Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tinh dịch có nồng ñộ tinh trùng khác nhau sẽ tạo nên các mức ñộ mờ ñục khác nhau, làm cho ñộ sáng ñến tế bào quang học có kết quả khác nhau và ñượ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
- -
MAN THỊ HỒNG BIÊN
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ðẾN PHẨM CHẤT TINH DỊCH GIỐNG BÒ HOLSTEIN FRIESIAN ÚC NUÔI TẠI TRẠM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT TINH
ðÔNG LẠNH MONCADA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI - 2013
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
- -
MAN THỊ HỒNG BIÊN
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ðẾN PHẨM CHẤT TINH DỊCH GIỐNG BÒ HOLSTEIN FRIESIAN ÚC NUÔI TẠI TRẠM NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT TINH
Trang 3LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác
Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các tài liệu tham khảo trích dẫn trong Luận văn ñều có nguồn gốc xuất xứ thực tế
và ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày10 tháng 11 năm 2013
Tác giả luận văn
Man Thị Hồng Biên
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện ñề tài này tôi luôn nhận ñược sự giúp
ñỡ, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện của các Thầy Cô giáo, các nhà khoa học, các nhà quản lý Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS ðinh Văn Chỉnh; TS Nguyễn Hữu Cường, người hướng dẫn khoa học ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này
Lãnh ñạo và tập thể các Thầy Cô trong Viện Sau ñại học, Các Thầy Cô trong Khoa Chăn nuôi; các Thầy Cô trong Bộ môn Di truyền Giống - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã dạy dỗ, hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này
Ban lãnh ñạo cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm giống gia súc lớn Trung ương, Trạm nghiên cứu và sản xuất tinh ñông lạnh Môncaña ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, khích lệ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và luận văn này
Tôi cũng xin trân thành cảm ơn toàn thể gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ tôi về mọi mặt, ñộng viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn này
Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2013
Tác giả luận văn
Man Thị Hồng Biên
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN iError! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined MỤC LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆUError! Bookmark not
defined
DANH MỤC BẢNG VIError! Bookmark not defined DANH MỤC BIỂU ðỒ Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined
1 MỞ ðẦU 0
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục tiêu của ñề tài 2
1.3 Ý nghĩa của ñề tài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Cơ sở khoa học 4
2.1.2 Một số chỉ tiêu ñánh giá số lượng và chất lượng tinh dịch bò ñực 9
2.1.3 Những nhân tố ảnh hưởng ñến khả năng sản xuất tinh dịch 13
2.1.4 Một số nguyên lý cơ bản về ñông lạnh tinh dịch 16
2.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng khi ñông lạnh hoặc giải ñông 20
2.1.6 Môi trường pha loãng tinh dịch bò 25
2.2 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về số lượng, chất lượng và khả năng sản xuất tinh của bò ñực giống HF 28
3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
3.1 ðối tượng, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 31
3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 31
Trang 63.1.2 Thời gian nghiên cứu 31
3.1.3 ðịa ñiểm và ñiều kiện nghiên cứu 31
3.2 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 32
3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ và tuổi ñến các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch của bò Hostein Friesian (HF) Úc nuôi tại Moncada 32
3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ và tuổi ñến khả năng sản xuất tinh ñông lạnh của bò Hostein Friesian (HF) Úc nuôi tại Moncada 32
3.3 Phương pháp nghiên cứu 32
3.3.1 Phương pháp nghiên cứu 32
3.3.2 Phương pháp ñánh giá các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch 33
3.3.3 Phương pháp ñánh giá khả năng sản xuất tinh ñông lạnh 35
3.3.4 Sản xuất tinh bò ñông lạnh dạng cọng rạ 35
2.3.5 Xử lí số liệu 37
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1 Ảnh hưởng của mùa vụ và tuổi ñến số lượng, chất lượng tinh dịch bò ñực giống HF Úc 38
4.1.1 Thể tích tinh dịch (V) 38
4.1.2 Hoạt lực tinh trùng (A) 42
4.1.3 Nồng ñộ tinh trùng (C) 47
4.1.4 Số tinh trùng tiến thẳng/ lần khai thác tinh (VAC) 52
4.1.5 pH tinh dịch 57
4.1.6 Tỷ lệ tinh trùng sống (%) 60
4.1.7 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) 64
4.2 Ảnh hưởng của mùa vụ và tuổi ñến khả năng sản xuất tinh ñông lạnh của bò ñực giống HF Úc 69
4.2.1 Tỷ lệ các lần lấy tinh ñạt tiêu chuẩn 69
Trang 74.2.2 Tổng số liều tinh cọng rạ sản xuất ñược trên 1 lần khai thác 72
4.2.3 Hoạt lực tinh trùng sau giải ñông 76
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 81
5.1 Kết luận 81
5.1.1 Ảnh hưởng cuả mùa vụ và tuổi ñến các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh của bò ñực giống HF Úc 81
5.1.2 Ảnh hưởng của mùa vụ và tuổi ñến khả năng sản xuất tinh ñông lạnh của bò ñực giống HF Úc 81
5.2 ðề nghị 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
Trang 8DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Tên viết tắt Tên viết ñầy ñủ
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Thang ñiểm ñánh giá hoạt lực tinh trùng 34
Bảng 4.1 Thể tích tinh dịch của bò ñực giống HF Úctheo mùa vụ (ml/ lần) 39
Bảng 4.2 Thể tích tinh dịch của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (ml/ lần) 41
Bảng 4.3 Hoạt lực tinh trùng của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ (%) 43
Bảng 4.4 Hoạt lực tinh trùng của bò ñực giống HF Úctheo tuổi (%) 45
Bảng 4.5 Nồng ñộ tinh trùng của bò ñực giống HF Úctheo mùa vụ (tỷ/ml) 48
Bảng 4.6 Nồng ñộ tinh trùng của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (ml/lần) 50
Bảng 4.7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/ lần khai thác tinh của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ (tỷ/lần khai thác) 53
Bảng 4.8 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/ lần khai thác tinh của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (tỷ/lần khai thác) 55
Bảng 4.9 pH tinh dịch của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ 57
