Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố đến sự ra hoa in vitro lan dendrobium

có những hiểu biết bước ñầu về cơ chế hình thành hoa in vitro ở một số cây trồng, vai trò của các yếu tố tham gia ñiều khiển quá trình ra hoa in vitro ở cây trồng như quang chu kỳ, nhiệt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨUẢNH HƯỞNG MỘT SỐ YẾU TỐ ðẾN

SỰ RA HOA IN VITRO LAN DENDROBIUM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG MỘT SỐ YẾU TỐ ðẾN

SỰ RA HOA IN VITRO LAN DENDROBIUM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60 42 02 01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI, 2014

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Huế

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 1 năm thực hiện luận văn tại khoa Công nghệ sinh học – Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội và Công ty Cổ phần Phát triển Thiên Nhiên xanh, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm ñộng viên, giúp ñỡ của các thầy cô giáo, các chị trong phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học và các cán bộ Công ty Cổ phần Phát triển Thiên Nhiên xanh ðến nay tôi ñã hoàn thành xong luận văn tốt nghiệp của mình

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi vượt qua những khó khăn ban ñầu, tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi chân thành cảm ơn Cô ðặng Thị Phương Trâm – Cố vấn kỹ thuật của Công ty Cổ phần Phát triển Thiên nhiên xanh, ñã tạo ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập cũng như thực hiện luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã sát cánh bên tôi và tạo ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt những năm tháng học tập và trong thời gian hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Huế

2.1.3 ðặc ñiểm hình thái học của loài Dendrobiumaphyllum (Roxb.) C

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

4.2 Ảnh hưởng của BA và nước dừa ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng,

4.3 Ảnh hưởng của PBZ (Paclobutrazol) ñến sự sinh trưởng, phát triển

4.4 Ảnh hưởng của PBZ và BA ñến ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

4.5 Ảnh hưởng của TDZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa in

4.6 Ảnh hưởng của TDZ và PBZñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường ñến sự sinh trưởng, phát

triển và ra hoa in vitro chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả

sau 12 tuần nuôi cấy) 39

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường ñến sự sinh trưởng, phát triển

và ra hoa in vitro cụm chồi lan Dendrobium (kết quảsau 12

tuần nuôi cấy) 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và nước dừa ñến sự sinh trưởng, phát

triển và ra hoa in vitro chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả

sau 12 tuần nuôi cấy) 42

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA và nước dừa ñến sự sinh trưởng, phát triển

và ra hoa in vitro cụm chồi lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 42

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của PBZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa

in vitro chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả sau 12 tuần nuôi

cấy) 45

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của PBZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa

in vitro cụm chồi lan Dendrobium (kết quả sau 12 tuần nuôi

cấy) 45

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của PBZ và BA ñến sự sinh trưởng, phát triển và

ra hoa in vitro của chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 47

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của PBZ và BA ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

hoa in vitro của cụm chồi lan Dendrobium (kết quả sau 12 tuần

nuôi cấy) 48

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của TDZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

hoa in vitro của chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 51

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của TDZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

hoa in vitro của cụm chồi lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 52

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của TDZ và PBZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và

ra hoa in vitro của chồi ñơn lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 55

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của TDZ và PBZ ñến sự sinh trưởng, phát triển và

ra hoa in vitro của cụm chồi lan Dendrobium (kết quả sau 12

tuần nuôi cấy) 55

hoa in vitro của chồi ñơn lan Dendrobium (kết quảsau 12

tuần nuôi cấy) 59

hoa in vitro của cụm chồi lan Dendrobium (kết quảsau 12

tuần nuôi cấy) 60

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Tổng hợp Ethylene và ảnh hưởng của ethylene ñếncác quá

Hình 2.3 Cơ chế phân tử của cảm ứng ra hoa dưới tác ñộng của ánh

Hình.4.3 Ảnh hưởng của TDZ ñến sự sinh trưởng, phát triển của chồi

Hình 4.4 Hoa in vitro của cụm chồi lan Dendrobium trên môi trường

PHẦN I MỞ đẦU 1.1.đặt vấn ựề

Hoa, cây cảnh là một mặt hàng có giá trị kinh tế và có tiềm năng phát triển rất lớn của Việt Nam

Ngoài các phương thức trồng và chơi hoa trên giá thể truyền thống là ựất thì phương thức trồng và chơi hoa trong môi trường nhân tạo ựang rất ựược quan tâm Ở các nước như Thái lan, Singapore, đài Loan, một số sản

phẩm mỹ thuật của cây trồng nuôi cấy invitro ựã ựược giới thiệu ra thị trường

bởi một số công ty thương mại.Ưu ựiểm của loại sản phẩm này là không phải tốn công chăm sóc nhưng vẫn ựược ngắm nhìn chúng lớn lên từng ngày trong thời gian một vài tháng Sản phẩm trang trắ ựầy sáng tạo này ựược vắ như một

hệ sinh thái trong lồng kắnh, làm cho nghệ thuật trồng cây và thú vui sinh vật

cảnh trở nên thú vị Về mặt khoa học, các cây hoa in vitro là một nguồn vật liệu có giá trị trong chọn tạo giống hoa Việc ựiều khiển cây ra hoa in vitro

vừa làm rút ngắn thời gian chọn tạo ựối với những cây có thời gian cảm ứng

ra hoa dài như hoa lan, lại vừa tạo môi trường in vitro thuận lợi cho việc lai

tạo, chủ ựộng trong việc hình thành các tổ hợp laiẦ

Trong lĩnh vực hoa cây cảnh, nuôi cấy in vitro ựã khẳng ựịnh vai trò

không thể thay thế và ựem lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự Rất nhiều

loài hoa và cây cảnh ựã ựược nuôi cấy in vitro thành công nhưng hầu hết

các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức vi nhân giống mà chưa ựược khai

thác về khắa cạnh ựiều khiển ra hoa in vitro Một số nhà khoa học trên thế

giới ựã nghiên cứu cơ chế nở hoa trong ống nghiệm nhưng kết quả còn khiêm tốn và cũng chỉ thành công ựối với một số ắt ựối tượng Hơn nữa, các ựối tượng nghiên cứu ngoài cây hoa hồng và hoa lan thuộc nhóm hoa cây cảnh, các nghiên cứu hầu hết mới chỉ tập trung vào các cây trồng nông, lâm nghiệp nhằm nghiên cứu cơ bản về quá trình ra hoa cũng như phục vụ việc rút ngắn thời gian ra hoa ở một số cây trồng lâu năm Như vậy, mặc dù ựã

có những hiểu biết bước ñầu về cơ chế hình thành hoa in vitro ở một số cây trồng, vai trò của các yếu tố tham gia ñiều khiển quá trình ra hoa in vitro ở

cây trồng như quang chu kỳ, nhiệt ñộ, chất ñiều hòa sinh trưởng cũng như thành phần ña, vi lượng trong môi trường nuôi cấy vẫn còn mang lại nhiều câu hỏi nghiên cứu cần phải giải quyết

Trên thị trường, có thể nhận thấy nhu cầu về hoa lan rất lớn và không ngừng tăng lên bởi vẻ ñẹp kiêu sa và sự ña dạng về màu sắc Loài hoa này

có ñóng góp lớn cho ngành công nghiệp hoa tươi Việc tạo ra sản phẩm hoa

in vitro là một trong các hướng tiếp cận mới, góp phần cho quá trình chọn

tạo các giống hoa mới cũng như làm ña dạng hóa sản phẩm và ñáp ứng nhu cầu về chơi và thưởng thức hoa trong nước

Chi Dendrobiumcó khoảng 1600 giống chia thành 2 dạng chính,

dạng thân ñứng và dạng thân thòng Ở Việt Nam có khoảng 100 giống, phân bố rải rác trong nước Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ giống hoa này tương ñối lớn bởi màu sắc hoa phong phú, số lượng bông hoa nhiều và ñường kính hoa to,…

Xuất phát từ nhu cầu nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng,

chúng tôi ñề xuất ñề tài luận văn: Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tốñến sự ra hoa in vitro lan Dendrobium nhằm xác ñịnh ñược ảnh

hưởng của một số yếu tố chính ñến quá trình ra hoa invitroở lanDendrobium, làm cơ sở cho việc hoàn thiện và phát triển các qui trình

kỹ thuật chủ ñộng ñiều khiển ra hoa in vitro

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Bước ñầu ñánh giá ảnh hưởng của các nhân tố ñến sự sinh trưởng,

phát triển và ra hoain vitro lan Dendrobium

1.2.2 Yêu cầu

Xác ñịnh ñược nồng ñộ tối ưu của ñường, BA, PBZ, TDZ, AgNO3ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa in vitro lanDendrobium

