Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (Arachis hypogaea L.) có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ

KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN SINH LÝ .... Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc nghiên cứu trong

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thànhluận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thu Thủy (Khoa Sinh - KTNN) đã

nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thựcnghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Hóa sinh; Phòng Côngnghệ tế bào; Phòng Di truyền và Công nghệ gen (Khoa Sinh - KTNN - Trường Đạihọc Sư Phạm Thái Nguyên); Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen (ViệnKhoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên) và các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinhhọc đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạmThái Nguyên, Khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN và các thầy côgiáo, cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoànthành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời những cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đãluôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tác giả

Phạm Tuấn Oanh

Trang bìa phụ

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Danh mục các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY LẠC

3 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc

3 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc 4

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam

5 1.2 TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

7 1.2.1 Hạn và tác động của hạn đến thực vật 7

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

8 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

10 1.4 MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG VÀ CÂY LẠC

12 1.5 CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT 14

1.5.1 Cysteine proteinase

14 1.5.2 Cystatin chất ức chế cysteine proteinase 15

1.5.3 Gen mã hóa cystatin ở thực vật và cây lạc 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật .21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 212.1.3 Địa điểm nghiên cứu .22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Mô hình nghiên cứu tổng quát 22

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng 23

2.2.3 Phương pháp đánh giá chất lượng hạt 23

2.2.4 Khả năng chịu hạn của các dòng lạc được đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phương pháp gây hạn sinh lý 24

2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 25

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƯỢNG HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU 28

3.1.1 Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 28

3.1.2 Chất lượng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 31

3.1.3 Đặc điểm nông học của một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu 35

3.1.4 Nhận xét về đặc điểm nông học, chất lượng hạt của các dòng lạc nghiên cứu

37 3.2 KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN SINH LÝ 40

3.2.1 Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý 40

3.2.2 Hàm lượng đường trong điều kiện gây hạn sinh lý 42

3.2.3 Mối tương quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường của các dòng lạc nghiên cứu trong giai đoạn hạt nảy mầm 43

3.2.4 Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý 44

3.2.5 Hàm lượng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý 46

3.2.6 Mối tương quan giữa hoạt độ của protease và hàm lượng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm 48

3.2.7 Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc nghiên cứu trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm 48

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN Ở LẠC 49

3.3.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 49

3.3.2 Kết quả PCR nhân gen cystatin 50

3.3.3 Kết quả tách dòng gen cystatin 51

3.3.4 Kết quả xác định trình tự nucleotide 52

3.3.5 Kết quả so sánh trình tự amino acid 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

HSP Heat shock protein

IPTG Isopropyl β – D –1 thiogalactopyranoside

LEA Late embryogenesis abundant

LTP Lipid transfer protein

MGPT Môi giới phân tử

mRNA Messenger Ribonucleic acid

Nxb Nhà xuất bản

OD Optical density

PCR Polymerase chain reaction

TAE Tris acetate EDTA

TN Thí nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009 5

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009 6

Bảng 3.1 Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc ở thế hệ thứ Năm 28

Bảng 3.2 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lượng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm 32

Bảng 3.3 Đặc điểm nông học của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Sáu 35

Bảng 3.4 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng lạc ở thế hệ thứ Sáu 37

Bảng 3.5 Hoạt độ của α - amylase trong điều kiện gây hạn sinh lý 41

Bảng 3.6 Hàm lượng đường tan trong điều kiện gây hạn sinh lý 43

Bảng 3.7 Mối tương quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm 44

Bảng 3.8 Hoạt độ của protease trong điều kiện gây hạn sinh lý 45

Bảng 3.9 Hàm lượng protein trong điều kiện gây hạn sinh lý 47

Bảng 3.10 Mối tương quan giữa hoạt độ của protease và hàm lượng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm 48

Bảng 3.11 Sự sai khác về trình tự nucleotide ở dòng R5.44, RM5.46 và ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên GenBank 55

Bảng 3.12 Độ tương đồng và độ sai khác của trình tự gen cystatin ở dòng lạc RM5.46 và R5.44 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố trên Genbank 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu tổng quát 22

Hình 2.2 Vector pTZ57R/T 26

Hình 3.1 Khu vực thí nghiệm và một số dòng nghiên cứu ngoài đồng ruộng 33

Hình 3.2 Một số dòng lạc nghiên cứu và giống lạc L18 ở thế hệ thứ Năm 34

Hình 3.3 Hình ảnh quả và hạt của các dòng lạc nghiên cứu và giống L18 ở thế hệ thứ Sáu 39

Hình 3.4 Hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phương pháp định tính 42

Hình 3.5 Hoạt độ của protease ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phương pháp định tính 46

Hình 3.6 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm và giống gốc L18 49

Hình 3.7 Kết quả nhân gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 50

Hình 3.8 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α 51

Hình 3.9 Kết quả colony – PCR ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 52

Hình 3.10 Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI 52

Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin ở dòng R5.44, RM5.46 và ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên GenBank 54

Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc đã công bố trên Genbank 56

Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid của gen cystatin ở dòng lạc R5.44 và RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố trên Genbank 57

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có lịch sử canh tác

lâu đời, có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Lạc còn là cây trồng có khảnăng thâm canh, cải tạo đất tốt, chống xói mòn và phù hợp với cơ cấu chuyển đổikinh tế nông nghiệp hiện nay [4]

Ở Việt Nam, lạc được trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam, tuy nhiêndiện tích trồng còn khá phân tán, năng suất và chất lượng chưa ổn định Một trongnhững nguyên nhân ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng lạc là do biến đổi khíhậu toàn cầu đang theo xu hướng sa mạc hóa, gây hạn hán kéo dài ở nhiều nơi Vìvậy, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu và tuyển chọn được những giống lạc có năngsuất, chất lượng tốt và có khả năng chịu hạn, thích hợp với điều kiện khí hậu và thổnhưỡng ở nước ta [4], [18], [19]

Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma được ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo cácgiống cây trồng có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môitrường Với nguồn biến dị cao (10-5 – 10-8), đa đạng về kiểu gen và kiểu hình, kỹthuật này cho phép tiến hành chọn lọc các dòng tế bào nhanh và hiệu quả hơn so vớicác phương pháp truyền thống Ngoài ra, có thể nghiên cứu ảnh hưởng của các tácnhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác nhau (gen, tế bào, mô, cơ quan nuôicấy, phân lập cây hoàn chỉnh) Tính ưu việt của kỹ thuật này đã được khẳng địnhtrên cây lúa [2]

Đối với cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2009), bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào thực vật, kết hợp gây mất nước và xử lý mô sẹo bằng chiếu xạ đã chọn lọcđược một số dòng cây xanh từ mô sẹo giống lạc L18 Các dòng lạc chọn lọcđược trồng và đánh giá qua các thế hệ đã tuyển chọn và phân loại các dòng theonhóm có triển vọng về năng suất, chất lượng hạt và có khả năng chống chịu hạn[20]