Bảng 4.10 pH tinh dịch của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (%) 58
Bảng 4.11 Tỷ lệ tinh trùng sống của bò ñực giống HF Úctheo mùa vụ (%) 61
Bảng 4.12 Tỷ lệ tinh trùng sống của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (%) 62
Bảng 4.13 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của bò ñực giống HF Úctheo mùa vụ (%) 65
Bảng 4.14 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của bò ñực giống HF Úc theo lứa tuổi (%) 67
Bảng 4.15 Tỷ lệ các lần lấy tinh ñạt tiêu chuẩn của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ (%) 69
Bảng 4.16 Tỷ lệ các lần lấy tinh ñạt tiêu chuẩn của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (%) 71
Bảng 4.17 Số liều tinh cọng rạ sản xuất ñược trên một lần khai thác tinh của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ (liều tinh cọng rạ/lần khai thác) 73
Trang 10Bảng 4.18 Số lượng tinh cọng rạ sản xuất ñược trên một lần khai thác
tinh của bò ñực giống HF Úc theo lứa tuổi(liều tinh cọng rạ/lần khai thác) 75
Bảng 4.19 Hoạt lực tinh trùng sau giải ñông của bò ñực giống HF Úc
theo mùa vụ (%) 77
Bảng 4.20 Hoạt lực tinh trùng sau giải ñông của bò ñực giống HF Úc
theo lứa tuổi (%) 79
Trang 11DANH MỤC BIỂU ðỒ
Biểu ñồ 4.1 Lượng xuất tinh của bò ñực giống HFtheo mùa vụ (ml/lần) 40
Biểu ñồ 4.2 Lượng xuất tinh của bò ñực giống HFtheo tuổi (ml/lần) 42
Biểu ñồ 4.3 Hoạt lực tinh trùng của bò ñực giống HF Úctheo mùa vụ (%) 44
Biểu ñồ 4.4 Hoạt lực tinh trùng của bò ñực giống HF Úc theo tuổi (%) 46
Biểu ñồ 4.5 Nồng ñộ tinh trùng của bò ñực giống HF Úc theo mù vụ
(tỷ/ml) 50
Biểu ñồ 4.6 Nồng ñộ tinh trùng của bò ñực giống HF Úctheo tuổi (tỷ/ml) 51
Biểu ñồ 4.7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/ lần khai thác tinh của bò ñực
giống HF Úc theo mùa vụ (tỷ/lần khai thác) 54
Biểu ñồ 4.8 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác tinh của bò ñực
giống HF Úc theo lứa tuổi (tỷ/lần khai thác) 56
Biểu ñồ 4.9 pH tinh dịch của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ 58
Biểu ñồ 4.10 pH tinh dịch của bò ñực giống HF Úc theo tuổi 59
Biểu ñồ 4.11 Tỷ lệ tinh trùng sống của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ
(%) 62
Biểu ñồ 4.12 Tỷ lệ tinh trùng sống của bò ñực giống HF Úctheo tuổi (%) 63
Biểu ñồ 4.13 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của bò ñực giống HF Úctheo mùa
Trang 12Biểu ñồ 4.17 Số lượng tinh cọng rạ sản xuất ñược trên một lần khai thác
tinh của bò ñực giống HF Úc theo mùa vụ (liều tinh cọng rạ/lần khai thác) 74
Biểu ñồ 4.18 Số lượng tinh cọng rạ sản xuất ñược trên một lần khai thác
tinh của bò ñực giống HF Úc theo lứa tuổi (liều/lần khai thác) 76
Biểu ñồ 4.19 Hoạt lực tinh trùng sau giải ñông của bò ñực giống HF Úc
theo mùa vụ (%) 78
Biểu ñồ 4.20 Hoạt lực tinh trùng sau giải ñông của bò ñực giống HF Úc
theo lứa tuổi (%) 80
Trang 13DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Sơ ñồ hình thành tinh trùng (Junichi Mori, 1992) 5
Hình 2.2 Quá trình tạo hình tinh trùng (Junichi, 1992) 6
Hình 2.3 Cấu trúc của tinh trùng bò (Hiroshi, 1992) 7
Hình 2.4 Các dạng kỳ hình của tinh trùng bò (McGowan, 2004) 12
Hình 2.5 Quá trình ñông băng dung dịch (Hiroshi, 1992) 17
Hình 2.6 Ảnh hưởng của glycerol trong dung dịch NaCl so với nồng ñộ NaCl trong dung dịch còn lại khi dung dịch NaCl (0,15M) ñược ñông lạnh (Hiroshi, 1992) 23
40,42,44,46,50,51,54,56,58,59,62,63,66,68,70,71,74,75,76,78,80,
90-92
Trang 141.MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề
Trong thập niên vừa qua, chăn nuôi bò sữa tại Việt Nam ñã có những bước tiến mạnh mẽ với sự phát triển cả về số và chất lượng ðặc biệt sau có Quyết ñịnh 167/2001-Qð-TTg ngày 26/10/2001 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát triển chăn nuôi bò sữa ở Việt Nam thời
kỳ 2001-2010 số lượng bò sữa ñã tăng lên ñáng kể Tổng ñàn bò sữa trong cả nước năm 2011 là 142.700 con, tăng bình quân giai ñoạn 2001-2011 là 14,57% Tổng sản lượng sữa tươi trong cả nước cũng tăng lên, giai ñoạn 2001-2011 sản xuất ñược 2.259.749 tấn sữa: năm 2011 ñạt 343.500 tấn tăng gấp 5,31 lần so với năm 2011
ðể nâng cao khả năng sản xuất và chất lượng giống bò, nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi bò, ñáp ứng nhu cầu về thịt, sữa ngày càng cao của xã hội, việc nhập các bò ñực giống sữa ngoại thuần chủng cao sản về cải tạo ñàn bò trong nước ñã ñược tiến hành từ lâu và ñã mang lại những kết quả to lớn, nâng cao năng suất, chất lượng ñàn bò
Theo di truyền học, mỗi cá thể sinh ra ñều nhận ñược 50% nguồn gen
từ bố và 50% nguồn gen từ mẹ Mỗi cá thể bò cái tốt một năm chỉ có thể sản xuất ñược một con bê, nhưng một bò ñực giống tốt một năm có thể sản xuất ñược hàng chục ngàn liều tinh ñông lạnh và cho ra ñời hàng chục ngàn bê con thông qua kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Do vậy, ñể cải tiến nhanh các tiến bộ di truyền, nâng cao chất lượng ñàn bò sữa trong nước, với vai trò vô cùng quan trọng của con ñực trong chăn nuôi, năm 2009 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ñã cho nhập khẩu 20 bò ñực giống Holstein Friesian từ Úc về nuôi tại Trạm Nghiên cứu và sản xuất tinh ñông lạnh Moncada ñể sản xuất tinh ñông lạnh phục vụ công tác truyền tinh nhân tạo Bò Holstein Friesian (HF) thuần chủng là giống bò cao sản nhập về Việt Nam, với mục ñích cải tạo
Trang 15giống bò sữa, tạo ra ựàn bò sữa thắch nghi với ựiều kiện khắ hậu của Việt Nam, sinh trưởng phát triển tốt, cho năng suất cao trong ựiều kiện chăn nuôi ở Việt Nam
để sử dụng và khai thác ựực giống có hiệu quả, chủ ựộng trong công tác truyền tinh nhân tạo thì nghiên cứu sự thay ựổi một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch theo tuổi, theo mùa vụẦ của các giống bò HF nhập ngoại nuôi trong ựiều kiện Việt Nam là rất cần thiết Tuy nhiên chưa có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về vấn ựề này Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài
ỘẢnh hưởng của một số yếu tố ựến phẩm chất tinh dịch giống bò Holstein
Friesian Úc nuôi tại Trạm Nghiên cứu và sản xuất tinh ựông lạnh MoncadaỢ nhằm ựánh giá sự thay ựổi về số lượng và chất lượng của tinh
dịch và tinh ựông lạnh của bò ựực giống Holstein Friesian Úc nuôi tại Moncada theo tuổi và theo mùa vụ trong năm làm cơ sở cho nghiên cứu khoa học và phục vụ sản xuất, góp phần nâng cao hiệu quả trong phát triển chăn nuôi bò sữa tại Việt Nam
1.2 Mục tiêu của ựề tài