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học:

Kết quả của luận văn có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp dẫn

liệu khoa học mới có giá trị về sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa in vitro lanDendrobium

Kết quả của luận văn là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu về ra

hoa in vitro lanDendrobium

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn:

Tạo ra ñược sản phẩm ra hoa in vitro của lanDendrobium có

giá trị thương mại cao

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)

2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại chi Hoàng thảo (Dendrobium)

Các ñại diện của chi Hoàng thảo (Dendrobium) chủ yếu sống phụ

sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên

ñá, thường ở nơi ẩm, mọc ở ñộ cao 500-1500 m so với mực nước biển, nhưng có khi gặp chúng mọc ở ñộ cao 200 m hoặc tới 2000 m

Theo Dương ðức Huyến (2007) xây dựng hệ thống phân loại lan Hoàng thảo ở Việt Nam chủ yếu dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985)

thành 15 nhóm:Grastidium (Blume) J.J Smith-Trúc lan (Thế giới có

100-120 loài, Việt Nam có 03 loài); Conostalix Kraenzl (Thế giới có 14 loài, Việt Nam có 03 loài); Formonsae (Benth & Hook F.) Hook.f (Thế giới có 30-35 loài, Việt Nam có 10 loài); Dendrobium – Hoàng thảo (Thế giới có

300 loài, Việt Nam có 30 loài); Breviflores Hook.f (Thế giới có 18 loài, Việt Nam có 08 loài); Distichophyllum Hook F (Thế giới có 15 loài, Việt Nam có 03 loài); Superbientina Kraenzl (Thế giới có 13 loài, Việt Nam có

01 loài); Stachyobium Liandl (Thế giới có 40-50 loài, Việt Nam có 06 loài);

Chrysotoxae Kraenzl (Thế giới có 10 loài, Việt Nam có 06 loài); Bolbidium

Lindl Ex Lindl (Thế giới có 7-8 loài, Việt Nam có 03 loài); Crumenatae Pfitz (Thế giới có 40-50 loài, Việt Nam có 08 loài); Strongyle Lindl (Thế giới có 20 loài, Việt Nam có 02 loài); Aporum (Blume) Lindl (Thế giới có

40 loài, Việt Nam có 12 loài); Oxystophyllum (Blume) Miq (Thế giới có

25 loài, Việt Nam có 01 loài)

2.1.2 ðặc ñiểm thực vật học của chi lan Hoàng thảo

Thân: Chi lan Hoàng thảo thuộc nhóm ña thân (sympodial) với

nhiều giả hành ðây là nhóm bao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng

có chu kỳ nghỉ sau những mùa sinh trưởng Chi này vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại có chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa ñầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóngbảo vệ ñể tránh sự mất nước do sức nóng mặt trời ða số các củ giả hành có màu xanh nên nó ñã cùng với lá làm

nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000)

Thân của các ñại diện chi Hoàng thảo ñều phân ñốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, hình trứng,… có chiều dài thay ñổi từ 2-3cm ñến 120

cm hoặc ñôi khi hơn, kích thước phổ biến làm 20-50cm Lát cắt ngang thân

có thể là hình tròn, bầu dục ñôi khi hình bốn cạnh nhưng ñược gọi chung theo kích thước ngang này là chiều dày, thay ñổi từ 0,3-1,5 cm nhưng ña số hay gặp là khoảng 0,5-1cm Thân có thể mảnh, ñôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên (Dương ðức Huyến, 2007)

Rễ: Sự ña dạng về hình thái và cấu trúc rễ ñã làm cho chi lan Hoàng

thảo phù hợp với ñiều kiện sống như khí sinh trong ñất thì rễ mập, thân rễ

bò dài (Trần Hợp, 2000) Rễ của các ñại diện chi Hoàng thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống

Lá: ða số lá có dạng lưng bụng bình thường, ñôi khi gặp vài ñại diện

có lá hình trụ Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung Lá thường hình mác, bầu dục, ñôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài, hình nêm ðỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn, tù, hoặc lá tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay ñổi từ 1-19cm và chiều rộng từ 0,3-3,5 cm Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4 cm) (Dương ðức Huyến, 2007)

Cụm hoa: cụm hoa chùm thường nhiều hoa, ñôi khi có ít hoa hoặc

ñơn ñộc Cụm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có cụm hoa ñẹp

có giá trị làm cảnh (Dương ðức Huyến, 2007)

Hoa: Hoa lưỡng tính, ñối xứng hai bên Màu sắc hoa ña dạng, sặc

sỡ Hoa ña số các loài có hương thơm, bao hoa chia 2 vòng Vòng ngoài gồm 1 lá ñài giữa và 2 lá ñài bên Vòng trong gồm có 2 hoa và một cánh môi (Dương ðức Huyến, 2007)

Quả: Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều

hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Khi quả già, gặp trời ấm sợi này sẽ hút nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa ñầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió (Dương ðức Huyến, 2007)

2.1.3 ðặc ñiểm hình thái học của loài Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch

Loài Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch.: có tên Việt Nam là

hạc vỹ, Ngọc lan, Huỳnh thiên ñại hội

Thân nhỏ dài tới 1m, thân thòng Lá rụng vào mùa thu Hoa mọc ở các ñốt, to 3-3,5 cm và nở vào mùa xuân Hoa cánh mỏng, môi

có lông nhung

2.1.4 ðặc ñiểm sinh thái học chi lanDendrobium

Nhiệt ñộ: Nhiệt ñộ ảnh hưởng nhiều ñến sự tăng trưởng phát

triển của lanDendrobiumthông qua con ñường quang hợp và hoạt ñộng

trao ñổi chất Nhiệt ñộ thích hợp cây quang hợp tốt, khả năng tích lũy chất khô cao nên sinh trưởng và phát triển của cây tốt Ngược lại nếu

triển của lan Lan Hoàng thảo thuộc loài cây ưa nóng, sinh trưởng tốt

ở nhiệt ựộ 23 Ờ 330C Dưới 120C và trên 370C ựều làm chậm và ảnh hưởng ựến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa của cây

Ẩm ựộ: độ ẩm thắch hợp giúp cho cây ựược phát triển nhanh hơn,

hoa tươi và lâu tàn Dendrobium cũng như ựa số các giống lan khác chỉ

phát triển tốt trong ựiều kiện không khắ ẩm nhưng thoáng khắ, vào ban ngày cây cần ựộ ẩm khoảng từ 40-60%, vào ban ựêm ựộ ẩm thắch hợp từ

60 -90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn Loại giá thể quá ẩm và úng sẽ là

ựiều kiện bất lợi cho sự phát triển của của các giống Dendrobium vì

chúng có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân [Bùi Thị Thu Hiền, 2009]

Ánh sáng: Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong ựiều

kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống

Dendrobium là 70%, vì thế giàn che với ựộ che sáng là 30% dưới ựất và

40% trên cao với cường ựộ ánh sáng từ 15.000-30.000 lux rất thắch hợp cho

sự phát triển của lan Dendrobium

Dinh dưỡng: Lan Hoàng thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất

ựịnh ựể sinh trưởng và phát triển Tuy không ựòi hỏi số lượng lớn nhưng phải ựầy ựủ các thành phần dinh dưỡng N, P, K và các yếu tố trung, vi lượng Tùy từng giai ựoạn sinh trưởng mà nhu cầu ựối với cac thành phần dinh dưỡng có khác nhau (đào Thanh Vân và đặng Thị Tố Nga, 2008)

Giá thể: Giá thể của Dendrobium cần chậu phải thật thoáng và

không úng nước Tuy nhiên, do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với

giả hành có thân, các loài thuộc giống Dendrobium cần giá thể hơi ẩm chút

ắt nhưng không ựược làm thối căn hành Vì thế một số loài Dendrobium có

thể phát triển trên các giá thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái

chậu chứa sẵn giá thể Tuy nhiên nếu giá thể là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên thì cần phải cưa ựáy, nếu không cây

bị thối và quá ẩm Cũng có thể trồng cây lan Dendrobium với căn hành

cách ựáy chậu khoảng 3 cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành là một

số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kắch thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả

nhất ựối với các loài Dendrobium

2.2 Cơ sở khoa học sự ra hoa ở cây trồng

Sự ra hoa ựánh dấu một giai ựoạn quan trọng trong ựời sống thực vật bậc cao đó là chuỗi các sự kiện khiến chồi sinh dưỡng chuyển thành chồi sinh dục, tượng hoa, tăng trưởng hoa và nở hoa Quá trình này ựược ựiều hòa bởi nhiều yếu tố ngoại sinh như nước, ánh sáng, nhiệt ựộ, dinh dưỡng, stress hữu sinh,Ầ và nội sinh như kiểu gen, trạng thái sinh lý của cây, tuổi cây, nhịp sinh học,Ầ (Bùi Trang Việt, 2000)

