%), 88% ở lách, 64% tại phổi, 35% tại thận và 15% tại gan

Khi tiến hành kiểm tra lợn 1-2 ngày tuổi tại 4 trại miền Trung - Tây Hoa

Kỳ cho thấy lợn chỉ nhiễm PCV type 2 PCV2 nhiễm hầu hết trong các mô bào nhưng tập trung nhiều nhất trong gan và hệ thống thần kinh trung ương Não và tủy nhiễm nhiều hơn mô thần kinh khác

Pallares và cs (2002) phân tích hồi cứu các trường hợp PMWS tại Mỹ cho biết chỉ 1,9% nhiễm PCV2 trong tổng số các ca khảo sát ở lợn cịi cọc sau cai sữa Các trường hợp khác phát hiện cĩ 35,5% PCV2 nhiễm kèm

Mycoplasma hyopneumoniae, 51,9% trường hợp PCV2 nhiễm kèm PRRS

Năm 2002, một nghiên cứu đầu tiên về chẩn đốn lợn mắc PMWS trong

một con lợn nái rừng Châu Âu, nhĩm tác giả đã sử dụng kỹ thuật để phát hiện DNA của virus PCV2 trong các cơ quan khác nhau bao gồm cả tử cung và trong tổn thương mơ bệnh học ðây là trường hợp đầu tiên phát hiện thấy PCV2 trong tử cung một con lợn rừng hoang dã Năm 2005, trên một con lợn rừng 6-8 tuổi hấp hối, cĩ các triệu chứng gầy cịm, khĩ thở và chết, virus PCV2 đã được phát hiện trong các mẫu mơ, tổn thương mơ bệnh học phù hợp với biểu hiện trong trường hợp mắc PMWS Hai lợn rừng đều thuộc vùng lân cận miền Trung Hy Lạp Virus PCV2 tách từ hai lợn rừng tiến hành phân tích đặc tính di truyền và so sánh đặc tính di truyền virus PCV2 lợn rừng và virus PCV2 lợn trong nước, kết quả thấy PCV2 của hai lợn rừng liên quan chặt chẽ tới nhau và cùng nhĩm với chủng phân lập từ lợn rừng Hungari

John C.S.Harding và cs năm 1998 đã xác định dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PMWS: Ở lợn sau cai sữa tỷ lệ tử vong đạt mức cao nhất vào tháng 9 của dịch (7,67%), sau đĩ trở lại 16 tháng sau với tỷ lệ 2,1% -2,5% Các nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất là cịi cọc (giảm cân, hốc hác), vàng da (bệnh gan) và khĩ thở (bệnh đường hơ hấp)

Bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào PK-15 nhiễm PCV, trên tế bào PK-15 nhiễm PCV1 và PCV2 Kết quả thu được sau 3 năm nghiên cứu là tỷ lệ huyết thanh dương tính với PCV2 nhiều hơn PCV1, PCV2 là loại PCV lưu hành chính và lưu hành ít nhất trong 10 đàn lợn tại Canada trước khi hội chứng PMWS được báo cáo

Tại Qenbec - Canada bằng phương pháp PCR được Gagnon C.A và cs (2007) sử dụng và đã phát hiện ra kiểu gen mới khác với kiểu gen PCV2 trên

lợn nhưng không phải loài mới và ñược gọi là “PCV-2b”

Năm 2011, nhóm tác giả ñã thu thập mẫu bệnh phẩm chủ yếu là hạch và

huyết thanh từ 23 con lợn rừng có nguồn gốc từ khu vực ñịa lý khác nhau ở Rumani trong lợn mắc dịch tả cổ ñiển (CSFV) năm 2008-2009 Tiến hành phân tích trình tự nucleotide khung ñọc mở ORF2 và so sánh với trình tự phân lập từ châu Âu và châu Á Các chuỗi phân tích ñược ở Rumani ñược xác ñịnh thuộc nhóm 2a và 2b với mức ñộ ñồng nhất cao (ñộ ñồng nhất nucleotide ORF2 dao ñộng trong khoảng 90,1% và 100%)

Năm 2008, Per Wallgren và cs ñã tiến hành nghiên cứu 40 lợn trung

bình 37,5 ngày tuổi, theo dõi trong 55 ngày; trong huyết thanh lợn bệnh không có kháng thể ñủ ñể chống lại mầm bệnh Số lượng PCV2 lớn hơn trong lợn mắc bệnh nặng và trong giai ñoạn ñầu so với lợn khỏe mạnh Ở 18/34 lợn không có dấu hiệu lâm sàng PMWS có 107 DNA PCV2/ml huyết thanh, có thể chúng mới bắt ñầu sinh miễn dịch chống lại mầm bệnh

2.1.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam

Theo kết quả khảo sát của Lâm Thị Thu Hương và ðường Chi Mai (2006) tại một số trại lợn công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ cận cho biết tỷ lệ nhiễm PCV2 trên lợn khá cao: 7 trại nhiễm trên 9 trại khảo sát và và tỷ lệ nhiễm ở các trại biến ñộng từ 1,25 – 83,33%

Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2006) sử dụng kỹ thuật miễn dịch Peroxidase trên tế bào một lớp IPMA khảo sát 988 mẫu huyết thanh của lợn nái ở một số tỉnh thành phía Nam cho biết: Tỷ lệ nhiễm PCV2 xuất hiện ở Việt Nam ít nhất từ năm 2000 và tỷ lệ nhiễm tăng dần: 38,97% năm 2000; 84,90% năm 2003 và 90,26% năm 2005