- đánh giá ựược phẩm chất tinh dịch của giống bò Holstein Friesian Úc nuôi tại Trạm Nghiên cứu và sản xuất tinh ựông lạnh Moncada
- Xác ựịnh ựược ảnh hưởng của các yếu tố: tuổi, mùa vụ ựến số lượng, chất lượng tinh dịch và khả năng sản xuất tinh cọng rạ của giống bò Holstein Friesian Úc nuôi tại Trạm Nghiên cứu và sản xuất tinh ựông lạnh Moncada.Từ ựó ựánh giá ựược mùa vụ nào và giai ựoạn tuổi nào có chất lượng tinh tốt nhất giúp cho nhà chăn nuôi ựực gống có biện pháp ựể sử dụng và khai thác bò ựực giống ựạt hiệu quả cao nhất
1.3 Ý nghĩa của ựề tài
- đánh giá một cách ựầy ựủ (số lượng và chất lượng), khả năng sản xuất tinh ựông lạnh của bò ựực giống Holstein Friesian Úc nuôi trong ựiều kiện Việt Nam làm cơ sở cho nghiên cứu khoa học và phục
Trang 172 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Cơ sở khoa học
2.1.1 Tinh dịch
Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục ñực khi nó thực hiện có kết quả phản xạ sinh dục Tinh dịch chỉ ñược hình thành một cách tức thời khi con ñực phóng tinh nghĩa là lúc nó hưng phấn cao nhất trong quá trình thực hiện phản xạ giao phối (Trần Tiến Dũng và CS, 2002)
Tinh dịch gồm: tinh trùng (3-5%) và tinh thanh (95-97%) Tinh trùng ñược sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn, còn tinh thanh ñược sinh ra
từ các tuyến sinh dục phụ
a.Tinh thanh
Sinh ra từ tuyến sinh dục phụ chủ yếu là nước, còn lại là vật chất khô (8,76% có nguồn gốc hữu cơ; 0,9% có nguồn gốc vô cơ) Tinh thanh chứa nhiều loại muối, axit amin và men góp phần vào hoạt ñộng sống và trao ñổi chất của tinh trùng ðường Fructoza do túi tinh tiết ra là nguồn năng lượng chủ yếu cho tinh trùng, ñồng thời nó chứa một số dung dịch ñệm làm pH không bị thay ñổi
Do vậy trong thụ tinh nhân tạo ñể duy trì các liều tinh ñông lạnh trong một thời gian dài nhất ñịnh người ta sử dụng nhiệt ñộ thấp (-1960C) nhằm giảm khả năng vận ñộng của tinh trùng và bảo tồn ñường Fructoza Các chất pha loãng tinh dịch cũng có các chất ñệm ñể ổn ñịnh pH Do vậy các loại môi trường pha chế tinh ñông lạnh ñều có thành phần giống như tinh thanh nhằm giúp cho tinh trùng sống ñược trong môi trường pha chế trước và sau ñông lạnh
b Tinh trùng
- Sự hình thành tinh trùng ở bò ñực
Trang 18Hình 2.1 Sơ ñồ hình thành tinh trùng (Junichi Mori, 1992)
Sự hình thành tinh trùng của bò ñực là một quá trình liên tục trong ống sinh tinh từ khi con ñực thành thục về tính ñến khi già yếu Các tế bào mầm nguyên thuỷ phát triển thành tinh nguyên bào rồi biệt hoá thành tinh trùng Các tế bào Sertoli có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho quá trình hình thành tinh trùng Quá trình hình thành tinh trùng có thể chia làm 3 giai ñoạn chính:
+ Sản sinh tinh trùng: quá trình sinh tinh và thành thục của tinh trùng diễn ra liên tục trong năm, tuy nhiên cường ñộ có thay ñổi theo mùa Quá trình tạo tinh bắt ñầu từ tế bào mầm biệt hoá thành tinh nguyên bào A1, rồi một tinh nguyên bào A1 chia thành 2 tinh nguyên bào A2, một trong hai tinh nguyên bào A2 bị tiêu hủy ngay sau ñó, tế bào A2 còn lại sẽ phân bào nguyên nhiễm thành các tinh nguyên bào trung gian, sau ñó chúng tạo thành tế bào tinh bào sơ cấp và nhanh chóng phân bào giảm nhiễm thành các tinh bào thứ cấp có n nhiễm sắc thể Mỗi tinh bào thứ cấp phân chia thành hai tinh tử Như vậy từ một tinh nguyên bào tạo thành 64 tinh tử trong thời gian 32-45 ngày ở
bò ñực (Junichi, 1992)
+ Sự tạo hình tinh trùng: là giai ñoạn tinh tử biến ñổi hình thái trở
thành tinh trùng ñặc trưng cho từng loài Một tinh tử biến ñổi hình thái thành
Trang 19một tinh trùng và chúng thường chụm quanh tế bào Sertoli, sau ñó chúng tách rời, di chuyển tự do trong ống sinh tinh và di chuyển ñến xoang dịch hoàn cuối cùng ñến dịch hoàn phụ
+ Sự thành thục tinh trùng: ngay sau khi hình thành, tinh trùng không
có khả năng hoạt ñộng, càng không có năng lực hoạt ñộng tiến thẳng hoặc nhiều tinh trùng còn có giọt bào tương bám theo Chỉ sau khi tinh trùng ñi qua dịnh hoàn phụ, do sự co thắt của ống dịch hoàn phụ và sức hút của ống dẫn tinh, giọt bào tương mất ñi, khả năng vận ñộng tiến thẳng, năng lực thụ tinh
của tinh trùng mới ñược hình thành
Hình 2.2 Quá trình tạo hình tinh trùng (Junichi, 1992)
1- Tinh bào sơ cấp 2- Pha hạt 3,4- Pha ñỉnh
5- Pha acrosome 6,7- Pha thành thục 8- Tinh trùng
+ Cấu tạo và ñặc ñiểm tinh trùng bò ñực: Tinh trùng bò ñực hình dạng giống con “nòng nọc”, có chiều dài 68,0 - 74,0µm, có thể chia làm bốn phần chính như: ðầu, cổ, thân và ñuôi
- ðầu tinh trùng: ðầu tinh trùng bò ñực dẹt, có hình ô van, dài 8,0 - 9,2µm, rộng 3,3 - 4,6µm, chứa nhân tế bào nơi có DNA (deoxyribonucleic acid)
là vật chất di truyền các ñặc ñiểm của con bố Bao lấy phần chỏm ñầu là thể ñỉnh
Trang 20(acrosome) chứa enzym hyaluronidaza, enzym này giúp tinh trùng chui qua màng phóng xạ của trứng, màng mucopolysacarit của tế bào trứng bị hoà tan Khi bảo tồn hệ thống acrosom dễ bị trương phồng lên, rời khỏi ñầu tinh trùng làm tinh trùng mất khả năng thụ tinh Men hyaluronidaza dễ bị thẩm xuất ra ngoài ñây là vấn ñề nghiên cứu cần quan tâm trong pha chế, bảo tồn, sử dụng tinh dịch nhằm tăng tỷ lệ thụ tinh
- Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, cắm vào hõm ở ñáy của ñầu, chứa hai trung tử, trung tử gần nhân và trung tử xa nhân, là nơi bắt nguồn bó trục của ñuôi tinh trùng (Nguyễn Tấn Anh và CS, 1998) Nó là phần ñính với phần ñầu rất lỏng lẻo, khi ñầu xâm nhập vào trứng thì cổ bị gẫy và ñuôi rơi ra
Hình 2.3 Cấu trúc của tinh trùng bò (Hiroshi, 1992)
Thân tinh trùng: nằm giữa cổ và vòng jensen có chiều dài 14,8µm, ñường kính 0,7 - 1,0µm Lõi của nó cùng với toàn bộ chiều dài của ñuôi tạo nên bó trục sợi, chúng gồm 9 ñôi vi ống ngoài, xếp ñồng tâm xung quanh 2 vi ống ñơn Phía ngoài 9 ñôi vi ống ñược bao quanh bằng 9 sợi chắc (sợi ưa Osmi) tạo thành một
bó trục sợi Bó trục sợi của thân giữa ñược bao bên ngoài bằng những ty thể xếp theo hình xoắn trôn ốc (lò xo ty thể) quanh bó trục sợi phía trong ðoạn giữa chứa nhiều photpholipid, lexitin và plasmalogen là nguồn dự trữ năng lượng, nên
Trang 21lò xo ty thể ñược xem như là “kho” năng lượng cần thiết cho sự hoạt ñộng của tinh trùng (Lubos Holý, 1970)
- ðuôi tinh trùng: là ñoạn còn lại từ vòng jensen cho ñến hết chót ñuôi,
có chiều dài 45,0 - 50,0µm , ñường kính 0,3 - 0,7µm Gồm hai phần là ñoạn chính và chót ñuôi ðoạn chính chỉ có bó trục ở giữa và những sợi ưa osmi vây bên ngoài (Nguyễn Tấn Anh và CS, 1997)