Để góp phần nghiên cứu bản chất của tính chống chịu ở thực vật, việc nghiêncứu và phân lập các gen liên quan đến tính chống chịu là rất cần thiết Qua đó, giúpcác nhà chọn giống phân tích và đánh giá hệ gen thực vật một cách nhanh chóng,

xác định sự thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử và tìm ra chỉ thị phân

tử trong việc chọn giống cây trồng có khả năng chống chịu cao [2], [11] Cystatin làchất ức chế cysteine proteinase, liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của

tế bào [31], [41], [46] Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cystatin có liênquan đến khả năng chống chịu của thực vật đối với tác động bất lợi của các nhân tốmôi trường, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [40], [42], [44], [52]

Để tiếp tục hướng nghiên cứu chọn lọc các dòng cây lạc mang các tính trạng

mong muốn, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Đánh giá một số đặc điểm nông sinh

học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (Arachis hypogaea L.) có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô vàthổi khô kết hợp chiếu xạ ưu việt về một số đặc điểm nông sinh học và khả năngchịu hạn ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu

Xác định được điểm khác biệt về trình tự gen cystatin của dòng lạc có nguồngốc từ mô sẹo chịu xử lý thổi khô và thổi khô kết hợp chiếu xạ so với giống gốc ởthế hệ thứ Năm

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của một số dòng lạc có nguồn gốc từ

mô sẹo chịu xử lý thổi khô và chiếu xạ ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu

3.2 Đánh giá chất lượng hạt của một số dòng lạc nghiên cứu thông qua xác địnhhàm lượng lipid và protein trong hạt tiềm sinh ở thế hệ thứ Năm

3.3 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng lạc nghiêncứu trong điều kiện hạn sinh lý ở thế hệ thứ Năm

3.4 Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của dòng lạc chịu hạn tốt

và dòng lạc chịu hạn kém ở thế hệ thứ Năm

1.1 CÂY LẠC

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây lạc

Cây lạc là loại cây thân thảo, thuộc học đậu (Leguminosae), chi Arachis,

phân họ cánh bướm phượng (Papillionaceae), bộ NST 2n = 40 Chi Arachis có 9

loài Loài lạc trồng là Arachis hypogaea L Loài Arachis hypogaea gồm nhiều kiểu,

dạng và biến chủng khác nhau [4]

Cây lạc có nguồn gốc từ Nam Mỹ Sau đó, lạc được đưa sang Châu Phi, rồiđến Châu Á, Châu Âu Đến nay, cây lạc được trồng ở nhiều nơi trên thế giới Ở ViệtNam lạc du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ thứ XIX [4]

Về hình thái, cây lạc có ba bộ phận chính: rễ, thân, lá

Rễ lạc là bộ rễ cọc gồm một rễ chính ăn sâu và hệ thống rễ bên rất phát triển.Giống các rễ các cây họ đậu khác, rễ cây lạc có nhiều nốt sần Các nốt sần này do vi

khuẩn Rhizobium sống cộng sinh với rễ cây lạc tạo nên và có khả năng cố định nitơ

khí quyển để bổ sung đạm cho cây và đất [19]

Thân lạc lúc còn non có hình tròn, lúc già có cạnh và rỗng ruột Trên thân cólông ngắn và nhiều lông tơ Chiều cao của thân cây lạc thay đổi tùy theo giống, kỹthuật trồng trọt và điều kiện ngoại cảnh Thân lạc có chiều cao thay đổi trong phạm

vi 19 – 80cm Hình thái thân cây là một đặc điểm để phân biệt các giống lạc [4]

Lá cây lạc thuộc loại lá kép hình lông chim Mỗi giống lạc đều có những đặcđiểm riêng về hình lá, mũi lá, màu lá, cỡ lá, hình lá kèm, tỷ lệ giữa chiều dài vớichiều rộng lá và tỷ lệ giữa cuống lá với trục lá [4], [18]

Hoa lạc thường có màu vàng da cam, đôi khi có màu trắng, hoa mọc thànhchùm từ các nách lá Cây lạc tự thụ phấn nghiêm ngặt, nhưng có khoảng 2 – 3%hiện tượng thụ phấn chéo xảy ra nhờ côn trùng [19]

Quả lạc là quả khô, có hình kén, một đầu có dính với tia, quả thắt ở giữangăn các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng, chứa từ 1 – 3 hạt Hạt lạc nằm trong quảhạt, gồm có 3 bộ phận: vỏ lụa, lá mầm và mộng [4]

Về mặt sinh thái, cây lạc chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố sinh thái: nhiệt

độ, nước, độ ẩm, ánh sáng, đất và các chất khoáng Nhiệt độ trung bình từ 25 –30°C thích hợp cho cây lạc sinh trưởng, phát triển và đạt năng suất cao Nước là yếu

tố chính đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển của cây lạc Nhu cầu về nước thayđổi theo từng thời kỳ Độ ẩm thích hợp cho cây lạc phát triển từ 60 – 70% [4]

Dựa vào thời gian sinh trưởng, cây lạc được chia làm hai loại: giống chínsớm có thời gian sinh trưởng từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian sinhtrưởng từ 140 – 160 ngày [4], [18], [19]

Lạc là loại cây trồng có giá trị về nhiều mặt: kinh tế, cải tạo đất, tăng vụ Hạtlạc là một trong những loài thực phẩm cung cấp lượng dinh dưỡng cao cho conngười Hạt lạc còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị, được sử dụng làmnguyên liệu trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, phomat Dầu lạc được sử dụngtrong y học, kỹ nghệ dầu máy, sản xuất xà phòng Các sản phẩm phụ của lạc (khôdầu lạc, thân, lá) được sử dụng làm thức cho gia súc, phân bón [4] Việc trồng lạcgóp phần cải tạo, bồi dưỡng đất, chống xói mòn Ngoài ra, lạc là nhóm cây ngắnngày, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên được sử dụng làm cây xencanh, gối vụ, làm tăng giá trị kinh tế trên một diện tích đất trồng [19]

1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của hạt lạc

Thành phần hóa sinh hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện canh tác, khíhậu, đất đai, dịch bệnh, sâu hại Hạt lạc thường chứa 40,2 – 60,7% lipid; 20,0 –33,7% protein; 2,0 – 4,3% cellulose; 6,0 – 22,0% đường; 1,8 – 4,6 % chất khoáng,

và một số loại vitamin khác nhau Trong 100g hạt lạc chứa 300 UI vitatmin B1 và

60 UI vitamin A, cung cấp 550 calo [4]

Lipid chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần vật chất khô của hạt lạc Thànhphần lipid bao gồm 80% các axit béo không bão hòa và 20% các axit béo bão hòa.Thành phần các loại axit béo trong lạc thay đổi theo giống, điều kiện canh tác.Protein trong hạt lạc có đặc tính chung của globulin, chứa chủ yếu là conarachin vàarachin Trong hạt lạc có đủ 8 loại amino acid không thay thế nên là nguồn cungcấp protein rất tốt cho con người [4], [18]

Lạc là cây lấy dầu, nên việc đánh giá chất lượng các giống lạc phụ thuộc chủyếu vào hàm lượng lipid [17] Bên cạnh đó, hàm lượng protein trong hạt cũng rấtquan trọng, không chỉ phản ánh phẩm chất giống mà còn liên quan đến khả năngchống chịu của cây [8] Tuy nhiên, lượng lipid và protein cao trong hạt lạc gây khókhăn trong quá trình bảo quản, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến phẩm chất hạt Đốivới hạt giống, việc giảm hàm lượng dầu trong hạt có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệnảy mầm và sức sống của hạt [17].

