Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm a/h5n1 clade 2.3.2.1b phân lập ở việt nam

Số liệu phân tích các mẫu vi rút từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám sát vi rút cúm cho thấy nhánh vi rút mới clade 2.3.2 của vi rút cúm A/H5N1 ñã biến ñổi và phát triển thành 3 nh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

ðÀO THANH VÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B

PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI , 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

ðÀO THANH VÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B

PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGUYỄN VIẾT KHÔNG

2 PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN

HÀ NỘI , 2013

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan: Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này trung thực, do tôi tiến hành nghiên cứu và thu thập, có sự hợp tác, giúp ựỡ của các ựồng nghiệp và chưa từng ựược sử dụng ựể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ựoan: Mọi sự giúp ựỡ cho việc thực hiện ựề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án ựều ựược cảm ơn Các thông tin trắch dẫn trong luận án ựều chắnh xác và ựược nêu rõ nguồn gốc

Hà nội, tháng 11 năm 2013

Học viên

đào Thanh Vân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS TS Nguyễn Viết Không, Phó viện trưởng Viện Thú y, trưởng bộ môn Siêu Vi trùng - Viện Thú y và PGS TS Nguyễn Bá Hiên - trưởng bộ môn

Vi sinh vật Ờ Truyền nhiễm, khoa Thú y Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà nội,

là những người thầy ựã tận tình hướng dẫn và giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Lãnh ựạo và các cán bộ của Viện Thú y, các bạn ựồng nghiệp của bộ môn Siêu Vi trùng Viện Thú y ựã tạo ựiều kiện thuận lợi về thời gian và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành ựề tài nghiên cứu của mình; các nghiên cứu sinh tại Viện Thú Y ựã chia sẻ thông tin và hợp tác nghiên cứu

Tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật Ờ Truyền nhiễm, khoa Thú y Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà nội, ựã giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Ban Giám hiệu, Viện đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú Trường đại học Nông nghiệp Hà nội ựã tạo ựiều kiện cho tôi ựược theo học chương trình ựào tạo thạc sĩ tại trường

y-Gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp ựã nhiệt tình giúp ựỡ, ựộng viên tôi trong quá trình thực hiện, hoàn thành nội dung nghiên cứu và bản luận văn này

Hà Nội, tháng 11 năm 2013

Học viên

đào Thanh Vân

MỤC LỤC

1.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 4

1.2.1 ðặc ñiểm phân loại hình thái và cấu trúc 5 1.2.2 ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A 7 1.2.3 Các phương thức biến ñổi kháng nguyên 9

1.3 Tiến hóa và hình thành genotype của vi rút cúm gia cầm 12

1.3.3 Khả năng thích ứng ña vật chủ của vi rút cúm A/H5N1 17

1.5 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 19 1.5.1 Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm 19

1.6 Tình hình dịch và nghiên cứu về cúm gia cầm ở Việt Nam 20

1.6.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm trong nước 24

2.4.1 Phương pháp phân lập vi rút trên phôi trứng gà 30 2.4.2 Phương pháp tiếp ñời (hồi phục) vi rút chủng ñã phân lập 31

2.4.10 Phương pháp phân tích trình tự nucleotide và cây phả hệ 37

3.1 Giám ñịnh ñặc tính vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân lập ñược 39 3.1.1 Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân lập ñược

39

3.1.2 ðặc tính di truyền (gene H5) của các chủng vi rút phân lập 40 3.1.3 ðặc tính nuôi cấy trên phôi trứng gà 42

3.2.1 Chỉ số EID50 của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 44

3.2.2 ðặc tính nhân lên trên tế bào MDCK của các chủng vi rút phân lập

47

3.2.3 Kết quả xác ñịnh chỉ số IVPI của các chủng vi rút phân lập 48 3.2.4 Trình tự axit amin tại cleavage site của chủng phân lập 50 3.3 ðặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút clade 2.3.2.1B 51 3.4 ðộc lực của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54 3.4.1 Kết quả xác ñịnh LD50 của chủng A/Duck/VNBN/06/12 54 3.4.2 Tính ổn ñịnh ELD50 và LD50 của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 55

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.3 : Bảng tính EID50, ELD50 /TCID50 theo Reed-Meunch 34

Bảng 3.1 : Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 39 Bảng 3.2 : Hiệu giá HA của nước trứng gây nhiễm vi rút cúm 43 Bảng 3.3 : Chỉ số EID50 và MDT của vi rút cúm trên phôi trứng 44 Bảng 3.4 : Chỉ số TCID50 của các chủng vi rút cúm trên tế bào MDCK 47 Bảng 3.5 : Chỉ số IVPI của 2 chủng vi rút phân lập 49 Bảng 3.6 : Trình tự Amino acid tại Cleavage site 50 Bảng 3.7 : Chỉ số HI miễn dịch chéo giữa các chủng vi rút phân lập 51 Bảng 3.8 : LD50 của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54 Bảng 3.9 : ELD50 của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 55 Bảng 3.10: LD50 của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên bề mặt vi rút (Stubb 1965) 8 Hình 1.3 Cây phả hệ dựa trên gene HA vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao 14 Hình 1.4 Tiến hóa của các clade vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian 16 Hình 1.5 Sự xuất hiện các clade H5N1 ở Việt Nam (Hui et al., 2008) 26 Hình 3.1 Phả hệ vi rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1 41 Hình 3.2 Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của các vi rút phân lập 43 Hình 3.3.Tương quan (C) của chỉ số EID50 (A) và MDT (B) của các chủng

vi rút phân lập

45

Hình 3.4 Tương quan giữa chỉ số EID50 và TCID50 của vi rút cúm A 48 Hình 3.5 ELD50 và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 56 Hình 3.6 LD50 và MDT trên gà của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 57 Hình 3.7 Biến ñộng ELD50, LD50 và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi

trứng gà

58

EID50 Embryo Infectious Dose 50%

FAO Food and Agriculture Organisation

HI Haemaglutination Inhibition

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza

IVPI Intravenous Pathogenicity Index

LD50 Leathal Dose 50%

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza

MDCK Mardine Darby Canine Kidney

MDEF Muscovy Duck Embryo Fibroblast

MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis

NS Non-strutural protein

OIE Office International des Epizooties

PA Polymerase acid protein 1

PB1 Polymerase basic protein 1

PB2 Polymerase basic protein 2

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50%

WHO World Health Organisation

MỞ ðẦU

Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao do vi rút cúm A/H5N1 xảy ra ở Việt Nam cuối năm 2003 ñã gây ra những hậu quả nghiêm trọng ñến ñời sống xã hội, làm giảm tăng trưởng kinh tế quốc dân và ảnh hưởng ñến sức khỏe con người Hàng triệu gia cầm ñã bị thiêu hủy, các vụ dịch cúm gia cầm ñã gây ra những ñình trệ và thiệt hại lớn về kinh tế ðầu năm 2004, những ca cúm gia cầm ở người ñã ñược phát hiện tại Việt Nam và Thái Lan, sau ñó ñến năm 2005, lần lượt ñược phát hiện tại Campuchia, Trung Quốc, Indonesia và Thổ Nhĩ Kỳ Vi rút cúm gia cầm hiện nay ñã lan truyền rộng khắp các quốc gia và có nguy cơ tồn tại dai dẳng với các biến chủng mới xuất hiện Nguy cơ dịch cúm gia cầm tái bùng phát và người nhiễm vi rút cúm gia cầm vẫn luôn tồn tại

Vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà còn rất nguy hiểm ñối với con người Từ năm 2003 cho ñến nay, thế giới ñã ghi nhận vi rút cúm gia cầm ñã gây nhiễm lên người ở 15 nước, với 607 ca bệnh và

358 người ñã chết (WHO, 7/2012)