Nếu phân ñoạn theo chức năng của từng bộ phận thì tinh trùng có thể chia thành hai phần chính:
- Phần ñầu lưu giữ yếu tố di truyền và các men liên quan ñến năng lực thụ tinh của tinh trùng
- Phần ñuôi là cơ quan có chức năng vận ñộng bằng nguồn năng lượng của ty thể và cấu trúc của ñuôi
+ Hoạt ñộng của tinh trùng: tinh trùng hoạt ñộng tiến thẳng, nhờ cấu trúc ñặc biệt của ñuôi và nguồn năng lượng từ lò xo ty thể Theo giả thuyết “Trượt vi ống” (Afzelius, 1960 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999), bọc ty thể cung cấp năng lượng dưới dạng ATP cho các tay Dynein của cặp vi ống Các tay Dynein thực chất là những phân tử của Adenozin Triphosphatase có khả năng phân hủy ATP giải phóng năng lượng ñể chuyển ñộng ñuôi của tinh trùng (Gibbons, 1975 trích
Trang 222.1.2 Một số chỉ tiêu ñánh giá số lượng và chất lượng tinh dịch bò ñực
bò ñực lượng xuất tinh bình quân thường là 5 - 6 ml, giao ñộng trong khoảng 2
- 12ml hoặc hơn (Hoàng Kim Giao và CS, 1997) Nếu lấy tinh hai lần thì lượng xuất tinh thu ñược lần lấy thứ hai thường cao hơn lần lấy ñầu (Nguyễn Tấn Anh và CS, 1997) Trong thực tế sản xuất, không phải tinh dịch của lần lấy tinh nào cũng ñạt tiêu chuẩn pha chế và ñông lạnh (Hoàng Kim Giao và CS, 1997)
Theo nghiên cứu của Brito và CS (2002) ở Brazil, bò ñực giống nói chung có thể tích tinh dịch từ 0,6 ñến 7,8 ml/lần xuất tinh; Ở bò ñực giống Bos Taurus có thể tích tinh dịch 7 ml/lần khai thác
2.1.2.2 Hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng (A) là sức sống hay sức hoạt ñộng của tinh trùng,
nó có tầm quan trọng ñặc biệt trong pha loãng tinh dịch và khả năng thụ thai của tinh trùng Tinh trùng ở phụ dịch hoàn không hoạt ñộng nhưng khi ra ngoài cơ thể ñược tinh thanh hoạt hoá nên ñã hoạt ñộng với tất cả sức sống của mình Tuỳ theo sức sống mà tinh trùng sẽ vận ñộng theo một trong ba phương thức (Trần Tiến Dũng và CS, 2002)
- Tiến thẳng: là sự vận ñộng của tinh trùng mà phương thức vectơ vận ñộng ổn ñịnh
- Xoay vòng: là vận ñộng của tinh trùng mà phương của vectơ luôn bị thay ñổi
- Lắc lư: là sự vận ñộng của tinh trùng nhưng hầu như không có vectơ vận ñộng, không thay ñổi vị trí tương ñối của chúng
Trang 23Chỉ có tinh trùng vận ñộng tiến thẳng mới có khả năng tham gia quá trình thụ tinh, vì vậy người ta ñánh giá chất lượng tinh dịch thông qua ước lượng tỷ lệ phần trăm (%) tinh trùng tiến thẳng hoặc mức "sóng ñộng’’ của mặt thoáng vi trường tinh dịch do hoạt lực của tinh trùng tạo nên
Hoạt lực tinh trùng (A) thường xếp theo thang % (0 - 100%) Hoạt lực tinh trùng kết hợp với lượng xuất tinh (V) và nồng ñộ tinh trùng (C), sẽ có tổng số tinh trùng sống và hoạt ñộng tiến thẳng (VAC) trong lần xuất tinh ñó Trong sản xuất tinh ñông lạnh, tinh dịch phải có hoạt lực tinh trùng ≥ 70%
mới ñủ tiêu chuẩn ñể pha chế
2.1.2.3 Nồng ñộ tinh trùng
Nồng ñộ tinh trùng (C) là số lượng tinh trùng có trong một ml tinh dịch (tỷ/ml) Ở bò ñực nồng ñộ tinh trùng khoảng 200-3.200 triệu tinh trùng/ml, trung bình 1.200-1.500 triệu tinh trùng/ml (American Breeders Service, 1991) Nếu nồng ñộ tinh trùng ñạt ≥800 triệu/ml thì ñủ tiêu chuẩn pha chế và sản xuất tinh ñông lạnh
Số lượng tinh trùng sản sinh ra hàng ngày có liên quan chặt chẽ tới
ñộ lớn của dịch hoàn, những bò ñực có dịch hoàn lớn sẽ sản xuất số lượng tinh trùng lớn hơn những bò ñực dịch hoàn nhỏ (Joel, 2008) Sự sản sinh tinh trùng cũng biến ñộng nhiều qua các cá thể bò ñực, giống, lứa tuổi Bò ñực Bos indicus có nồng ñộ tinh trùng lớn hơn bò ñực Bos taurus (Brito và CS, 2002)
Có nhiều cách xác ñịnh nồng ñộ tinh trùng, nhưng hiện nay nồng ñộ tinh trùng ñược xác ñịnh bằng máy so màu rất nhanh và chính xác Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tinh dịch có nồng ñộ tinh trùng khác nhau sẽ tạo nên các mức ñộ mờ ñục khác nhau, làm cho ñộ sáng ñến tế bào quang học
có kết quả khác nhau và ñược chuyển thành dòng ñiện tích làm lệch kim ñiện
kế, nhờ chương trình cài ñặt sẵn trong máy mà nó sẽ tự ñộng tính toán và hiện thông số nồng ñộ tinh trùng khá chính xác Nồng ñộ tinh trùng có ý nghĩa
Trang 24khoa học thực tiễn, nó xác ñịnh số lượng tinh trùng trên một lần lấy tinh, phân loại tinh dịch, quyết ñịnh loại bỏ hay sử dụng tinh dịch cho các công ñoạn sau Nồng ñộ tinh trùng (C) khi phối hợp với V và A cho biết tổng số tinh trùng hoạt ñộng tiến thẳng của lần xuất tinh ñó (Hà Văn Chiêu, 1999)
2.1.2.4 Màu sắc tinh dịch
Tinh dịch bò thường có màu trắng ñục, trắng sữa, trắng ngà Màu sắc tinh dịch phụ thuộc vào nồng ñộ tinh trùng cũng như sự hiện diện của các chất khác Tinh dịch có màu trắng ñục, trắng sữa hoặc trắng ngà, thường có nồng
ñộ tinh trùng cao Tinh trùng có màu trắng trong, loãng là tinh dịch có nồng
ñộ tinh trùng thấp Tinh dịch có màu xanh hoặc xám thường có lẫn mủ, có màu cà phê hay màu nâu, thường do lẫn máu hay sản phẩm viêm của ñường sinh dục (Hà Văn Chiêu, 1999)
2.1.2.5 pH tinh dịch
pH của tinh dịch do nồng ñộ ion H+ quyết ñịnh, nếu nồng ñộ H+ cao thì tinh dịch toan tính ðộ pH có liên quan ñến năng lực ñệm, khả năng sống sót
và năng lực thụ tinh của tinh trùng pH tinh dịch có thể xác ñịnh bằng máy ño
pH hoặc dùng giấy ño pH pH của tinh dịch bò thường biến ñộng trong khoảng 6,3 - 6,9 (Hoàng Kim Giao và CS, 1997)
pH tinh dịch có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh bước ñầu chất lượng tinh dịch ðộ pH kết hợp với các ñặc ñiểm khác sẽ giúp cho người chăn nuôi ñực giống quyết ñịnh loại bỏ hay sử dụng tinh dịch vừa mới khai thác ñược (Hà Văn Chiêu, 1999)
2.1.2.6 Tinh trùng kỳ hình
Trong ñiều kiện bình thường, tinh trùng có hình dạng ñặc trưng cho mỗi loài, nếu vì một lý do nào ñó trong quá trình sinh tinh, hoặc xử lý tinh dịch, tinh trùng có hình thái khác thường như giọt bào tương bám theo, biến dạng hay khuyết tật ở ñầu, ñuôi như: ñầu méo, to, hình quả ké, hai ñầu, ñuôi gấp khúc, hai ñuôi, ñuôi xoăn, có giọt bào tương, thể ñỉnh phù, tháo rời, vỡ
Trang 25vv Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ñược tính bằng %, ñược xác ñịnh bằng cách ñếm Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, ñiều kiện nuôi dưỡng, thời tiết, bệnh tật, di truyền kỹ thuật xử lý tinh dịch vv
Hình 2.4 Các dạng kỳ hình của tinh trùng bò (McGowan, 2004)
Trong ñó:
A Acrosom lồi (dạng phổ biến) I Phản xạ xa tâm
C ðầu quả lê (nghiêm trọng) K ðuôi gập ñôi (ñoạn giữa uốn cong mạnh)
Trang 262.1.2.7 Tỷ lệ tinh trùng sống