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam

Trong các cây lấy dầu, lạc có diện tích, sản lượng đứng thứ hai sau đỗtương và được trồng khắp các châu lục [4]

Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước trên thế giới và là câytrồng quan trọng đối với các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi vàNam Châu Mỹ [4], [19] Trên 90% diện tích trồng lạc tập trung ở lục địa Á phi:châu Á (60%), châu Phi (30%), châu Mỹ (5%), châu Âu (0,22%) Các nước sản xuấtlạc lớn nhất gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Xênêgan, Nigiêria và Mỹ [18] Về năng suất,

Mỹ là nước có năng suất trung bình tương đối cao, xấp xỉ 2,8 tấn/ ha, sau đóđến Trung Quốc 2,6 tấn/ha, Argentina 2 tấn/ha Trong khi đó, ở Châu Phi, năng suấtlạc chỉ đạt 0,7 - 0,8 tấn/ha Sự khác biệt về năng suất lạc do sự khác biệt về điều kiện

tự nhiên, khả năng đầu tư và trình độ ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật trong sản xuấtlạc ở các nước trên thế giới [19] Các số liệu về diện tích, năng suất, sản lượng lạctrên thế giới từ năm 2005 đến 2009 được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2005 – 2009

Chỉ tiêu/năm 2005 2006 2007 2008 2009Diện tích (triệu ha) 24,05 21,62 22,47 23,96 23,95Năng suất (tấn/ha) 1,60 1,54 1,65 1,57 1,52

Sản lượng (triệu tấn) 38,44 33,19 36,98 37,65 36,46

( Nguồn: FAOSTAT, 2009) [53]

Bảng 1.1 cho thấy sản xuất lạc trên thế giới giai đoạn 2005 - 2009 tương đối

ổn định về diện tích, sản lượng với năng suất trung bình khoảng 1,5 – 1,6 tấn/ha [53]

Ở Việt Nam, lạc là một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lựcvới khối lượng lớn và giá trị cao [19] Việt Nam đứng thứ 5 về sản lượng lạc hàngnăm ở Châu Á, sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Indonesia Trong 7 nước trồnglạc ở Đông Nam Á, Việt Nam đứng thứ 3 về diện tích trồng lạc, sau Myanmar vàIndonesia, đồng thời có khối lượng lạc xuất khẩu lớn nhất chiếm 45,13% (đạt33,800 tấn) [19]

Ở Việt Nam, cây lạc được trồng ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước vàđược chia làm 5 khu vực chính, bao gồm: Đồng bằng sông Hồng, Trung du và miềnnúi phía bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ,Đồng bằng sông Cửu Long Trong đó, khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên hải miềntrung có diện tích trồng lạc, năng suất và sản lượng cao nhất nước (năm 2008, diệntích trồng lạc của khu vực này đạt 111,2 nghìn ha, sản lượng đạt 204,0 nghìn tấn[54] Diện tích, năng suất và sản lượng lạc ở Việt Nam được cập nhật trong nhữngnăm gần đây, từ năm 2005 đến 2009 được thể hiện ở bảng 1.2 Bảng 1.2 cho thấy,diện tích gieo trồng lạc ở Việt Nam năm 2009 đạt 249,2 nghìn ha (giảm 1,08 lần sovới năm 2005), nhưng năng suất tăng 1,17 lần so với năm 2005 (đạt 2,11 tấn/ha)[53] Năng suất lạc tăng cao cho thấy Việt Nam đã ứng dụng tốt các tiến bộ kỹ thuậtvào trong sản xuất, lai tạo và tuyển chọn được những giống lạc cho năng suất cao vàphù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của Việt Nam (Trạm Xuyên, Sen Lai,V79, MD7, L02, L05, L14 ) [4], [19]

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2005 – 2009

Chỉ tiêu/năm 2005 2006 2007 2008 2009Diện tích (1000 ha) 269,6 246,7 254,5 255,3 249,2Năng suất (tấn/ha) 1,81 1,87 2,00 2,08 2,11Sản lượng (1000 tấn) 489,3 462,5 510 530,2 525,1

(Nguồn: FAOSTAT, 2009) [53]

1.2 TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

1.2.1 Hạn và tác động của hạn đến thực vật

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước của thực vật domôi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởngđến sinh trưởng và phát triển [2] Khái niệm "khô hạn" dùng để chỉ hiện tượng mấtnước của cây Hiện tượng mất nước có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của

sự thiếu nước trong môi trường, hoặc là tác động thứ cấp được gây ra bởi nhiệt

độ thấp, sự đốt nóng hay tác động của muối [2], [8]

Những loại cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối

ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn Khả năng của thực vật cóthể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn Đặctính chịu hạn của thực vật được hình thành trong quá trình tiến hóa dưới tác độngcủa chọn lọc tự nhiên [2],[11]

Ảnh hưởng của hạn trước hết là đến sự mất nước của tế bào và mô Sự thiếuhụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu Thiếu nước nhẹ chỉ ảnh hưởng đến quátrình sinh trưởng Thiếu nước nặng hơn gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh chấttheo cùng hướng với sự già hóa của tế bào, làm cho cây bị héo Khi bị khô, nguyênsinh chất bị đứt gẫy cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết [2] Hạn ảnhhưởng đến hai quá trình sinh trưởng và phát triển của cây là giai đoạn cây non vàgiai đoạn ra hoa, do đó làm giảm năng suất cây trồng [11] Phản ứng của cây đối vớihạn là sự đóng của khí khổng, giảm tỉ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp vàtăng tích lũy ABA, proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat,glutathion và sự tổng hợp protein mới [50]

Cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn tương đối ở một thời kỳ sinh trưởng nhấtđịnh Thiếu nước ở các thời kỳ khác nhau đều ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triểncủa cây lạc và làm giảm năng suất [18]

Ở thời kì nảy mầm, nước là nhân tố quan trọng thứ hai sau nhiệt độ ảnhhưởng đến thời gian nảy mầm, tỷ lệ mọc và mức độ đồng đều của hạt nảy mầm [4].Nhiệt độ thích hợp nhất từ 32 – 33oC, độ ẩm đất khoảng 70 – 80 % [4], [18]

Từ thời kỳ cây con đến thời kỳ ra hoa, cây lạc có khả năng chịu được hạnnhưng khả năng này chỉ xảy ra khi các hoạt động sinh lý mạnh mẽ như ra hoa, hìnhthành quả đã diễn ra [19] Thiếu nước trong thời kỳ ra hoa làm giảm số hoa, đợt rộkhông được hình thành, thời gian ra hoa kéo dài, tỷ lệ hoa có ích giảm do quá trìnhthụ phấn bị cản trở Tuy nhiên, nếu được tưới nước kịp thời, lượng hoa nởhàng ngày có thể được phục hồi và quá trình nở hoa trở lại bình thường [4].

Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khôtích lũy cao nên cần lượng nước lớn nhất Nếu thiếu nước trong giai đoạn này làmgiảm số quả chắc, giảm trọng lượng hạt, dẫn đến giảm năng suất [4], [19]

Đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịuhạn trên một số loại cây trồng: lúa [2], đậu tương [8], lạc [1], [10], [16]

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

Hai cơ chế bảo vệ thực tồn tại trên môi trường thiếu nước gồm cơ chế tránhmất nước và cơ chế chịu mất nước Cơ chế tránh mất nước phụ thuộc vào khả năngthích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối đa sựmất nước hoặc tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua tích lũy các chấthòa tan, các protein và axit amin nhằm duy trì lượng nước tối thiểu trong tế bào Cơchế chịu mất nước liên quan tới những thay đổi sinh hóa trong tế bào nhằm sinhtổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước [47]

Khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ Hình thái và chức năngcủa bộ rễ thường liên quan đến khả năng chịu hạn của cây trồng cạn Do đó, đặcđiểm của bộ rễ là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong việc tuyển chọn giốngcây trồng có khả năng chịu hạn Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâugiúp cho cây hút được nước ở những tầng đất sâu và cho năng suất ổn định trongđiều kiện khó khăn về nước Ở các loại cây trồng khác nhau, bộ rễ phát triển đadạng nhằm khắc phục hiện tượng thiếu nước [2], [11]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật có liên quan trựctiếp đến khả năng cạnh trạnh của tế bào rễ cây đối với đất Khi áp suất thẩm thấutăng lên giúp cho tế bào rễ cây thu nhận được những phân tử nước trong đất, giúpcho thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ [11]

Khi cây bị mất nước dần dần, chất hòa tan được tích lũy tăng dần trong tế bàochất, nhằm chống lại mất nước và tăng khả năng giữ nước của chất nguyên sinh Khiphân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn cho thấy có hiện tượng tăng lên

về hoạt độ enzyme, hàm lượng ABA hàm lượng proline, nồng độ các chất hòa tansắc tố như betain, nồng độ ion K+, các loại đường tan, axit hữu cơ đồng thời giảmphức hợp CO2, giảm tổng hợp protein và axit nucleic [2], [11], [35]

ABA là hormone thực vật có liên quan đến các quá trình sinh lý, sinh trưởng

và phát triển, đáp ứng với stress của thực vật bậc cao ABA có vai trò điều chỉnh sựtrao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước của cây và giúp cây thích nghiđược với điều kiện khô hạn Khi cây bị hạn, hàm lượng ABA trong cây tăng lêngiúp cây tăng khả năng đáp ứng với điều kiện khô hạn [11]

Thành phần hoá sinh hạt như protein tan, đường tan , enzyme… không chỉ

là cơ sở để đánh giá chất lượng hạt mà còn thể hiện khả năng chống chịu của câytrồng [2], [8]

α - amylase xúc tác quá trình phân giải tinh bột thành các phân tử có khốilượng thấp, cuối cùng thành glucose, mantose Nhiều nghiên cứu cho thấy cómối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ của α - amylase Sự giatăng hoạt độ của α - amylase, làm tăng hàm lượng đường tan trong tế bào, cung cấpcho quá trình nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng của mầm, tăng áp suất thẩm thấutrong tế bào và bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi tác động của các điều kiện cực đoan [8],[16]

Protease đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống và nhất là trong thời kỳnảy mầm của hạt Protease tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ trong hạt,cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây, tham gia vào quá trình

vi xử lý phân tử protein và hoạt hóa các enzyme Protease tham gia phân giảiprotein lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơhọc [26]

Trần Thị Phương Liên (1999) khi so sánh phổ điện di hoạt tính protease củacác giống đậu tương chịu nóng, chịu hạn khác nhau đã nhận thấy protease của cácgiống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải

hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới Xử lýnhiệt độ cao không ảnh hưởng đến protease ở một số giống chịu nóng, nhưng ảnhhưởng đến các giống chịu hạn [8].

Nghiên cứu cơ chế phân tử của tính chống chịu chủ yếu đi vào hai hướngtiếp cận chính:

- Khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan: Nghiên cứu

sự biểu hiện và chức năng của các chất, các gen tương ứng liên quan đến sự bảo vệcác enzyme, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời đào thải các chất bị biến tính cókhả năng gây độc cho tế bào khi gặp điều kiện cực đoan Những nhóm chất đượcquan tâm đến là protein sốc nhiệt (HSP), trong đó có các chất MGPT, ubiquitin,protease

- Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Nghiên cứu các chất có khả năngtạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bảo để cạnh tranh nước với môi trường xungquanh Những nhóm chất được chú ý đến gồm: ion K+, amino acid, proline, estoine,các chất đường: glucose, sucrose, fructose, mannitol Ngoài ra còn có các chất:glycine betaine, β – alanine betaine Sản phẩm của các gen liên quan đến khả năngbảo vệ của tế bào khỏi tác động của các điều kiện cực đoan [2], [8], [11]

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CHỌN DÕNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đang được xem là công cụ mới choviệc cải tạo tính chống chịu ở thực vật Quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật tạo

ra nguồn biến dị cao (10-5 - 10-8), nếu kết hợp xử lý đột biến thì tần số có thể tănglên gấp 10 lần Các biến dị soma này phong phú và đa dạng về kiểu gen và kiểuhình Vì thế có thể tiến hành chọn lọc được những dòng tế bào khác nhau về các đặcđiểm sinh lí, sinh hóa nhanh và hiệu quả hơn các phương pháp chọn giống truyềnthống Các tính trạng được chọn lọc có thể di truyền cho các thế hệ sau thông quasinh sản hữu tính và trở thành tính trạng ổn định của giống khi đáp ứng được yêucầu tạo giống Đồng thời, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho phép nghiên cứu chophép nghiên cứu tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu thôngqua nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khácnhau (gen, tế bào riêng rẽ, tế bào mô, cơ quan nuôi cấy, cây hoàn chỉnh) [2]

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu cải thiện hoặc nâng cao khảnăng chống chịu của cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào như chịu hạn lúa[14].

