nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng virus pvy của các con lai soma khoai tây

MỤC LỤC 1.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 4 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 6 1.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế b

BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



-BÙI THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS PVY

CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2013

Tác giả

Bùi Thị Phương

LỜI CẢM ƠN!

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo NGND.GS.TS Nguyễn Quang Thạch, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Thủy, kỹ sư ðỗ Thị Thu

Hà ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi

về thời gian, cơ sở vật chất thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này

Hà Nội ngày 20 tháng 08 năm 2013

Tác giả

Bùi Thị Phương

MỤC LỤC

1.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 4

1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 6

1.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 17

1.5.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên

2.5.2 Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ñối tượng cây

Chương 2 đỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu 23

3.1 đánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng con lai soma

khoai tây và Ộbố mẹỢ của chúng thông qua kiểm tra gen kháng

3.2 đánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng con lai soma

khoai tây và Ộbố mẹỢ của chúng thông qua lây nhiễm nhân tạo 32

3.3 Nghiên cứu ựánh giá sự khác nhau về sự sinh trưởng, phát triển,

hình thành năng suất và phẩm chất củ của các con lai soma khoai tây so với Ợbố mẹỢ của chúng trong ựiều kiện chậu vại 38

3.3.1 Kết quả ựánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các con

lai soma và Ợbố mẹỢ của chúng trong ựiều kiện chậu vại 38

3.3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma

3.3.3 Các chỉ tiêu hình thái củ và chất lượng chế biến của củ 46

3.4 đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng con lai soma

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

15 PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN

17 PVX Potato virus X

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế

1.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 (triệu

1.3 Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987;

2.2 Các dòng con lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp nghiên

2.3 Các mồi sử dụng ñể chạy PCR phát hiện gen kháng virus PVY

của các con lai soma khoai tây và ”bố mẹ” của chúng 24

3.1 Kết quả khi lây nhiễm nhân tạo virus PVY sau 15 ngày của các

3.2 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các con

3.3 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng con lai soma và “bố

3.4 Một số kết quả ñánh giá ñặc ñiểm thực vật học củ các con lai

3.6 Một số chỉ tiêu hóa sinh của các con lai soma khoai tây và “bố

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo,

nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp

3.1 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GP

122406c liên kết chặt với gen Rysto – gen kháng virus PVY 30

3.2 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu

GP122718b liên kết chặt với gen Ry sto - gen kháng virus PVY 31

3.3 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virut PVY của các con lai soma

khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên

3.4 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virus PVY của các con lai soma

khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên

3.5 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virus PVY của các con lai soma

khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên

3.6 Thí nghiệm ñánh giá ñặc tính sinh trưởng phát triển của các con

3.7 Hình ảnh con lai và “bố mẹ” của một số tổ hợp lai 41

3.8 Hình ảnh củ ñại diện của các dòng “bố mẹ” và con lai của chúng 46

3.9 Hình ảnh về số lượng củ trung bình /khóm của một số con lai

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực

phẩm quan trọng của con người, xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và ñại mạch (FAO, 2005) Với ñặc ñiểm dễ canh tác và có hàm lượng dinh dưỡng cao, khoai tây là một cây trồng quan trọng trong việc ñảm bảo an ninh lương thực cho con người

Tuy nhiên hiện nay, sự thoái hóa giống khoai tây ñang là vấn ñề nghiêm trọng, ñặc biệt là sự thoái hóa do bị nhiễm bệnh virus ðiển hình là nhiễm virus PLRV và virus PVY ở khắp các vùng trồng khoai tây trên thế giới, làm giảm năng suất và chất lượng củ, ước tính thiệt hại lên tới khoảng 20 triệu tấn mỗi năm (Koijima và Lapierre, 1988]

ðể giải quyết vấn ñề này ñã có nhiều giải pháp ñược ñề xuất, trong ñó chọn tạo giống khoai tây kháng virus ñã và ñang thu ñược kết quả tốt Tuy nhiên bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48) nên gây khó khăn cho công tác chọn tạo giống theo con ñường cổ ñiển như lai tạo, ñột biến, chọn lọc (Kuckuck

và cs, 1985)[30], các kỹ thuật này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền Trên

cơ sở bộ genom tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, khiến quá trình chọn lọc sau ñấy rất khó khăn với một quần thể rất lớn Quá trình chọn tạo giống mới tốn rất nhiều công sức và thời gian Dung hợp protoplast là con ñường

có hiệu quả ñể khắc phục ñược khó khăn trong quá trình lai tạo hữu tính khác loài hoặc khác chi Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra sự tái tổ hợp gen ở những loài

ña bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính kém phát triển

Gần ñây, phòng Công nghệ Sinh học Khoai tây - Viện Sinh học Nông nghiệp ñang nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần, bước ñầu thành công trong nghiên cứu quy trình tách, dung hợp, nuôi

cấy, tái sinh protoplast tạo ra các con lai soma khoai tây phục vụ cho chương

trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus Hàng loạt con lai soma ựược tạo ra cần ựược ựánh giá để tiếp nối chương trình chọn tạo giống khoai tây theo

hướng này, chúng tôi tiến hành ựề tài: ỘNghiên cứu ựánh giá ựặc ựiểm nông

sinh học và khả năng kháng virus PVY của các con lai soma khoai tâyỢ

2 Mục ựắch và yêu cầu

2.1 Mục ựắch

Xác ựịnh ựược các con lai soma khoai tây mang những ựặc ựiểm nông sinh học tốt và có khả năng kháng ựược virus PVY phục vụ cho chương trình chọn tạo giống khoai tây

2.2 Yêu cầu

- đánh giá ựược khả năng sinh trưởng, phát triển hình thành năng suất

của các con lai soma trong ựiều kiện chậu vại

- đánh giá ựược chất lượng chế biến và ăn tươi của các con lai soma

- đánh giá ựược khả năng kháng virus PVY của các con lai soma thông qua việc kiểm tra gen kháng bằng phương pháp PCR

- đánh giá khả năng kháng virus PVY của các con lai soma thông qua lây nhiễm nhân tạo

- Giới thiệu ựược một số con lai có triển vọng ựể phát triển thành giống

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả của ựề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới, có giá

trị về khả năng sinh trưởng, phát triển, hình thành củ, phẩm chất giống và tắnh kháng virus PVY của các con lai khoai tây sau khi dung hợp tế bào trần