2.2.1 Cơ sở sinh lý, sinh hóa

Ở hầu hết các loài thực vật bậc cao, các yếu tố ngoại sinh như dinh dưỡng, nước, nhiệt ựộ, ánh sáng,Ầ có ảnh hưởng rất lớn ựến thời ựiểm ra hoa Mặc dù vậy, ngay cả khi ựặt trong ựiều kiện môi trường thắch hợp cho

sự ra hoa, các cơ quan hoa vẫn không xuất hiện khi cây chưa ựủ lớn và không ở trạng thái sinh lý thắch hợp Tuy nhiên, trong trường hợp cây phải ựối phó với các ựiều kiện khắc nghiệt của môi trường (stress nước, thiếu hụt chất dinh dưỡng, sâu bệnh tấn công) cây sẽ chuyển sang giai ựoạn ra hoa nhằm ựảm bảo khả năng duy trì nòi giống

a Các chất dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố giới hạn của thực vật trong giai ựoạn ra hoa (Kostenyuk và cs, 1999; Meria và cs, 2006) Yêu cầu dinh dưỡng ựể cây chuyển từ giai ựoạn sinh dưỡng sang giai ựoạn sinh sản ựòi hỏi cả lượng và

chất Về lượng, ở thực vật bậc cao thường tồn tại hai giới hạn: giới hạn dưới (nguồn dinh dưỡng không ñủ cho cây ra hoa) và giới hạn trên (sự phát triển dinh dưỡng chiếm ưu thế) Do ñó, hai yếu tố cơ bản ảnh hưởng ñến quá trình ra hoa của cây là nitơ và cacbon

sự phát triển sinh dưỡng cao, nếu quá thấp hoặc quá cao thì lại ức chế sự sinh trưởng của thực vật

Khi môi trường thay ñổi, bổ sung tỷ lệ các chất chứa N/P/K như

NH4NO3, KH2PO4, KNO3 và (NH4)2NO3, KClO3,…ñã cho kết quả khác

nhau về sự ra hoa in vitro Các thí nghiệm này ñã ñược ứng dụng ở nhiều cây trồng như ñậu Hà Lan (Franklin và cs., 2000], Perilla frutescens(Zhang,

2007) ðặc biệt ñối với hoaLan, Kostenyuk và cộng sự (1999) ñã kích thích

ra hoa sớm thành công trên cây Lan Cymbidium niveo-marginatum Maksau

90 ngày bằng việc thay ñổi tỷ lệ các chất có N và P (x1 N + x1 P) trên môi trường cơ bản MS có bổ sung TDZ hoặc BA Ngoài ra, Tee và cs(2008) ñã

cho thấy, kích thích cảm ứng ra hoa ở Lan Dendrobium soniatrên nền môi

trường cơ bản MS với thành phần KH2PO4 x 1.25 lần, nitrogen giảm còn 0.25 lần (bao gồm KNO3 và (NH4)2NO3) + 20 µM BA ñã làm tăng gấp ñôi

tỷ lệ chồi có hoa in vitro so với ñối chứng Trên cây Torenia(Tanimoto và cs,

1981) cho thấy sự có mặt của NH4NO3 và các vitamin trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự sinh trưởng của cây, ức chế sự ra hoa Môi trường tối

ưu cho sự ra hoa in vitro cây Torenia là 1/5 các muối MS, không có

NH4NO3 và các vitamin

Bên cạnh ñó, hàm lượng nitơ trong môi trường cao sẽ ức chế sự ra hoa Trên nhân sâm (Chang và cs, 1980), cà chua (Dielen và cs, 2001), giảm hàm lượng nitơ ñơn lẻ không cảm ứng ra hoa nhưng khi kết hợp giảm nitơ với bổ sung BA, cắt rễ và tăng hàm lượng phosphor, kali trong môi

trường nuôi cấy thúc ñẩy sự ra hoa in vitro xảy ra nhanh hơn Ngoài ra, nguồn nitơ cũng ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoain vitro Trên cây kiều mạch (Fagoppyrum esculentum L.), khi tăng tỷ lệ C/N từ 0/3

ñến 3/0 trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ chồi hoa tăng từ 0% ñến 97,2 % và

số hoa trên mỗi phát hoa cũng tăng lên từ 0 ñến 3,73 hoa/phát hoa (Yongsak và cs, 2001)

* ðường

Ngọn là nơi nhận nhiều hormone, cacbonhydrate và các chất khác

từ những phần còn lại của cây Ở nhiều loài cây, cây bị trẻ hóa hoặc kéo dài giai ñoạn ấu niên khi nguồn cacbonhydrate chuyển ñến ngọn giảm (Taiz và cs, 2002)

Các nghiên cứu cơ bản về sự hình thành hoa ở thực vật ñã cho thấy rằng Cacbonhydrate ñược xem là nguồn carbon cần thiết trong môi trường nuôi cấy cho sự hình thành hoa và nó là nguồn năng lượng ñáp ứng cho sự nở

của hoa, có vai trò cảm ứng sự hình thành và phát triển của hoa in vitro

(Nitsch, 1972; Dien và Trần Thanh Vân, 1974) Các loại ñường như glucose, maltose, lactose và raffinose ñều có tác dụng tốt mặc dù sucrose ñược sử dụng phổ biến nhất (Nitsch và Nitsch, 1967) Nồng ñộ ñường tốt nhất cho sự ra hoa khác nhau giữa các loài khác nhau Việc sử dụng các

loại ñường hòa tan có thể làm gia tăng hoạt ñộng của con ñường pentose phosphate (Nitsch, 1972)

Bổ sung nguồn carbonhydrate trong môi trường nuôi cấy in vitro ñã cho kết quả tích cực ñến sự kích thích, cảm ứng hình thành hoa in vitro ở một

số cây trồng như Phyllanthus niruri(Lian và cs, 2006),Swainsona formosa(Tapingkaevà cs, 2000), Kniphofia leucocephala(Taylor và cs, 2007),Spathiphyllum(Dewir và cs, 2007)

Ngoài ra, ánh sáng và nhiệt ñộ thấp cũng ñóng vai trò ñáng kể trong

việc biểu hiện vai trò của ñường Ở long ñởm (Gentiana triflora), nhu cầu

sucrose của cây thay ñổi tùy theo cường ñộ ánh sáng của môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, sucrose không thể thay thế cho nhu cầu ánh sáng của cây trong giai ñoạn ra hoa (Zemin và cs, 2002)

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường chứa nồng ñộ ñường cao làm

tăng quá trình ñồng hóa cung cấp cho ñỉnh thúc ñẩy sự ra hoa ở một số loài (Dickens và cs, 1988) Tuy nhiên nồng ñộ quá cao của ñường làm suy yếu

sự sinh trưởng và ức chế ra hoa (Vincent Dielen và cs, 2000) vì làm ảnh hưởng ñến áp suất thẩm thấu của môi trường

* Yếu tố vi lượng

Các yếu tố vi lượng có mặt trong cây với lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu ñược Chúng có vai trò ñiều chỉnh các hoạt ñộng sống của cây, hoạt hóa hệ thống enzym, làm thay ñổi ñặc tính lý hóa của nguyên sinh chất, thay ñổi tính chống chịu của cây với các ñiều kiện không thuận lợi của môi trường

Coban là thành phần thiết yếu của một số enzyme và Co-enzym Nó ñược chứng minh là có ảnh hưởng tới sự tăng trưởng và chuyển hóa ở thực vật ở các mức ñộ khác nhau tùy thuộc vào nồng ñộ và trạng thái của nó Trong quá trình hô hấp, coban không có mặt tại các vị trí hoạt ñộng của một số enzyme chuỗi hô hấp Trong quang hợp, coban ức chế hoạt ñộng

của PSII Trong tế bào thực vật, nồng ñộ ñộc hại của coban gây ức chế hoạt ñộng vận chuyển các ion, cản trở quá trình tổng hợp RNA, làm giảm số lượng DNA và RNA bằng cách thay ñổi hoạt ñộng của một lượng lớn các endo và exonuclease Tác dụng bất lợi của coban lên hình thái học bao gồm: vàng lá, ức chế sự xanh, giảm trọng lượng chồi Tác dụng có lợi của coban bao gồm: làm tăng sức chịu hạn trong hạt giống, quyết ñịnh sự tích lũy alkaloid trong cây thuốc (Palid và cs, 1994)