Adkins và đtg (1995) bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy

mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 đã chọn được dòng lúa chịu hạn có nhữngtính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và ổn định ở thế

hệ R2 [23]

Nguyễn Thị Tâm và đtg (2009) tiến hành đánh giá một số đặc điểm hóa sinhcủa các dòng lúa chọn lọc thế hệ thứ 4 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giốnglúa Khang Dân Kết quả cho thấy hàm lượng protein, đường tan, lipid của hầu hếtcác dòng chọn lọc có xu hướng tăng cao hơn so với giống gốc Tác giả đã chọn lọcđược dòng R4.05 có hàm lượng protein cao nhất và dòng R4.05 có hàm lượngđường tan đạt cao nhất Phân tích thành phần amino acid trong protein dự trữ củahạt đã xác định đuợc sự có mặt của 17 loại amino acid với hàm lượng khác nhau,bao gồm các amino acid không thay thế Các dòng chọn lọc tiếp tục được đánh giá

về khả năng chịu hạn để chọn lọc dòng ưu việt [15]

Vũ Thị Thu Thủy và đtg (2011) bằng kỹ thuật xử lý mất nước mô sẹo và gâyđột biến bằng chiếu xạ liều 2 krad kết hợp với thổi khô 9 giờ giống lạc L18 đã thuđược 167 dòng mô, từ đó tạo ra 198 dòng lạc Đánh giá các đặc điểm nông sinh họcqua 5 thế hệ, tác giả đã thu được 7 dòng có sự ổn định các tính trạng về chiều caothân chính, số quả/cây, số quả chắc/cây tốt hơn so với giống gốc Phân tích một sốđặc điểm nông học, chỉ tiêu năng suất, chất lượng hạt ở thế hệ thứ năm và sự saikhác hệ gen của 7 dòng chọn lọc đã tuyển chọn 3 dòng ưu việt về năng suất, chấtlượng hạt Các dòng ưu việt trên được tiếp tục đánh giá, theo doi về các tínhtrạng liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc [20]

Đinh Thị Phòng và đtg (2004) bằng phương pháp chọn dòng biến dị soma đãtạo được 2 dòng lúa DR1, DR2 có khả năng chịu lạnh và chịu hạn tốt Dòng DR2được công nhận là giống lúa quốc gia năm 1998 Tiếp tục sử dụng phương phápchọn dòng tế bào mang biến dị soma từ giống lúa CR203, tác giả đã chọn đượcdòng lúa DR3 có triển vọng, tính chịu hạn được cải thiện so với giống gốc CR203thông qua hàm lượng proline tăng 1,4 lần [14]

1.4 MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG

VÀ CÂY LẠC

Đặc tính chịu hạn của thực vật được hình thành trong quá trình tiến hóa dướitác động của chọn lọc tự nhiên Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lí, hóa sinh vàcấu trúc tế bào nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khácnhau, trong các giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau Điều này chứng tỏ tínhchống chịu của thực vật là một hệ đa gen, nhiều gen quy định, biểu hiện trong cácgiai đoạn phát triển khác nhau của cây Ngày nay, trên thực tế vẫn chưa tìmđược gen giữ vai trò chính quyết định tính chịu hạn, mà chỉ tìm thấy các gen liênquan đến đặc tính này [8], [11]

* Gen liên quan đến tăng cường áp suất thẩm thấu

LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn muộncủa quá trình hình thành phôi và liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào LEAđiều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín, đồng thời hạn chế sự mấtnước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra như nóng, lạnh, muốicao Mức độ phiên mã của gen LEA được điều kiển bởi ABA, độ mất nước của tếbào và áp suất thẩm thấu trong tế bào [43] Ngày nay, nhiều gen LEA đã đượcnghiên cứu, phân lập, và xác định chức năng Dramé và đtg (2007) đã phân lậpmRNA của gen LEA trên cây lạc dài 556 nucleotide [29] Hundertmark và đtg(2008) đã xác định được 51 gen mã hóa cho protein LEA từ hệ gen của câyArabidopsis và được phân loại thành 9 nhóm riêng biệt Bằng phương pháp địnhlượng Real Time PCR, các tác giả đã tìm thấy bằng chứng về sự biểu hiện của cả

51 gen LEA này ở các giai đoạn phát triển của thực vật, trong các cơ quan và các tácnhân bất lợi, hormone LEA phản ứng với ABA, nhiệt độ thấp, lạnh hoặc hạn [34]

Khi tế bào bị mất nước, proline được tích lũy nhiều trong tế bào chất làm hạnchế sự mất nước và tăng khả năng giữ nước của chất nguyên sinh Khả năng điềuchỉnh áp suất thẩm thấu của proline thể hiện ở khả năng giữ nước và lấy nước vào tếbào Proline còn có khả năng thay thế nước ở nơi xảy ra có phản ứng sinh hóa, khả

năng tương tác với lipid và protein màng, ức chế sự phá hủy của các phứcprotein [2], [11].

P5CS (pyrroline - 5 - carboxylase) là một trong những enzyme chức năng,tham gia vào quá trình tổng hợp proline Proline đóng vai trò quan trọng trong quá

trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong cơ thể thực vật Gen P5CS biểu hiện mạnh

mẽ làm tăng hàm lượng proline, có vai trò tăng cường áp suất thẩm thấu của tế bào

và cây trong điều kiện khô hạn Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã được nghiên cứu

và tách dòng ở nhiều loại cây khác nhau Nhiều dòng cây trồng đã được chuyển gen

P5CS nhằm tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi như hạn, mặn,lạnh [11]

* Gen liên quan đến khả năng bảo vệ thành tế bào

Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyểnphospholipid qua màng LTP xúc tác sự vận chuyển lipid qua màng tế bào, tham giavào cấu tạo lớp sáp, lớp biểu bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, giúp thực vật

có thể giảm mất nước, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và thích nghi với nhữngbiến đổi của môi trường Khi gặp điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tốnhư hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điềukhiển gen LTP hoạt động, tổng hợp nên protein tương ứng giúp cây tăng khả năngchống chịu và hạn chế tác động của các nhân tố bất lợi của môi trường [28], [32].Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu và đtg (2003) nhận thấy rằng hàm lượng mRNAcủa LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lượng ABAngoại bào tăng lên [37]

* Các gen liên quan đến chất bảo vệ tế bào: Môi giới phân tử, các protein sốc nhiệt (HSP).

HSP chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có ở hầu hết các loài thựcvật HSP được tổng hợp thêm trong điều kiện môi trường cực đoan như hạn, nhiệt

độ cao, muối cao Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sựphá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng chống chịu nhiệt độ cao [49].Kumar và đtg (2007) đã phân lập được mRNA của gen mã hóa HSP ở cây lạc dài

450 bp Đoạn mRNA này có kích thước 17,3 kDa, và được công bố trênGenBank với mã số DQ294615.1 [58] Đoạn mRNA của gen mã hóa protein sốcnhiệt đã được Bi và đtg (2008) phân lập thành công Đoạn mRNA này được phânlập từ hạt lạc và có kích thước 533 nucleotide (GenBank: mã số DQ889543) [59].