Lê Tiến Dũng (2006) khảo sát trên ñịa bàn thành phố Hồ Chí Minh cho biết: bằng kỹ thuật PCR ñã phát hiện 50,77% (33/65) lợn còi dương tính với PCV2 tại 17/22 trại khác nhau của 5/6 ñịa bàn lấy mẫu

Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2008) phân lập ñược 2 mẫu virus PCV2 trên lợn còi cọc sau cai sữa Các PCV2 phát hiện ở Việt Nam khá tương ñồng với nhau trên 96%, và tương ñồng với các chủng từ Trung Quốc Virus PCV2 phân lập từ thực ñịa có thể gây nhiễm, nhân lên và kích thích sinh miễn dịch trên lợn thí nghiệm

Nguyễn Tiến Hà (2008) kiểm tra 1073 mẫu huyết thanh lợn ñực giống và lợn nái ở 8 tỉnh thành phía Nam trong các năm 2000 - 2006; tỷ lệ huyết thanh dương tính chiếm 38,9% năm 2000 và 96,47% năm 2006

Trần Thị Dân và cs (2010) cho biết: lợn ñược chủng ngừa vacxin thể ORF2 không thay ñổi các chỉ tiêu huyết học và ít bệnh tích liên quan PCV2 so với lợn không tiêm Hiệu quả kinh tế ñược cải thiện ở lô ñối chứng trong ñiều kiện trại bị nhiễm Circovirus

Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2010) so sánh hiệu giá kháng thể virus DTL và kháng PCV2, không nhận thấy ảnh hưởng của PCV2 ñến hiệu quả miễn dịch sau tiêm phòng vacxin DTL ðiều này rất có ý nghĩa là loại ñược nguyên nhân nghi ngờ có ảnh hưởng ñến hiệu quả miễn dịch sau tiêm phòng vacxin DTL trên ñàn lợn có sự hiện diện của PCV2

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2012) sử dụng kỹ thuật Nested PCR phát hiện

và ñịnh type PCV2 trong 453 mẫu huyết thanh và 130 mẫu phủ tạng ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc cho biết tỷ lệ dương tính PCV2 có sự khác nhau giữa các ñịa phương, trong ñó cao nhất là trong phủ tạng của lợn thu thập từ Bắc Giang (71,43%) và Hải Dương (70,00%) Với các mẫu phủ tạng ñược kiểm tra chỉ phát hiện ñược PCV2 ở lợn có các triệu chứng của PCVAD với

tỷ lệ 54,17% Các chủng PCV2 lưu hành ở ñàn lợn thuộc 4 tỉnh trong phạm vi nghiên cứu ñều thuộc genotype PCV2b

2.2 HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH

Circovirus thuộc họ Circoviridae gồm những virus có DNA sợi ñơn, vòng và chúng có chung ñặc ñiểm lý hóa và ñặc tính, cũng như các thành

viên thuộc họ Paroviridae, chúng ñược biết tới là những DNA virus của ñộng vật có xương sống và có DNA sợi ñơn

Họ Circoviridae là những tác nhân gây bệnh quan trọng cho chim, lợn Torque Tenovirus (TTV) là một DNA virus, sợi ñơn, có hình thái giống như Circovirus nhưng chúng ñược xếp vào một chi khác – Anellovirus bởi vì những ñặc ñiểm riêng biệt khác

2.2.1 Phân loại

Các thành viên trong họ Circoviridae có hạt virus, và hệ gen phần nào giống nhau nhưng về sinh thái học, ñặc tính sinh học và tính kháng nguyên khá khác biệt

Hiện tại họ Ciroviridae chia làm hai chi Circovirus và Gyrovirus Chi Circovirus gồm virus gây bệnh mỏ và lông, canady virus, goose virus, pigeon virus, porcine circovirus type 1 và porcine circovirus type 2 Virus gây thiếu máu gà là một nhánh thuộc chi Gynovirus

Porcine circovirus

PCV1 phân lập ñược ñầu tiên ở ðức năm 1974 từ dòng tế bào thận lợn

PK15 nhiễm lâu dài virus này, các nghiên cứu huyết thanh ban ñầu cho thấy virus có mặt trong tất cả các con lợn kiểm tra Những nghiên cứu gần ñây, sử dụng nhiều hơn các phản ứng huyết thanh học cho thấy nhiễm PCV1 không nhiều như chúng ta ñã nghĩ Kiểm tra những ñộng vật khác nhau chỉ có lợn nhà, lợn con và lợn rừng có kháng thể PCV1 ñược coi là không gây bệnh ở lợn, tuy nhiên nó ñược phân lập ở lợn con chết trước khi sinh

PCV2 phân lập ñầu tiên tại Pháp năm 1997 những nghiên cứu tiếp theo

chỉ ra một cách rõ ràng sự hiện diện của kháng thể capsid riêng của PCV2 (PCV2 capsid-specific antibodies) và chính bản thân virus trong mô, huyết thanh Virus ñược phân lập ở hầu hết các vùng trên thế giới - những nơi nuôi lợn bao gồm: Nam Mỹ, Châu Á, Châu Âu và châu ðại Dương PCV2 trên toàn cầu có sự tương ñồng là 96% và tương ñồng ít nhất 60% với PCV1, sự khác nhau cơ bản là trên protein capside

Năm 2008, những thành viên của Hiệp hội các nước châu Âu về bệnh do Circovirus gây ra trên lợn, bao gồm 15 phòng thí nghiệm ở châu Âu và Mỹ ñã

ñề xuất một danh pháp tiêu chuẩn hóa cho việc ñịnh kiểu gen của PCV2 ðề xuất này bước ñầu ñã ñược thông qua phương pháp dựa trên so sánh trình tự cặp (PASC) ñể xác ñịnh kiểu gen PCV2 Phân tích PASC ñược áp dụng cho trình tự nucleocapsid (ORF2) Dùng phương pháp phân tích này và khoảng cách ngưỡng 0,035, kiểu gen của PCV2 ñược gọi tên là PCV2a, PCV2b, PCV2c