Vi rút cúm A/H5N1 có ñặc tính biến chủng rất nhanh ðến nay ñã có nhiều biến chủng vi rút A/H5N1 ñã ñược phát hiện và phân lập ở nhiều nước khác nhau từ châu Á sang châu Âu ðặc biệt ở Việt Nam, chúng ta cũng ñã phát hiện ñược nhiều chủng vi rút A/H5N1 khác nhau ñược phân loại vào các nhánh (clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1A, clade 2.3.2.1B, clade 7…(Cục Thú y, 2013) Qua theo dõi phân bố về thời gian của các clade vi rút cúm A/H5N1 cho thấy: Clade 1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2003 ñến nay; clade 2.3.4 xuất hiện từ năm 2007 ñến năm 2010; clade 2.3.2 xuất hiện trong năm 2006 sau ñó không xuất hiện và tái xuất hiện trong năm 2010 cho ñến nay Số liệu phân tích các mẫu vi rút từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám sát vi rút cúm cho thấy nhánh vi rút mới (clade 2.3.2) của vi rút cúm A/H5N1 ñã biến ñổi và phát triển thành 3 nhánh phụ có sự khác biệt lớn về kháng nguyên Nhánh phụ 1 (gọi là 2.3.2.1A) lưu hành rộng rãi ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, Duyên Hải, miền Trung và Tây Nguyên; nhánh phụ 2 (2.3.2.1B) xuất hiện tại

Nam ðịnh, Thái Bình, sau ñó lần lượt có mặt ở Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên và Nghệ An Sau khi chúng tôi khởi ñộng nghiên cứu này, nhánh phụ thứ 3 (2.3.2.1C) xuất hiện tại các tỉnh ở phía Bắc và dần dần thay thế các nhánh phụ 2.3.2.1 trước ñây

ðược sự ñồng ý của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và Viện Thú Y, tại thời ñiểm tháng 6/2012, chúng tôi tiến hành ñề tài:

“Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 clade

2.3.2.1B phân lập ở Việt Nam”

• Mục tiêu của ñề tài

Hiểu biết rõ hơn về các ñặc ñiểm sinh học của vi rút cúm gia cầm clade phổ biến nhất (clade 2.3.2.1B) ñang lưu hành ñể có thể ñề xuất một chủng vi rút chuẩn sử dụng trong nghiên cứu kiểm ñịnh hiệu quả phòng bệnh của văc xin, góp phần vào công tác phòng chống dịch cúm gia cầm ở nước ta

• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin ñể hiểu biết rõ hơn về một số ñặc tính sinh học của vi rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1B (bao gồm các ñặc tính về di truyền, phát sinh loài, ñặc tính kháng nguyên và ñặc biệt là về ñộc lực của vi rút)

Sản phẩm chủng chuẩn của nghiên cứu có thể ñược ñề xuất ñể sử dụng trong công tác kiểm nghiệm và khảo nghiệm các văc xin phòng cúm gia cầm do chủng thuộc clade 2.3.2.1 gây ra

CHƯƠNG I

1.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm

1.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm (avian influenza), là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi

vi rút cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtype khác nhau Bệnh lúc ñầu có tên dịch tả gà (Fowl plague) (Stubb, 1965), từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 tên bệnh ñược gọi là bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly Pathogenic Avian Influenza viết tắt là HPAI: vi rút cúm type A có ñộc lực cao) (Beard C.W., 1998) Bệnh cúm gia cầm HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao Các chủng vi rút gây dịch cúm gia cầm lớn chủ yếu có genotype loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loại chim Người tuy nhiễm vi rút cúm gia cầm mang tính cá thể cảm thụ nhưng sự biến ñổi ñặc tính loài cảm thụ luôn có nguy cơ hình thành ñại dịch cúm

ở người làm cho bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết

1.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate ñã mô tả về bệnh cúm Năm

1680 một vụ ñại dịch cúm ñược mô tả chi tiết và từ ñó ñến nay ñã xảy ra 31 vụ ñại dịch ở diện rộng trên thế giới Ở người, trong hơn 100 năm qua có 4 vụ ñại dịch cúm xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

Năm 1878 ở Italy ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở ñàn gia cầm và ñược gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), bệnh lần ñầu tiên ñược Porroncito mô tả (Perroncito E., 1878) Năm 1901, Centanni và Savunozzi phát hiện căn bệnh là siêu vi trùng qua lọc (Filterable agent) (Centanni E and Savonuzzi E, 1901), (Stubs E.L, 1943)

Năm 1955 Achafer ựã xác ựịnh ựược vi rút thuộc nhóm cúm type A (Schảfer W., 1878) dựa vào kháng nguyên bề mặt, các vi rút A/H7N1 và A/H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận đông (Beard C.W, 1998), (Lupiani and Reddy, 2009)

1.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới

Năm 1963, vi rút cúm type A ựược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do thủy cầm di trú lây cho gà (sau ựó ngày càng có nhiều bằng chứng chứng tỏ chim hoang dã là vật mang và truyền bệnh cho gia cầm nuôi ựặc biệt là các subtype H5

và H7 (Lupiani and Reddy, 2009) Cuối thập kỷ 60, phân type A/H1N1 thấy ở

lợn (Iftimovici, Iacobescu et al., 1979), (Nerome, Ishida et al., 1982a), (Nerome, Ishida et al., 1982b) và gà tây (Hinshaw, Alexander et al., 1984), (Aymard, Douglas et al., 1985), tạo nên khả năng vi rút cúm ở ựộng vật có vú có thể lây

nhiễm và gây bệnh cho gia cầm Vi rút cúm type A/ H1N1 ở lợn truyền cho gà

tây và vi rút phân type A/H1N1 ở vịt truyền cho lợn (Wright, Kawaoka et al., 1992), (Webster, Wright et al., 1993), (Shu, Lin et al., 1994), (Munster and

Fouchier 2009)

Năm 1971, Beard ựã mô tả chi tiết vi rút gây bệnh và ựặc ựiểm bệnh lý lâm sàng của gà và gà tây nhiễm A/H7N1 (Beard and Easterday, 1973) Từ năm 1960-1979 bệnh lần lượt ựược báo cáo ở Canada, Mehico, Achentina, Braxin, Nam Phi, Ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kông, Nhật Bản, các nước khu

vực Trung Cận đông, liên hiệp Anh và Liên Xô (Capua, Mutinelli et al., 2002;

Senne, 2000), (Yee, Novick et al., 2011) Tại Ireland 270 nghìn vịt tuy không có

triệu chứng lâm sàng nhưng ựã bị tiêu hủy do phân lập ựược vi rút cúm (HPAI) (Alexander, 2003)

Năm 1986 dịch cúm gà do chủng H5N2 xảy ra tại bang Victoria, Australia (Senne, 2003)

Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gà do vi rút cúm A/H5N1, ựồng thời gây tử vong cho con người, toàn bộ ựàn gia cầm của lãnh thổ này ựã bị tiêu hủy Dịch cúm gia cầm Hồng Kông năm 1997 ựánh dấu lần ựầu tiên vi rút cúm gia cầm ựã vượt Ộhàng rào loàiỢ, 18 người nhiễm bệnh, trong ựó có 6 người chết

(Wu, Chen et al., 2008)

Năm 2003, ở Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mô lớn do chủng vi rút A/H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu hủy, 83 người lây nhiễm và 1 người chết,

gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng (Koopmans, Wilbrink et al., 2004)

Dịch xảy ra gần như ựồng thời ở 11 quốc gia ở châu Á: Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia, Trung Quốc, Hồng Kông, đài Loan, Pakistan và Việt Nam Sau ựó, dịch tái bùng phát trở lại ở nhiều nước châu Á, lây lan nhanh chóng sang nhiều nước châu Âu và châu Phi ( Phạm Sỹ Lăng, 2004) Tắnh ựến tháng 4-2012 ựã có tổng số 55 nước, vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm, thiệt hại trên 250 triệu gia cầm Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 7/2012), từ năm 2003 ựến nay có 607 người nhiễm bệnh tại 15 quốc gia, trong ựó

có 358 trường hợp tử vong

1.2 đặc ựiểm sinh học của vi rút cúm type A

1.2.1 đặc ựiểm phân loại hình thái và cấu trúc

ñoạn (6-8) mỗi phân ñoạn là một gene chịu trách nhiệm mã hóa cho một ñến một vài protein của vi rút, với tổng ñộ dài từ 10.000-15.000 nucleotit (tùy loại vi rút) Hình thái cấu trúc của vi rút cúm A ñược mô phỏng như ở hình 1.1

