nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove (phaseolus vulgarí.l) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

tumefaciens 13 1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 13 1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 16 1.5 Các nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHỆP HÀ NỘI

PHẠM THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE

(PHASEOLUS VULGARIS L) THÔNG QUA VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

PHẠM THỊ TRANG

“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE

(PHASEOLUS VULGARIS L) THÔNG QUA VI KHUẨN

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Phạm Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Luận văn ựược hoàn thành theo chương trình ựào tạo Thạc sĩ, hệ chắnh quy niên khóa 2011-2013 của trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi ựã nhận ựược sự quan tâm, giúp

ựỡ tạo mọi ựiều kiện thuận lợi của Ban Giám Hiệu và phòng đào Tạo Nhà trường; Ban chủ nhiệm khoa, các giảng viên và nhân viên bộ môn Công nghệ sinh học thực vật; Ban Giám Hiệu và các ựồng nghiệp trường đại Học Hải Dương Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trước những sự quan tâm và giúp ựỡ quý báu ựó

để có ựược kết quả trên là nhờ sự hướng dẫn và chỉ bảo tận tình của giảng viên PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, trưởng Khoa Công nghệ sinh học Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự kắnh trọng nhất ựối với cô

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới giảng viên ThS Ninh Thị Thảo, ThS Nguyễn Thị Thủy, ThS Phạm Thị Thu Hằng cán bộ tại phòng thắ nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học thực vật ựã giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Tôi còn nhận ựược sự giúp ựỡ và ựộng viên tinh thần của cha mẹ, anh chị em trong gia ựình cùng các bạn học cùng khóa Tôi thành thật cảm ơn và ghi nhớ tất cả

sự giúp ựỡ chân thành ựó

TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Tác giả luận văn

Phạm Thị Trang

MỤC LỤC

1.2 Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây ñậu cove 4

1.2.1 Tái sinh in vitro thông qua tái sinh cơ quan sinh dưỡng 5

1.3 Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13

1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 13

1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 16

1.5 Các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của V – ATPase ở côn trùng 20

1.6 Các nghiên cứu về chuyển gen RNAi vào cây trồng kháng côn trùng 22

1.7 Các nghiên cứu sử dụng RNAi cho các mục tiêu khác 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống ựậu cove 29

2.2.2 Nghiên cứu xác ựịnh ảnh hưởng của một số thông số của quy trình

2.2.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector mang gen amiRNA V-ATPase

2.3.2 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34

3.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống ựậu cove 36

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng việc bóc vỏ hạt ựến sự nảy mầm của các giống

3.1.2 đánh giá khả năng nảy mầm của các giống ựậu cove 38

3.1.3 Nghiên cứu môi trường nhân nhanh tốt nhất ựậu cove 39

3.2 Nghiên cứu xác ựịnh ảnh hưởng của một số thông số của quy trình

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ kháng sinh kanamycin ựến sức

3.2.2 đánh giá khả năng biểu hiện gen gus của các giống ựậu cove khác nhau 43

3.2.3 đánh giá ảnh hưởng của mật ựộ quang của dịch khuẩn (OD) ựến khả

3.3.4 đánh giá ảnh hưởng thời gian lây nhiễm ựến khả năng biểu hiện gen

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các

gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 15

3.1 Ảnh hưởng của việc bóc vỏ hạt ñến sự nảy mầm của các giống ñậu cove 37

3.2 Ảnh hưởng công thức nhân nhanh tới khả năng tái sinh của ñậu cove

3.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ kháng sinh kanamycin ñến sức sống của mẫu

3.4 Khả năng biểu hiện gen gus của các giống ñậu cove khác nhau 44

3.5 Ảnh hưởng của mật ñộ quang của dịch khuẩn (OD) ñến khả năng

3.6 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm ñến khả năng biểu hiện gen gus của

3.7 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau 50

DANH MỤC HÌNH

1.2 Cấu trúc của H+ V – ATPase (Kawasaki Nishi và Forgac, 2003) 21

3.3 Khả năng tái sinh giống GS012 trên các môi trường khác nhau 40

3.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ kháng sinh Kanamycin ñến sức sống của

3.5 Khả năng biểu hiện gen gus của GS012 (A) và AYOKA (B) 45

3.7 Chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau trên 51

DANH MỤC BIỂU ðỒ

3.1 Sự nảy mầm của các giống ñậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi

3.2 Ảnh hưởng của mật ñộ quang của dịch khuẩn (OD) ñến khả năng biểu

33.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm ñến khả năng biểu hiện gen gus của