Tháng 10 năm 2009, Wang và cs xuất bản bài báo “Genetic varition analysis of Chinese strain of porcine circovirus type 2” trong 40 hệ gen PCV2 ñược phân lập trong khoảng những năm 2004 – 2008 ñược so sánh và ñưa ra

sự tồn tại của 2 kiểu gen PCV2 mới là PCV2d và PCV2e

2.2.2 Cấu trúc virus

Hình 2.1 Cấu trúc virus PCV2

Circovirus có kích thước nhỏ, ñường kính 20-25 nm, không có vỏ bọc, hình cầu, ñối xứng Hạt virus cấu tạo bởi 60 tiểu ñơn vị capsid, bọc lấy DNA ñơn của virus Hệ gen bao gồm phân tử DNA ñơn, vòng, kích thước 1,7-2,3 kb

Sau khi PCV nhiễm vào tế bào, ssDNA được chuyển thành dsDNA- trung gian được biết như là hình thức nhân rộng (RF - replicative form), RF là abisense, với những gen mã hĩa bởi cả chuỗi (+) và chuổi bổ sung (-)

Hệ gen PCV2 được xếp thành 11 khung đọc mở chính thức (ORF) Nhưng Theo Protein biểu hiện thì chỉ cĩ 3 khung đọc mở chính

Theo Meehan B.M và cs (1999), ORF1 (rep gen) được xác định vị trí trên chuỗi dương tính và định hướng theo chiều kim đồng hồ ORF1 (vị trí nucleotide khoảng từ 398-1.342) mã hĩa protein cĩ trọng lượng phân tử 37,7 kDa mã hĩa một protein liên quan đến sự nhân lên của virus Sự tương đồng

về phân tử protein quy định bởi ORF1 của PCV1 và PCV2 khoảng là 86% ORF2 (Cap gen) nằm trên chuỗi bổ sung và định hướng ngược chiều kim đồng hồ, nĩ mã hĩa cho protein cấu trúc của virus, chủ yếu liên quan đến sự hình thành vỏ capsid, cĩ trọng lượng phân tử 27,8 kDa của PCV Sự tương đồng về phân tử protein PCV1, PCV2 do ORF2 mã hĩa là 66±4% Sản phẩm ORF2 kích thích sinh kháng thể chống lại virus, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một cơng cụ để chẩn đốn phân biệt PCV Meehan B.M và cs( 1997) cho biết ORF3 được định vị trên chuỗi bổ sung, định hướng ngược chiều kim đồng hồ và chồng chéo lên ORF1 Nĩ mã hĩa cho protein khơng phải cấu trúc với chiều dài 105 aa Trong ống nghiệm Protein của ORF3 gây ra apoptosis trong tế bào PK-15 Một PCV2 đột biến thiếu ORF3 được thấy là cĩ độc lực kém hơn PCV2 tự nhiên Sự tương đồng aminoacid của protein này giữa PCV1 và PCV2 là 61±5 %

ORF4 mã hĩa cho protein cĩ trọng lượng phân tử 6,5 kDa (vị trí nucleotide khoảng từ 912-733) cĩ sự tương đồng về phân tử protein do ORF4

mã hĩa với PCV1 là 83%, protein này giàu cysteine nhưng chưa rõ chức năng

2.2.3 Sức đề kháng

PCV2 cĩ sức đề kháng cao và bền vững với nhiệt độ cao, formalin, pH thấp Cĩ thể duy trì tính gây nhiễm trong điều kiện pH < 2 và giảm rõ ràng ở pH 11-12

PCV2 bất hoạt ở nhiệt độ cao 560C (1330F) trong 1h, trong 15 phút ở

750C (1670F), và bị diệt ở 800C trong 15 phút Trong điều kiện khơ, virus chịu được nhiệt độ 1200C trong 30 phút

Do virus cĩ tính đề kháng cao, ngay trong điều kiện khử trùng rất cao, PCV2 vẫn cĩ thể tìm thấy trong huyết tương lợn sau điều trị

Khĩ bị tiêu diệt bằng thuốc sát trùng thơng thường (ethanol, iodine, formaldehyde), nhưng bị diệt bằng Sodium hydroxide

Virus bị diệt bởi 2% các chất diệt trùng hỗn hợp 1 (20% glutaraldehyde, 12% 2-propenal, polymer với formaldehyde), và hỗn hợp 2 (55 acid formic%, 7% glyoxylic acid) sau 120 phút ở 200C, nhưng tác dụng rất kém ở 100C

Cĩ thể phân lập virus trong mẫu bệnh phẩm bảo quản ở -700C

2.3 HIỂU BIẾT VỀ BỆNH DO PORCINE CIRCOVIRUS GÂY RA

PCV2 khơng chỉ liên quan tới PMWS, gần đây người ta sử dụng thuật ngữ “bệnh đồng hành với porcine circovirus” (Porcine Circovirus Associated Disease-PCVAD) để chỉ tất cả các bệnh liên quan tới PCV2 xảy ra trên lợn Việc chẩn đốn lâm sàng PCVAD cịn gặp nhiều khĩ khăn vì biểu hiện triệu chứng lâm sàng khơng điển hình, do vậy chẩn đốn bệnh chủ yếu dựa vào xác định bệnh do PCV2 và các biểu hiện chung của PCVAD