Tỷ lệ tinh trùng sống liên quan chặt chẽ ñến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng Dựa vào nguyên lý màng của tinh trùng chết hoặc ñang chết có khả năng cho các chất nhuộm màu thấm qua, do sự rối loạn tính thẩm thấu của màng tinh trùng Trong khi ñó những tinh trùng sống, màng tinh trùng không cho các chất nhuộm màu thấm qua nên không bắt màu khi nhuộm Bằng cách này người ta
ñã sử dụng thuốc nhuộm màu Eosine 5% ñể nhuộm tinh trùng chết rồi ñếm chúng trên kính hiển vi có ñộ phóng ñại 1600 lần và tính tỷ lệ sống
2.1.2.8 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác
Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác VAC (tỷ/lần) là chỉ tiêu tổng
hợp của cả 3 chỉ tiêu V, A và C (là tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh) Qua ñó có thể ñánh giá ñược năng xuất ñực giống thông qua số liều tinh sản xuất trong một lần khai thác, tổng số liều tinh của ñực giống trong một năm Chỉ tiêu VAC cao thì phẩm chất tinh dịch tốt (Phạm Văn Tiềm, 2009)
2.1.3 Những nhân tố ảnh hưởng ñến khả năng sản xuất tinh dịch
2.1.3.1 Giống và cá thể bò ñực
Tuỳ từng giống, tầm vóc to hay nhỏ, cường ñộ trao ñổi chất mạnh hay yếu, khả năng thích nghi với thời tiết khí hậu tốt hay không mà có số lượng và chất lượng tinh dịch sản xuất khác nhau Ví dụ bò ñực giống ôn ñới (800 – 1.000kg) mỗi lần lấy tinh có thể cho 8 - 9ml hay thậm chí 10 - 15ml, còn bò nội của ta chỉ cho ñược 3 - 5ml Bò ôn ñới nhập vào nước ta do thích nghi với khí hậu mùa hè kém nên lượng tinh dịch giảm và tính hăng cũng kém (Nguyễn Xuân Trạch, 2003)
2.1.3.2 Tuổi bò ñực
Lượng xuất tinh và số lượng tinh trùng của bò ñực già thường nhiều và
ổn ñịnh hơn so với bò ñực trẻ Bò ñực sản xuất tinh dịch tốt và ổn ñịnh vào khoảng 3 - 6 năm tuổi Tinh dịch ñược lấy từ những bò ñực già hơn thể hiện
Trang 27những ựặc trưng như giảm tỷ lệ tinh trùng sống, tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
và giảm khả năng có thể ựông lạnh (Hiroshi, 1992)
Tuổi thọ của bò ựực giống có thể ựạt 18 Ờ 20 năm nhưng do nhiều nguyên nhân khác nhau nên thường chỉ ựược sử dụng 5 - 8 năm (Nguyễn Xuân Trạch và CS, 2006)
2.1.3.3 Thời tiết khắ hậu
Như mọi cơ thể sống khác, bò ựực chịu tác ựộng trực tiếp của môi trường, chủ yếu là các yếu tố tự nhiên như nhiệt ựộ, ựộ ẩm, ánh sáng vv Theo quy luật giới hạn sinh thái (Hà Văn Chiêu, 1999), mỗi loài hoặc mỗi cơ thể ựều có một khoảng thắch hợp của một yếu tố khắ hậu nào ựó Nếu ngoài giới hạn thắch hợp sẽ làm giảm khả năng sống của cơ thể và bị tác ựộng cộng hưởng bởi các yếu tố môi trường Trong mối quan hệ giữa ngoại cảnh với sinh vật, tác ựộng của môi trường tới sinh sản là quan trọng nhất, việc tác ựộng của môi trường ựến sản xuất tinh dịch của con ựực là rất phức tạp, khó xác ựịnh ựược nhân tố nào là quan trọng vào từng thời ựiểm nhất ựịnh Ở nhiệt ựộ không khắ 60C, dịch hoàn ựược nâng lên gần với thân bò ựực, khi nhiệt ựộ không khắ 240C dịch hoàn buông thõng xuống ựể ựiều hòa nhiệt ựộ dịch hoàn Thông qua sự ảnh hưởng của nhiệt ựộ và ựộ ẩm không khắ, yếu tố mùa vụ biểu hiện khá rõ rệt Ở các tháng mát mẻ, nhiệt ựộ không khắ 18 -
200C và ựộ ẩm thắch hợp là 83 - 86%, bò ựực HF, bò Zêbu ựều thể hiện sức sản xuất tinh cao hơn Vào các tháng nắng nóng nhiệt ựộ không khắ trên 300C
và ựộ ẩm quá cao trên 90%, hoặc thấp hơn 40%, sức sản xuất tinh của bò ựực giống giảm ựi rõ rệt (Hà Văn Chiêu, 1999)
Ở các nước ôn ựới chất lượng tinh dịch kém nhất vào mùa ựông, tốt nhất vào mùa hè và mùa thu Nguyên nhân chủ yếu là do ánh sáng Nhưng ở nước ta tinh dịch thường kém nhất vào mùa hè do nắng nóng Tinh dịch tốt nhất là vụ đông - Xuân, mùa Hè giảm nhiều, mùa Thu lại tăng lên (Nguyễn Xuân Trạch và CS, 2006)
Trang 28Nghiên cứu của Lê Bá Quế và CS (2007) cho biết khả năng sản xuất tinh ựông lạnh của bò ựực Holstein Friesian trong vụ đông - Xuân cao hơn vụ
Chế ựộ dinh dưỡng kém làm chậm thành thục về tắnh, giảm tắnh hăng của ựực giống, giảm sự hình thành tinh trùng, tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Chế ựộ nuôi dưỡng tốt, cân bằng dinh dưỡng có tác dụng làm cho con ựực sớm thành thục về tắnh, khả năng sinh tinh cao Nhưng nếu chế ựộ dinh dưỡng quá cao sẽ làm bò ựực béo, trong thân thể và dịch hoàn tắch mỡ, tuần hoàn máu kém lưu thông, làm giảm khả năng sinh tinh, tăng tỉ lệ tinh trùng chết và
tỉ lệ tinh trùng kỳ hình cao (Bùi đức Lũng và CS, 1995)
Khẩu phần ăn cho bò ựực giống phải ựáp ứng ựược ựầy ựủ nhu cầu dinh dưỡng của chúng, theo tuổi, giống, giai ựoạn phát triển, khối lượng cơ thể và năng lực sản xuất tinh dịch
Trong khẩu phần của bò ựực giống các nguyên tố khoáng vi lượng ( Zn,
Cu, Co ) và các vitamin A, D, E cũng rất quan trọng nếu trong khẩu phần ăn của bò giống mà thiếu thì bò giống sẽ không có khả năng sinh sản (Vũ Duy Giảng, 2007)
2.1.3.5 Khoảng cách lấy tinh
Thời gian từ ngày lấy tinh này ựến ngày lấy tinh tiếp theo là khoảng cách lấy tinh của ựực giống Khoảng cách lấy tinh ảnh hưởng ựến lượng xuất tinh,
Trang 29chất lượng, nồng ñộ và hoạt lực của tinh trùng ðối với bò ñực giống thường khoảng cách 3 - 5 ngày lấy tinh một lần là tốt nhất, nếu khoảng cách lấy tinh ngắn có thể mỗi lần lấy tinh ñược ít, nhưng số lần lấy tinh thì nhiều (Hà Văn Chiêu, 1996) , nên tổng lượng xuất tinh trong một khoảng thời gian nhất ñịnh tăng so với lấy tinh có khoảng cách dài Nếu khoảng cách lấy tinh dài, lượng xuất tinh lấy ñược nhiều nhưng tỷ lệ tinh trùng chết cao, hoạt lực tinh trùng yếu Việc xác ñịnh khoảng cách lấy tinh phải căn cứ vào lượng xuất tinh và chất lượng tinh lấy ñược lần trước của từng con ñực ñể xác ñịnh lần lấy tinh tiếp theo
ðể duy trì khả năng sinh sản lâu dài của bò ñực thì khoảng cách lấy tinh thích hợp cho bò là 3 - 4 ngày/lần (Cheng, 1992)
2.1.3.6 Chăm sóc
Chăm sóc là công việc tác ñộng trực triếp lên cơ thể bò ñực gồm: cách cho ăn, tắm trải vận ñộng, thái ñộ của người chăm sóc và lấy tinh sẽ có ảnh hưởng rất lớn ñến số lượng và chất lượng tinh khai thác Có thể sẽ không lấy ñược tinh trong một thời gian dài và có thể làm cho hỏng bò ñực giống nếu chăm sóc quản lý không tốt (Nguyễn Xuân Trạch và CS, 2006)
Chuồng trại sạch sẽ, thoáng mát về mùa hè, ấm áp về mùa ñông, bò ñược tắm, chải, vận ñộng thoải mái hàng ngày, tuần hoàn máu lưu thông vv…, giúp bò ñực khoẻ mạnh sẽ làm tăng khả năng sinh tinh và chất lượng tinh cũng ñược tăng lên
2.1.4 Một số nguyên lý cơ bản về ñông lạnh tinh dịch