Hình 1.1 Mô phỏng cấu trúc của vi rút cúm

Hạt vi rút (virion) có cấu trúc hình khối, ñôi khi có dạng hình khối kéo dài, ñường kính khoảng 80-120 nm, có khối lượng khoảng 250 triệu dalton

Vỏ vi rút có bản chất protein có nguồn gốc từ tế bào chủ, chủ yếu bao gồm các glycoprotein, tạo thành những gai, mấu có ñộ dài 10-14 nm, ñường kính 4-6

nm

Phân bố trên bề mặt của vi rút là Haemagglutinin (HA) gây ngưng kết hồng cầu và một loại protein - enzym phá hủy thụ thể của vi rút có tên gọi Neuraminidae (NA)

Nucleocapsid protein bao bọc lõi vi rút là tập hợp của nhiều protein phân ñoạn, cấu trúc ñối xứng xoắn, kích thước 130-150 nm Lõi vi rút có cấu trúc là axit Ribonucleic sợi âm ở dạng ñơn, tổng ñộ dài 13.500 nucleotit chứa 8 phân ñoạn mã hóa cho 10 loại protein khác nhau: HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2,

PA, NS1, NS2

- Phân ñoạn 1-3: mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein có chức năng là enzym polymerase ñể tổng hợp axit Ribonucleic của vi rút

- Phân ñoạn 4: mã hóa cho protein Haemagglutinin (HA) có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào làm hợp nhất

vỏ vi rút với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút HA

là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn HA0 Trình tự axit amin mang tính ñặc thù cho ñặc tính kháng nguyên và tạo khung cho các motyf ðến nay, có 16 motif ñặc trưng cho subtype H (H1-H16) Thành phần và trình tự axit amin tại HA0 có tính chất quyết ñịnh ñộc lực của vi

rút (Bosch, Garten et al 1981), (Keawcharoen, Amonsin et al., 2005), (Gambotto, Barratt-Boyes et al., 2008), (Zhang, Sun et al., 2012)

- Phân ñoạn 5: mã hóa cho Nucleoprotein (NP) một loại phosphoryl protein mang tính kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm (Group-Specific), có chức năng bám ARN tạo cấu trúc lõi vi rút (Ribonucleo protein) (Nguyễn Tiến Dũng

- Phân ñoạn 8 : Có ñộ dài ổn ñịnh (890 nucleotit) mã hóa cho 2 tiểu phần protein phi cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp

với M1, kích thích phiên mã, và kháng interferon (Sekellick, Carra et al., 2000), (Zhou, Fu et al., 2007), (Zhu, Yang et al., 2008)

1.2.2 ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A

Vi rút cúm type A ñược xác ñịnh subtype dựa trên cơ sở kháng nguyên bề mặt Haemagglutinin (HA viết tắt là H) và Neuraminidase (NA, viết tắt là N) Cả hai protein này ñóng vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ, trong ñó Haemagglutinin có vai trò quyết ñịnh về kháng nguyên tính và ñộc lực của vi rút cúm A

Protein HA (Haemagglutinin)

Haemagglutinin là một glycoprotein màng type I (cấu trúc thuộc nhóm lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro) Kháng thể ñặc hiệu kháng HA có thể phong tỏa quá trình ngưng kết hồng cầu, còn gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Haemagglutinin Inhibitory antibody)

Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên bề mặt vi rút (Stubb 1965)

Trên mỗi hạt vi rút, có khoảng 400 phân tử HA Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Angstron (Å), cấu tạo từ ba tiểu phần có cấu trúc giống nhau (trimer), mỗi tiểu phần (monomer) ñược tạo thành từ hai tiểu ñơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (S-S) Glycosyl hóa chủ yếu xảy ra ở tiểu ñơn vị HA2, nằm ở mặt vỏ ngoài của capsid, phần móc nối bên trong do HA1 ñảm nhiệm và không ñược glycosyl hóa Cấu trúc này tạo nên ñiểm gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào ñích

Quá trinh xâm nhiễm tế bào ñược khởi ñộng bằng sự nhận biết của HA với thụ thể ñặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt tế bào cảm thụ ðiểm bám dính ñược quyết ñịnh ở vị trí tương ứng với các axit amin 226 (aa226) của HA1 Thành phần của các axit amin tại vị trí này là yếu tố quyết ñịnh tính ñặc hiệu loài ðối với ñường hô hấp của gia cầm, Glycine226 là axit amin ñược nhận

biết bởi thụ thể Gal α-2,3 sialic acid Thành phần axit amin ở một số vị trí gần

ñiểm bám như Glutamine 222, Glycine 224, cũng có ảnh hưởng ñến quá trình xâm nhập tế bảo chủ của vi rút Có thể coi thành phần axit amin tại những vị trí này là chỉ thị phân tử của các subtype H của vi rút

Protein NA (Neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein gắn trên bề mặt capsid của vi rút cúm A, mang tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng subtype NA trong số 9 subtype hiện lưu hành Subtype N1 - N9 có ở vi rút cúm gia cầm, hai subtype N1 và N2 chủ yếu tìm thấy

ở vi rút cúm A gây bệnh cho người Mỗi capsid có khoảng 100 phân tử NA nằm xen giữa các phân tử HA, phần có hoạt tính ñược tạo thảnh bởi cấu trúc 4 tiểu ñơn vị, vùng kỵ nước giúp NA bám vào vỏ capsid

Hoạt tính cắt sialic acid ñóng vai trò quan trọng trong giai ñoạn “hòa

màng”, ñẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gene của vi rút vào trong bào tương tế bào nhiễm Hoạt tính của NA bị ức chế bởi các cấu trúc phân

tử như Oseltamivir; biệt dược Tamiflu tác ñộng ức chế hoạt tính của enzyme theo

cơ chế này

1.2.3 Các phương thức biến ñổi kháng nguyên

Có hai phương thức chủ yếu làm biến ñổi ñặc tính kháng nguyên ở vi rút cúm A : Trôi trượt và ñảo dạng

Trôi trượt kháng nguyên (antigenic drift)

Trôi trượt kháng nguyên là một quá trình diễn ra thường xuyên, từ từ xảy

ra do ñột biến ñiểm Trong tự nhiên, ñột biến ñiểm thường xảy ra ở tần suất trung bình 1/10.000 nucleotide, nghĩa là gần như mỗi hạt vi rút mới ñược sinh ra ñều

chứa ñựng một ñột biến ñiểm trong hệ gene Tùy thuộc vào vị trí ñột biến mà ñặc tính protein mã hóa có sự thay ñổi Sự thay ñổi kháng nguyên tính chủ yếu phụ thuộc vào hai loại protein Haemagglutinin và Neuramidase, thành phần chính của

vỏ vi rút bề mặt Tuy nhiên, sự tích lũy của quá trình ñột biến ñiểm là cho vi rút sau một số lần nhân lên nhất ñịnh có ñược tính trạng mới (kháng nguyên trôi

trượt dần khỏi ñặc tính kháng nguyên chung của quần thể) (Abbas, Spackman et

al., 2011) Thay ñổi thường xuyên có thể ñược xem là một phương thức vi rút trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ : một vật chủ nhiễm một vi rút nhất ñịnh, sản sinh kháng thể ñặc hiệu kháng vi rút Một thời ñiểm nào ñó một vi rút « mới » xuất hiện trong quần thể vi rút mà kháng thể không thể nhận biết Kết quả là ñặc tính di truyền học (trình tự nucleotid của hệ gene) không thay ñổi nhiều nhưng vi rút ñã có ñược tính trạng mới (ñặc tính kháng nguyên thay ñổi so

với vi rút thủy tổ (Medeiros, Naffakh et al., 2004), (Velkov, Thompson et al., 2011), (Rockman, Camuglia et al., 2013)

ðảo dạng kháng nguyên (antigenic shift)