- Kết quả của ựề tài là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu về tạo

giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua dung hợp tế bào trần

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Tạo ựược các dòng khoai tây tứ bội có khả năng kháng virus PVY

làm vật liệu khởi ựầu cho các nghiên cứu chọn tạo giống tiếp theo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây trồng cổ ựại Các

bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học ựều chứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều loài khoai tây hoang dại còn tồn tại tới ngày nay, ựặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia (Nguyễn Quang Thạch, 1993)

Chúng ựược ựem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ thứ 16, loài cây này nhanh chóng thắch nghi và sớm trở thành loại thực phẩm chắnh tại thời ựiểm mà dân số thế giới tăng nhanh Khoai Tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật học người Thụy sỹ C.Bauhin và J.Bauhin mang tới, ựược trồng rộng rãi vào năm 1773 Từ Châu Âu khoai tây sang tới Ấn độ năm

1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm 1766 vào Nhật Bản Khoai tây ựến với Áo, Italia, đức và các vùng lãnh thổ Châu Âu vào cuối thế kỷ XVII Khoai tây ựược trồng trên quy mô lớn vào những năm 1800 và tới khoảng thế

kỷ XIX mới thực sự phổ biến trên các châu lục

Ở Việt Nam, khoai tây ựược người Pháp ựưa vào trồng năm 1890 ở một số vùng: Tú Sơn Ờ Hải Phòng, Trà Lĩnh Ờ Cao Bằng (1907), Thường Tắn Ờ Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005)[1] Hiện nay, khoai tây ựược trồng tập trung chủ yếu ở đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, đà Lạt những vùng có khắ hậu mát

mẻ, ôn hòaẦ (đỗ Kim Chung, 2003)

loài trồng trọt khác

Có nhiều cách ñể phân loại khoai tây; dựa vào ñặc ñiểm hình thái thân,

lá, hoa…hay số lượng nhiễm sắc thể…Theo J.G Hawkerkks (1991), khoai tây ñược phân thành 18 nhóm, trong ñó có 68 loài dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, ñược chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng NST (Tạ Thu Cúc, 2007)

• Nhóm 1: Diploid: 2n = 2x = 24

S arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum Juz.et Buk

S phueja Juz.et Buk

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt

Có 1 loài là : S curtilobum juz et Buk

1.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây

* Nhiệt ñộ:

Nhiệt ñộ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến

sự phát triển của cây và năng suất củ Nhiệt ñộ trong vụ trồng bình quân là

16oC – 18oC là thích hợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau sẽ yêu cầu ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau

Hạt nảy mầm ở nhiệt ñộ tối thiểu 12oC –15oC và nhiệt ñộ thích hợp nhất

là 18oC – 22oC Nhiệt ñộ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ thối

Thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt ñộ thích hợp là 20oC – 22oC

Thời kỳ hình thành và phát triển củ: Quá trình tích lũy tinh bột vào củ hình thành khó khăn hơn, tia củ vươn dài và thời gian hình thành củ kéo dài hơn dẫn ñến giảm năng suất, củ khoa tây bị dị hình

ðộ dài ngày ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Khoai tây là cây ưa ánh sáng ngày dài Cường ñộ ánh sáng thích hợp từ 40000 – 60000 Lux sẽ cho năng suất cao Cường ñộ ánh sáng mạnh có lợi cho quang hợp, sẽ thuận lợi cho sự hình thành và tích luỹ chất khô Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu thời gian chiếu sáng khác nhau

Từ khi khoai tây mọc khỏi mặt ñất cho ñến thời kỳ xuất hiện nụ hoa yêu cầu thời gian chiếu sáng dài ñể cây quang hợp và tích lũy vật chất

Thời kỳ phát triển tia củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn ñể thúc ñẩy hình thành thân và củ (Mai Thạch Hoành, 2003)

* ðộ ẩm:

Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, tiềm năng năng suất cao nên ñể cây khoai tây sinh trưởng, phát triển tốt cần phải cung cấp nước thường xuyên Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác nhau:

Thời kỳ trồng ñến xuất hiện tia củ ñảm bảo ñộ ẩm tối thiểu 60 – 80% Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ ẩm ñộ ẩm ñất là 80% Thiếu nước hoặc thừa nước ñều ảnh hưởng xấu ñến sinh trưởng của cây (Mai Thạch Hoành, 2003)[4]

1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước

1.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Vào thế kỷ XIX, khoai tây thực sự ñược trồng phổ biến ở các châu lục với khoảng 150 nước Ngày nay, khoai tây ñược trồng chủ yếu ở khu vực Châu Á, Châu Âu cho năng suất và sản lượng lớn

Qua bảng 1.1 cho thấy, diện tích trồng khoai tây ở Trung Quốc lớn nhất khoảng 5 077 504 (ha), thứ hai là Nga với diện tích 2 109 100 (ha) và khoai tây ñược trồng ít nhất ở Hà lan vào khoảng 156 969 (ha) Nhưng năng suất khoai tây lớn nhất là ở Mỹ ñạt 44,3 (tấn/ha), sau ñó là Hà Lan ñạt 43,6 (tấn/ha), ñứng thứ 3 là ðức 40,00 (tấn/ha)

Do ñó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tương lai, với diện tích trồng ngày càng ñược mở rộng và năng suất, chất lượng khoai tây ngày càng tăng, nhất là ở các nước ñang phát triển

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên

thế giới năm 2011 (FAOSTAT) Nước

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

Năng suất (tấn/ha)

Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau ñó mở rộng sang các nước phát triển Vậy tại sao hiện nay khoai tây ñược trồng chủ yếu ở những nước ñang phát triển? Theo các chuyên gia nhận ñịnh: Khoai tây chính là cây lương thực của tương lai dành cho những nước nghèo và nước ñang phát triển “Khi giá lúa gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây ñược phát hiện là nguồn cây trồng giàu dinh dưỡng cho những nước ñó với giá rất rẻ” (FAO, 2005) Mặt khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO, 2005)

Bảng 1.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007

(triệu tấn) (FAOSTAT)

Năm

Quốc gia 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007

Phát triển 183.13 199.31 177.47 174.63 165.93 166.93 160.97 159.97 159.89 ðang phát triển 84.86 101.95 108.50 128.72 135.15 145.92 152.11 160.01 165.41 Thế giới 267.99 301.26 285.97 303.35 301.08 312.85 313.08 319.98 325.30