PMWS (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome) – Hội chứng

gầy mịn trên lợn con sau cai sữa lần đầu tiên được phát hiện ở Canada năm

1996, dấu hiệu lâm sàng bao gồm: giảm cân, chậm chạp, sưng hạch bẹn nơng, tiêu chảy, da nhợt nhạt hoặc vàng da Tổn thương mơ học chủ yếu là sự suy giảm tế bào lympho với sự thay thế của các bạch cầu trong mơ lympho Tuy nhiên, PMWS rất dễ đồng nhiễm với các vi sinh vật cĩ hại khác như: Virus gây hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản trên lợn (PRRS), Parvovirus lợn

(PPV), virus dịch tả lợn (CSFV), coronavirus lợn, virus cúm lợn (SIV) và một

số vi khuẩn gây bệnh khác như: Streptococcus suis, Pastereulla mutocida, Actinobacillus pleuromoniae (APP), Mycoplasma hyopyneumoniae (MH), Haemophilus parasuis

Theo Taner KARAO và cs (2011), PDNS (Porcine Dematitis and

Nephropathy Syndrome) - Hội chứng viêm da và viêm thận: phát hiện ra lần ñầu tiên vào năm 1993 tại Anh và sau ñó là hàng loạt các nước có ngành công nghiệp chăn nuôi lợn khác Bệnh gây ra các tổn thương trên da, thận, phổi, dạ dày, các hạch lympho Biểu hiện bệnh lý ñặc trưng viêm ống thận, viêm cầu thận Căn nguyên chưa ñược xác ñịnh rõ, người ta thấy nó gắn liền với

PRRSV, Pasteurella mutocida và PCV2

PRDC (Porcine Respiratiory Diseases Complex) – Bệnh phức hợp hô

hấp trên lợn với các triệu chứng biểu hiện như lợn suy nhược, bỏ ăn, hắt hơi,

ho, khó thở, chảy nước mắt, ñi ñứng khó khăn do bị viêm ña khớp và có khi lợn bị co giật

2.3.1 Loài mắc bệnh

Zimmerman và cs (2012) cho biết PCV2 phổ biến trên ñàn lợn trên toàn thế giới, lợn nhà và lợn hoang dã ñều là vật chủ tự nhiên của nó, có nghĩa là khi nhận dạng phân tích nucleotide của PCV2 phân lập từ lợn rừng giống hoàn toàn khi phân lập từ lợn nhà, bao gồm cả PCV2a và PCV2b

Những loài khác, bao gồm cả con người không dễ mắc PCV2 Không thấy có các bệnh tích ñại thể và tổn thương vi thể sau khi gây nhiễm PCV2 trên cừu hoặc bê, kháng nguyên không tìm thấy ở trong các mô Bằng phản ứng ELISA, John A.Ellis và cs (2001) ñã chứng minh ngựa, trâu, bò thịt, bò sữa không cảm nhiễm với căn bệnh

Chuột là một ngoại lệ, có nghĩa là PCV2 có khả năng nhân lên và lây truyền giữa các con, nó ñóng vai trò là vật chủ thay thế hoặc là một vectơ truyền bệnh

PCV2 ñược tìm thấy trên chuột là những con chuột sống quanh và bên trong trại lợn Các con chuột sống không gần hay không liên quan tới trại lợn không thấy mang PCV2

Quan sát thực ñịa, thấy rằng một số dòng lợn có thể mẫn cảm hơn với PMWS, quan sát này ñược hỗ trợ bằng những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Trong ñó lợn Landrace ñươc thấy là mẫn cảm hơn với PMWS so với lợn Duroc, Large white và Pietrain

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh

PMWS do PCV2 thường gây bệnh ở lợn 2-17 tuần tuổi, chủ yếu ở lợn 2 - 5 tuần tuổi, tại thời ñiểm lợn con không còn bú sữa mẹ, không còn ñược nhận kháng thể từ mẹ

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh

Virus thường có mặt trong phân, dịch mũi, miệng, và nước tiểu, hạch amidan, phế quản, chất bài tiết của mắt, nước bọt, sữa, sữa non và tinh dịch của lợn nhiễm bệnh, trong bụi, dụng cụ chăn nuôi.

Virus PCV2 trong máu có thể phát hiện sau 7 ngày sau khi gây nhiễm, cao ñiểm nhất là 14-21 ngày sau nhiễm (DPI)

Những mô lympho thường chứa lượng virus cao nhất, nhưng cũng có thể tìm thấy trong những tế bào biểu mô thận và ñường hô hấp, những tế bào nội

mô, tế bào lympho, tế bào niêm mạc ruột, tế bào gan, tế bào cơ trơn, tuyến tụy

và tế bào ống ñộng mạch

Theo Timmusk và cs (2006), ở lợn ñực gây nhiễm, virus ñược tìm thấy sau 5 - 35 ngày trong tinh dịch, kháng thể xuất hiện sau 11 - 90 ngày Virus PCV2 xuất hiện ở máu lợn nái mang thai sau 7 - 14 ngày sau thụ tinh nhân tạo (tinh nhiễm PCV2), trong lợn con chết lưu, thai bị sảy, và lợn yếu khi sơ sinh PCV2 trong tử cung lợn nái mang thai là nguyên nhân gây ra sảy thai

Virus có trong cơ tim và nhiều mô bào bị tổn thương khác trong thai lợn

bị sảy, chết lưu và thai gỗ

2.3.4 ðường xâm nhập

Sự lây nhiễm có thể xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp

Tiếp xúc trực tiếp với con vật mắc bệnh hoặc phân, nước tiểu, dịch miệng, mũi của con vật mắc bệnh

Tiếp xúc gián tiếp thông qua dụng cụ chăn nuôi như: máng ăn, máng uống, nền chuồng…