Thường do quá trình tái tổ hợp của 2 hay nhiều vi rút cúm A ñồng nhiễm tạo ra vi rút mới có kiểu hình khác biệt mang tính tổ hợp của 2 hay nhiều vi rút

Hệ gene của vi rút cúm A gồm 8 phân ñoạn riêng biệt Khi ñồng nhiễm sản phẩm

có thể bao gồm thành phần phân ñoạn có nguồn gốc từ cả hai vi rút tái tổ hợp

(reassort) hoặc trao ñổi (swap) Vi rút mới hình thành có ñặc tính của hai vi rút

bố mẹ ðặc tính này dẫn ñến vi rút hoàn toàn có tính kháng nguyên mới và ñôi khi vượt cả hàng rào loài cảm thụ (Manuguerra and Hannoun, 1997), (Shoham,

2006)

1.2.4 ðộc lực của vi rút

ðộc lực của vi rút cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong ñó protein HA có vai trò quan trọng nhất Ở mức ñộ phân tử, khả năng lây nhiễm của vi rút phụ thuộc vào tác ñộng của enzym proteaza vật chủ giúp phá vỡ liên kết hóa học của haemaglutinin, thực chất là tách rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2 Khả năng cắt tách tiểu phần phụ thuộc vào thành

phần và số lượng các axit amin kiềm tại peptid HA0 Các enzym nhóm trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi HA0 có một phân tử Arginin, trong khi ñó các protease khác chỉ có thể phân hủy cầu nối này khi có nhiều axit amin kiềm tại HA0

Tổ chức Y tế Thế giới, kết hợp với các bằng chứng thực nghiệm, ñã công

bố thành phần và trình tự axit amin tại HA0 ñược xem là dấu hiệu nhận biết ñộc lực của vi rút cúm

Tổng kết các ổ dịch và type H gây bệnh gia cầm, người ta cho rằng 2 type H5 và H7 thường có ñộc lực cao ở gia cầm Tại Hội thảo thế giới lần ñầu tiên về

bệnh cúm gà 1981, Bankowski et al., công bố vi rút cúm gà mang kháng nguyên

bề mặt type H7 thuộc loại có ñộc lực cao Tuy nhiên sau ñó dịch xảy ra tại Pensyvania (Mỹ) gây chết 75% số gà lại do vi rút cúm A/H5

ðể ñánh giá ñộc lực của vi rút cúm có cơ sở thực nghiệm, các nhà khoa học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch nước trứng ñã ñược gây nhiễm vi rút Sau ñó ñánh giá mức ñộ bệnh của gà bằng phương pháp cho ñiểm (chỉ số IVPI) Chỉ số IVPI tối ña là 3 ñiểm ñược xác nhận cho những vi rút có ñộc lực cao nhất, gây chết toàn bộ gia cầm thí nghiệm trong 1-2 ngày Theo quy ñịnh của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), vi rút cúm A

có chỉ số IVPI trên 1,2 thuộc nhóm vi rút có ñộc lực cao (Nguyễn Tiến Dũng và

cs, 2004)

Áp dụng cùng quy trình gây bệnh thực nghiệm : Tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng gà ñã gây nhiễm vi rút ñược pha loãng ở nồng ñộ 1/10 cho gà mẫn cảm từ 3-6 tuần tuổi, căn cứ vào kết quả chỉ số IVPI, các nhà khoa học ñã thống nhất chia ñộc lực của vi rút ra 3 nhóm:

- Vi rút có ñộc lực cao: Sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày có 75%-100% số

gà thực nghiệm chết Trường hợp chỉ số này thấp hơn, nếu vi rút cúm gà phải làm chết tối thiểu 20% số gà mẫn cảm tại thực ñịa và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin

- Vi rút có ựộc lực trung bình: là những chủng vi rút gây dịch cúm gà

với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng không gây chết quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm

- Vi rút có ựộc lực thấp: là những vi rút phát triển tốt trong cơ thể gà, có

thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, không có bệnh tắch ựại thể và không làm chết gà

Trong thực tế người ta thường chia vi rút cúm gà ra làm 2 loại: Loại vi rút

có ựộc lực thấp- LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) Loại vi rút có ựộc lực cao- HPAI (Highly Pathogennic Avian Influenza)

Cho ựến nay người ta thừa nhận chỉ có 2 biến chủng vi rút có cấu trúc kháng nguyên H5, H7 ựược coi là loại có ựộc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng không phải tất cả các chủng mang gene H5, H7 ựều gây bệnh

Tuy nhiên, ựối với các chủng có ựộc lực thấp, trong quá trình lưu hành tại các nguồn dịch thiên nhiên, ở các ựàn thủy cầm, chúng có thể mang ựột biến nội gene hoặc tái tổ hợp ựể trở thành các chủng có ựộc

1.2.5 Nuôi cấy và lưu giữ vi rút cúm gà

Vi rút cúm gà phát triển tốt trên phôi gà 9-11 ngày tuổi, trong dịch niệu

mô gà tập trung khá nhiều vi rút và có thể lưu giữ vi rút ựược vài tuần ở ựiều kiện

40C Khả năng tồn tại và gây bệnh của vi rút rất cao nếu ta bảo quản dịch niệu mô

ựó ở - 700C hoặc cho ựông khô

Vi rút cúm gà cũng phát triển tốt trên nuôi cấy tế bào tế bào xơ phôi gà (CEF: Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào thận chó MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) trong ựiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin

1.3 Tiến hóa và hình thành genotype của vi rút cúm gia cầm

1.3.1 Sự tiến hóa của vi rút cúm A/H5N1

Năm 1996, vi rút cúm A/H5N1 ựược phân lập lần ựầu tiên từ ngỗng ở Quảng đông (Trung Quốc) và chủng này ựược coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng vi rút gây bệnh cúm gia cầm trong 12 năm qua Chủng vi rút nguyên

thủy tổ hợp với các chủng vi rút khác từ người và chim cút tạo nên biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997 đối với gene HA (H5) ựột biến làm tăng số lượng axit amin kiềm tại HA0 (chuỗi nối giữa HA1 và HA2) (Arginin và Lysin) có liên quan ựến tiến trình tăng ựộc lực của vi rút, và ở các chủng thuộc dòng Quảng đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông thường là ỜRRRKK

Trong các năm 1997 - 2002, các biến chủng vi rút cúm A/H5N1 mang những ựặc tắnh kháng nguyên khác nhau của subtype H5 ựược hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) 1 có ựộc lực cao với gà nhưng thấp ựối với vịt Nhóm này ựã biến mất vào những năm 2001 - 2002 Trong năm 2002 - 2003, gene HA (H5) có những ựột biến mới do hậu quả của hiện tượng trôi trượt kháng nguyên (antigenic drift), tạo nên biến chủng có tắnh gây bệnh cao, ựặc biệt ựối với vịt (lần ựầu tiên ghi nhận vi rút cúm gây bệnh lâm sàng ở vịt), và lây sang

người (Doherty, Turner et al., 2006) đặc tắnh thắch ứng gây bệnh trên người

càng tăng dần, ựồng thời ựộc lực ựối với ựa vật chủ bao gồm vịt, gà, ngan, ngỗng, chim cút, chim hoang dã, mèo, hổ, cày vằn và người cũng ựược gia tăng Biến chủng mới ựã gây thành dịch và xâm nhập vào nhiều quốc gia châu Á trong ựó

có Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, CampuchiaẦ

Tóm tắt diễn biến các biến cố hình thành chủng và tắnh cảm thụ ựa loài, có thể nói, kết thúc giai ựoạn 1997 - 2003, vi rút cúm A/H5N1 ựã có ựược mức ựộ

ổn ựịnh cao về ựặc tắnh gây bệnh và thắch ứng ựa vật chủ, trở thành nguy cơ cao gây bệnh cho gia cầm, ựộng vật có vú và người trong các năm kế tiếp