Các ion bạc dưới dạng nitrate (AgNO3) ñóng vai trò chính trong quá

trình phát sinh phôi, hình thành rễ in vitro, ra chồi (Bais, 1999) Sự thêm

AgNO3 vào môi trường nuôi cấy mô thực vật làm tăng ñáng kể quá trình tái sinh cơ quan ở cả thực vật một lá mầm và hai lá mầm (Beyer, 1976; Bais, 2000) Các ion bạc còn ñược sử dụng dưới dạng thiosunfat (Ag2S2O3) trong

nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô (Eapen và cs, 1997).ðối với hoa Hồng in

vitro, thí nghiệm của Ibrahim và cs, 2001 bước ñầu ghi nhận ảnh hưởng của

AgNO3 ñến số chồi hoa trên một mẫu cấy tái sinh

Coban và bạc ñóng vai trò quan trọng thúc ñẩy sự ra hoa của thực vật thông qua việc ảnh hưởng ñến hoạt ñộng và quá trình tổng hợp ethylene (Ethylene là chất có tác dụng kích thích quá trình chín quả, rụng lá, sự tàn nhanh hoa, kích thích sự ra hoa ở một số loài ñặc biệt là ra hoa trái vụ ñồng thời ức chế các quá trình hình thành rễ, tạo callus, tái sinh phôi, tăng trưởng chồi và hình thành hoa) Coban ức chế quá trình tổng hợp ethylene (Lau và

cs, 1976) bằng cách cản trở sự trao ñổi ACC với ethylene Bạc ức chế hoạt ñộng của ethylene (Beyer, 1976) Cơ chế của bạc ức chế hoạt ñộng của ethylene ñược cho là do sự xáo trộn các ñiểm liên kết ethylene Thụ thể ethylene, ETR1, có chứa một ñiểm liên kết thông qua trung gian là một ñồng yếu tố (Cu) Sự thay thế ñồng yếu tố này bằng ion bạc làm ức chế

hoạt ñộng của ethylene (Zhao, 2002)

Hình 2.1 Tổng hợp Ethylene và ảnh hưởng của ethylene ñến

các quá trình sinh lý

Ứng dụng các nguyên tố vi lượng ñến ñiều khiển ra hoa ở cây trồng chưa nhiều Sharma và cộng sự (2008) ñã nghiên cứu về ảnh hưởng của bạc nitrat (AgNO3) và coban clorit (CoCl2) ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra

hoain vitro của cây ớt (Capsicum frutescens) Trong nghiên cứu này, Sharma và cộng sự ñã bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitroAgNO3 và CoCl2 ở các nồng ñộ 0, 10, 20, 30, 40, 50 µM Kết quả những cây ớt ñã nở hoa sau 25 ngày ở nồng ñộ AgNO3 (40 µM) và sau 45 ngày với CoCl2 (30 µM) Cây sinh trưởng và phát triển bình thường

b Ánh sáng

Ngoài vai trò cung cấp năng lượng cho cây quang hợp, ánh sáng còn là môi trường thông tin cho các quá trình tăng trưởng và phát triển thực vật Năm 1920, Garner và Allard nhận thấy hiện tượng ra hoa cùng nhiều ñáp ứng khác ở thực vật chịu tác ñộng của quang kỳ ngày dài hoặc quang kỳ ngày ngắn qua các thí nghiệm trên cây thuốc lá Maryland

Mammoth (Brian, 2006; Wada và cs, 2005) Càng về sau, các nhà khoa học càng phát hiện quang kỳ có ảnh hưởng lớn ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa ở nhiều loài thực vật

Quang kỳ là sự xen kẽ giữa giai ñoạn sáng và giai ñoạn tối trong 24 giờ (có thể dài hơn trong thực nghiệm) Sự xen kẽ giữa giai ñoạn sáng (ngày) và giai ñoạn tối (ñêm) tạo nên quang kỳ cảm ứng

Mỗi loài thực vật khác nhau cần ñộ dài ngày và số quang kỳ cảm ứng khác nhau ñể ra hoa Khả năng phản ứng của thực vật với ñộ dài tương ñối của ngày và ñêm ñược gọi là quang kỳ tính Dựa vào quang kỳ tính, thực

vật ñược chia làm 03 loại:

- Cây ngày ngắn (short-day plants): Ra hoa trong ñiều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày ít hơn thời gian chiếu sáng tới hạn Ví dụ: cây hoa cúc, dâu tây, lúa, mía

- Cây ngày dài (long-day plants): Ra hoa trong ñiều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn thời gian chiếu sáng tới hạn Ví dụ như cây cẩm chướng, yến mạch, hoa chuông

- Cây trung tính: Không mẫn cảm với quang chu kỳ mà khi ñạt ñược mức ñộ sinh trưởng nhất ñịnh thì ra hoa Gồm phần lớn cây trồng như: Hoa hồng, cà chua, lạc ngô, ñậu tương, hướng dương…

Nhân tố quan trọng quyết ñịnh sự ra hoa là thời gian tối hay ñộ dài ñêm mà cây nhận ñược Mỗi loài yêu cầu thời gian tối riêng, ñược gọi là ñộ dài ñêm tiêu chuẩn Sự mẫn cảm của sự cảm ứng quang chu kỳ tùy thuộc vào nhiều yếu tố Sự mẫn cảm thay ñổi với tuổi sinh lý của lá

Có 2 quan ñiểm giải thích quang chu kỳ của sự ra hoa:

Hoocmon ra hoa - florigen:

Bản chất florigen: Theo học thuyết Trailakhian thì florigen là hoocmon kắch thắch ra hoa đó là một tập hợp của gibberellin (kắch thắch sinh trưởng của ựế hoa) và antesin (kắch thắch sự ra mầm hoa Ờ antesin là chất giả thiết)

Quang chu kỳ ảnh hưởng tới các hoocmon ra hoa ựó Thực vật ngày dài (ựêm ngắn) luôn luôn có antesin nhưng ựể ra hoa thì cần có gibberellin,

mà gibberellin lại chỉ ựược tạo ra trong ựiều kiện ngày dài Khi chiếu sáng ngày ngắn thì cây ngày dài không ra hoa ựược.Thực vật ngày ngắn (ựêm dài) luôn có gibberellin, nhưng ựể ra hoa cần có antesin, ựược tạo ra trong ựiều kiện ngàyngắn Vì vậy trong ựiều kiện ngày ngắn phức hệ florigen ựược hình thành và cây ra hoa

Tác ựộng của florigen: Lá là cơ quan tiếp nhận ánh sáng và sản sinh florigen kắch thắch sự ra hoa của cây

Học thuyết Phytochrom:

Phytochrom là một sắc tố thực vật có khả năng ựiều chỉnh quá trình phát triển của cây trong ựó có quá trình ra hoa của thực vật dưới tác ựộng của quang chu kỳ Nó là một chất tiếp nhận ánh sáng trong cây ựể gây nên các biến ựổi liên quan ựến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa Học thuyết này chỉ

ra rằng ánh sáng ựỏ có bước sóng 660nm kìm hãm sự ra hoa của cây ngày ngắn và kắch thắch sự ra hoa của cây ngày dài Ngược lại ánh sáng vùng cuối

ựỏ (ựỏ xa) có bước sóng 730nm lại kìm hãm sự ra hoa của cây ngày dài và kắch thắch cây ngày ngắn ra hoa điều ựó chứng tỏ trong cây tồn tại một hệ thống sắc tố nào ựó hấp thu ánh sáng ựỏ và cuối ựỏ Các sắc tố này có khả năng ựiều khiển sự ra hoa của cây ngày ngắn và ngày dài Bản chất tác dụng của phytochrom lên sự ra hoa còn chưa hoàn toàn sáng tỏ

Quang kỳ kiểm soát ra hoa thông qua sự tương tác sinh học và các thụ quan ánh sáng (photoreceptor), tác ñộng ñến sự ñóng, mở những gen xác ñịnh mô phân sinh hoa, từ ñó thúc ñẩy hay kìm hãm quá trình ra hoa Thực vật có hai hệ thống nhận tín hiệu ánh sáng chính: phytochrome nhận ánh sáng ñỏ, cryptochrome và phototropin nhận ánh sáng UV-A/xanh Ở