Tinh trùng là một tế bào sống, vận ñộng ngoài cơ thể, rất mẫn cảm với sự thay ñổi của ñiều kiện môi trường xung quanh Trong quá trình ñông lạnh tinh dịch, ngoài việc dựa vào nguyên lý, lý học, hóa học còn phải dựa vào nguyên lý sinh học và mối tương tác của chúng sao cho tinh trùng khi ñông băng vẫn giữ nguyên hình thái, trao ñổi chất tạm ngừng và sau khi giải ñông tinh trùng vẫn hoạt ñộng bình thường (Ditto, 1992; Nguyễn Xuân Hoàn, 1994)
Trang 302.1.4.1 Hiện tượng ñông băng chất lỏng
Khi một chất lỏng ñược làm lạnh, quá trình ñông băng xảy ra, quá trình này gồm các giai ñoạn: Tiền ñông băng (supercooling), tạo nhân (nucleation), giãn nở của tinh thể băng (growth off ice crystals) và kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt ñộ nhất ñịnh (eutectic point), diễn biến trong quá trình ñông băng theo ñồ thị như hình số 2.7 Khi ñông lạnh tinh dịch sự tạo tinh thể và giãn nở tinh thể băng chỉ xảy ra trong ñiều kiện ñông lạnh chậm, còn khi ñông lạnh cực nhanh thì hai hiện tượng trên không xảy ra, mà xảy ra hiện tượng thủy tinh hóa (Vitrification), tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ ñược hiện tượng giãn nở tinh thể (Mazur, 1989) Quá trình làm lạnh và ñông băng của một dung dịch sảy ra
như hình 2.5
Hình 2.5 Quá trình ñông băng dung dịch (Hiroshi, 1992)
a Hiện tượng tiền ñông băng
Khi làm lạnh một chất lỏng nếu tốc ñộ làm lạnh chậm, nhiệt ñộ của chất lỏng hạ xuống ñiểm ñông băng, thậm chí còn xuống thấp dưới ñiểm ñông băng
mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái, chưa có tinh thể băng Quá trình này gọi là tiền ñông băng (Supercooling) Trạng thái của chất lỏng không ổn ñịnh, chỉ cần một tác ñộng nhẹ sẽ xảy ra hiện tượng tạo nhân, hoặc phá vỡ hiện tượng tạo tinh thể, thay vào ñó sẽ xảy ra hiện tượng kết hạt (Ditto, 1992)
Trang 31b Hiện tượng tạo nhân tinh thể
Một chất lỏng ñông băng phải có một hạt nhỏ làm “nhân” cho các phân tử nước lần lượt bám vào ñể hình thành tinh thể Hiện tượng tạo nhân tinh thể có hai hình thức Ở nước nguyên chất việc tạo nhân là từ các hạt tinh thể nước, còn ở dung dịch có chất tan, các hạt chất tan này sẽ là nhân cho các phân tử nước bám vào tạo tinh thể Vì thế ở trường hợp ñầu việc tạo tinh thể nước xảy ra ở nhiệt ñộ thấp hơn
so với trường hợp sau (Barios, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999)
c Sự dãn nở của tinh thể băng
Khi ñông băng các tinh thể hình thành, lượng xuất tinh của chúng sẽ tăng, sự dãn nở lượng xuất tinh này giải phóng năng lượng tiềm ẩn sẵn trong các phân tử nước, làm nhiệt ñộ của dung dịch tăng ñến ñiểm ñông băng, mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục nhưng tại thời ñiển này nhiệt ñộ của dung dịch không ñổi trong một giai ñoạn nhất ñịnh và giai ñoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc ñộ ñông băng Nếu tốc ñộ ñông băng nhanh thì giai ñoạn trên sẽ ngắn và sự giãn nở của tinh thể băng sẽ bị loại trừ và thay vào ñó là hiện tượng thuỷ tinh hoá (Ditto, 1992)
d ðiểm ñông băng hoàn chỉnh và sự kết tinh tinh thể của dung dịch
Khi hiện tượng làm lạnh tiếp tục, lượng tinh thể nước tăng lên và pha loãng giảm dần, nồng ñộ dung dịch tăng Dung dịch sẽ tách làm hai phần: Pha tinh thể nước và pha lỏng Nếu hiện tượng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ bị biến mất tại một nhiệt ñộ nhất ñịnh ðiểm ñó gọi là ñiểm ñông băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Rodriguez và Duverger, 1997 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999)
2.1.4.2 Ảnh hưởng của ñông băng lên tế bào tinh trùng
Tinh trùng rất mẫn cảm và luôn tồn tại trong tinh thanh, khi ñông lạnh, tinh trùng chịu sự tác ñộng của các hiện tượng sau (Ditto, 1992):
a Hiện tượng ñông băng nội bào
Tinh trùng bị chết, hoặc mất năng lực hoạt ñộng, khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nước nội bào Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch muối sinh lý có thể loại trừ ñược hiện tượng này vì ñược các phân
Trang 32tử nước dạng lỏng bao quanh, mặc dù dung dịch ngoại bào bắt ñầu ñông băng
ở nhiệt ñộ - 20C hoặc - 50C Như vậy quá trình ñông băng sẽ không làm hại tới tế bào tinh trùng cho ñến khi nước nội bào ñông lạnh mặc dù dung dịch môi trường bao quanh ñã ñông lạnh (Mazur, 1989)
b Sự mất nước của tế bào tinh trùng
Nếu nước nội bào thoát ra ngoài, tinh trùng sẽ bị teo lại, nhưng vẫn có tinh trùng sống ñược ở nhiệt ñộ thấp hoặc siêu thấp chẳng hạn -1960C Trong quá trình làm lạnh tinh dịch, nước ngoại bào ñông băng làm áp suất thẩm thấu chênh lệch, nước nội bào thoát ra ngoài tinh trùng và tiếp tục ñông băng phần ngoại bào Ở nhiệt ñộ - 150C có 80% nước nội bào bị ñông lạnh và ñược thoát
ra ngoài, do ñó ngăn ngừa ñược hiện tượng ñông băng nội bào (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) Ở nhiệt ñộ -300C phần lớn nước nội bào thoát ra khỏi tinh trùng Với tinh trùng có thể chịu lạnh ở nhiệt ñộ -300C, có thể tồn tại ñược ở nhiệt ñộ -1960C, còn tế bào bình thường thì bị phá hủy, tuy nhiên cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các biến ñổi lý - hoá - sinh xảy ra Những biến ñổi hóa sinh có thể xảy ra trong tế bào bị phá hủy ở nhiệt
ñộ thấp như vậy, bao gồm thay ñổi trong cấu trúc nội bào, do thay ñổi trong cấu trúc nội bào và thay ñổi liên kết hydro ở chuỗi polyme Sự ñông ñặc hóa không thể quay trở lại như cũ và sự kết tủa protein do mất nước của nguyên sinh chất (Aritani, 1989)
c Hiện tượng ñông băng ngoại bào
Trong khi ñông lạnh ngoại bào, sẽ xảy ra hiện tượng nồng ñộ chất hòa tan kèm theo áp suất thẩm thấu tăng lên và kéo theo những thay ñổi về ñộ pH Các chất ñiện giải như Natri và Kali có nhiều nhất trong tinh thanh và chúng tồn tại ở dạng Natri clorua, Kali clorua Ở ñiểm eutectic, nồng ñộ các muối này cao nhất là khi nhiệt ñộ -21,20C ñối với Natri clorua và -11,10C ñối với Kali clorua và biên ñộ nhiệt ñộ này có hại cho tinh trùng Do có sự tăng nồng
ñộ chất hòa tan ñi kèm với tăng áp suất thẩm thấu cũng như pH thay ñổi, tất
Trang 33cả xảy ra trong biên ñộ nhiệt ñộ này, mà người ta không rõ cái gì có tác hại nhất ñến tinh trùng (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999)
d Chuyển ñộng của nước và sự giãn nở của tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học ñối với tinh trùng