Tuy nhiên, xét về kiểu gene và kiểu hình (tắnh kháng nguyên), các chủng

vi rút cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện trong giai ựoạn 1997 - 2002 vẫn mang tắnh tương ựồng kháng nguyên HA với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng đông Sự thay ựổi mạnh về tắnh kháng nguyên thực sự diễn ra ở giai ựoạn ựại dịch cúm gia cầm xảy ra năm 2003 - 2005 Sự xuất hiện của kiểu hình Z trong thời gian này ở các nước đông Nam Á là bằng chứng của sự ựột biến Ộựảo dạng kháng nguyênỢ của vi rút cúm A/H5N1

Hình 1.3 Cây phả hệ dựa trên gene HA vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao

Cuối năm 2005, có nhiều dòng phụ (sublineage) của vi rút cúm A/H5N1 cùng lúc ựược hình thành, ựó là sự xuất hiện dòng phụ Thanh Hải (Qinghai và các Qinghai-like sublineage) và dòng phụ Phúc Kiến (Fujian và Fujian-like sublineage) Các dòng này lan tràn sang các nước châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, sau ựó lan rộng sang khu vực Trung

Á, châu Âu và châu Phi, tại ựó ựã có trường hợp người nhiễm cúm gia cầm Các chủng thuộc dòng phụ Phúc Kiến có trình tự gene NA (N1) ắt thay ựổi so với chủng nguyên thủy, nhưng motif axit amin ở vùng HA0 của ựiểm cắt protease là

ựã biến ựổi -RRRK- (giảm mất một axit amin Lysine) so với các chủng phát sinh hậu Quảng đông Theo dòng lịch sử, từ sau năm 2006, nhiều chủng/dòng/clade

vi rút cúm A/H5N1 mới xuất hiện và ựồng tồn tại, tạo thành một quần thể vi rút gây bệnh có ựặc tắnh kháng nguyên và ựộc lực khác nhau, làm cho diễn biến dịch

tễ học của dịch cúm A/H5N1 trở nên ngày càng phức tạp

1.3.2 Tiến hóa của kiểu hình H5

Protein HA quyết ựịnh tắnh kháng nguyên của vi rút cúm, có tắnh ngưng kết hồng cầu, do vậy còn có tên gọi là ngưng kết tố - Haemagglutinin Tắnh kháng nguyên này có thể xác ựịnh ựược bằng phản ứng Ộức chế ngưng kếtỢ hồng cầu Bản chất của phản ứng là kháng thể ựặc hiệu kháng HA sẽ ngăn không cho

vi rút cúm bám dắnh vào hồng cầu và tạo ra phản ứng ngưng kết Sự thay ựổi tắnh kháng nguyên do hiện tượng drift không làm thay ựổi có tắnh toàn bộ mà có tắnh mức ựộ Một khi có sự sai khác về hiệu giá ức chế ngưng kết giữa hai vi rút cúm với một loại kháng thể ựặc hiệu cho một trong hai vi rút ựến 2 log2 trở lên thì có thể coi chúng thuộc hai clade khác nhau Mặt khác, theo dõi cây phả hệ bằng phân tắch gene thì cho biết chúng liên quan với nhau về phả hệ như thế nào Trên

cơ sở ựó nhóm theo dõi tiến hóa của vi rút cúm gia cầm ựã tổng hợp quá trình này như cây phả hệ ở hình 1.4

Hình 1.4 Tiến hóa của các clade vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian

Trong giai ựoạn 1996-2001, vi rút cúm gia cầm ựộc lực cao A/H5N1 chủ yếu chỉ lưu hành ở phắa Nam Trung Quốc Giai ựoạn này ghi nhận có 4 clade vi rút A/H5N1 khác nhau là clade 0, clade 3, clade 5 và clade 9, trong ựó clade 0 là

vi rút thuỷ tổ A/Goose/Guangdong/96 (H5N1) Sơ ựồ biến ựổi kháng nguyên HA của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 ựộc lực cao (hình 1.3) qua các giai ựoạn khác nhau, cho thấy thấy sự biến ựổi liên tục của vi rút cúm và ựặc biệt là có những clade vi rút tiếp tục phân hóa thành các nhánh phụ như clade 2: Năm 2004 chỉ có

1 lớp clade 2; đến năm 2005 clade 2 ựã tiến hoá thành 5 nhánh phụ từ clade 2.1 Ờ 2.5, rồi ựến năm 2008 chúng lại tiến hoá thành lớp thứ 3

Từ năm 2009 cho ựến nay, một số phân nhóm kháng nguyên mới ựược hình thành tại Việt Nam, trong ựó có phân nhóm 1.1 tập trung gây bệnh ở một số tỉnh phắa Nam và phân nhóm 2.3.2.1 vẫn tiếp tục gây ra các ổ dịch ở hầu khắp

các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên (Nguyễn Ngọc Tiến và cs, 2013)

Riêng nhánh mới 2.3.2.1 chia thành 3 nhóm nhỏ (nhóm A, B và C) Nhánh virút 2.3.2.1 nhóm A (2.3.2.1A) xuất hiện từ giữa năm 2010 ựến ựầu 2012 tại hầu khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên và đông Nam Bộ Nhánh virút 2.3.2.1 nhóm B (2.3.2.1B) năm 2012 ựược phát hiện tại một số ựịa phương như

Quảng Ninh, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Nam ðịnh, Thái Bình, Sơn La, Ninh Bình, Nghệ An, xuất hiện năm 2012 và gây bệnh tại hầu khắp các

tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ, Duyên Hải miền Trung (Nguyễn Ngọc Tiến và cs,

2013)

1.3.3 Khả năng thích ứng ña vật chủ của vi rút cúm A/H5N1

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng vi rút cúm A/H5N1 là thủy cầm (chủ yếu là vịt trời) Vi rút cúm A có khả năng gia tăng phổ vật chủ của chúng trong

quá trình lây truyền ở tự nhiên (Keawcharoen, et al., 2005), (Doherty, et al.,

2006) Nhờ ñặc tính luôn thay ñổi kháng nguyên, vi rút cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài ñộng vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ

nguồn vi rút gây nhiễm (Ito, Couceiro et al., 1998), (Webster, Guan et al., 2002), (Chen, Smith et al., 2006), (WHO, 2013) ðặc ñiểm thích ứng vật chủ này (vật

mang trùng) là ñiều kiện thuận lợi cho vi rút cúm A trao ñổi và tổ hợp các phân ñoạn gene, tạo ra một chủng vi rút cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới ðặc biệt khi chúng vượt qua ñược “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người

(Horimoto and Kawaoka, 1994), (Chan, Lam et al., 2007), (Hui, 2008) Trong

lịch sử các ñại dịch cúm ở người, lợn ñược coi vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp cho vi rút cúm A biến ñổi ñể dễ dàng lây nhiễm từ loài chim sang loài ñộng vật có vú gây nên bệnh dịch ở người Ví dụ: cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của vi rút cúm A/H2N2 của người và vi rút chứa gene H3 trong tự nhiên thông qua ñồng nhiễm trên lợn, gây nên ñại dịch cúm châu Á năm 1968

1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm

ðịa dư phân bố : Vi rút cúm gia cầm phân bố khắp thế giới trong các loài gia cầm, dã cầm, ñộng vật có vú Sự phân bố và lưu hành của vi rút cúm khó xác ñịnh chính xác và chịu ảnh hưởng bởi cả loài vật nuôi, hoang dã, tập quán chăn

nuôi gia cầm, ựường di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh, phương pháp nghiên cứu (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004), (Tô Long Thành, 2004)

động vật cảm nhiễm: Tất cả các loài gia cầm (gà, vịt, ngan, chim cút, vẹt, bồ câu), chim hoang dã (ựặc biệt thủy cầm di trú) ựều mẫn cảm với vi rút Phần lớn các loài gia cầm non ựều mẫn cảm với vi rút cúm type A Ngoài ra vi rút cúm type A còn gây bệnh cho nhiều loài ựộng vật có vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, thú hoang dã và cả con người Lợn mắc bệnh cúm thường do phân type

vi rút cúm A/H1N1 và A/H3N2

động vật mang vi rút: Vi rút cúm ựã phân lập ựược ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt ựuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu Tần suất và số lượng vi rút phân lập ựược ở thủy cầm (ựặc biệt vịt trời) ựều cao hơn các loài khác