Arabidopsisánh sáng ñỏ xa và ánh sáng xanh thúc ñẩy sự ra hoa Nhiều

nghiên cứu cho thấy, cryptochrome 1, cryptochrome 2 và phytochrome A thúc ñẩy ra hoa Chúng hiện diện ở cytosol trong ñiều kiện tối và di chuyển vào nhân dưới tác ñộng của ánh sáng, tương tác với cac protein có chức năng ñiều hòa biểu hiện các gen ñáp ứng với ánh sáng Chúng kiểm soát sự chuyển tiếp từ chồi sinh dưỡng sang chồi sinh dục theo cơ chế chính là tác ñộng ñến các yếu tố phiên mã nhằm ñiều hòa biểu hiện của các gen xác ñịnh

mô phân sinh hoa Cho ñến nay, cấu trúc, chức năng của các thụ quan ánh sáng và vai trò của chúng trong quá trình ra hoa còn nhiều ñiều cần nghiên cứu thêm (Brian, 2006; Fabrice và cs, 2006)

Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt ñộ ñến việc ñiều khiển

ra hoa in vitro ñã ñược tiến hành trên rất nhiều cây trồng khác nhau như cây Watsonia laccata(Suh và cs, 2011), cây Saffron(Jun và cs,2006) ðối

với hoa Lan, ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sự sinh trưởng, phát triển và

ra hoa ñã ñược ghi nhận trong một số công trình nghiên cứu trên một số ñối tượng: Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Paphiopedilum và Phalaenopsis(Wang, 2009) Trên cây hoa Hồng, Mole (1998) ñã nghiên

cứu về ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng ra hoa của cây ñã kết luận rằng nhiệt ñộ 18 oC là nhiệt ñộ thích hợp cho cây hoa hồng sinh trưởng,

phát triển và ra hoa tốt nhất ðối với cây hoa thuộc họ Bỏng (Kalanchoe

blossfediana Poellniz.), Dicker và cs, (1990) ñã kết luận loài cây này tích

cực cảm ứng ra hoa trong ñiều kiện ngày ngắn

Bên cạnh ñó, khả năng ảnh hưởng của ánh sáng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa còn tùy thuộc vào cách tác ñộng trực tiếp hay gián tiếp, loại ánh sáng và cường ñộ ánh sáng Các thí nghiệm khảo sát vai trò của ánh sáng và khả năng tương tác của ánh sáng với các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa (nồng ñộ ñường, nồng ñộ BA, nồng ñộ GA3,

pH) trên chồi in vitro của cây long ñởm cho thấy khả năng ra hoa của cây

không tỷ lệ thuận với sự gia tăng cường ñộ ánh sáng (Zemin và cs, 2002)

c Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ có vai trò quan trọng trong sự ra hoa Nhiệt ñộ ngày và ñêm tương tác với nhau, ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa của cây Nhiệt ñộ cũng có thể tương tác với yếu tố môi trường khác và cùng tác ñộng lên sự tượng hoa ở thực vật ðối với cây hàng năm, ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa là thứ yếu sau ảnh hưởng của quang kỳ Nhưng với cây hai năm (ñặc biệt là cây vùng ôn ñới) thì ngược lại, trong năm ñầu chúng duy trì ở trạng thái dinh dưỡng và qua năm sau, sau khi ñã trải qua một thời gian lạnh dài thì chúng ra hoa Nếu những thực vật này không ñược thọ hàn thì phần lớn chúng ở trạng thái sinh trưởng, phát triển dinh dưỡng Ngoài ra, nhiệt ñộ cao trước và sau thời gian thọ hàn cũng ảnh hưởng ñến khả năng ra hoa và số lượng hoa (Beverley, 2007; Bùi Trang Việt, 2000)

Sự hình thành hoa ñược cảm ứng nhờ nhiệt ñộ thấp gọi là sự xuân hóa Cơ quan tiếp nhận nhiệt ñộ thấp là ñỉnh sinh trưởng ngọn, chỉ cần ñỉnh sinh trưởng chịu tác ñộng của nhiệt ñộ thấp là ñủ ñể gây nên sự phân hóa mầm hoa mà không cần nhiệt ñộ thấp ở cơ quan khác Xuân hóathông quaxử lý lạnhrấthiệu quảởgiai ñoạnhạt giốnghoặcgiai ñoạncây con.Theogiả thuyếtñược ñề xuất củaPurvis, các thực vậtbình thườngtổng hợpmộtchấtgọi là'B' từmột sốtiền tố không biếtgọi là'A' Sự tổng hợpcủaBñượctăng

tốcbằng cáchxử lýlạnh, khi'B' ñượctổng hợp, nóvẫn còn tồn tạitrong một khoảngthời gian Hơn nữachuyển ñổicủaBthành C vàDñược diễn ra dưới sựkiểm soátcủaquang chu kỳ Cácchất Dñược cho làcácnội tiết tố kích thích

ra hoavàClà mộthợp chấttrung gian Việc chuyển Bthành Clàchậm,nhưng một khinóñược hình thànhnónnhanh chóngchuyển sangD.KhiDtích lũyñến mộtmức ñộthích hợp, nócảm ứng rahoa Nếucùng một câyñược giữtrongñiều kiệnngắnngày,sự chuyểncủaBthànhCbịức chế, thay vìCñượcchuyển thànhBvàsau ñóBñượcchuyển thànhE.Vì vậy,thực vậtvẫn còntrong trạng thái sinh trưởng(Vũ Quang Sáng, 2007)

d Nước

Khô hạn là vấn ñề ñáng lo ngại cho sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên chủ ñộng gây stress nước lại có khả năng cảm ứng ra hoa và ñược ứng dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở vùng nhiệt ñới Cho ñến nay, có khoảng 100 loài cây ñược cảm ứng ra hoa theo phương thức này ðiển hình

như Chamae Gigas intrepdius, cây họ cam chanh, Craterostigma

plantagineum, Myrothamnus flabellifolia Khi cây rơi vào trạng thái thiếu

nước, hàm lượng acid abscisic trong lá gia tăng khá nhanh cảm ứng việc ñóng khí khổng, cây giảm hoặc ngừng quang hợp, tốc ñộ hô hấp giảm, hàm lượng ñường tăng do tăng cường sử dụng nguồn tinh bột dự trữ, sự sinh tổng hợp protein giảm, tốc ñộ tăng trưởng tế bào cũng giảm Tuy nhiên, tác nhân nào ñược hình thành do quá trình stress nước cảm ứng ra hoa vẫn chưa ñược nghiên cứu kỹ (Helgi và cs, 2005)

e.Tuổi và trạng thái sinh lý của cây

Dù cây ñược trồng trong ñiều kiện như thế nào, hầu hết các cây ñều trải qua một thời gian sinh trưởng dinh dưỡng sau khi trồng Thời kỳ này ñược gọi là thời kỳ cây non Trong thời kỳ này, cây không mẫn cảm với sự

kích thích ra hoa Thời kỳ cây non thường xuất hiện trên cây thân gỗ nhiều năm hoặc một số ít trên trên cây thân thảo hàng năm hay hai năm mà thời gian kéo dài từ vài ngày ñến vài tháng Khi cây qua giai ñoạn này thì ñạt ñến tình trạng ñủ khả năng ra hoa và sẽ mẫn cảm với ñiều kiện cảm ứng ra

hoa Trạng thái này có thể rất sớm ở ñậu phộng (Arachis),ở cà chua (13

lóng), cây ăn trái (5-7 năm) và hàng chục năm ở cây lâu năm (sồi) (Bùi

Trang Việt, 2000) Trong ñiều kiện in vitro, Cây Chenopodium murale ở

giai ñoạn 1, 2, 3 cặp lá ñược khảo sát tác ñộng của các yếu tố ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa Kết quả cho thấy ở những cây có 3 cặp lá sau khi cảm ứng có tỷ lệ ra hoa cao nhất (Mitrovic và cs, 2000)

f Các nhân tố phi sinh học

Các nhân tố phi sinh học (hạn, nhiệt ñộ quá cao hoặc quá thấp, cường

ñộ ánh sáng quá cao hoặc quá thấp, thiếu hụt dinh dưỡng…)ñã ñược chứng minh là ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa ở một số cây, và những tác ñộng này có tính ñặc thù cho loài: chẳng hạn như stress về nồng ñộ

muối thúc ñẩy ra hoa ở Mesembryanthemum crystallinum (Adams và cs, 1998) nhưng lại làm chậm quá trình ra hoa ở Arabidopsis thaliana(Achard và cs,

2006) Tác ñộng ñiều khiển ra hoa ở cây trồng của các yếu tố stress còn liên quan ñến môi trường sống tự nhiên của cây trồng Tác ñộng ñiều khiển ra hoa

của stress hạn ñã ñược nghiên cứu nhiều trên ở chi Citrus(Monselise, 1985;