Hiện tượng giải ñông giống như ñông lạnh cũng làm huỷ hoại tinh trùng do chênh lệch áp suất thẩm thấu, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nước ñá trong quá trình ñông lạnh hoặc tan băng có thể gây tổn thương tế bào tinh trùng Các bọt khí tồn tại trong tinh thể băng cũng có thể gây tổn hại tinh trùng trong quá trình này (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999)
Các tổn thương trên có thể loại trừ ñược bằng cách giảm kích cỡ các tinh thể băng và làm tăng số lượng tinh thể nhỏ hơn Tốc ñộ làm lạnh nhanh
có thể làm tăng tinh thể nhỏ ñó khi ñông lạnh Nói cách khác là khi làm lạnh nhanh sẽ ngăn chăn ñược sự lớn lên của các tinh thể băng trong dung dịch và tạo ñiều kiện ñông lạnh giống như thủy tinh hóa Tuy vậy, băng thủy tinh gồm các tinh thể băng sẽ không ổn ñịnh ở nhiệt ñộ trên -1290C và sự chuyển ñộng
và tái tinh thể hóa của chúng sẽ gây tổn hại tế bào tinh trùng Chuyển ñộng sẽ tăng lên ở trên -400C và dễ gây tổn hại tinh trùng ñặc biệt là ở khoảng -200C
Trang 342.1.5.1 Sức ñề kháng của tinh trùng ñối với ñông lạnh
Khả năng của tinh trùng chịu ñựng ñược ñông lạnh gọi là sức kháng ñông
và thường ñược ño bằng tỷ lệ hồi phục lại của tinh trùng sau khi ñông lạnh và giải ñông Ở bò ñực, sức kháng ñông của tinh trùng là khác nhau, tùy theo từng
cá thể bò ñực, ñiều kiện lúc lấy tinh và tuổi của bò ñực Cụ thể như sau:
b Mùa vụ
Vào mùa hè nhiệt ñộ không khí cao nên sức kháng của tinh trùng vào mùa này thường thấp Hiện tượng giảm này còn tùy thuộc vào từng cá thể và tuổi của chúng, bò ñực nào già hơn thì dễ bị tác ñộng của nhiệt hơn Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng trong mùa hè nóng bức có thể thấp hơn so với tinh trong mùa mát mẻ (Ditto, 1992)
c Lấy tinh nhiều lần
Khả năng chịu lạnh của tinh trùng biến ñổi theo lần lấy tinh Lần lấy tinh thứ 2 khả năng chịu lạnh tinh trùng cao hơn khả năng chịu lạnh của lần lấy tinh ñầu (Bidot, 1985)
2.1.5.2 Thành phần của môi trường pha loãng
Thành phần cơ bản của môi trường pha loãng (MTPL) tinh dịch gồm chất có năng lượng ( fuctose, lactose, raffinose, glucose, lòng ñỏ trứng gà),
chất ñệm (axit Citric, muối Tris), chất chống ñông (glycerol), chất ñiện giải
Trang 35Nồng ñộ tối ưu của lòng ñỏ trứng trong MTPL tinh dịch là 20 - 22%, nếu nồng ñộ này quá thấp hoặc quá cao thì không tốt cho tinh trùng, mặc dù lòng ñỏ trứng ñã bảo vệ tinh trùng không bị tổn hại trong khi ñông lạnh Chức năng này chủ yếu do tác ñộng của lipoprotein và lecithin trong lòng ñỏ Các loại ñường ñóng vai trò quan trọng trong môi trường, do tác ñộng ñến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi ở nhiệt ñộ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng
Chất ñệm có vai trò quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi ñông lạnh và khi giải ñông, trong kích thích trao ñổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải ñông, ñồng thời duy trì sức sống của chúng Chất ñệm phải phù hợp như là môi trường khi ñông lạnh và phải có ñặc tính duy trì mức thấp nhất về sự tổn hại cho tinh trùng do các muối gây ra, phải tan trong nước với hằng số phân ly ñiện tích là 6 - 8
Chất chống ñông - glycerol có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hòa tan mạnh trong nước và cồn, là dung môi tốt cho các chất ñiện giải
và hợp chất hữu cơ, làm giảm khối lượng tinh thể nước (Hiroshi Masuda, 1992) Trong MTPL, glycerol ngấm vào tinh trùng thay thế nước bị mất ñi làm cho tế bào tinh trùng không bị teo, làm cho nước ñông băng ở dạng hạt nhỏ, chống lại sự phá vỡ tế bào Nó còn giữ ổn ñịnh nồng ñộ các chất hòa tan, không làm thay ñổi áp suất thẩm thấu, hạn chế việc phá hủy các protein của tinh trùng (Hà Văn Chiêu, 1999)
2.1.5.3 Cân bằng tinh pha ở 5 0 C trước khi ñông lạnh
Bảo quản ở 50C trước khi ñông lạnh sẽ tăng cường sức kháng ñông cho tinh trùng bò ñực Thông thường tinh bò ñực sau khi khai thác và ñủ tiêu chuẩn pha chế thì tinh dịch sẽ ñược pha loãng lần ñầu ở nhiệt ñộ 35oC, hỗn hợp tinh dịch và môi trường pha loãng này ñược gọi là tinh pha, tinh pha ñược ñưa vào tủ cân bằng làm lạnh dần xuống 50C trong khoảng thời gian từ 2 - 3
Trang 36giờ Tinh pha tiếp tục ñược pha lần thứ hai với môi trường có chứa glycerol, lần pha này thực hiện theo phương pháp nhỏ giọt từ từ và cân bằng trong khoảng thời gian từ 2 - 3,5 giờ Sau ñó tinh pha lần hai ñược nạp vào cọng rạ và tiếp tục cân bằng trong thời gian từ 1 - 2 giờ, cọng rạ sẽ ñược ñông lạnh trong hơi nitơ ñến -165oC rồi ñưa vào nitơ lỏng -196oC ñể bảo quản
Bảo quản tinh trùng ñã làm lạnh ở 50C trước khi pha loãng lần hai ñã nâng cao ñáng kể tỷ lệ sống của tinh trùng sau khi ñông lạnh và giải ñông
2.1.5.4 Nồng ñộ của glycerol và thời gian cân bằng
Nồng ñộ glycerol trong môi trường pha loãng cuối cùng ñể làm ñông lạnh tinh trùng bò là 6,5 - 7%, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của môi trường pha loãng Nồng ñộ tối ưu cho sức sống của tinh trùng là 11% với môi trường sữa khử bơ Nồng ñộ glycerol trong môi trường pha loãng có mối tương quan ñáng tin cậy với tốc ñộ giải ñông, ñó là nồng ñộ glycerol cao trong môi trường pha loãng là cần thiết cho tốc ñộ giải ñông nhanh (Hiroshi, 1992)
2.1.5.5 Tốc ñộ làm lạnh
Hình 2.6 Ảnh hưởng của glycerol trong dung dịch NaCl so với nồng ñộ NaCl trong dung dịch còn lại khi dung dịch NaCl (0,15M) ñược ñông
lạnh (Hiroshi, 1992)
Trang 37Tốc ñộ làm lạnh quá nhanh sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bào ðiều ñó gây ra ñông lạnh ngoại bào và sau ñó ñông lạnh nội bào Tốc ñộ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập trung nồng ñộ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối loạn tế bào, ñây ñược coi là ảnh hưởng của dung dịch Tốc ñộ làm lạnh tối ưu
là tốc ñộ làm giảm tối ña cả ñông lạnh nội bào và ảnh hưởng của dung dịch
Tốc ñộ làm lạnh tối ưu này khác nhau không chỉ theo loại tế bào mà còn theo các yếu tố như các thành phần của thể vẩn tế bào và loại chất chống ñông băng Chẳng hạn dung dịch ñường saccharide ñược ñông lạnh nhanh (ñông lạnh 2 - 4 phút, 50C xuống -790C), cho hoạt lực tinh trùng sau giải ñông cao hơn so với ñông lạnh chậm (ñông lạnh 45 phút, từ 50C xuống -790C), vì
ñã ngăn cản ñược ảnh hưởng của dung dịch Môi trường pha loãng có nồng ñộ glycerol 5-7% ñược ñông lạnh nhanh (ñông lạnh 3 - 5 phút, từ 50C xuống -
1300C) cho hoạt lực tinh trùng cao hơn so với ñông lạnh chậm (ñông lạnh 20 -
40 phút, từ 50C xuống -790C) (Hiroshi, 1992)
2.1.5.6 Nhiệt ñộ giải ñông
Nhiệt ñộ giải ñông tinh ñông lạnh có ảnh hưởng lớn ñến sức sống, hoạt lực,