Qua bảng 1.2 cho thấy: Từ năm 1991 – 2003 sản lượng khoai tây ở các nước ñang phát triển tăng liên tục từ 84,86 triệu tấn (1991) lên 152,11 triệu tấn (2003) và tăng ñều hơn so với các nước phát triển mặc dù sản lượng thấp hơn Bởi các nước ñang phát triển ngày càng mở rộng diện tích trồng nhưng năng suất không cao, còn các nước phát triển thì diện tích thu dẹp dần, năng suất khá cao do có vốn ñầu tư lớn và kinh nghiệm trồng trọt lâu năm Vào những năm 2005, lần ñầu tiên sản lượng khoai tây ở các nước ñang phát triển vượt qua sản lượng khoai tây ở các nước phát triển Trong ñó Trung Quốc là quốc gia dẫn ñầu về sản lượng khoai tây ñạt 72 triệu tấn năm 2007 và 1/3 sản lượng khoai tây của thế giới ñược thu hoạch ở Trung Quốc và Ấn ðộ

Ở các nước ñang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém

một phần là do nguồn giống không ñảm bảo chất lượng, củ giống không rõ nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn ñến sự thoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ

Do vậy, các nhà nghiên cứu ñang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạch bệnh và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại

1.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Vấn ñề khó khăn nhất hiện nay ñối với ngành sản xuất khoai tây ñó là giống Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng từ 20 – 25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54 – 65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45 – 60% Khoai tây trồng chủ yếu bằng con ñường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong ñiều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 – tháng 10), ñiều kiện nóng ẩm của mùa hè

củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất lượng củ thấp

Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ

lẻ, chưa mang tính hệ thống Trước tình hình ñó cần xây dựng các chương trình nhân tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con nông dân

Từ năm 2003 ñến 2004 diện tích trồng khoai tây ở nước ta là 47340 ha với năng suất ñạt 148 tạ/ ha Vùng Trung du miền núi phía Bắc có 9266 ha ñạt năng suất 109 tạ/ ha Vùng Duyên hải Bắc Trung Bộ có 1686 ha với năng suất ñạt 200 tạ/ ha Vùng ðồng bằng sông Hồng có 38267 ha ñạt năng suất 164 tạ/

ha Vùng Tây Nguyên có 1126 ha với năng suất ñạt 178 tạ/ ha

Trong giai ñoạn hiện nay, cây khoai tây rất ñược chú trọng trong công

tác nhập nội, chọn lọc và lai tạo dòng ựặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và dung hợp tế bào trần Vì vậy, trong những năm gần ựây diện tắch trồng khoai tây ựược mở rộng nhanh chóng và khoai tây trở thành cây trồng chắnh trong vụ ựông, là cây quan trọng ở nước ta

1.3 Tình hình bệnh virus hại khoai tây

Như chúng ta ựã biết, khoai tây là loại cây trồng rất dễ bị tấn công bởi

một số tác nhân gây bệnh: Virus (PVX, PVY, PLRV, LR, S, M, A, PSTVD),

vi khuẩn (Ralstonia solanacearum), nấm (Phytophthora infestans), nhóm

ngành giun tròn (nematodes Ờ bệnh do tuyến trùng), và một số loại bệnh khác

1.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây

Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấn công vào các tế bào, các cơ quan làm thay ựổi các quá trình trao ựổi chất của cây, qua ựó sẽ làm ảnh hưởng lớn ựến năng suất Khi cây bị nhiễm virus không thể chữa, chỉ có thể nhổ cây bị hại vứt xa nguồn nước và nơi trồng Bởi

vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy hiểm ựối với những cây trồng nhân giống vô tắnh bằng củ tiếp tục nhân lên ở các thế hệ sau Ngoài ra bệnh virus còn ựược lan truyền do côn trùng hoặc tiếp xúc cơ giới

Theo (Vũ Triệu Mân, 1978) và một số tác giả khác cho rằng: Virus ựã làm ảnh hưởng rất lớn ựến năng suất và phẩm chất khoai tây, ựặc biệt là virus PVY làm giảm năng suất từ 50% - 90% Chắnh vì vậy, ựến nay dù có nhiều tác nhân gây bệnh hại khoai tây nhưng virus vẫn là nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất kinh tế một cách trầm trọng

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương đại, Hà Minh Trung,

Vũ Triệu Mân (1978 Ờ 1986) về virus khoai tây ở Miền Bắc Việt Nam cho thấy:

Bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chắnh đó là:

Virus Y khoai tây (PVY)

Virus X khoai tây (PVX)

VirusA khoai tây (PVA)

Virus S khoai tây (PVS)

Virus M khoai tây (PVM)

Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)

Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV–International Committee on Taxonomy of Viruses) ñã xây dựng hệ thống dữ liệu về các nhóm virus gồm ñặc ñiểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu ño lường (số hóa) các loại virus ñó

Với loài S Tuberosum L phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như sau:

Bảng 1.3 Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987;

từ 40-90% Ở Việt Nam khoai tây ít bị nhiễm virus này (Bode, 1969)

• PVY – Smith phát hiện năm 1931 tại Anh Nhóm này gồm 3 dòng chính: PVYO gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới, PVYN gây ra các vết chết hoại trên gân lá thuốc lá, PVYC ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới Bên cạnh ñó mới phát hiện ra PVYNTN, PVYNW, PVYZ.PVYNTN Virus Y kết hợp với virus PLRV sẽ gây hại rất nặng ở Châu Âu Khả năng gây giảm năng suất từ 50 – 90% Riêng virus Y ñặc biệt gây hại nặng ở các vùng trồng khoai tây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân, 1986)

• PVA – Nhóm virus này khá phổ biến trên thế giới, Murphy và Mckay phát hiện ở Eire năm 1932 Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng

A1 cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S tuberosum.cv King Edward, ngược

lại dòng A2 thì không (Valkonen và cs.1994) Virus này gây hại giảm năng suất trên 50% (Bode 1969)

• Theo Cockerham (1955) PVX ñược chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng của gen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiện PVXHB gây giảm năng suất từ 10 – 25%

• PVV – Rozendaal phát hiện ở Nertherl vào năm 1971, gây hại nhiều ở Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm Qua phân tích

Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S tuberosum cv Pentlvà Dell

• PVM – Schltz và Folson phát hiện năm 1923 tại Mỹ, khá phổ biến và gây ra vài triệu chứng lạ Theo Vũ Triệu Mân (1986) cho biết hai giống khoai tây ở Nga ñã bị nhiễm virus PVM làm giảm năng suất tới 60 – 70%