Lợn cũng có thể nhiễm khi ăn mô sống của ñộng vật có virus trong máu Việc lây nhiễm qua nhau thai xảy ra ở lợn nái mang thai 3 tuần trước khi sinh

Lợn nái thụ tinh nhân tạo với tinh dịch có chứa PCV2 gây xảy thai và thai của chúng bị nhiễm virus Tuy nhiên vẫn chưa biết ñược lượng tinh dịch thải ra ñủ ñể gây nhiễm cho lợn nái và con của chúng

2.3.5 Cơ chế sinh bệnh

Tế bào ñích của PCV là tế bào ñơn nhân lớn/tế bào dòng ñại thực bào và các tế bào trình diện kháng nguyên, tế bào ñuôi gai; ở mức thấp hơn là các tế bào biểu mô ống thận, tế bào phế quản và tế bào tiểu phế quản; ngoài ra, các

tế bào nội mô, tế bào gan, tế bào lympho khác cũng là tế bào ñích

Tế bào lympho nhiễm virus làm thay ñổi hình thái vi thể của các nang lympho và các hạch lympho, hạch amidan, mảng Peyer và lách (Magar và cs, 2000) Sự thâm nhiễm PCV2 trong tế bào thực bào, tế bào võng lưới nội mô

và các tổn thương u hạt do miễn dịch tế bào là ñặc trưng của lợn sau cai sữa mắc PCV2

Trong dòng tế bào ñại thực bào, tế bào ñại thực bào phế nang là tế bào ñích ñầu tiên của PCV2 Các ñại thực bào nhiễm PCV2 giảm khả năng kiểm soát sự xâm nhiễm các virus khác, các tế bào ñại thực bào phế nang nhiễm PCV2 giảm khả năng sản sinh O-, hệ thống miễn dịch tại mô phổi, ñặc biệt ở những con lợn mắc PMWS, suy giảm, con vật dễ dàng nhiễm các tác nhân gây bệnh khác

Capside protein hoặc chính DNA của PCV2 ngăn cản quá trình tiêu hóa nội bào (endocytic) trong tế bào võng lưới nội mô (dendritic cell), làm suy yếu khả năng truyền tín hiệu “nguy hiểm” và do vậy làm suy yếu hệ thống miễn dịch bẩm sinh Tế bào võng lưới nội mô ñóng vai trò then chốt trong quá

trình xâm nhập của PCV2 (John A.Ellis và cs, 2003) Virus PCV2 in vitro

xâm nhập tế bào ñơn nhân dòng 3D4/31 (từ phế nang lợn) thông qua quá trình tiêu hóa nội bào (clathrin-mediated Endocytosis) và trong môi trường axít

2.3.6 Triệu chứng lâm sàng

Hội chứng gầy mòn trên lợn con sau cai sữa PMWS

PMWS hầu hết phổ biến ở lợn từ 2 - 4 tháng tuổi, nhiễm cao nhất vào thời gian PMWS xuất hiện, vào thời gian ñó những con lợn có biểu hiện lâm sàng có lượng virus tập trung trong huyết thanh cao nhất, thải virus ở mức ñộ cao và chứng minh một phản ứng kháng thể yếu hơn so với những con vật mắc bệnh cận lâm sàng Tỷ lệ nhiễm ở các trại thường từ 4 – 30% và thỉnh thoảng lên tới 50 – 60% Tỷ lệ tử vong trong phạm vi 4 – 20%

Ở lợn sau cai sữa 2 - 3 tuần bắt ñầu xuất hiện những triệu chứng PMWS Các dấu hiệu lâm sàng ban ñầu gồm giảm cân, sự chênh lệch trọng lượng của lợn trong ñàn, tỷ lệ tử vong trong ñàn tăng

John C.S.Harding và cs (1998) cho biết biểu hiện lâm sàng chính là còi cọc, chậm lớn Hiện tượng rối loạn hô hấp ở mức ñộ khác nhau từ nhẹ ñến tử vong và “không phân biệt ñược bằng lâm sàng với các bệnh hô hấp khác” Hạch bẹn nông sưng có thể kết hợp tiêu chảy mạnh, phân màu nâu, mất nước mạnh Da ñôi khi hoàng ñản hoặc nhợt nhạt thiếu máu không phục hồi

do kết hợp với virus tác ñộng ñến tủy xương hoặc do suy dinh dưỡng

Các biểu hiện lâm sàng khác có thể có của lợn trước khi chết do PMWS là: què quặt, suy tim, viêm khớp, chết ñột ngột, co giật

Nghiên cứu của Welch J và cs (2006); Yilmaz A và cs (2004), trong ñàn với triệu chứng PMWS ở mức nhẹ, dấu hiệu ở mức ñộ khác nhau tùy thuộc vào quá trình quản lý chăm sóc, nhưng dễ nhận thấy nhất là dũi mõm liên tục

Khi có các yếu tố stress, nuôi chung lợn các lứa tuổi làm tăng nguy cơ mắc bệnh và biểu hiện PMWS trầm trọng hơn

Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)

PDNS xảy ra ở lợn con, lợn thịt và lợn trưởng thành (11 – 14 tuần tuổi)

Tỷ lệ nhiễm khoảng dưới 1% nhưng ñôi khi có thể cao hơn Tỷ lệ chết có thể lên ñến 100% ở ñàn lợn trên 3 tháng tuổi nhưng chỉ khoảng 50% với lợn nhỏ hơn Lợn chết chỉ sau một vài ngày có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Những con sống sót có thể tăng trọng trở lại sau 7 – 10 ngày