* Các gen mã hóa sản phẩm điều khiển quá trình phiên mã

Đây là các gen có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên

quan đến tính chịu hạn thông qua việc bám vào đoạn DNA điều kiển (cis acting

element) trên vùng khởi động (promoter) của gen và tương tác với RNApolymerase, tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chứcnăng Có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn của thực vậtnhư: DREB, bZIP, MYB Gen DREB (dehydration responsive elemen binding) ởcây lạc đã được tác giả Liu (2008) tách từ lá (GenBank: mã số FM955398) dài 687nucleotide, mã hóa phân tử protein tương ứng dài 221 amino acid [60]

Cystatin là một loại protein phổ biến trong cơ thể động vật, thực vật và visinh vật… Cystatin tham gia ức chế hoạt động của enzyme tham gia vào quá trìnhphân cắt phân tử protein là cysteine proteinase Gần đây, nhiều nghiên cứu chỉ rarằng cystatin có liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật dưới tác động bấtlợi của các nhân tố môi trường, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [31],[41], [42], [52]

1.5 CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT

1.5.1 Cysteine proteinase

Cysteine proteinase có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng và pháttriển của thực vật, sự già và chết theo chương trình của tế bào, tích lũy và huy độngprotein dự trữ trong hạt, cung cấp đạm cho sự phát triển của cây non Ngoài ra,cysteine proteinase còn liên quan đến khả năng chống chịu với những tác động bấtlợi của môi trường [31], [41]

Cysteine proteinase là enzyme tham gia phân cắt chuỗi peptide ở vị trí bêntrong mạch polypeptide (endopeptidyl hydrolase) Trung tâm hoạt động củacysteine proteinase có chữa nhóm SH (hay còn gọi là thiol, sunfuhydryl) Nhóm SH

có khả năng phản ứng cao, tham gia vào nhiều biến đổi hóa học quan trọng như ionhóa, oxyl hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, ankyl hóa Nhóm SH có vai trò quantrọng đối với hoạt động của enzyme Khi chức năng của nhóm SH bị khóa, hoạtđộng của enzyme sẽ bị ức chế [8], [31], [41].

Cysteine proteinase được kí hiệu với tiếp đầu ngữ C với hơn 40 họ vàđược xếp vào ít nhất là 6 họ chung Hầu hết các cysteine proteinase thực vật thuộc

họ papain (C1) và họ legumin (C13) Các thành viên khác của cysteine proteinasegồm: caspases (C14) và calpains (C2), ubiquitin C – terminal hydrolase (C12) vàubiquitin

– specific proteinase (C19)

[31]

Ở động vật có xương sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống phângiải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá trình trao đổichất Ở động vật không xương sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa Đối vớiđộng vật chân đốt, cysteine proteinase giữ vai trò tiêu hóa và liên quan đến hệ thầnkinh [31], [41]

Ở thực vật, cysteine proteinase được tìm thấy chủ yếu trong không bào vàthành tế bào, và vẫn chưa rõ liệu cysteine proteinase trong lục lạp có liên quan đếnquá trình thoái hóa protein trong lục lạp [31] Lindhal (1995) chỉ ra rằng cysteineliên quan đến màng thylakoid chịu trách nhiệm cho sự phân hủy trung tâm phản ứngcủa hệ thống quang hóa II ở cây rau Bina [36] Cysteine proteinase còn được tìmthấy trong môi trường ngoại bào [41]

1.5.2 Cystatin chất ức chế cysteine proteinase

Cystatin là protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase Các protein này

có liên quan về cấu trúc và chức năng với cysteine proteinase [42] Cystatin tồn tạitrong vi sinh vật, động vật [27] và thực vật [52], [22] Cystatin được mô tả lần đầutiên ở lòng trắng trứng gà và sau đó được gọi là cystatin lòng trắng trứng [27]

Các cystatin mối liên quan về mặt tiến hóa và tạo thành “siêu họ cystatin”.Cystatin được chia thành bốn họ nhỏ là stefin, cystatin, kininogen và phytocystatin.Các họ này khác nhau về trình tự tương đồng của các axit amin, số lượng liên kết

disunfide và khối lƣợng phân tử của protein [24], [31], [41].

Cystatin họ 1, còn gọi là stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc nhómcarbonhydrate trong thành phần cấu tạo Stefin có khối lượng phân tử khoảng11kDa, gồm khoảng 100 gốc axit amin [31].

Cystatin họ 2, còn gọi là cystatin, chứa khoảng 120 - 126 axit amin, khốilượng phân tử khoảng 13,4 - 14,4 kDa Cystatin họ 2 chứa 4 gốc cysteine được bảotồn tạo thành hai liên kết disulfide và hầu hết không được glycosyl hóa [31]

Cystatin họ 3, còn gọi là kininogen, là họ cystatin lớn hơn so với hai họ cònlại, có khối lượng phân tử khoảng 60 - 120 kDa [45] Kininogen gồm khoảng 355axit amin, chứa các cầu nối disulfide và được glycosyl hóa Kininogen có chức năngquan trọng trong quá trình đông máu [41]

Hầu hết các cystatin họ 1 và họ 3 đều chứa pentapeptide Gly và trình tự tương đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ 2 [25] Trình tự Phe-Ala-Val được định vị gần đầu C và dipeptide Pro-Trp ở gần đầu N, là trình tự bảothủ của cystatin họ 2 nhưng không tìm thấy ở cystatin họ 1 và họ 3 Vùngpentapeptide và dipeptide có vai trò quan trọng trong việc gắn kết với cysteineproteinase [45]

Gln-Val-Val-Ala-Cystatin họ 4 (còn gọi là phytocystatin) [45], [46] gồm hầu hết các chất ứcchế cysteine proteinase của thực vật [22], [40] Phytocystatin có độ tương đồng caovới các thành viên của họ cystatin, nhưng không chứa cầu nối disulfide và các gốccysteine giống stefin [48]

Phytocystatin được tìm thấy ở thực vật một lá mầm như lúa [22], ngô [40] vàthực vật hai lá mầm như đậu tương [64], cây dẻ [42]

Phytocystatin là chất ức chế mạnh của cysteine proteinases (hay CPsproteinase) ở thực vật [39] Cystatin đóng vai trò như cơ chất để xâm nhập vàotrung tâm hoạt động của enzyme cysteine proteinase và ngăn chặn sự đi vào của các

cơ chất protein khác Về cấu trúc, phytocystatin là chất ức chế cạnh tranh thuộc họenzyme phân hủy (hay Cys protease) Phytocysatatin gồm có các vùng bảo thủ caosau: gốc Gly ở gần đầu N, vùng trung tâm Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (Xaa là axit aminbất kỳ) và cấu trúc kẹp tóc Pro-Trp bậc 2 gần đầu C [31] Các vùng bảo thủ cao này

là vị trí tương tác giữa phytocystatin và cysteine proteinase [24] Ngoài ra, cácphytocystatin chứa thêm so với cystatin động vật một trình tự bảo thủ [LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[HYFQ]-N ở đoạn xoắn alpha vùng đầu aminocủa chuỗi protein [24], [46] Cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) chứa bavùng tương tác với cysteine proteinase gồm: gốc Gly47, vị trí phản ứng Gln90Val

Hầu hết các phytocystatin là các protein nhỏ, trong khoảng kích thước daođộng từ 12 đến 85 kDa và không chứa liên kết disulphide [41] Theo Marcia (2008)[38] và Martinez (2007) [39] dựa vào kích thước phân tử chia phytocystatin thành 3nhóm khác biệt: nhóm 1 và nhóm 2 có kích thước 12 đến 16 kDa, không có cầudisunfide và vùng glycosilation giả định, gen mã hóa cũng không có intron hoặc có

1 intron ở đoạn giữa LARFAV và QxVxQ (x là axit amin bất kỳ) Nhóm thứ 3 cókhối lượng phân tử cao hơn (23kDa) do đầu C mở rộng được chứng minh là có liênquan đến sự ức chế legumains và có 3 intron trong gen mã hóa [39], [40] Ngoài ra,còn có các đa cystatin có kích thước khoảng 80kDa, chứa 8 vùng cystatin cũng đãđược tìm thấy [48]