• PVS – ðược phát hiện ở Nertherland vào năm 1952, gây hại ít làm giảm năng suất từ 10 – 15% thường gây hại khi kết hợp với các virus khác

1.3.2 Tác hại của bệnh virus

- Virus khoai tây ñược ñánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, làm giảm ñáng kể năng suất và chất lượng củ Bởi bệnh virus có những ñặc tính sau:

- Là bệnh không chữa ñược khi ñã bị nhiễm Do virus khi xâm nhiễm vào cây trồng chúng không có sự trao ñổi chất riêng và ñộc lập mà phải sử dụng vật chất của ký chủ ñể nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trí xâm nhiễm Như vậy, tế bào ký chủ ñã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tác nhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus ñồng thời cũng ức chế các quá trình sinh tổng hợp của ký chủ

- Bệnh virus khoai tây có ñặc tính di truyền Ở những cây nhân giống theo con ñường hữu tính, bệnh virus rất ít truyền qua hạt Ngược lại cây nhân giống vô tính, virus có mặt ở mọi tế bào ñang sống nên rất dễ lan truyền Khi

virus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyện tới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con Khi ñó, một củ mẹ bị nhiễm bệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễm virus Do vậy, năm này qua năm khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanh chóng Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trình sống của cây

- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus ñược truyền ngay hoặc có thời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trích nạp virus cho tới lúc truyền sang cây mới

Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gây nên hiện tượng thoái hóa giống Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồng của củ, biểu hiện củ nhỏ ñi về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu, hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khả năng quang hợp Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn ñến tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào ñó Ngoài ra, khi củ giống bị già sinh lý do bảo quản lâu trong ñiều kiện nóng ẩm cũng dẫn ñến hiện tượng thoái hóa củ Trong ñó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng thoái hóa

Ở Anh khoai tây bị nhiễm virus PLRV, PVY và PVX gây thiệt hại trung bình từ 30 – 50 triệu pound mỗi năm (Hull, 1984)

Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20 triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giới (Kojima và Lapierre, 1988)

Theo Banttari và cs (1993) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY và PLRV dẫn tới năng suất giảm 80%

Hiện nay, người trồng khoai tây ñã sử dụng quá nhiều lượng thuốc trừ sâu, với mục ñích tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh (rệp muội, bọ phấn…) Tuy nhiên giải pháp sử dụng thuốc trừ sâu ñể kiểm soát sự nhân lên của virus là không hiệu quả Do ñó, việc sử dụng thuốc trừ sâu tràn lan không những không cho hiệu quả trừ bệnh mà còn làm tăng tính kháng thuốc của côn trùng truyền virus, xuất hiện nhiều loài mới trong quần thể, hơn

nữa còn gây ảnh hưởng tiêu cực ñến hệ sinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh Quan trọng nhất là lượng thuốc còn tồn dư trong củ khoai tây sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng

Chính vì thế hướng ñi theo con ñường tạo giống khoai tây kháng virus, kháng vector truyền bệnh ñược xem là giải pháp tối ưu Hướng ñi này ñã và ñang nhận ñược sự quan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây nói riêng và cây trồng nói chung

1.4 Giải pháp khắc phục

1.4.1 Các giải pháp về canh tác

Trước những tác hại của bệnh virus trên, các nhà nghiên cứu về cây khoai tây ñã ñề xuất một số giải pháp nhằm canh tác phòng trừ sự nhiễm bệnh virus khoai tây như sau:

• Loại bỏ nguồn cây, củ bị nhiễm virus

• Hạn chế tối ña sự nhân lên và lan rộng của phân tử virus

• Trồng xen canh, luân canh một số loại cây trồng có tính kháng virus, xua ñuổi côn trùng truyền bệnh virus Ngoài ra, có thể áp dụng biện pháp dùng côn trùng ñể kiểm soát vector truyền virus, tuy nhiên phương pháp này rất ñắt (Valkonen và cs, 1994)

• Hay sử dụng giải pháp phun xịt dầu khoáng ñể ngăn chặn vector truyền virus theo kiểu không bền vững (R.M.Solomon-blackburn và H.Barker, 2001)

1.4.2 Giải pháp công nghệ sinh học

Tạo giống khoai tây chuyển gen kháng virus

1.4.2.1 Tính kháng bắt nguồn từ gen CP (CPMR-Coat Protein Mediated Resistance)

Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây ñể tạo giống kháng virus, ñây là hướng nghiên cứu ñầu tiên về tính kháng virus bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh Trong ñó, Hemenway (1988) ñã chuyển nạp thành công gen Cp

của PVX vào khoai tây, thu ñược kết quả tạo khoai tây chống chịu virus PVX

Cơ chế của tính kháng là chống lại sự tích lũy virus trong cây Kawchuk

và cs (1991) chứng minh nồng ñộ virus PLRV ở cây chuyển gen Cp rất thấp chỉ khoảng 1% giống như cây ñối chứng trong giai ñoạn tiền xâm nhiễm

1.4.2.2 Tính kháng bắt nguồn từ protein di chuyển

Virus mã hóa một số loại protein di chuyển hỗ trợ sự lây lan của virus trong cây Khi ñó các phân tử protein này chính là mục tiêu trong tạo giống kháng virus

Vào năm 1996, Tacke ñã chuyển trình tự gen ORF của virus PLRV sang cây khoai tây, gen này mã hóa cho protein pr17 giúp virus di chuyển trong mạch phloem Dòng khoai tây chuyển gen có biểu hiện ñột biến protein pr17 thì kháng ñược với virus PVX, PVY Ngược lại, dòng không có ñột biến trên thì chỉ kháng virus PLRV nhưng không kháng PVX và PVY Khi tiến hành kiểm tra về tính kháng với virus PLRV của các cây chuyển gen thấy ñược lượng kháng nguyên (virus) trong cây giảm rõ rệt Qua nghiên cứu này Tacke chứng minh tính kháng PLRV ñược kiểm soát ở mức RNA, trong khi

ñó tính kháng PVX và PVY là tính kháng bắt nguồn từ protein ñược mã hóa của tác nhân gây bệnh Do ñó, những cây tích lũy protein này sẽ kháng ñược

sự lây nhiễm của nhiều loại virus khác nhau, PVY và PVX Cơ chế kháng này không mang tính ñặc hiệu dòng virus