Lợn mắc PDNS có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn, sốt (410C) hoặc không sốt, nằm một chỗ, lười vận ñộng và/hoặc ñi lại khó khăn, cứng nhắc Triệu chứng rõ nhất là trên da xuất hiện những ñám phát ban có màu ñỏ tía, không

có hình dạng nhất ñịnh, bắt ñầu ở vùng chân sau và mông, có trường hợp nốt phát ban lại phân tán khắp cơ thể Bệnh tiến triển, hình thành ñám vẩy sẫm ở những nơi có bệnh tích, sau ñó nhạt màu dần, ñôi khi ñể lại sẹo

Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn

PCV2 có liên quan ñến hiện tượng sảy thai và thai chết non, tuy nhiên trong thực tế hiếm gặp ðiều này có thể giải thích do tỷ lệ huyết thanh dương tính với PCV2 ở lợn trưởng thành cao và do ñó lợn sinh sản thường không mẫn cảm với bệnh Trong những trường hợp rối loạn sinh sản do PCV2, lợn chết yểu có hiện tượng gan xung huyết, tim sưng to, trên bề mặt có nhiều ñiểm hoại tử Bệnh tích vi thể rõ nhất là hiện tượng cơ tim bị viêm tơ huyết và/hoặc hoại tử

2.3.7 Bệnh tích

Bệnh tích ñại thể

Hội chứng gày mòn trên lợn con sau cai sữa PMWS

Ở lợn sau cai sữa: xác gầy và da xanh xao Phổi phù thũng, ñặc lại,

không xẹp xuống, các tiểu thùy có màu hồng nhạt hoặc màu ñỏ, viêm phổi kẽ

Hạch bẹn nông, hạch dưới hàm, hạch màng treo ruột sưng gấp 3-4 lần bình thường Lá lách hơi sưng Gan viêm, xuất hiện các ñiểm hoại tử Thận có thể thấy sưng, có những ñốm trắng, phù thũng rõ ràng Dạ dày và ruột viêm loét

Gan sưng hoặc teo, nhạt màu và những hạt trên bề mặt mà kính hiển vi tương ứng với thoái hóa

Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)

Bệnh tích ñại thể là hiện tượng hoại tử và xuất huyết mô bào, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử mạch máu Hạch lympho, ñặc biệt là hạch sau bụng có màu ñỏ, lớn và có thể có chất lỏng chứa trong bụng

Khi lợn chết thể cấp tính, hai bên thận sưng to, trên bề mặt có nốt màu trắng, phù thũng bể thận, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử có mủ tiểu cầu thận và viêm kẽ thận

Thường thì bệnh tích ở da và thận ñều xuất hiện khi lợn mắc PDNS, tuy nhiên có những trường hợp chỉ biểu hiện một trong hai bệnh tích trên

Hạch lympho thường bị sưng to, có màu ñỏ Lách bị nhồi huyết

Lợn nái nhiễm PCV2 có thể bị sảy thai, thai gỗ, lợn con chết khi sinh ra

viêm cơ tim rất nặng Có thể tìm thấy virus trong cơ tim và các cơ quan khác của bào thai

Bệnh tích vi thể: Các tổn thương vi thể tìm thấy trong các cơ quan

lympho: hạch lympho, amidan, mảng Peyer ruột và lách Trong mô lympho, tổn thương ñặc trưng là suy giảm tế bào lympho sự xuất hiện của thể vùi và tế bào khổng lồ ña nhân

Các tổn thương ngoài cơ quan lympho là: Viêm phổi kẽ, viêm và thâm nhiễm tế bào ñơn nhân ở gan ở mức ñộ khác nhau, viêm thận kẽ

Hoại tử biểu mô ñường hô hấp, viêm tiểu phế quản với sự xâm nhập của tế bào bạch cầu ñơn nhân lớn và bạch cầu trung tính Tổn thương phổi ñặc trưng bởi

sự hình thành u hạt kẽ phổi, xâm nhập tế bào ñại thực bào, tế bào lympho vào các phế nang Virus tìm thấy trong các tế bào biểu mô ñường hô hấp

Thận cĩ thâm nhiễm các tế bào lympho trong tế bào tổ chức u nang thận

và viêm hạch vùng vỏ và tủy thận, rải rác hoặc một vùng rộng

Trong đường tiêu hĩa các u tuyến (villous) từ nhẹ đến nặng Thường virus xâm nhập và nhân lên trong tế bào lympho biểu mơ tuyến và lớp dưới biểu mơ Kháng nguyên virus phát hiện thấy tại tế bào biểu mơ, niêm mạc và

hạ niêm mạc ruột non

2.3.8 Chẩn đốn

Chẩn đốn PCV2 ở lợn hoặc nhĩm lợn con sau cai sữa khi cĩ đầy đủ cả

3 tiêu chuẩn sau:

(1) Sự xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng cịi cọc và giảm cân, cĩ hoặc khơng cĩ dấu hiệu khĩ thở, hạch bẹn nơng sưng và thỉnh thoảng xuất hiện triệu chứng vàng da

(2) Cĩ các tổn thương mơ bệnh học bao gồm: Sự suy giảm các tế bào bạch cầu, viêm u hạt các cơ quan gồm mơ lympho, phổi, gan và thận

(3) Tìm thấy kháng nguyên PCV2 trong các mơ tổn thương

Chẩn đốn PCV2 chỉ cĩ các dấu hiệu lâm sàng và tổn thương bệnh lý là khơng đủ, và khơng cĩ dấu hiệu lâm sàng và tổn thương bệnh lý cũng cĩ thể nghi ngờ mắc PCV2