Kết quả ựiều tra thủy cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm vi rút do tập hợp ựàn trước khi di trú

Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân type vi rút cúm

A diễn ra ở chim hoang dã Những vi rút này không gây ựộc ựối với vật chủ, ựược nhân lên ở ựường ruột những chim này khiến cho các loài này mang vi rút

là nguồn gieo rắc vi rút cho các loài khác, ựặc biệt gia cầm

đã có nghiên cứu phát hiện nhiều vi rút cúm từ những loài vịt ựi ựầu trong mùa di trú, sau khi xuất hiện ựã gây ra dịch ở gà tây Vịt từ khi bị nhiễm ựến khi bắt ựầu thải vi rút trong vòng 30 ngày Dường như vi rút ựược duy trì trong số ựông vịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyền cho các con non theo ựường tiêu hóa do vi rút bài thải theo phân, gây ô nhiễm ao, hồ (Trần Hữu Cổn

và Bùi Quang Anh, 2004)

Con ựường truyền lây: Khi gia cầm nhiễm vi rút cúm, vi rút ựược nhân

lên trong ựường hô hấp và ựường tiêu hóa Sự truyền lây của bệnh ựược thực hiện theo 2 phương thức

- Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh

- Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chăn nuôi, phân, thức ăn, nước uống, quần áo, giầy dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, côn trùng có mang mầm bệnh Như vậy vi rút cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi Bệnh chủ yếu truyền ngang (do tiếp xúc), chưa có bằng chứng cho thấy bệnh có thể truyền dọc (qua phôi thai) vì những phôi bị nhiễm vi rút thường chết mà không phát triển ñược ðối với gia cầm nuôi, nguồn dịch ñầu tiên thường thấy là:

Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau trong cùng một trang trại hoặc các trang trại khác liền kề như vịt lây sang gà

Từ gia cầm nhập khẩu

Từ chim di trú ñặc biệt thuỷ cầm ñược coi là ñối tượng chính truyền vi rút vào quần thể ñàn gia cầm nuôi

Từ người và các ñộng vật có vú khác, phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm gần ñây ñã có sự lây lan thứ cấp thông qua con người (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

1.5 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm

1.5.1 Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm

Các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh diễn biến rất ña dạng và phức tạp, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñộc lực, số lượng vi rút, loài nhiễm bệnh, mật ñộ chăn nuôi, tiểu khí hậu chuồng nuôi

Thời gian ủ bệnh ngắn thường chỉ vài giờ ñến 21 ngày, Tổ chức Thú y thế

giới ñề nghị nâng lên 28 ngày (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) Các triệu chứng

về hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như khọc khẹc, lắc ñầu, vẩy

mỏ, khó thở, chảy nước mũi, nước mắt Tiếp theo là mí mắt viêm, sưng mọng, phù mặt, phù ñầu Mào và tích dầy lên do phù thũng, tím tái, xuất huyết Thịt gà

bị bệnh thâm tím Xuất huyết dưới da chân là ñặc ñiểm ñặc trưng của bệnh cúm gia cầm

Ngoài các triệu chứng trên còn thấy các triệu chứng về thần kinh như ñi lại không bình thường, siêu vẹo, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụm ñống với nhau Gia cầm tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng, trắng xanh Với gia cầm ñang ñẻ thì tỉ lệ

ñẻ giảm rất nhanh Bệnh lây lan nhanh, gia cầm chết ñột ngột Với chủng vi rút ñộc lực cao (HPAI) tỉ lệ chết từ 15-100%, với chủng vi rút ñộc lực thấp (LPAI) tỉ

lệ chết thấp hơn và mức ñộ biểu hiện triệu chứng cũng nhẹ hơn Tuy nhiên khi có

sự bội nhiễm hoặc ñiều kiện chăn nuôi bất lợi, tỉ lệ tử vong cao hơn có thể tới 60%-70% với các biểu hiện triệu chứng nặng hơn

1.5.2 Bệnh tích

Mức ñộ biến ñổi bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm cũng ña dạng và rất khác nhau trong cùng một ñàn, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực vi rút, quá trình diễn biến của bệnh Những biến ñổi mang tính tổng quan như sau:

Mào và tích thâm tím, phù nề, xuất huyết dưới da và rìa tích Xuất huyết dưới da ống chân thành vệt, nốt

Khí quản viêm xuất huyết, chứa nhiều ñờm Túi khí phù nề, thành túi khí dầy và có nhiều fibrin bám dính Phổi viêm cata, xuất huyết ñến viêm fibrin làm phổi dính vào lồng ngực

Viêm xuất huyết ñường ruột, ñặc biệt vùng hậu môn, van hồi manh tràng,

dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng

Bao tim tích nước vàng, xuất huyết màng bao tim, mỡ vành tim, cơ tim Lách biến màu lốm ñốm vàng, rắn chắc hơn bình thường Tụy khô dễ vỡ, xuất huyết

Viêm xuất huyết buồng trứng, ống dẫn trứng, nhiều trường hợp trứng non dập vỡ, xoang bụng tích nước vàng lợn cợn

Xuất huyết màng treo ruột, màng bao dạ dày tuyến, dạ dày cơ, màng xương lồng ngực có thể coi là ñặc ñiểm riêng của bệnh cúm gia cầm

1.6 Tình hình dịch và nghiên cứu về cúm gia cầm ở Việt Nam

1.6.1 Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm ở nước ta xuất hiện lần ñầu tiên vào cuối tháng 12/2003 (Ban chỉ ñạo Quốc gia, 2005), (Bùi Quang Anh, 2005), sau ñó liên tục tái phát và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là trong giai ñoạn ñông-xuân Diễn biến dịch cúm gia cầm ở Việt Nam như sau:

* ðợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 ñến 30/3/2004: Lần ñầu tiên trong lịch sử nước ta, dịch cúm gia cầm xuất hiện vào cuối tháng 12 năm 2003 Dịch xảy ra gần như ñồng loạt ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng, ñến ngày 27/2/2004 dịch ñã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6% số xã, phường trong cả nước), 381 huyện, quận, thị xã (60%) thuộc 57 tỉnh và thành phố (trong số 64 tỉnh và thành phố) Dịch diễn biến trầm trọng ở các tỉnh Long An, Tiền Giang, ðồng Tháp, Hà Tây, Hải Dương Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con (chiếm 16,79% tổng ñàn), trong ñó gà chiếm 30,4 triệu con, thủy cầm chiếm 13,5 triệu con Ngoài ra cũng có 14,76 triệu chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy

* ðợt dịch thứ hai từ tháng 4 ñến tháng 11/2004: Trong giai ñoạn này, dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ ở các hộ gia ñình chăn nuôi gia cầm; bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7 sau ñó giảm dần, ñến tháng 11/2004 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy trong giai ñoạn này là 84.078 con, trong ñó 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút

* ðợt dịch thứ ba từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005: Trong khoảng thời gian này, dịch xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Số gia cầm tiêu hủy là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ñồng bằng sông Cửu Long; những tỉnh bị dịch nặng là Long An, Tiền Giang, Bạc Liêu, ðồng Tháp

* ðợt dịch thứ 4 từ tháng 10/2005 ñến tháng 01/2006: Dịch xảy ra ở cả 3

miền Bắc, Trung và Nam với 24 tỉnh, thành có dịch tái phát Trong ñó, miền

Nam có 3 tỉnh (Bạc Liêu, ðồng Tháp và Long An), miền Trung có 3 tỉnh (Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng Trị) và 18 tỉnh thuộc miền Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Thái Bình, Hưng Yên, Hải Dương, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Sơn La, Quảng Ninh, Yên Bái, Thái Nguyên, Ninh Bình, Cao Bằng và Hà Giang) Tổng số gia cầm tiêu hủy là 3.972.763 con, trong ñó 1.338.378 gà, 2.135.081 thủy cầm và loài khác

* Trong năm 2006: Ở Việt Nam không xảy ra dịch, do sự chỉ ñạo phòng dịch quyết liệt của Chính phủ, Ban chỉ ñạo quốc gia và hiệu quả của chiến dịch tiêm phòng ðến cuối năm lại xuất hiện các ổ dịch trên ñàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, chưa tiêm phòng văc xin