tỷ lệ acrosome bình thường và quá trình trao ñổi chất bình thường của tinh trùng Giải ñông tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước
40C họăc 200C Giải ñông ở nước 35 - 750C cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 40C hoặc 200C Nhưng nếu giải ñông bằng nước có nhiệt ñộ cao hơn nữa, chẳng hạn nước 900C, sẽ không làm tăng sức sống của tinh trùng
2.1.5.7 Thời gian bảo quản
Tinh trùng ñông lạnh phải luôn luôn ñược bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (-1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và hoạt lực tinh của tinh trùng vẫn không thay ñổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1997) Ở Thụy Sỹ tinh ñông lạnh bảo quản 20 năm vẫn thụ tinh và bò mẹ ñẻ bê con ngày 25/7/1975 (America Breeders Service, 1991) Ở
Trang 38Nhật Bản tinh cọng rạ bảo quản 4 - 13 năm vẫn có hoạt lực tinh trùng 45 - 55% và có tỷ lệ thụ tinh 54% Có nhiều trường hợp tinh ñông lạnh bảo quản
20 năm vẫn có tỷ lệ thụ tinh là 69,8% (Hiroshi, 1992)
2.1.6 Môi trường pha loãng tinh dịch bò
Nhờ pha loãng nên ñã phát huy ñược tính ưu việt của thụ tinh nhân tạo như tăng khả năng chịu lạnh, tăng hiệu quả sử dụng tinh dịch bò Môi trường pha loãng cần ñảm bảo những tính chất sau ñây:
2.1.6.1 Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng ñộ hòa tan của các phân tử và các ion có trong dung dịch ñó ðể cho tinh trùng tồn tại ñược, áp suất thẩm thấu của môi trường (áp suất ngoại bào) phải tương ñương như áp suất thẩm thấu bên trong tinh trùng (áp suất nội bào), tức là có hiện tượng ñẳng trương Các dung dịch ưu trương (áp suất ngoại bào lớn hơn áp suất nội bào) sẽ làm cho tinh trùng teo lại Các dung dịch nhược trương (áp suất ngoại bào thấp hơn áp suất nội bào) sẽ làm cho tinh trùng trương phồng lên và có thể gây vỡ màng tinh trùng (Nguyễn Tấn Anh, 1984) Tuy nhiên trong thực tế khả năng chịu ñựng áp suất thẩm thấu của tinh trùng không chặt chẽ mà chúng chịu ñựng
và tồn tại ñược trong một khoảng giá trị áp suất thẩm thấu biến thiên nhất ñịnh dao ñộng từ 250 ñến 500 mosmol, nhờ khả năng thích ứng và ñộ bền thẩm thấu của màng tế bào (Innecda, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) Vì vậy nồng ñộ của các chất tan trong môi trường pha loãng cần tạo nên một áp suất thẩm thấu phù hợp với khả năng chịu ñựng của tinh trùng
2.1.6.2 pH và năng lực ñệm của môi trường
pH của môi trường phụ thuộc vào nồng ñộ H+ có trong môi trường Nồng
ñộ H+ càng tăng thì môi trường càng toan tính và ngược lại Môi trường pha loãng tinh dịch phải có pH 6,2 - 6,8 (Nguyễn Tấn Anh và CS, 1997) Trong sản xuất ñể môi trường pha loãng tinh dịch có khả năng duy trì một cách ổn ñịnh ñộ
Trang 39pH ở mức thích hợp, người ta ñưa vào môi trường loại hoá chất có tác dụng làm giảm khả năng kiềm hoá hoặc toan hoá của môi trường
2.1.6.3 Chất ñiện giải và không ñiện giải trong môi trường
Chất không ñiện giải làm giảm ñộ dẫn ñiện của môi trường giúp tinh trùng tránh ñược mất ñiện tích, ngăn ngừa hiện tượng tụ dính của tinh trùng
và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tinh trùng duy trì sự sống Chất không ñiện giải giữ vai trò chất khử, gánh chịu sự tác ñộng của oxy nên có tác dụng như chất chống oxy hoá và bảo vệ chất chống ñông của tinh dịch khỏi bị oxy hoá Tinh trùng rất mẫn cảm với dung dịch NaCl, nhưng vẫn phải ñưa vào môi trường pha loãng tinh dịch một lượng nhất ñịnh chất ñiện giải không ñộc và có anion hoá trị cao Nếu tăng cation sẽ làm cho tinh trùng tụ dính, khi ñông lạnh tinh trùng sẽ chóng chết, còn các anion tác ñộng lên tinh trùng tốt hơn, vì nó chống ñược hiện tượng tụ dính của tinh trùng (Tsuyoshi, 1992)
2.1.6.4 Tác dụng của glycerol
Glycerol là một chất bảo vệ cần thiết, có tác dụng như một chất chống ñóng băng cho tinh trùng (Hiroshi, 1992)
a Làm thay ñổi ñông lạnh và giải ñông ñối với thể vẩn tế bào
Glycerol có ảnh hưởng ñến thể vẩn tế bào khi ñược ñông lạnh rồi giải ñông Ví dụ nếu thể vẩn tinh trùng trong dung dịch Ringer ñược phết mỏng trên phiến kính, khi ñược làm lạnh nó bắt ñầu ñông lạnh ở 0 - 80C Các tinh thể băng
có hình gậy dẹt, hình năm cạnh, ở biên ñộ nhiệt ñộ này nó lớn lên nhanh chóng
Ở nhiệt ñộ khoảng -200C, tinh trùng bị ñẩy ñi do sự lớn lên của các tinh thể băng và buộc phải vào khoảng trống giữa các tinh thể băng khác Làm ấm nhanh sẽ làm giảm số lượng tinh thể này và kích thích tăng nhanh số bọt khí
và những vết nứt trên tinh thể băng Khi băng tan tinh trùng nằm ở rìa các tinh thể Tinh trùng lơ lửng trong dung dịch Ringer có chứa 15 - 20% glycerol bắt ñầu ñông lạnh ở -100C ñến -200C Các tinh thể băng khi lớn lên có hình giống như một chiếc lông chim hoặc cây dương xỉ, thậm chí ở -400C, với không
Trang 40gian khá chật giữa các tinh thể, tinh trùng vẫn lơ lửng giữa những khoảng hở này Khi dung dịch ñược làm ấm lên, các tinh thể băng tan chảy chậm, nhưng không thay ñổi nhanh chóng như trước ñó Bằng cách này, glycerol có tác dụng như là một chất hòa tan muối và làm giảm bớt những thay ñổi vật lý học khi làm ñông lạnh và giải ñông (Hiroshi, 1992)
b Glycerol ñi vào tế bào
Trong môi trường pha loãng tinh glycerol ngấm vào tinh trùng thay thế nước bị mất ñi làm cho tế bào tinh trùng không bị teo Glycerol làm cho nước ñông băng ở dạng hạt nhỏ, loại trừ ñược sự dãn nở của tinh thể nước nội bào, chống ñược sự phá vỡ tế bào, nó còn giữ ñược sự ổn ñịnh nồng ñộ của các chất hoà tan, không làm thay ñổi áp suất thẩm thấu, hạn chế việc phá vỡ các protein của tinh trùng (Hiroshi, 1992)
2.1.6.5 Tác dụng của kháng sinh trong môi trường pha loãng
Trong môi trường pha loãng tinh dịch thường có một lượng kháng sinh nhất ñịnh, thường là peniciline và streptomycine Peniciline có tác dụng ức chế tổng hợp các mucopeptid của vỏ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn trưởng thành, vỏ tế bào mỏng ra tại một số ñiểm ñể chuẩn bị phân bào, tại các ñiểm ñó peniciline phong bế men chuyển hóa peptit, làm cho vỏ tế bào vi khuẩn không ñược bổ sung, trong lúc lượng xuất tinh của nguyên sinh chất vẫn tăng làm tế bào vi khuẩn vỡ (Hoàng Tích Huyền, 1994) Vỏ tế bào vi khuẩn gram dương chứa 60% mucopeptit, nên chịu tác ñộng và phân hủy theo cơ chế của peniciline, các
vi khuẩn gram âm chỉ có 10% mucopeptit, nên không mẫn cảm với penicilin Steptomycine làm tổn hại ñến ARN thông tin, làm cho ARN thông tin chọn nhầm các axít amin, tạo ra một ña peptit khác, protein ñặc trưng không hình thành do ñó vi khuẩn mới không ñược tạo nên (Hoàng Tích Huyền, 1994)