Chẩn đốn lâm sàng

Dựa vào triệu chứng lâm sàng đặc trưng: Lợn bệnh là cịi cọc chậm lớn, thường xuyên khĩ thở, sưng hạch lympho, da cĩ thể nhợt nhạt hoặc hồng đản Lợn nái cĩ hiện tượng sảy thai ở các giai đoạn khác nhau, thai gỗ, lợn con sinh ra yếu ớt

Chẩn đốn phân biệt bệnh đường ruột, bệnh đường hơ hấp và bệnh cịi cọc do thiếu dinh dưỡng

Bệnh tích mổ khám: Sưng hạch lympho, viêm phổi kẽ, thối hĩa gan,

viêm loét dạ dày Kiểm tra mơ bệnh học tìm thấy các tế bào khổng lồ Lợn con chết trong bụng mẹ, khi sinh ra viêm cơ tim rất nặng

Chẩn đốn phịng thí nghiệm

Chẩn đốn virus học: Tế bào PK-15 được sử dụng để nuơi cấy PCV2

trong phịng thí nghiệm PCV2 khơng gây bệnh tích tế bào nên để xác định sự nhân lên của virus nên dùng các phương pháp miễn dịch huỳnh quang hay nhuộm miễn dịch peroxidase

Chẩn đốn huyết thanh học: phát hiện kháng thể kháng PCV2 trên lợn

mắc PCV2 bằng các phương pháp như:

- Phương pháp trung hịa virus trong huyết thanh

- Miễn dịch peroxidase trên một lớp tế bào (Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay – IPMA)

- Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunofluorescense Assay – IFA)

- Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

Phát hiện axit nucleic của PCV2

- PCR (polymerase chain reaction): được sử dụng để phát hiện axit nucleic của PCV2 với độ chính xác và độ nhạy cao (Choi và cs., 2000) Cĩ các biến thể khác như: multiplex PCR, nested PCR, multiplex-nested PCR, quantitative real time PCR, reverse transcriptase (RT) PCR

- Lai tại chỗ (In situ hybridization – ISH): sử dụng một đầu dị DNA phù hợp với một đoạn đặc biệt của bộ gen PCV2 (Kim và Chae, 2003)

- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): RFLP sử dụng enzyme cĩ khả năng tiêu hĩa axit nucleic của virus (một phần hay tồn bộ)

mà kết quả là các mơ hình đặc hiệu được chụp ảnh trên gel

Phát hiện virus PCV2 hay kháng nguyên của virus PCV2

- Hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC): sử dụng kháng thể

đa dịng để phát hiện kháng nguyên PCV2 trong dung dịch cố định formalin, lát cắt mơ được vùi trong paraffin (McNeilly và cs., 1999)

- Kính hiển vi ñiện tử (EM): Phương pháp này ñược sử dụng ñể chứng minh hạt giống circovirus trực tiếp bên trong tế bào và ñể nghiên cứu cấu trúc và kích thước của virus

- Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp hay gián tiếp trên lát cắt

mô (FA/IFA): IFA/FA sử dụng kháng thể ñơn dòng hay kháng huyết thanh ña dòng ñể phát hiện kháng nguyên trên lát cắt mô ñông lạnh (McNeilly và cs.,

2002)

2.3.9 Phòng và kiểm soát bệnh

Phòng bệnh

Bệnh do PCV2 là một bệnh ña yếu tố nên việc phòng và kiểm soát bằng cách

sử dụng vacxin PCV2 Tất cả các vacxin hiện nay ñều dựa trên chủng PCV2a

Ở lợn, tiêm vacxin ñược báo cáo là cải thiện tăng trọng bình quân trên ngày (ADG) và chuyển ñổi thức ăn, giảm chi phí thuốc men và giảm lượng virus và tổn thương do PCV2 gây ra Ở lợn nái, tiêm vacxin làm tăng tỷ lệ sinh sản

Tiêm phòng cho lợn con: Ingelvac CircoFlex là vacxin capside protein

PCV2 (Boehringer Ingelheim) tiêm bắp 1 lần cho lợn con 3 tuần tuổi, sau 2 tuần sinh miễn dịch kháng PCV2, miễn dịch kéo dài ñến 20 tuần tuổi Tác dụng giảm tỷ lệ tử vong liên quan ñến PMWS từ 14,3% ñến 4,6%, và giảm dấu hiệu giảm cân, tổn thương hạch lympho, giảm quả trình phát tán virus ra ngoài môi trường qua phân, mũi, giảm sự có mặt virus trong máu, mô

lympho

Vacxin Suvaxyn PCV2 tiêm cho lợn khỏe mạnh 4 tuần tuổi trở lên

Tiêm phòng cho lợn nái: Circovac (Merial) là vacxin vô hoạt dùng ñể tiêm

cho lợn nái mang thai và cung cấp kháng thể cho lợn con sinh ra ñến 5 tuần

Kiểm soát bệnh

Hiện nay các vấn ñề các trại chăn nuôi quan tâm không chỉ có quản lý trại, nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn làm thế nào ñể kiểm soát dịch bệnh Chúng ta trước ñây và ngay cả bây giờ thường quan tâm ñến việc ñiều trị hơn

là vấn ñề phòng dịch Ai cũng biết vấn ñề phòng dịch cho trại chăn nuôi rất quan trọng Có 4 nguyên tắc cơ bản trong phòng chống dịch bệnh:

+ Hạn chế tiếp xúc tối ña với lợn:

Mặc dù có trường hợp dịch bệnh lây vào trại là do các ñộng vật hoang dã, côn trùng, gió nhưng ña số nguyên nhân là do con người, xe cộ, kim tiêm, dụng

cụ phẫu thuật, phân hoặc con người cũng có thể là vật trung gian lây bệnh gây ra Chính vì vậy, trại chăn nuôi lợn phải xây dựng các biện pháp cách ly hiệu quả, khống chế tại cửa ra vào, hạn chế tối ña việc tiếp xúc với lợn