ðợt dịch thứ 5 (dịch ñịa phương): Bắt ñầu và kéo dài trong suốt năm 2007

và những năm kế tiếp Dịch không tập trung mà rải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và có thể chia nhiều ñợt, tóm tắt tình hình dịch theo năm như sau

* Trong năm 2007: Từ tháng 12/2006 và năm 2007, toàn quốc có 283 xã, phường thuộc 115 huyện quận của 33 tỉnh, thành phố (18 tỉnh miền Bắc, 10 tỉnh miền Nam, 5 tỉnh miền Trung) có dịch cúm tái phát Dịch chủ yếu tập trung vào

2 ñợt chính (ñợt 1 từ 06/12/2006-07/03/2007 và ñợt 2 từ 01/05/2007-23/8/2007) Tổng số gia cầm bệnh, chết và tiêu hủy là 314.268 con, trong ñó gà chiếm 16,68%, vịt chiếm 80,82% và ngan chiếm 2,50% Các ổ dịch chủ yếu xảy ra trên ñàn vịt trước, sau ñó lây nhiễm cho ñàn gà Các ổ dịch chủ yếu xảy ra trên vịt nhỏ, dưới 3 tháng tuổi, chưa ñược tiêm phòng văc xin cúm và ở một số ñàn gia cầm mới tiêm văc xin nhưng chưa ñủ thời gian sinh kháng thể bảo hộ Các ổ dịch xảy ra trên ñàn gia cầm chăn nuôi phân tán, nhỏ lẻ (quy mô dưới 500 con là phổ biến) tại các hộ gia ñình

* Trong năm 2008: Dịch cúm gia cầm ñã xuất hiện tại 80 xã thuộc 54 huyện, quận, thị xã của 27 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm chết và buộc phải tiêu hủy là 106.508 con (gồm 40.525 gà, 61.027 vịt và 4.506 ngan)

* Năm 2009: Cả nước ñã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn thuộc

35 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành phố: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, ðiện

Biên, ðồng Tháp, Hậu Giang, Khánh Hòa, Nghệ An, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Hà Nội, Vĩnh Long và Cao Bằng Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 105.601 con, trong ñó gà 23.733 con (chiếm 22,51 %), vịt 79.138 con (chiếm 74,94 %) và ngan 2.690 con (chiếm 2,55 %)

ðặc ñiểm dịch ở giai ñoạn này là xuất hiện rải rác (nhỏ lẻ, ở nhiều tỉnh và ñịa phương, xảy ra vào các khoảng thời gian khác nhau) Các ổ dịch xuất hiện thường ñược ñịa phương bao vây, xử lý ngay, do vậy các ổ dịch ñều chỉ giới hạn trong phạm vi hẹp, không có hiện tượng lây lan diện rộng

* Trong năm 2010: Dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 64 xã, phường của 38 huyện, quận thuộc 23 tỉnh, thành phố, bao gồm Bắc Kạn, Bắc Ninh, Bến Tre, Cà Mau, ðắc Lắc, ðiện Biên, ðồng Tháp, Gia Lai, Hà Giang, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, Kon Tum, Lạng Sơn, Nam ðịnh, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Bình, Tuyên Quang và Thái Nguyên Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 147.399 con, trong ñó có 43.068 gà (chiếm 29,2%), 102.363 vịt (chiếm 69,5% và ngan là 1.968 con (chiếm 1,3%) ( Cục Thú

Y, 2013)

* Trong năm 2011: Dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 82 xã, 43 huyện, quận thuộc 22 tỉnh, thành phố, bao gồm: Bắc Kạn, Bắc Ninh, Bình ðịnh, Cà Mau, ðăk Lăk, Hà Nam, Kontum, Lạng Sơn, Long An, Nam ðịnh, Nghệ An, Phú Thọ, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Bình, Thái Nguyên, Tiền Giang, Hải Phòng, Vĩnh Long,Vĩnh Phúc Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 gia cầm trong ñó có 39,126 gà, 70,020 vịt và 1.165 ngan con; tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 gia cầm trong ñó có 60,787 gà, 89,204 vịt và 1,365 ngan

* Năm 2012: Từ ñầu năm 2012 ñến tháng 1/2013, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 71 xã, 47 huyện, quận thuộc 20 tỉnh, thành phố là: Hà Nội, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hải Dương, Hải Phòng, Hà Nam, Nam ðịnh, Thái Nguyên, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Quảng Nam, ðăk Lăk, Vĩnh

Long, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Tiền Giang Tổng số gia cầm mắc bệnh là 20.522 gia cầm trong ñó có 3.197 gà, 16.910 vịt và 415 ngan con; tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 86.571 con gia cầm trong ñó 19.435 gà (chiếm 22.5%),

61.483 vịt (chiếm 71%) và 5.653 ngan (6.5%) (Nguyễn Ngọc Tiến và cs, 2011,

2013)

1.6.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm trong nước

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) Từ ñó ñến nay ñã có nhiều nghiên cứu về vi rút và bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam Những nghiên cứu này tập trung vào các hướng chính bao gồm:

- Những nghiên cứu về căn bệnh, dịch tễ, giám sát sự lưu hành của vi rút xây dựng phả hệ xác ñịnh nguồn gốc phát sinh loài Nghiên cứu ñịnh type, biến ñổi di truyền và gene học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 ñược các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng ñầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 (Trương Văn Dung, 2008) Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y ñã phân lập, giải mã và công bố trên Ngân hàng gene ñã giải trình tự gene ñịnh subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc (Lê Thanh Hòa, 2004),

(Nguyễn Tiến Minh và cs, 2004), (Nguyễn Thị Bích Nga, 2006), (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2008), (Trần Quang Vui và cs, 2010) Trên cơ sở phân tích trình tự

gen H5 và N1, các tác giả khẳng ñịnh nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với vi rút cúm A/H5N1 phân lập tại

Trung Quốc (Nguyễn Tiến Dũng, 2004), (Muramoto, Le et al., 2006b), (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2008), (Lê Thanh Hòa và cs, 2008); và vị trí của các chủng lưu

hành tại Việt Nam trong cây phát sinh loài nói chung của vi rút cúm A trên thế

giới (Nguyễn Tiến Dũng, 2004), (Lê Thanh Hòa, 2004), (Lê Trần Bình và cs, 2006), (Nguyễn Thị Hoa và cs, 2006), (Lê Trần Bình và cs, 2007), (Lee and Saif,

2009)

- Nghiên cứu về ựộc lực của vi rút phân lập tại các ổ dịch (Muramoto, Le

et al., 2006a), (Le, Ito et al., 2010); các ựặc ựiểm bệnh học (Lê Văn Năm, 2004), (Nguyễn Tùng và cs, 2011, 2011b), khả năng kháng thuốc (Le, Kiso et al., 2005); các phương pháp chẩn ựoán phát hiện vi rút (Nguyễn Hoài Anh, 2006), (Chan et

al., 2007), (Phạm Sỹ Lăng, 2009), (Lê Văn Năm, 2009), (Bùi Quang Anh và

Văn đăng Kỳ, 2010); giám sát sự lưu hành của vi rút (Nguyễn Tiến Dũng và cs,

2004, 2005, 2008), (Trần Mạnh Giang, 2009), (Nguyễn Tiến Minh và cs, 2009); nguyên nhân phát sinh ổ dịch (Trần đức Minh và cs, 2004), (Trần Mạnh Giang,

2009); và các giải pháp phòng chống dịch (Nguyễn Hoài Anh, 2006), (Trần Xuân Hạnh, 2006), (Trần Duy Khanh, 2006), (Văn đăng Kỳ, 2008), (Nguyễn Ngọc

Tiến và cs, 2011, 2013)