Southwick và cs, 1986) Trên các cây trồng khác, ñặc biệt là cây hàng năm, các nhân tố phi sinh học có thể thúc ñẩy quá trình ra hoa như là một bộ phận của chiến lược tránh stress; tức là, thay vì tăng cường tính chống chịu stress thì cây trồng có thể rút ngắn chu kỳ sống của nó ñể ñảm bảo hình thành số hạt tối thiểu Một vài nghiên cứu sinh thái ñã chỉ ra rằng các quần thể sống trong ñiều kiện càng khắc nghiệt thì càng ra hoa sớm hơn (Aronson và cs, 1992) Tuy nhiên, ở một số cây hàng năm thì sự ra hoa lại ñược ñiều khiển trực tiếp bởi các nhân tố

phi sinh học Nồng ñộ muối và hạn thúc ñẩy quá trình ra hoa ở cây M

crystallinum(Adams và cs, 1998) Các cây ra hoa dưới tác ñộng của quang chu

kỳ thậm chí vẫn có thể ra hoa trong ñiều kiện dài ngày không tiêu chuẩn sau khi

nó bị tác ñộng bởi stress Xử lý stress nhiệt ñộ cao hoặc nhiệt ñộ thấp cho rễ của

cây ngày ngắn Chenopodium polyspermum ñiều khiển sự ra hoa trong ñiều kiện ngày dài và sau giai ñoạn cảm ứng ngày ngắn (Chamont và cs, 1982) Ở A

thaliana, cây bị che bóng (có thể coi là stress cường ñộ ánh sáng thấp) cũng

kích thích sự ra hoa (Smith và cs, 1997) Hàm lượng dinh dưỡng thấp ảnh hưởng khác nhau ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa ñối với các kiểu hình

sinh thái khác nhau ở cây A thaliana(Luquez và cs, 2006)

Áp dụng trong việc ñiều khiển ra hoa, hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thường ñược dùng ñó là auxin và cytokinin

* Auxin

Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng auxin sẽ làm thay ñổi tỷ lệ giữa hoa ñực và hoa cái của một số loại cây Vai trò của auxin với sự hình thành hoa không rõ Auxin có thể kích thích sự ra hoa của một số cây, nhưng lại ức chế sự ra hoa của một số loài cây khác, hiệu quả của chúng lên sự ra hoa là không ñặc trưng

Trên cây Torenia, Tanimoto và Harada (1981) ñã nghiên cứu ảnh

hưởng của IAA ở các nồng ñộ 0.01mg/l, 0.1mg/l và 1mg/l Kết quả cho thấy

IAA ở nồng ñộ 0.1mg/l cho tỷ lệ hoa cao nhất Ở nồng ñộ 1mg/l IAA ức chế ñáng kể sự ra hoa

Khi dùng chất ức chế sự vận chuyển của auxin ở Arabidopsis, hoa phát

triển một cách bất thường Chính vì thế có thể auxin cần cho sự phát triển của các cơ quan hoa (Taiz và cs, 2002) Auxin giữ vai trò chủ chốt trong sự ra hoa

in vitro của ñậu Hà Lan (Pisum sativum L.) Khi tăng nồng ñộ auxin, tỷ lệ hoa

hình thành tăng lên Hầu hết chồi in vitro ra hoa khi ñược nuôi trên môi

trường tạo rễ là MS bổ sung NAA hoặc IBA có hoặc không bổ sung GA3 Số lượng hoa trên mỗi cây cao nhất trên môi trường chứa 0,5mg/l IBA kết hợp

với 1mg/l GA3 (4,2 hoa) (Franklin và cs, 2000) Ở Pentanema indicum, tỷ lệ chồi in vitro ra hoa tăng từ 62,6% lên 90% khi tăng nồng ñộ IBA (0,5 –

2mg/l) Tuy nhiên, IBA ở nồng ñộ cao hơn 2mg/l khiến tỷ lệ ra hoa giảm (39,7%) (Iyyakkannu và cs, 2007)

* Cytokinin

Cytokinin có hiệu quả phân hóa giới tính cái, làm tăng tỷ lệ hoa cái của các cây ñơn tính như các cây trong họ bầu bí và các cây có hoa ñực, hoa cái và hoa lưỡng tính riêng rẽ như ñu ñủ, nhãn, vải, xoài…

Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng kích thích ra hoa in vitro của

cytokinin trên nhiều loài cây một lá mầm và hai lá mầm khi ñược sử dụng ñơn lẻ hoặc kết hợp với auxin, gibberellin Cytokinnin là thành phần của tín hiệu kích thích ra hoa có trong nhựa cây, ñược vận chuyển lên ngọn (Werner và cs, 2001) Các loại cytokinin khác nhau có hoạt tính sinh học khác nhau, do ñó khả năng kích thích ra hoa của chúng cũng khác nhau và tùy thuộc vào loài cây cần cảm ứng

Một số chất trong nhóm này ñược sử dụng nhiều hơn là ZT, BA và TDZ Tanimoto và Harada (1981b) nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin tới

sự ra hoa cây Torenia ở các nồng ñộ 0.01mg/l, 0.1mg/l và 1mg/l Kết

quả cây ra hoa tốt khi sử dụng nồng ñộ 0.1mg/l.Duan và Yazawa (1995)

ñã chỉ ra rằng trên cây hoa Lan Phalaenopsis 70% chồi tạo hoa ở môi trường 5mg/l BA Arabidopsis, lượng 2-iP và ZT ở mô phân sinh ngọn

chồi tăng lên trong giai ñoạn ñầu của sự ra hoa Mặt khác, cytokinin ngoại sinh cùng với sự hiện diện của sucrose cảm ứng sự thay ñổi ở mức phân tử và tế bào khiến có sự chuyển mô phân sinh từ giai ñoạn dinh dưỡng sang giai ñoạn sinh sản Tuy nhiên, nó chỉ cần cho giai ñoạn ñầu của quá trình khởi tạo và phát triển mô phân sinh hoa ðể hoa phát triển hoàn thiện cần thêm các nhân tố khác như nhiệt ñộ, ánh sáng Thêm vào

ñó, nồng ñộ BA trong môi trường cao còn khiến rễ khó hình thành Chính vì vậy, cytokinin có vai trò loại bỏ các tác nhân ức chế ra hoa ở rễ (Kostenyuk và cs, 1999; Hanna và cs, 1996)

Theo Wang và cs(1997) khi sử dụng BA ở nồng ñộ 2mg/l cho cây hoa

Lan Dendrobium candium cho kết quả 82.8% chồi có hoa Một số nghiên cứu

cũng ñã ñưa ra kết luận về sự ảnh hưởng của BA ñến sự nảy chồi và ra hoa trong ống nghiệm của hoa hồng Wang và cs (2002) tiến hành thí nghiệm trên

6 giống hoa hồng khác nhau, sử dụng môi trường MS, vitamin của môi trường B5 và 400mg/l myo-inositol, bổ sung thêm tổ hợp BA kết hợp với NAA, TDZ

và NAA, ZT với nồng ñộ khác nhau Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ các chồi cảm ứng hoa cao nhất ở sự kết hợp của 0,5mg/l (2,27µM) TDZ với 0,1mg/l (0,54µM) NAA (49,1%) hoặc 0,5 mg/l (2,28µM) ZT kết hợp với 0,1 mg/l (0,54µM) NAA (44,1%) trên giống Orange Parade Kantamaht Kanchanapoom và cs (2009) cũng ñã chỉ ra rằng không có hiện tượng cảm ứng hoa của hoa hồng trên môi trường có bổ sung BA và kinetin

* Gibberellin

Gibberellin là một nhóm hormone thực vật có trên 80 chất và ñược

cô lập lần ñầu tiên từ Fusarium heterosporum Hiệu ứng chính của

gibberellin là kéo dài lóng là do gibberellin có tác dụng kéo dài và kích thích phân chia tế bào

Gibberellin có tác dụng kích thích sự ra hoa rõ rệt Theo học thuyết

ra hoa của Trailakhyan thì gibberellin là một trong hai thành viên của hoocmon ra hoa (florigen) là gibberellin và antesin Gibberellin cần cho sự hình thành và phát triển của nụ dưới hoa (cuống hoa), còn antesin cần cho

sự phát triển của hoa Ảnh hưởng ñặc trưng của gibberellin là kích thích sự tăng trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa Gibberellin kích thích cây ngày dài ra hoa trong ñiều kiện ngày ngắn Gibberellin ảnh hưởng ñến

sự phân hóa giới tính của hoa, ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa ñực

Nghiên cứu của Tanimoto và Harada (1981b) trên cây Torenia cho

thấy nồng ñộ GA bổ sung vào môi trường cho hoa tối ưu là 0.01mg/l so với các nồng ñộ 0.1mg/l và 1mg/l