Phytocystatin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng của tế bào,bao gồm quá trình phát sinh cơ quan; điều chỉnh quả trình phân giải protein tronggiai đoạn tiềm sinh và nảy mầm của hạt; bảo vệ thực vật bằng cách ngăn ngừa hoạtđộng của các protease ngoại sinh của côn trùng, giun tròn; sự già và chết theochương trình của tế bào [41]

Phytocystatin tham gia kiểm soát cysteine proteinase trong suốt quá trình

chín và nảy mầm của hạt Nhiều nghiên cứu về biểu hiện gen đã chỉ ra mối tương

quan giữa việc sinh tổng hợp và tích trữ cystatin trong các cơ quan dự trữ và sự suygiảm hoạt động của các cysteine proteinase [31] Ở cây lúa, Abe và đtg (1991) đãphát hiện có sự tích lũy của mRNA cystatin trong giai đoạn phát triển của hạt haituần sau khi nở hoa và một tuần trước quá trình tạo glutelin Oryzacystatin đượcxem là chất ức chế cysteine proteinase oryzain α, β, γ được sinh ra trong quá trìnhnảy mầm của hạt [22].

Phytocystatin còn được mô tả như là chất điều hòa cyssteine proteinase, cókhả năng ức chế hoạt động phân giải protein nội sinh trong quá trình nảy mầm củahạt và sinh trưởng của cây non [31], [33], [41] Hwang và đtg (2009) đã phân lậpđược cDNA mã hóa cho phytocystatin của Arabidopsis thaliana (hay AtCYS6), cókhối lượng phân tử 22,4 kDa và chứa đầu C kéo dài Protein AtCYS6 tích lũy tronghạt, cây non và ở hoa và biểu hiện tăng cường khi phản ứng với ABA (làphytohormone ức chế quá trình nảy mầm) Khi nghiên cứu biểu hiện của câychuyển gen chứa cấu trúc AtCYS6 promoter-β-glucuronidase, nhóm tác giả nhậnthấy AtCYS6 ức chế hoạt động của cysteine proteinases, ức chế hoạt động tích trữcủa cysteine proteinase trong hạt Qua đó, các tác giả đã đề xuất là biểu hiện củaAtCYS6 được tăng cường bởi ABA và ức chế hoạt động tích trữ cysteine proteinasenhằm kiểm soát tốc độ nảy mầm và phát triển của cây con bằng cách [33]

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytocystatin còn tham gia vào quátrình đáp ứng lại các căng thẳng phi sinh học của môi trường [40], [42], [44], [52].Biểu hiện của phytocystatin thường trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các phariêng rẽ của các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Pernas và đtg(2000) chỉ ra rằng cystatin của hạt dẻ biểu hiện mạnh trong rễ và lá non khi chịu tácđộng bất lợi của lạnh và muối và ở rễ khi chịu tác động của nhiệt độ cao [42].Massonneau và đtg (2005) nghiên cứu gen cystatin ở ngô cho thấy biểu hiện củagen này trong đáp ứng với tác động của lạnh và hạn [40] Gen cystatin ở cây

Arabidopsis biểu hiện tăng cường trong phản ứng với tác động của muối và hạnhán, oxy hóa và tác động của lạnh, ánh sáng và bị tổn thương [52] Rodriguez và đtg(2007) phân tích biểu hiện của cystatin ở cây rau giền (còn gọi là AhCPI) cho thấy:

AhCPI biểu hiện chủ yếu ở hạt trưởng thành và giảm dần trong quá trình nảy mầm.Trong mô sinh dưỡng, AhCPI biểu hiện trong rễ mầm và trụ dưới lá mầm của hạtnảy mầm, trong thân và rễ của cây con Biểu hiện của AhCPI trong rễ và thân tăngdần trong đáp ứng với sự thiếu hụt nước, tác động của mặn, lạnh và nóng Nhiệt độcao làm cho sản phẩm phiên mã của AhCPI được tích tụ nhanh chóng trong thờigian ngắn ở lá [44].

Như vậy, nghiên cứu gen cystatin và cysteine proteinase đã mở ra hướngnghiên cứu mới trong việc ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng sức chống chịucủa cây trồng bằng cách tạo thực vật chuyển gen chứa gen cystatin, ức chế sự tíchlũy proteinase trong cây

1.5.3 Gen mã hóa cystatin ở thực vật và cây lạc

Hiện nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân lập, biểu hiện gencystatin ở nhiều loài cây trồng khác nhau

Cystatin có nguồn gốc thực vật được phát hiện đầu tiên ở lúa gạo (Oryza

sativa Japonica Group) là Oryzacystatin [22] Abe và đtg (1987) đã phân lập đượcđoạn cDNA mã hoá cho oryzacystatin gồm có 598 cặp base Gen quy địnhoryzacystatin phiên mã chuỗi mRNA dài 700 nucleotide, mã hóa cho 102 axit amin.Oryzacystatin có mối quan hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắngtrứng Do không có liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide được tạo thành vởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc 71-61), khối lượng phân tử khoảng 11,5 kDa với 102 gốc axitamin, nên oryzacystatin được xếp vào cystatin nhóm 1 Tuy nhiên, trình tự củaoryzacystatin giống 30% so với cystatin họ 2, chúng chứa vùng bảo thủ Phe-Ala-Val (gốc thứ 29-31) và Pro-Trp-Met (gốc thứ 83-85), nên oryzacystatin cũng có thếxếp vào cystatin nhóm 2 [22]

Misaka và đtg (1996) đã phân lập thành công cDNA của gen mã hóa cystatin

từ cây đậu tương (Glycine max) Đoạn cDNA này được công bố trên GenBank với

mã số BAA19608, có kích thước 1175 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide dài

245 axit amin [64]

Yang và đtg (2005) phân lập cDNA mã hóa cho Tarocystatin (còn gọi là

CeCPI) từ thân cây khoai sọ (Colocasia esculenta) Đoạn cDNA này dài 1008 bp,

mã hóa chuỗi polypeptide dài 206 amino acid với kích thước 29 kDa Trình tự nàychứa motif bảo thủ Gln-Val-Val-Ser-Gly của chất ức chế cysteine proteinase vàtrình tự tương đồng LARFAV của phytocystatin Tarocystatin thuộc nhóm 2 củaphân họ cystatin thực vật [51]

Rodriguez và đtg (2007), phân lập thành công cDNA mã hóa cho cystatin

(còn gọi là AhCPI) từ hạt non cây rau giền (Armanthus hypochondriacus) Đoạn

cDNA dài 1016 bp, khung đọc mở dài 741 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide dài

247 axit amin AhCPI bao gồm 1 peptide tín hiệu N-terminal, vùng Gly, motif PW(Pro-Trp) có tính bảo thủ, trình tự LARFAV của phytocystatin và vị trí phản ứngGln-Val-Val-Ala-Gly Trình tự axit amin được giả định của AhCPI có tínhtương đồng với các cystatin ở các thực vật khác [44]