- Nghiên cứu sử dụng văc xin, phòng chống bệnh, ựánh giá hiệu lực văc xin trong ựiều kiện thực ựịa (Trần Hữu Cổn, 2004), (Cục Thú Y, 2004), (Capua Haria và Stefano.M, 2004) (Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu, 2004), (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2005), (Ninh Văn Hiểu, 2006), (Dư đình Quân, 2006), (Nguyễn Hoàng đăng, 2008), (Vũ Thị Mỹ Hạnh, 2008), (Bạch Thị Như Quỳnh, 2008), (Lưu đình Lệ Quý và Trần Thị Dân, 2008), (Trịnh Thị Quý,

2009), (Lê đình Nghị, 2010), (Tô Long Thành và cs, 2008, 2010), (Nguyễn Văn Cảm và cs, 2011, 2011a), (Lưu Hữu Mãnh và cs, 2011), ở các mô hình chăn nuôi khác nhau (Hồ Trung Thông và cs, 2008)

Gần ựây, một số nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm văc xin ựã bước ựầu

có kết quả (Lê Thanh Hòa, 2006a), (Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn Hiệp,

2006), (Lê Trần Bình, 2007), (Bạch Thị Như Quỳnh, 2008), (đậu Huy Tùng và

cs, 2012)

Trong xác ựịnh type vi rút, biến ựổi di truyền phân tắch phả hệ gene H5 cho biết nguồn gốc của vi rút cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với vi rút cúm A/H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến

Dũng và cs, 2004), (Lê Thanh Hòa và cs, 2006b) Các biến chủng H5N1 của

Hồng Kông, Trung Quốc (năm 1997-2001) và Hàn Quốc, đài Loan (năm 2003)

ựều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng đông (Trung Quốc) (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004), (Beato and Capua, 2011), (Zhao, Sun et al., 2011)

Cho ựến nay tất cả 10 clade của vi rút cúm gia cầm ựộc lực cao A/ H5N1

ựã ựược phát hiện và phân lập ở khu vực đông Á Tắnh ựến 2007, có 6 clade vi rút cúm gia cầm ựã xuất hiện ở Việt Nam (hình 1.5)

Vi rút A/H5N1 gây nên dịch cúm gia cầm ở Việt Nam từ cuối năm 2003 Tuy nhiên, qua ựiều tra, người ta ựã từng phát hiện thấy vi rút A/H5N1 có mặt ở

chợ gia cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyen, Uyeki et al., 2005), (Corbellini, Pellegrini et al., 2011) Sáu clade lưu hành ựến 2007 (Wallace et al., 2007), (Wan, Nguyen et al., 2008), (Lê Thanh Hòa và cs,, 2008), (Nguyễn Thị Bắch Nga và cs, 2008), bao gồm: Clade 3 (2001), clade 1 và 5 (2003); clade 0 và

clade 2.3.2 (2005); clade 2.3.4 (2007) Vi rút cúm A/H5N1 thuộc clade 7 ựược phân lập ở biên giới phắa Bắc và một số chợ gia cầm sống ở phắa Bắc Việt Nam

(Nguyễn Tùng và cs, 2011) Vi rút A/H5N1 thuộc clade 2.3.2 tái xuất hiện ở Việt

Nam năm 2010 sau ựó, sự ựồng lưu hành của clade 1 và các biến chủng của clade 2.3.2.1 (A, B và C) làm cho diễn biến tình hình cúm gia cầm ở Việt Nam rất

phức tạp (Wan, et al., 2008)

Hình 1.5 Sự xuất hiện các clade H5N1 ở Việt Nam (Hui et al., 2008)

Từ khi clade 1 xuất hiện sớm năm 2003 (Nguyễn Thị Bích Nga, 2006),

(Beato and Capua, 2011), (Lê Thanh Hòa và cs, 2006b), (Lê Trần Bình, 2007)

lan rộng trong cả nước, sự xuất hiện clade 2.3.2 năm 2005, clade 2.3.4 năm 2007

thay thế cho clade 1 ở các tỉnh phía Bắc (Nguyễn Thị Dung và cs,, 2008), sự tái

xuất hiện clade 2.3.2.1 năm 2010 làm cho diễn biến phát sinh loài ngày càng trở nên phức tạp Tại cùng một thời ñiểm, vi rút các clade khác nhau ñược phân lập

(ñôi khi ở cùng một tỉnh) (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004), (Corbellini, et al.,

2011), tạo ra sự hỗn hợp các kháng nguyên

Chủng A/H5N1 mới, dòng Phúc Kiến, xuất hiện tại Việt Nam có tỷ lệ tương ñồng kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) thấp, tuy nhiên vẫn có mức miễn dịch bảo hộ Sự tái xuất hiện của clade 2.3.2, phát triển thành các dòng (clade) 2.3.2.1A; 2.3.2.1B, có mức tương ñồng kháng nguyên rất thấp và các văc xin có nguồn gốc clade 1 dường như không còn tác dụng ðến nay, văc xin sử dung chủng NIBRG-14, (nguồn A/Vietnam/1194/2004(H5N1) chỉ còn tác dụng ở một số ñịa phương Những nghiên cứu tạo văc xin dựa vào công nghệ di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền vi rút cúm A/H5N1 của Việt Nam không thể ñáp ứng kịp tốc ñộ biến ñổi của vi rút

CHƯƠNG II

2.1 ðối tượng và nội dung

- Nghiên cứu ñặc tính di truyền (gene H5)

- Xác ñịnh ñặc tính nuôi cấy trên phôi trứng gà

2 Xác ñịnh các chỉ tiêu ñộc lực của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân lập ñược

- Xác ñịnh chỉ số EID50

- Khảo sát ñặc tính nhân lên trên tế bào MDCK

- Xác ñịnh chỉ số IVPI

- Nghiên cứu thành phần và trình tự axit amin tại cleavage site

3 Nghiên cứu ñặc tính kháng nguyên của chủng vi rút clade 2.3.2.1B

4 Nghiên cứu ñộc lực của vi rút lựa chọn trên gà

- Xác ñịnh LD50 của chủng vi rút lựa chọn

- Nghiên cứu tính ổn ñịnh ELD50 và LD50 của vi rút lựa chọn

2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

ðịa ñiểm: Phòng thí nghiệm Cúm, bộ môn Siêu Vi trùng, Viện Thú y

Thời gian: từ 1/6/2012 ñến 30/6/2013

2.3 Nguyên liệu

- Trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi (âm tính kháng thể kháng cúm gia cầm)

- Gà khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm và âm tính kháng thể cúm gia cầm

- Kháng nguyên, kháng thể chuẩn kháng vi rút cúm A/H5N1 do Viện Thú

y cung cấp

2.3.2 Môi trường, sinh phẩm

- Môi trường MEM (Modifed Eagle's Medium do Gibco cung cấp

- Huyết thanh bào thai bê ngoại nhập (FBS) do Gibco cung cấp

- Dung dịch Trypsin - EDTA do Gibco cung cấp

- Kháng sinh (Penicilline, Steptomycine), kháng nấm (Fungizone)

- Dung dịch PBS

- Dung dịch Formol 10%

- Methylene Blue 0,05% trong formol 10%

- Sinh phẩm Real-Time RT-PCR do hãng Invitrogene cung cấp

2.3.3 Máy, thiết bị, vật liệu và dụng cụ

- Phòng thí nghiệm cúm gia cầm an toàn sinh học cấp ñộ 3

- Buồng cấy vô trùng (Safty cabinet BSL2)

- Máy hấp tiệt trùng

- Lò sấy tiệt trùng

- Lò thiêu xác

- Kính hiển vi soi ngược

- Máy hút chân không

- ðĩa nhựa 96 giếng ñáy bằng (Costar) nuôi tế bào

- ðĩa 96 giếng ñáy chữ V làm HA và HI

- Chai nuôi cấy tế bào

- Bơm kim tiêm 5 ml

Các máy, thiết bị và vật liệu thông thường phòng thí nghiệm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập vi rút trên phôi trứng gà

- Bệnh phẩm là dịch swab ñược xử lý bằng cách lắc ống dịch swab có tăm bông bên trong, rồi ly tâm sau ñó chuyển dịch nổi sang ống 1,5 ml và vô trùng bằng kháng sinh

- Sử dụng trứng gà có phôi 10 ngày tuổi