Ở những cây dạng hoa hồng, việc bổ sung gibberellin ngoại sinh kích thích cây ra hoa sớm nhưng lại không có tác dụng tương tự trên nhiều cây khác Cây bị ức chế sinh tổng hợp gibberellin có nhu cầu thọ hàn cao hơn, hàm lượng FLC cao, không ra hoa trong ñiều kiện ngày dài và tỷ lệ ra hoa trong ñiều kiện ngày ngắn rất thấp Các thí nghiệm ức chế sinh tổng hợp

gibberellin ở Arabidopsis cho thấy gibberellin tác ñộng ñến sự sinh trưởng,

phát triển và ra hoa bằng nhiều con ñường phức tạp thông qua ñiều hòa lượng FLC ở mô phân sinh, tách biệt với con ñường cảm ứng của quang kỳ

và thọ hàn (Beverley, 2007) Ở cây cải xong (Thalaspi) hoạt ñộng của

enzyme chủ chốt trong con ñường sinh tổng hợp gibberellin tăng mạnh ở

chồi sau thời gian cây trải qua thọ hàn Ở cải bó xôi (Spinacia oleracea) sự

tổng hợp gibberellin bị ức chế trong ñiều kiện ngày ngắn Khi ñã ñặt trong ñiều kiện ngày dài, hàm lượng gibberellin trong cây tăng nhanh, thân cây kéo dài và ra hoa ðiều này cho thấy tổng hợp gibberellin ñược kiểm soát bởi quang kỳ (Helgi và cs, 2005)

Mặt khác, ñáp ứng của thực vật với gibberellintrong sự ra hoa cũng thay

ñổi tùy theo loài Trong ñiều kiện in vitro, việc bổ sung GA3 khiến sự ra hoa xảy

ra sớm hơn và làm tăng tỷ lệ chồi ra hoa olive (Chaari-Rkhis và cs, 2006), diệp

hạ châu (Phyllanthus niruri) (Ong và cs, 2006), ba gạc (Rauvolfia tetraphylla L.)

(Anitha và cs, 2006), GA3 ở nồng ñộ cao kết hợp với BA làm tăng khả năng tăng

trưởng phát triển các cơ quan hoa ở Lycopersicon esculentum, Viscaria nhưng lại làm thui nhị cây Aquilegia (Franklin và cs, 2000)

h Các chất ức chế sinh trưởng

* Acid abscisic (ABA): ABA kích thích sự hình thành hoa ở một số cây ngày ngắn chỉ dưới ñiều kiện cảm ứng một phần, còn ña số trường hợp thì không có hiệu quả hoặc ức chế

Trên cây Torenia, Tanimoto và Harada (1981b) ñã chỉ ra rằng môi

trường có bổ sung ABA làm giảm tỷ lệ ra hoa

* Ethylen: là hoocmon thực vật, tham gia vào nhiều khía cạnh của chu kỳ ñời sống thực vật như: nảy mầm hạt, phát triển rễ tóc, tạo nút rễ, tăng sự rụng hoa, kích thích quả chín, kích thích sự ra hoa ñặc biệt là ra hoa trái vụ ở nhiều thực vật

2.2.2 Cơ sở phân tử

Ra hoa là một quá trình phức tạp của cây trồng ñược ñiều hòa bởi các yếu tố môi trường và các nhân tố di truyền Các nghiên cứu về việc ñiều khiển quá trình ra hoa ở cây trồng ñã ñược tiến hành cách ñây hơn 100 năm, ñến nay ñã có những kiến thức và hệ thống các thông tin liên quan

ñến cơ chế sự ra hoa thực vật ở mức ñộ tế bào và ở ñiều kiện in vivo

Bên cạnh phương pháp truyền thống nghiên cứu quá trình ra hoa ở

thực vật thì nghiên cứu quá trình ra hoa trong ñiều kiện in vitro là mô hình

nghiên cứu thí nghiệm chuẩn bởi vì nó hạn chế ñược ảnh hưởng của các nhân tố môi trường ñể làm sáng tỏ ñược nhân tố thiết yếu cho việc ñiều

khiển ra hoa in vitro Ngoài ra, phương pháp này rút ngắn ñược thời gian

cảm ứng ra hoa ở cây trồng Cho ñến nay các nghiên cứu ñiều khiển ra hoa

nói chung trong ñiều kiện in vitro ñã chỉ ra rằng có một số nhân tố thiết yếu

tác ñộng ñến việc cảm ứng ra hoa ở cây trồng như: chất ñiều tiết sinh trưởng, carbonhydrate, ánh sáng, nhiệt ñộ, yếu tố vi lượng, stress của môi trường Các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng mỗi loại giống cây trồng cần có một chế ñộ ñiều khiển cảm ứng ra hoa riêng và ñặc thù

Các nghiên cứu về sinh hóa ở mức tế bào cho thấy sau khi nhận tín hiệu kích thích ra hoa, mô phân sinh ngọn chồi tăng cường tổng hợp RNA, tăng tốc ñộ tổng hợp protein, các enzyme invertase tăng cường hoạt ñộng sống, số lượng ty thể gia tăng, hàm lượng sucrose và ATP cũng tăng Bên cạnh ñó, chu trình tế bào ở mô phân sinh ñược rút ngắn lại, tăng tỷ lệ phân chia tế bào Ở mô phân sinh dinh dưỡng, các tế bào vùng trung tâm phân chia rất chậm, chính sự phân chia nhanh của vùng trung tâm khiến mô phân sinh hoa lớn hơn so với mô phân sinh dinh dưỡng (Taiz và cs, 2002)

Từ những thí nghiệm tạo thể khảm trên cây hai lá mầm cho thấy các nhóm tế bào thuộc các lớp khác nhau ở mô phân sinh ngọn chồi giữ vai trò khác nhau trong sự hình thành các cơ quan hoa, ñồng thời các lớp này cũng kiểm soát sự hoạt ñộng của nhau Các lớp tế bào từ lớp 1 hình thành nên các

tế bào biểu bì, các tế bào thuộc lớp 2 tạo nên các tế bào sinh dục của nhị và nhụy, các tế bào thuộc lớp 3 hình thành nên các cơ quan hoa (Elliot và cs, 1991)

Hình 2.2 Sự phát triển của hoa theo mô hình ABC [Brian, 2006]

Mô hình ABC ñược Coen và cs ñề xuất năm 1991, ñược xem như

mô hình cơ bản trong nghiên cứu sự phát triển của hoa trên cây Aradopsis

và Antirrhinum Theo mô hình này, ở cây hai lá mầm, hoa ñược chia thành

- Vòng 3: có sự hoạt ñộng ñồng thời của các gen B, C hình thành nên nhị

- Vòng 4: Tạo nên nhụy hoa nhờ hoạt ñộng của các gen thuộc nhóm C

Năm 1995, nhóm gen D ñược phát hiện trên Petunia Các gen thuộc

nhóm này cần cho sự phát triển của noãn và giá noãn trong nhụy Các gen thuộc nhóm D hoạt ñộng muộn và kết hợp với các gen nhóm C trong việc ñiều khiển sự phát triển của noãn Ngoài ra, còn các gen thuộc nhóm E tham gia ñiều hòa sự chuyển ñổi chồi sinh dưỡng sang chồi sinh dục, cần cho sự phát triển của tất cả các cơ quan hoa (ngoại trừ ñài hoa) Các gen SEP1, SEP2,SEP3, thuộc nhóm gen mã hóa cho các nhân tố phiên mã, biểu hiện ở cả vòng 2,3 và 4 trong suốt quá trình phát triển của hoa Ở cây ñột biến mất chức năng các gen SEP1, SEP2,SEP3 không có sự hình thành

cánh hoa, nhị và nhụy mà chỉ có ñài hoa (tương tự như khi gây ñột biến mất chức năng các gen thuộc nhóm B, C) ðiều này cho thấy các gen thuộc nhóm E cần cho sự hoạt ñộng của những gen thuộc nhóm B và C (Beverley, 2007)

Có nhiều quan ñiểm về sự ra hoa như thuyết Florigen, ñồng hồ cát, nhịp nội sinh, ña yếu tố kiểm soát sự ra hoa Trong ñó nổi bật nhất là thuyết florigen (ñã ñược trình bày ở trên) và thuyết ña yếu tố kiểm soát sự ra hoa

Thuyết ña yếu tố kiểm soát sự ra hoa ñã ñược Bernier và cs ñưa vào

năm 1981 dựa trên mô hình cây S.alba Theo ñó, ra hoa là hiện tượng chịu

tác ñộng của nhiều yếu tố như sự tương tác giữa các cơ quan, trạng thái sinh lý, ñộ tuổi, dinh dưỡng, hormone nội sinh, ñiều kiện môi trường (nhiệt