2.4.2.3 Tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản (Replicase (polymerase) mediated resistance

Năm 1990, nhà khoa học Golemboski ñã chuyển vùng gen polymerase

của virus TMV (Tobacco Mosaic tobamovirus) vào cây khoai tây, gen này tạo

ra tính kháng virus theo cơ chế “tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymerase” Tiếp ñó, hàng loạt nghiên cứu về chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus và tương tự như cơ chế kháng trên ñối với nhiều loại virus khác nhau Nguyên lý của phản ứng kháng là sự ức chế quá trình tái bản của virus (Braun và Hemenway 1992; Mueller và cs, 1995)

1.4.2.4 Tính kháng theo cơ chế làm câm gen sau phiên mã Postranscriptional Gene Silencing)

Trong một số trường hợp tính kháng chuyển gen bắt nguồn từ quá trình phiên mã RNA tỏ ra ưu thế hơn phương pháp gen mã hóa protein cũng như một vài phương pháp trên Dougherty năm 1994 cho biết các cây chuyển gen

Cp của virus TEV (Tobacco etch potyvirus) không ñược dịch mã thì có biểu

hiện tính kháng hoặc nhiễm với virus TEV sau vài tuần lây nhiễm Ông giải thích hiện tượng trên là do sự phân giải RNA chuyển gen sau phiên mã ñã xảy

ra trong cây, lượng RNA bị giảm mặc dù gen chuyển ñã ñược phiên mã Tiếp

ñó, tính kháng virus PVX bằng phương pháp chuyển gen RNA polymerase ñược nghiên cứu bởi Mueller (1995) Kết quả cho thấy những cây có tính kháng cao nhất với virus PVX thì lượng polymerase là thấp nhất và số bản sao của gen chuyển nhiều Tính kháng không ảnh hưởng ñến sự phiên mã của gen chuyển Cơ chế kháng ở ñây là sự làm câm gen sau phiên mã (PTGS) PTGS không những ñược cảm ứng bởi gen chuyển mà còn bởi virus (Baulcombe, 1996) và dường như là phản ứng phòng thủ chung của cây trồng

và ñược giải thích theo nhiều cơ chế bảo vệ cây trồng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh (pathoge – derived protection)

Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

ðối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiều dòng mang ñặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu ñiểm: Tổ hợp ñược bộ genome của cả hai “bố mẹ” tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ ñầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus

Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài nguyên thủy và một loài khoai tây trồng

Solanum spp, cũng như một số loài dại không mang củ có ñặc tính kháng

virus tốt (Spooner và Hijmans, 2001) Trong số ñó dòng S etuberosum có ñặc

tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen và cs, 1992b; Thieme

và cs, 2000, S tarnii tính kháng cao với dòng virus PVY (Thieme và cs, 2003), loài khoai tây S cardiophyllum Lindl và S etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa thể hiện tính kháng cao với nấm Phytophthora infestans Chúng ñược thu thập và thăm dò về tính kháng virus và tác nhân gây

bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng ñịnh 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới có

ý nghĩa ðây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâu

Rất khó khăn ñể có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng Châu Âu bằng lai hữu tính, do ñó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu

hiệu ñể ñưa nguồn gen ñó vào quỹ gen của loài S Tuberosum L., vượt qua

ñược tính không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây

dại không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S Tuberosum tạo con

lai soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyền bệnh (Austin và cs, 1985b; Fish và cs, 1987; Vankonen và cs, 1994b)

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các biến ñổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi vector (Thieme và cs, 2000) Một số con lai soma ñược lai lại thành công với dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng Hàng loạt con lai soma của

S etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY và

tính rất kháng với PVX (Gavrirenco và cs, 2003) Nghiên cứu của Polgar và cs

(2002) ñã tạo ñược 150 dòng lai soma giữa khoai tây Hungari và S brevidens

cùng một vài thế hệ BC Kết quả cho thấy tất cả con lai và hầu hết dòng BC

biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV

Nghiên cứu gần ựây của Thieme và cs (2008) cho biết loài khoai tây dại

S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện tắnh kháng cao với virus PVY, tắnh kháng cao với nấm Phytopthera infestans Khi ựó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc loài S tuberosum ựể tạo thể lai mới kế thừa tắnh kháng từ dòng khoai tây dại S tarnii

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phương pháp lai soma có nhiều ưu ựiểm và hiệu quả hơn cả Phương pháp lai hữu tắnh gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo đối với phương pháp chuyển gen, gen kháng virus có thể không biểu hiện tắnh kháng (Cockerham, 1970; Jones 1990) mà còn xuất hiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt ựộng của cây chủ Nhược ựiểm của phương pháp chuyển gen là mang tắnh kháng ựặc hiệu dòng virus, dễ bị phá vỡ tắnh kháng khi lây nhiễm virus với nồng ựộ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng

để có thể giải quyết vấn ựề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, trong ựó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vector truyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

1.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

1.5.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới

Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai hồi giao (back cross), ựột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp phải những khó khăn về mặt ựặc tắnh di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum) đó là bộ genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, ựòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức Quá trình này ựòi hỏi tối thiểu 10 năm ựể có ựược một giống lai

ra ñời Ngoài ra, nhiều ñặc tính chống chịu do nhiều gen quy ñịnh sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau

Phương pháp chuyển gen ñược coi là chiến lược mới ñể cải tiến các giống cây trồng Tuy nhiên, nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng ñược kiểm soát bởi ña gen; hoặc các gen kiểm soát các tính trạng mong muốn vẫn chưa ñược biết ñến; hoặc các gen của chúng chưa thể tách ra ñược và nhân dòng thành công Do ñó, phương pháp lai tạo giữa các loài có quan

hệ gần gũi bằng dung hợp tế bào trần là một phương pháp thú vị ñể khắc phục những nhược ñiểm trên Phương pháp dung hợp tế bào trần ñã giải thích cơ sở di truyền của tính kháng với các stress vô sinh và hữu sinh ở cây trồng (McGrath và cộng sự, 2002)

Các dòng tứ bội khởi ñầu (4x )

Tạo dòng ñơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn – nhị bội hóa tạo 2x