+ Rà soát lại các nguyên nhân gây stress:

ðộng vật khi bị stress là lúc dễ bị mắc bệnh Không chỉ là các nguyên nhân gây stress vật lý thông thường mà ta ñã biết như nuôi mật ñộ cao, lợn bị lạnh mà còn do hệ thống miễn dịch không bảo vệñược trước sự tấn công của

vi khuẩn gây stress Chúng ta luôn phải quan sát, rà soát ñể tìm biện pháp sao cho lợn giảm ñược các nguyên nhân gây stress

+ Vệ sinh – Sát trùng:

Vệ sinh, sát trùng các thiết bị, dụng cụ Mỗi ngày phải kiểm tra xem dụng cụ có ñược sát trùng ñạt yêu cầu hay không Cần chọn lựa thuốc sát trùng theo ñúng nồng ñộ và mục ñích Phải nắm rõ nồng ñộ, thời gian tác dụng của thuốc ñể sử dụng ñạt hiệu quả cao nhất Cần tiến hành vệ sinh sát trùng chuồng trại thường xuyên, theo chu kỳ sản xuất của trại và ñúng kỹ thuật Trong tình huống khẩn cấp, ví dụ như trang trại gần ñó có lợn mắc dịch bệnh tiêu chảy, cần phải vệ sinh sát trùng cẩn thận hơn và thường xuyên hơn

cả bên trong và bên ngoài trại Cuối cùng là, tất cả mọi người trong trại phải

có ý thức tốt trong vệ sinh phòng chống dịch

+ Tầm quan trọng của dinh dưỡng:

Phải cho ñủ tất cả lợn con bú ñược sữa ñầu (colostrum); vì sữa ñầu chỉ ñược sản sinh trong khoảng 24 giờ ñầu sau khi nái sinh con và lợn con cũng chỉ có khả năng hấp thụ sữa ñầu tốt nhất trong 24 giờ ñầu Sữa non (hay sữa

ñầu) thường ñậm ñặc hơn sữa thường, có chứa nhiều sinh tố A, nhiều protein

mà ñặc biệt là gamma globulin (kháng thể) của nái mẹ ñể truyền cho lợn con, giúp lợn con kháng bệnh trong thời kỳ bú mẹ ðể phát huy hết khả năng của

hệ miễn dịch nhằm chống lại các loại bệnh cần tiếp tục bổ sung trong cám các nguyên tố vi lượng, khoáng chất, vitamin, chất chống oxy hóa với liều lượng phù hợp cho từng lứa tuổi của lợn

Inactivated PCV1-2 Chimera

PCV2 expressed

in incativated Baculovirus

Inactivated PCV2

Single dose

2 ml IM Single dose

2 ml IM Two injections

3 weeks apart

2 ml IM Primary vaccination: Two injections 3-4 weeks apart, at least 2 weeks before mating Revaccination: One injection at each gestation, at least 2-4 weeks before farrowing

Licensed for Healthy pigs

3-weeks and older

Healthy pigs 4-weeks and older

Healthy pigs 3 weeks and older

Healthy female breeding

age pigs

Available United States

Canada United States

United States Canada

Canada Europe

Phần III ðỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- ðối tượng nghiên cứu: Lợn sau cai sữa, từ 4 – 12 tuần tuổi nghi mắc PCV2

- ðịa ñiểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Trung Tâm, phòng thí nghiệm

bộ môn Bệnh lý, khoa Thú Y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- ðịa ñiểm lấy mẫu: Hà Nội, Thái Bình, Bắc Giang, Hải Dương, Hưng Yên

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác ñịnh một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PCV2

- Xác ñịnh một số bệnh tích ñại thể của lợn sau cai sữa mắc PCV2

- Nghiên cứu bệnh tích vi thể của một số cơ quan của lợn sau cai sữa mắc PCV2

- Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện sự có mặt của virus PCV2 trong một số cơ quan của lợn bệnh

3.3 NGUYÊN LIỆU

- Mẫu bệnh phẩm: gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể lợn lứa tuổi sau cai

sữa nhiễm hoặc nghi nhiễm PCV2 bao gồm: máu, phổi, gan, thận, lách, hạch, ruột, tim ñược thu ở các trại tại 5 tỉnh, thành phố: Hà Nội, Thái Bình, Bắc Giang, Hải Dương, Hưng Yên

- Dụng cụ, trang thiết bị

+ Dụng cụ: Ống nghiệm, lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc ñựng hóa chất, phiến kính, lamen, máy ñúc block, khuôn ñúc, tủ ấm 560C, tủ

ấm 370C, máy cắt mảnh microtom, ống ñựng máu, ống eppendorf, pippet, ñầu típ tương ứng,

+ Cân phân tích, buồng cấy vô trùng, tủ lạnh các loại: -200C, -800C + Máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR

- Hoá chất, môi trường và mồi cần thiết

+ Cồn 700, cồn 950, ethanol tuyệt ñối

+ Formol 10%, thuốc nhuộm HE, cồn, xylen, parafin, PBS, DAB, kháng thể kháng PCV2

+ Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR: cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược), DW2, TBE, Ethidium bromide, agarose, DNA Marker (Bionexus – Mỹ)

+ Bộ kít DNeasy Blood & Tissue và hóa chất do hãng Qiagen cung cấp dùng ñể tách chiết DNA tổng số

+ Bộ kít PlatinumTaq DNA Polymerase (Invitrogen) dùng cho phản ứng PCR

Bảng 3.1 Cặp mồi ñặc hiệu với ñoạn gen ORF1 của PCV2