ñộ, cường ñộ ánh sáng, thời gian chiếu sáng) (Bùi Trang Việt, 2000) Theo quan ñiểm này, có 4 con ñường kiểm soát ra hoa chủ yếu ở thực vật: con ñường tự chủ, con ñường chịu sự kiểm soát của nhiệt ñộ, con ñường chịu

sự ảnh hưởng của ánh sáng và do sự kiểm soát của hormone (Brian, 2006; Fabrice và cs, 2006)

Hình 2.3 Cơ chế phân tử của cảm ứng ra hoa dưới tác ñộng của ánh

sáng và nhiệt ñộ lạnh (xuân hóa)

Sự ra hoa ở thực vật bậc cao chịu tác ựộng của nhiều yếu tố và có sự tham gia của nhiều gen Có ba nhóm gen chịu trách nhiệm chắnh trong sự hình thành hoa:

- Nhóm gen xác ựịnh mô phân sinh hoa;

- Nhóm gen nền;

- Nhóm gen xác ựịnh cơ quan hoa

Trong ựó, các gen CO, FLC, FRI,Ầ giữ vai trò chủ chốt trong từng con ựường cảm ứng ra hoa Các gen này ựiều hòa sự ra hoa thông qua tác ựộng ựến mức ựộ biểu hiện của FT Gen FT mã hóa cho protein di chuyển

từ lá ựến mô phân sinh ngọn chồi, gắn trên màng tế bào và kết hợp với tắn hiệu cảm ứng của ánh sáng thông qua CO và tắn hiệu cảm ứng từ sự thọ hàn, thông qua FLC từ con ựường tự chủ ựể hoạt hóa các gene xác ựịnh mô phân sinh hoa Ngoài ra, các gene xác ựịnh mô phân sinh ựỉnh hoa bao gồm LEAFY (LFY), APETALA (AP1), AP2, CALIFLOWER (CAL), UNASUAL FLORAL ORGANS (UFO) ựã ựược xác ựịnh và tập trung nghiên cứu đó là những gen mã hóa cho các nhân tố ựiều hòa phiên mã thuộc nhóm MADS box Trong ựó, LFY ựược cảm ứng bởi SOC1 và gibberellin Nó có vai trò hoạt hóa, tăng cường sự biểu hiện của các gen ựiều hòa sự phát triển cơ quan hoa AP1 có vai trò khá quan trọng trong sự phát triển của cơ quan hoa, biểu hiện ở mô phân sinh hoa và ở ựài hoa, cánh hoa, ựược ựiều hòa biểu hiện bởi FLY mRNA CAL ựược tắch lũy trong mô phân sinh hoa ở giai ựoạn sớm nhưng không có mặt trong giai ựoạn phát triển của các cơ quan hoa Cho ựến nay, ngoài khả năng tương tác với AP1 ựể tăng cường sự biểu hiện của LFY, vai trò của CAL vẫn chưa ựược hiểu rõ (Beverley, 2007)

2.3 Các nghiên cứu về ñiều khiển ra hoa in vitro

2.3.1 Trên thế giới

Trên thế giới, xử lý ra hoa in vitro ñã ñược tiến hành thí nghiệm và

thành công trên nhiều ñối tượng như:

Chang và Hsing (1980) ñã ñiều khiển thành công ra hoa in vitrocủa

Panax ginseng (cây nhân sâm) khi nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ

sung 1 mg/BA và 1 mg/l GA3 từ nguồn vật liệu là phôi từ các mô sẹo rễ của cây nhân sâm

Haeng và cs (1991): từ tế bào hợp tử (zygotic embryos) nghiên cứu

ñiều khiển ra hoa trong ống nghiệm trên cây nhân sâm (Panax ginseng)

Thí nghiệm ñược tiến hành trên môi trường muối vô cơ MS (1962) có nồng

ñộ nitrogen giảm ñi một nửa, 100mg/l myo-inositol, 0,4mg/l thiamin HCl, 30mg/l sucrose và BA, GA3, ABA Sau 10 tuần nuôi cấy, cây nhân sâm ra hoa với tỉ lệ cao nhất trên môi trường chứa 5µm BA và 5µm GA3 Ngoài

ra, trên các môi trường chỉ chứa BA; tổ hợp BA+GA3+ABA, hoặc BA + ABA cây cũng cho ra hoa với tỉ lệ tương ñối cao

Rout và cs (1994) nghiên cứu tạo phôi soma và ra hoa trong ống

nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và

Dendrocalamus strictus ðốt thân của cây con tái sinh từ phôi soma ñược

nuôi cấy trên môi trường cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin - sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose Sau 12 tuần nuôi cấy thì cho hoa, môi trường lỏng cảm ứng ra hoa tốtmôi trường có agar (60-70%

so với 25-30%)

Rajani và cs (1997) báo cáo rằng khi nuôi cấy cây con in vitro của giống tre Babusa arundinacea trong môi trường MS lỏng chứa 2% sucrose,

5% nước dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng có 70 % mẫu cấy ra hoa

Nadgauda và cs (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây

Dendrocalamus strictus Cây ñược nuôi cấy trong môi trường1/2 MS có bổ

sung các nồng ñộ khác nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và ñể trong ñiều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20C Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả mẫu ñược chuyển sang môi trường1/2MS không chứa TDZ Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa caonhất sau 2 tuần nuôi cấy trên những mẫu cấy ñược cấy chuyền từ môi trường 1/2 MS có chứa 0,5mg/l TDZ sang môi trường 1/2 MS

Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewaoji và

Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuôi cấy in vitro Trên môi trường 1/2MS, với nitrat là nguồn nitro

duy nhất, 5% sucrose, 0,1µm kinetin trong ñiều kiện nuôi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy ñược cảm ứng tạo hoa trên 100% số lượng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là

9, sau 8 tuần nuôi cấy

Sudhakaran và Sivasankari (2002): chồi của cây húng (Ocimum

basilicum L.) ñược cấy trên môi trường 1/2MS có bổ sung BAP (3- 5- 7

mg/l) và IAA (1-3-5 mg/l) Sau 20 ngày nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro ở

môi trường có nồng ñộ BAP là 7 mg/l và IAA là 5 mg/l

Wang và cs (2002) ñã nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm ở 6 loại hoa hồng Cây con tái sinh từ chồi sau 45 ngày thì chuyển sang môi trường

MS chứa 400 mg/l myo–inositol, 30 g/l sucrose bổ sung các chất ñiều hoà sinh trưởng zeatin, TDZ, NAA, BA, IAA, GA3 ở các nồng ñộ khác nhau

Sau 156-561 ngày kể từ khi bắt ñầu nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro với

mật ñộ hoa cao nhất ở môi trường chứa 0,5 mg/l TDZ hoặc 0,5 mg/l zeatin kết hợp với 0,1 mg/l NAA (49,2%, 44,2%)

Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) ñã thành công khi callus

có ñược từ thân rễ của Cymbidium ensifolium var misericors ra hoa in

vitro trên môi trường 1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng

ñộ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng ñộ 10–33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy

thành hoa in vitro, còn cytokinin giúp làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp

biệt hoá các cấu trúc hoa ở giai ñoạn sau khi kích thích sự hình thành hoa Tuy nhiên ñề tài vẫn còn một số ñiểm chưa hoàn thiện lắm: ñôi lúc hoa bị ñột biến, cánh hoa không ñều, ñài hoa chưa chuẩn hoặc có khi chưa ra ñược màu giống với hoa trồng trong môi trường thiên nhiên do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm

Phạm Thị Minh Thu và cs (2005) ñã cho loài hoa Torenia màu tím

(Torenia Fournieri)rahoa thành công trong ống nghiệm từ mẫu chồi ñược

tái sinh từ lá cây Torenia mọc lên từ hạt

Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và cs ñã tiếp tục tiến hành thí nghiệm làm thay ñổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng bằng cách bổ sung yếu tố vi lượng vào môi trường sống của cây

Vũ Quốc Luận, Dương Tấn Nhựt (2006) ñã ñiều khiển làm cho

những ñóa hoa lan ñầu tiên nở trong ống nghiệm ở loài lan Dendrobium

Mild Yumi

Lê Hồng Thủy Tiên và cs (2006) ñiều khiển ra hoa thành công cây

dừa cạn (Catharanthus roseus) trong ñiều kiện in vitro Theo thí nghiệm

này, môi trường thích hợp nhất cho sự ra hoa của cây dừa cạn trong ống nghiệm là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA Tỉ lệ

ra hoa là 100% Cây ra nụ sau 58 ngày nuôi cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình có 4 hoa/cây