Theo ñịnh hướng này ñã có hàng loạt công trình của các tác giả nhằm giải quyết từng khâu của sơ ñồ tạo giống trên: các công trình về nghiên cứu

kỹ thuật giảm ñộ bội của khoai tây tứ bội xuống nhị bội khi lai khoai tứ bội

với dòng dại Solanum phureja (Nitzche và Wenzel, 1977); các công trình

nghiên cứu về hoàn thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương pháp hoá học, ñiện học (Thomas 1981), Eduard Chani và cộng sự (2000) ñã áp dụng công nghệ dung hợp protoplast và nuôi cấy bao phấn ñể tạo các cây ñơn bội Các con lai soma ñược tạo ra từ tổ hợp

lai giữa Solanum phureja Juz.&Buk và S chacoense Bitt Nuôi cấy hạt phấn

của các con lai này ñể tạo 1 họ cây ñơn bội Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến nuôi cấy bao phấn như ñiều kiện trồng cây cho bao phấn; phương pháp chuẩn

bị môi trường nuôi cấy; ñiều kiện nuôi cấy; kiểu gen; thời gian lấy bao phấn

ða số các cây tái sinh ñều là cây nhị bội, ñiều này chứng tỏ rằng có một số alen ñã bị ñào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn Trong các cây tái sinh, các thể ñồng hợp cũng ñược xác ñịnh thành công bằng chỉ thị phân tử SSR

với 8 cặp mồi

Trong giai ñoạn những năm 80 ñến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma ñược tiến hành rất mạnh mẽ (Haberlach và cs,1985; Austin và cs, 1985a; Fish và cs,

1987; Deimling và cs,1988; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1979; Thach et al., 1993) Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh virus từ bố mẹ ñã chọn lọc (2x) cũng ñược rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các ñặc tính này có thể quan sát rõ trên ñồng ruộng Tuy nhiên những

dòng con lai soma có nhiều biến dị trên ñồng ruộng cần phải chọn lọc

Thạch và cộng sự (1993) ñã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị

bội S tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tính

kháng rất cao với virus PVX, PVY, ñiều này rất ý nghĩa ñể tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang ñặc tính kháng bệnh virus Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một số kết quả khác gần 50% là thể lục bội (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid) ðặc biệt một tổ hợp lai thu ñược có tới 94% dòng lai soma, trong khi ñó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai soma

ða số các con lai soma thu ñược có biểu hiện tính kháng virus của cả hai ñối tượng khoai tây dung hợp, con lai ñược xác ñịnh bằng kỹ thuật RFLP và phân tích isozyme với 2 loại enzym esterase và peroxidase

Lu Wenhe và cộng sự (2004) cho rằng dung hợp tế bào trần không chỉ vượt qua rào cản lai tạo thông thường mà còn thu ñược các thể lai soma, do vậy con lai soma sẽ thể hiện ưu thế lai rất rõ Kỹ thuật dung hợp tế bào ñã ñược nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc phát triển các giống cây trồng mới Có thể kể tên một số giống ñã thương mại hoá thành công như : Cam "Oretachi" (cam + cam ba lá), "Shuvel" (quít Satsuma + cam), "Gravel" (cam lai bưởi chùm), "Murrel" (murcott +cam) và "Yuvel" (Yuzu + cam), Giống thuốc lá bất dục ñực Ms-F 224 Ngoài ra nhiều dòng bất dục ñực dùng

ñể sản xuất hạt F1 ở lúa, cà rốt, cải bắp và cà cũng ñược phát triển bằng kỹ thuật dung hợp tế bào

Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện ñại kết hợp với các kỹ thuật truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX ñã ñược xác ñịnh thông qua các nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử (Blackburn & Barker, 2001) Các trình tự liên quan ñến khả năng kháng virus ở khoai tây ñã ñược xác ñịnh Bên cạnh ñó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây ñã ñược tìm thấy ðây chính là những cơ sở dữ liệu quan trọng ñể ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện ñại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các giống khoai tây theo ñịnh hướng mong muốn D.Milbourne và cộng

sự (1998) ñã thành công trong việc phân lập, ñánh giá và lập bản ñồ SSR cho khoai tây Các nhà nghiên cứu ñã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trí chính xác trên ADN của khoai tây ñược thiết kế và tổng hợp ðây là những giữ liệu rất quan trọng cho nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương lai Kế thừa những kết quả này, Ye –So Song và cộng sự (2005)

ñã xây dựng thành công bản ñồ gen Rysto (gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số XII của khoai tây 12 marker của

gen Rysto ñã ñược sử dụng ñể phân tích ña hình của 106 giống khoai tây của ðức, Ba lan, Thụy sỹ Locus của gen Rysto ñã ñược xác ñịnh nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003 Sử dụng các dòng khoai tây nhị bội tạo ra

từ nuôi cấy hạt phấn sơ cấp ñể phát triển các chỉ thị phân tử ñã ñược chứng minh ðây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn tạo giống khoai

tây có các ñặc tính mong muốn

Gần ñây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai

tây dại có ñặc tính kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp

truyền bệnh ) rất ñiển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng ñể tạo các con lai soma mang ñặc tính chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ ñược sử dụng làm vật liệu lai lại (BC) với chính bố mẹ của chúng Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang ñặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các ñặc tính nông sinh

học tốt của bố mẹ đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại ựể chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào

trần và lai hữu tắnh: S.brevidens (Austin và cs, 1985; helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij và cs, 1992); S.berthaultii (Serraf và cs,1991); S.commersonii (Cardi và cs, 1993); (Thieme và cs 2004, 2008, 2010)

1.5.2 Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ựối tượng cây khoai tây ở Việt Nam

Cùng với những tiến bộ và thành tựu ựạt ựược của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam ựang dần kế thừa và bắt ựầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng như một số sâu hại nguy hiểm khác

Trên ựối tượng cây khoai tây, ựã cải tạo nguồn gen của một số dòng khoai tây trồng, loại bỏ hoàn toàn bệnh virus của một số dòng khoai tây như KT2, giống khoai tây Thường Tắn (Ackersegen)Ầbằng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật gồm các kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy meristemẦ) và các kỹ thuật phân tử khác

Nghiên cứu dung hợp tế bào trần cây khoai tây còn rất mới mẻ và ựang ựược tiến hành khá thành công tại Viện Sinh Học Nông NghiệpỜTrường đHNNHN do GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS Nguyễn Phương Thảo chủ trì ựề tài ỘTạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trầnỢ giai ựoạn 2006 Ờ 2011 Nghiên cứu ựã bước ựầu thành công ở quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast của các dòng khoai tây nhị bội phục

vụ cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

A41 - Có gen kháng virus PVY B186 - Có gen kháng virus PVY

A56 - Có gen kháng virus PVY B208 - Có gen kháng virus PVY

- 17 dòng con lai soma khoai tây tứ bội tái sinh ñược sau dung hợp bằng xung ñiện của 4 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây nhị bội ñang ñược lưu trữ tại Viện Sinh học Nông nghiệp, thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các dòng con lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp

* Vật liệu:

- Các dòng lai soma khoai tây và các dòng ”bố mẹ” lưu giữ ở dạng cây

in vitro ñược nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản, với quang chu kỳ chiếu

sáng 16h/ngày, nhiệt ñộ phòng nuôi 18 – 22oC

- Các hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:

+ Hóa chất nuôi cấy mô (Phụ lục 1)

+ Hóa chất dùng ñể tách chiết DNA (Phụ lục 2)

+ Thành phần cho phản ứng PCR (Phụ lục 4)

+ Chỉ tiêu theo dõi và ñánh giá các ñặc ñiểm nông sinh học (Phụ lục 5)

- Các dụng cụ và máy móc cần thiết cho các thí nghiệm: Cối sứ, pipet,

cân vi lượng, máy ñiện di, máy PCR, máy ly tâm, máy xung ñiện

- ðể ñánh giá tính kháng virus PVY của các con lai soma và các dòng

”bố mẹ” chúng tôi sử dụng hai cặp mồi ñặc hiệu theo Czech J Gennet (2007)

Cặp mồi GP 122406c liên kết chặt với gen Ry sto là một gen kháng có khả năng kháng rất cao với tất cả các chủng virus PVY với cặp mồi này sẽ nhân ñược ñoạn DNA có kích thước là 406 bp Cặp mồi thứ 2 là GP 122718b liên kết chặt

với gen Ry sto có thể nhân ñược ñoạn DNA với kích thước là 718 bp

Bảng 2.3 Các mồi sử dụng ñể chạy PCR phát hiện gen kháng virus PVY

của các con lai soma khoai tây và ”bố mẹ” của chúng

mồi

GP 122406c Primer F: CAA TTG GCT CCC GAC TAT CTA CAG

Primer R: ACA ATT GCA CCA CCT TCT CTT CAG 53oC

GP 122 718b Primer F : TAT TTT AGG GGT ACT TCT TTC TTA

Primer R : GAT ACT TCC AACCGCTTCAC 53o C

• ðịa ñiểm

ðề tài ñược tiến hành tại phòng Công nghệ sinh học khoai tây thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội

Ớ Thời gian nghiên cứu

đề tài tiến hành từ tháng 8/2012 Ờ 8/2013

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Kiểm tra gen kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây và Ộbố mẹỢ bằng phương pháp PCR

Nội dung 2: đánh giá khả năng kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây và Ộbố mẹỢ bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Nội dung 3: Nghiên cứu ựánh giá sự sinh trưởng, phát triển, năng suất

và phẩm chất củ của các con lai soma khoai tây và cây Ợbố mẹỢ (trồng trong chậu vại)

Nội dung 4: đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh của củ các con lai soma khoai tây và Ợbố mẹỢ của chúng sau khi thu hoạch

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phòng

2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:

Các con lai soma khoai tây và Ộbố mẹỢ của chúng ựược nuôi cấy in vitro trong môi trường MS Cây in vitro ựược ựặt trong phòng nuôi theo chế

ựộ nhiệt ựộ là 210C, cường ựộ chiếu sáng 3000 Ờ 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày

2.3.1.2.Phương pháp chiết tách DNA

Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số của GS Hans Ờ Joerg Jacobsen trường đại học Hannover (Phụ lục 3), tiến hành kiểm tra ựộ nguyên vẹn của DNA tổng số bằng ựiện di trên gel agarose 1% Nếu ựạt yêu cầu thì thực hiện thắ nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu

2.3.1.3 Phương pháp ựánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp DAS Ờ ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Ờ linked imunosorbent assay Bước 1: Cố ựịnh kháng thể IgG ựặc hiệu của virus vào bản ELISA

IgG hòa trong dung dịch ựệm carbonat, cho vào mỗi giếng 200ộl đặt

bản ELISA trong hộp ẩm có nắp ñậy, ñể vào tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C trong 2 giờ Sau khi ủ, các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần

Bước 2: Cố ñịnh dịch cây vào bản ELISA

Nghiền mỗi mẫu 1g trong ñệm chiết với ñộ pha loãng 1/10 Dịch cây ñược nhỏ vào bản ELISA với lượng 200µl/1giếng ðồng thời cho 200µl dung dịch ñối chứng âm và 200µl dung dịch ñối chứng dương vào các giếng ñánh dấu riêng Ủ bản Elisa ở 370C trong 2 giờ Sau khi ủ các giếng ñược rửa bằng dung dịch ñệm rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút

Bước 3: Cố ñịnh IgG liên kết Enzyme

Hòa IgG liên kết enzyme (IgG – E) trong dung dịch ñệm liên kết Cho vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA ñược ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2

Bước 4: Cố ñịnh chất nền vào bản ELISA

Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch ñệm subtra theo tỷ lệ ñã cho Sau ñó nhỏ vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA ñể trong hộp

ẩm ñược ñặt ở nhiệt ñộ phòng Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tính, giếng không

có màu là không có phản ứng Kết quả ñược ñọc chính xác hơn trên máy ñọc ELISA ở bước sóng 405nm

2.3.1.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng

* ðịnh lượng ñường khử (phương pháp iod-Ixekutz)

Nguyên liệu: Dịch chiết ñược chuẩn bị theo phương pháp Bertrand (phụ lục 6)

Tiến hành: lấy 2 bình tam giác: Bình 1 (ñối chứng), bình 2 (thí nghiệm)

Cho vào bình 1: 5ml nước cất, bình 2: từ 2 – 5ml dịch chiết ñường, cho vào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0.05N ðun sôi 1 phút trên bếp ñiện, ñể nguội Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4 + KI), 10ml CH3COOH 10%

Chuẩn ñộ bằng Na2S2O3 0.05N cho ñến màu vàng rơm Thêm 3 giọt

tinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn ñộ tiếp cho tới khi có màu trắng sữa hoàn toàn

* ðịnh lượng tinh bột (phương pháp thủy phân bằng axit)

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit tinh bột ñược thủy phân hoàn

toàn thành ñường glucose ðịnh lượng ñường khử, suy ra hàm lượng tinh bột

Nguyên liệu: 2g củ khoai tây

Tiến hành: Nghiền 2g nguyên liệu, nghiền nhỏ, trộn ñều chuyển sang cốc Cho vào cốc 100ml nước cất, khuấy ñều từ 45-60 phút Sau ñó lọc bằng phễu có giấy lọc Tráng cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất ñể loại toàn bộ ñường khử khỏi tinh bột

Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình 250ml, dùng ñũa thủy tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bình cầu bằng nước cất (80-100ml) Sau ñó cho 125ml HCl 25% vào bình ðặt bình vào nồi cách thủy sôi, ñun nóng từ 3-4h, thỉnh thoảng lắc ñều Sau khi kết thúc thủy phân tinh bột, làm nguội bình, trung hòa dịch thủy phân bằng NaOH 10%, dùng giấy quỳ thử sao cho dung dịch thủy phân không thừa kiềm Sau ñó thêm 1-2 giọt HCl 25% ñể dung dịch thủy phân ñã ñược trung hòa có ñộ axit yếu Chuyển toàn

bộ dung dịch sang bình ñịnh mức 100ml, dùng nước cất ñịnh mức tới mức của bình Khuấy ñều, lọc dung dịch, dung dịch lọc trong suốt, ñể ñịnh lượng ñường khử

2.3.2 Các phương pháp thí nghiệm ñồng ruộng

2.3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm chậu vại

Thí nghiệm ñược bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB với 3 lần

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 9 cây ( mỗi dòng 27 cây) Các dòng cây lai soma và

các dòng “bố mẹ” sau nuôi cấy in vitro 4 tuần, ñược chuyển ra trồng trong

chậu (20x25cm) Chậu ñược ñặt trong nhà màn ñể theo dõi và ñánh giá các ñặc tính sinh trưởng, phát triển, hình thái, các ñặc tính năng suất và các yếu tố

cấu thành năng suất Các chỉ tiêu theo dõi theo qui phạm khảo nghiệm giống khoai tây 10 TCN 310-98 như sau:

- Sức sinh trưởng của cây: Yếu, khỏe, trung bình tính theo ñiểm

- Chiều cao cuối cùng của cây (cm): ðo trực tiếp từ gốc ñến ñỉnh sinh trưởng

- ðặc ñiểm củ: Hình dạng củ, ñộ sâu mắt ngủ, màu sắc vỏ củ, màu sắc ruột củ

- Các yếu tố hình thành năng suất:

 Khối lượng củ trung bình/ khóm (g): Tổng khối lượng củ/ Tổng số lượng cây thu hoạch

 Số lượng củ trung bình/khóm: Tổng số lượng củ thu ñược/ Tổng số lượng cây thu hoạch

 Khối lượng trung bình/củ: Tổng khối lượng củ/tổng số củ

- Phân loại cấp củ sau thu hoạch bằng ñường kính: ðo bằng thước pannet, nhỏ = ф< 30mm, trung bình = 30< ф< 50mm, to = ф > 50mm, không ñạt = củ khuyết tật, sâu bệnh

2.3.2.2 Phương pháp ñánh giá tính kháng virus bằng lây nhiễm nhân tạo với virus PVY theo Dr Jorg Schubert – Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng – ðức)

- Dùng bột carborundum (silicon carbide, Aldrich 357391) chà nhẹ lên

lá non của các cây thuốc lá (Nicotiana tabacum)

- Nghiền khoảng 20mg nguyên liệu lá nhiễm bệnh ñông khô trong một cối chày sứ

- Bổ sung khoảng 2 – 3ml dung dịch Na – phospate 50 mM (pH= 7.0) với một lượng nhỏ carborundum, ñồng nhất dung dịch

- Dùng que bông sát nhẹ dịch chiết virus lên lá cây thuốc lá theo chiều

từ cuống lá ñến ñỉnh lá

- Rửa sạch lá ñã lây nhiễm bằng cách phun nước sạch

- Lây nhiễm mỗi dòng 5 cây, lây trên lá ñang phát triển tốt Lây vào lúc chiều mát, thời gian lây nhanh (khoảng 15 phút) ñể ñảm bảo khả năng lây nhiễm virus

- Sau khi lây nhiễm quan sát triệu chứng biểu hiện của từng dòng và tính tỷ lệ phần trăm số cây nhiễm /tổng số cây lây nhiễm

2.3.2.3 Phương pháp xử lý kết quả thí nghiệm

Số liệu ñược xử lý trên phần mềm Excel và IRRISTAS 4.2

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 đánh giá khả năng kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây

và Ộbố mẹỢ của chúng thông qua kiểm tra gen kháng bằng phương pháp PCR

Trong phần thắ nghiệm kiểm tra gen kháng virus PVY cho các con lai soma khoai tây và Ợbố mẹỢ của chúng, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị phân tử

liên kết chặt với gen Ry sto là GP 122 406 c nhân ựược ựoạn DNA có kắch thước

406 bp và chỉ thị GP122718b nhân ựược ựoạn DNA có kắch thước 718 bp

Kết quả PCR và tiến hành ựiện di sản phẩm ựược thể hiện như sau: Qua

hình 3.1 với cặp mồi GP122406c thấy rằng cả 23 dòng vật liệu nghiên cứu ựều

có sản phẩm nhân lên với kắch thước là 406 bp Tương tự kiểm tra gen kháng

virus PVY với cặp mồi GP122718b qua hình 3.2 cho thấy tất cả các dòng vật liệu nghiên cứu ựều có ựoạn DNA ựược nhân lên với kắch thước là 718 bp

Hình 3.1 Kết quả ựiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ựặc hiệu GP

122 406 c liên kết chặt với gen Ry sto Ờ gen kháng virus PVY

406bp

406bp

Lader 4 15 14 13 12 11 1 3 7 8 100bp

10 16 17 18 19 20 21 22 23 5 6 2 9 Lader

100 bp

406 bp

Hình 3.2 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu

GP122 718 b liên kết chặt với gen Ry sto - gen kháng virus PVY

Kí hiệu các dòng giống trên bản ñiện di: 1- A15; 2-A16; 3-A41; 4-A56; 5-B208; 6- B186; 7-H76; 8-H79; 9-81-2; 10-21-1; 11- AI-47/7; 12- AII-47/11; 13- AIII- 47/14; 14- AIV- 47/24; 15 AV-47/26; 16- BI-130/2; 17-BII- 131/1; 18- BIII-131/3; 19- BIV- 131/4; 20-BV-131/5; 21- BVI-131/10; 22-BVII-131/11; 23-BVIII-131/12

Kết luận: Như vậy tất cả các dòng ”bố mẹ” và các con lai soma khoai

tây ñều có băng liên kết với gen Ry sto là gen kháng ñặc hiệu với hầu hết các chủng virus khi thực hiện PCR với cả 2 cặp mồi ñặc hiệu