Chu Hoàng Mậu và đtg (2008) phân lập được gen cystatin ở cây đậu xanh

Vigna radiata L Wilzek từ DNA hệ gen dài 1115 nucleotide, gồm 2 exon và 1

intron, đoạn mã hoá dài 267 nucleotit mã hoá chuỗi polipeptide dài 88 axit amin.Tác giả đã không tìm thấy được sự sai khác khi so sánh gen cystatin đậu xanh phânlập được với các trình tự công bố trên GenBank [12]

Gen cystatin cây lạc (Arachis hypogaea L.) được Yan và đtg (2004) phân lập

từ mRNA và công bố trên GenBank với mã số mã số AY722693 [58] Năm 2009,

2011, Vũ Thị Thu Thủy và đtg đã phân lập thành công gen cystatin của giống lạcL18 (GenBank, mã số FN811133) [61] và L23 (GenBank, mã số FR691053.1) [63].Gen cystatin lạc có kích thước 461 bp, gồm 2 exon và 1 intron, đoạn mã hóa dài 297nucleotide, mã hóa cho phân tử protein dài 98 axit amin [21]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Trên cơ sở chọn dòng chịu hạn của giống lạc L18, chúng tôi tiếp tục theodõi, đánh giá một số dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm và thế hệ thứ Sáu Sửdụng hạt của các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Tư có nguồn gốc từ mô sẹo chịumất nước và xử lý chiếu xạ kết hợp gây mất nước của giống lạc L18, trong đó:

- Giống lạc L18 (đối chứng) có nguồn gốc từ Trung Quốc, do Trung tâmNghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm thuộc ViệnKhoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp L18 là giống lạc chịu thâm canh cao, cókhả năng kháng sâu cao, kháng bệnh hại lá, kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trungbình và khả năng chịu hạn kém

- 4 dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ 2Krad kết hợp với xử lýgây mất nước liên tục trong 9 giờ: thế hệ thứ Năm - kí hiệu: RM5.46; RM5.47; RM5-

- PCR master mix; Cặp mồi CysAra F/CysAra R tổng hợp tại hãng DNAanpha; Bộ kit thôi gel và bộ kit tách plasmid (hãng Bioneer); Các enzyme giới hạn

EcoRI, BamHI do phòng Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.

2.1.2.2 Thiết bị

Máy li tâm (Eppendorf, Đức); Pipette (Thermo Labsystem, Phần Lan); Máyquang phổ Biomate3 (Thermo Scientific, Mỹ); Máy PCR Amplied Biosystems(USA/Singapore); Máy DNA sequencing ABI Prism 3130 (USA/Japan)

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Các chỉ tiêu nông sinh học và năng suất được thực hiện tổ Rừng Vầu,phường Quang Vinh, thành phố Thái Nguyên

- Các chỉ tiêu hóa sinh và sinh học phân tử được thực hiện tại phòng thínghiệm Hóa sinh, phòng thí nghiệm Di truyền - Khoa Sinh – KTNN thuộc TrườngĐại học Sư phạm Thái Nguyên; Bộ môn Sinh học phân tử thuộc Viện Khoa học sựsống, Đại học Thái nguyên; Xác định trình tự gen cystatin tại Viện Công nghệ Sinhhọc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mô hình nghiên cứu tổng quát

Các dòng lạc nghiên cứu ở thế hệ thứ Năm

Đánh giá nông sinh học, chất lượng hạt Đánh giá khả năng chịu hạn

Phân nhóm theo khả năng chịu hạn

Phân lập và so sánh trình tự gen cystatin của một số

dòng lạc với giống lạc gốc L18

Đánh giá nông sinh học các dòng lạc nghiên cứu thế

hệ thứ Sáu

Giới thiệu dòng ưu việt

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu tổng quát

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng

Nghiên cứu đồng ruộng được thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn [55]

Các dòng lạc nghiên cứu và giống đối chứng được trồng riêng trong cùngmột điều kiện và chế độ chăm sóc Các dòng lạc nghiên cứu được trồng theo hàng,chia ô, gắn nhãn để tiện cho việc theo dõi và lấy số liệu

Thời vụ: Các dòng lạc nghiên cứu thế hệ thứ Năm được trồng vào vụ thuđông 2010 (từ 8/2010 – 12/2010), thế hệ thứ Sáu được trồng vào vụ xuân 2011 (từ2/2011 – 7/2011)

Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học ở giai đoạn thu hoạch của các dòng

2.2.3.2 Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein tan xác định theo phương pháp Lowry được mô tảtrong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và đtg (1998) [3] Dựa vào cường độ màuxanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden -photphovonphramat (thuốc thử Folin – Ciocalteau) để xác định khối lượngprotein Chiết protein bằng đệm photphat citrat (pH=10), để qua đêm ở 4oC, ly tâm12,000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy dịch Đo hấp phụ quang phổ trên máy

UV ở bước sóng 750nm với thuốc thử Folin – Ciocalteau

2.2.4 Khả năng chịu hạn của các dòng lạc được đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng phương pháp gây hạn sinh lý

2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm nước 2 giờ, sau đó ủ ẩm bằng dung dịchsorbitol 7% Hạt nảy mầm sau các khoảng thời gian ủ 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9ngày được lấy để xác định hoạt độ của α – amylase, hàm lượng đường khử, hoạt độcủa protease, hàm lượng protein tan Đối chứng là hạt lạc được ủ bằng nước cất,không chứa sorbitol 7%

2.2.4.2 Xác định hoạt độ của α - amylase

Sử dụng đệm photphat 0,2M (pH=6,8) để chiết α - amylase Hoạt độ củaenzyme được xác định thông qua lượng tinh bột bị thủy phân ở 30 oC trong 30phút dựa vào đồ thị chuẩn tinh bột với giá trị OD đo ở bước sóng 560nm [5]

Định tính hoạt độ của α - amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạchvới cơ chất là tinh bột 1%

2.2.4.3 Xác định hàm lượng đường tan bằng phương pháp vi phân tích

Xác định hàm lượng đường tan dựa trên nguyên tắc: Trong môi trường kiềm,đường khử kaliferixianua thành kaliferoxianua Với sự có mặt của gelatin,kaliferoxianua kết hợp với sắt sunphat axit tạo thành phức chất màu xanh bền Hỗnhợp thu được đo trên máy ở bước sóng 585 nm [3]

2.2.4.4 Xác định hoạt độ của enzyme protease

Hoạt độ protease xác định bằng phương pháp Anson cải tiến theo mô tả củaNguyễn Văn Mùi (2001) [13] Sử dụng đệm photphat pH=6,5 để chiết protease Xácđịnh hoạt độ của enzyme trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo ra trong phản ứng bằngphản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau Hoạt độ enzyme được tính dựa trên

đồ thị đường chuẩn xây dựng bằng tyrozin với giá trị OD đo ở bước sóng 750nm

Định tính hoạt độ của protease: Tiến hành tương tự như định tính hoạt độ amylase, cơ chất là cazein 1%

α-2.2.4.5 Xác định hàm lượng protein tan

Hàm lượng protein tan ở giai đoạn hạt nảy mầm được xác định như mô tả ởmục 2.2.3.2