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

TÓM TẮT

ðề tài ñược thực hiện nhằm nghiên cứu chuyển gen vào ñậu cove Phaseolus

vulgaris L thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các chủng Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) ñược sử dụng là LB 303 mang plasmid pBin 19 chứa gen gus

và chủng LBA 4404 mang plasmid pPSI chứa cấu trúc amiRNA (có trình tự

5’-TCAAACTCTTTGAATTGCCTT-3’) có tiềm năng làm câm gen mã hóa V-ATPase ở 5 loài sâu hại, ñể tạo cây ñậu chuyển gen kháng côn trùng

ðối tượng nghiên cứu là các giống ñậu GS012, AYOKA, BEA01, CONTENDER Sau một số thí nghiệm, chúng tôi ñã thu ñược kết quả như sau: Khử trùng hạt ngâm qua ñêm rồi tách vỏ hạt sau ñó mới cấy vào môi trường nảy mầm hạt giúp rút ngắn thời gan này mầm hạt và tăng chất lượng mẫu sử dụng cho chuyển

gen Khả năng tiếp nạp gen của ñậu cove khá khó khăn, sự biểu hiện gus ở ñậu cove

rất thấp Trong 4 giống xét nghiệm xác ñịnh ñược giống có tiềm năng ñể ñược sử dụng trong chuyển gen ñậu cove là GS012 Nguồn vật liệu cho hệ thống tái sinh cây

ñậu cove là ñốt lá mầm Nồng ñộ khuẩn thích hợp sử dụng ñể chuyển gene OD600

0,6 – 0,8 Thời gian lây nhiễm mẫu với dịch khuẩn chuyển gen là 60 phút Sau khi ñồng nuôi cấy trong tối 3 ngày, mẫu ñược rửa khuẩn và nuôi cấy trên môi trường diệt khuẩn chọn lọc

MSB5+20mg/lAS+2,5mg/lBA+0,1mg/l α-NAA+25mg/l kanamycin + 400mg/l cefotaxime +10%ND Qua 3 lần chọn lọc các chồi ñủ tiêu chuẩn ñược cấy sang môi trường ra rễ diệt khuẩn MSB5+20mg/lAS+1mg/lIBA+1mg/lGA3+400mg/l cefotaxime Sau ñó tiến hành kiểm tra PCR và chuyển cây ra ngoài nhà lưới

MỞ ðẦU

Tính cấp thiết

ðậu cove (Phaseolus vulgaris L) là nguồn cung cấp năng lượng và protein

thực vật quan trọng ở nhiều nước trên thế giới ñặc biệt ở những vùng còn thiếu nguồn protein ñộng vật (Mariam Sticklen, 2012) ðậu rau cung cấp 15% tổng lượng calories và hơn 30% tổng lượng protein cần thiết hàng ngày ở nhiều nước ñang phát triển (FAO:http//faostat.fao.org) Mặc dù có giá trị dinh dưỡng quan trọng, nhưng năng suất ñậu cove ở một số vùng trên thế giới còn thấp chưa tương xứng với năng suất tiềm năng Năng suất ñậu trung bình ở các nước Tây Á và Bắc Mĩ khoảng 1100-1500kg/ha, Châu Mĩ Latin và Châu Phi khoảng 500-600 kg/ha, trong khi tiềm năng sản lượng có thể ñạt 4000kg/ha (Aragao và Rech, 2001) Một trong những nguyên nhân làm suy giảm nghiêm trọng năng suất của ñậu rau chính là sâu hại ðậu rau dễ bị tấn công bởi 200-450 loài sâu hại trong ñó các loài sâu gây hại chính thuộc họ Lepidotera gây giảm năng suất từ 35-100% (Singh và Schartz, 2010) Bên cạnh các phương pháp phòng chống sâu hại truyền thống như sử dụng thuốc hóa học, biện pháp canh tác, biện pháp thủ công, IPM… thì việc sử dụng cây trồng biến ñổi gen là biện pháp rất ñược quan tâm chú ý, ñặc biệt việc áp dụng công nghệ RNAi trong việc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng khi gây hại trên cây (Baum và cộng sự, 2007; Mao.Y.B, 2007) Các RNAi chỉ tham gia ức chế quá trình sau phiên mã (ức chế dịch mã hoặc phân hủy mRNA), không sản sinh các protein lạ trong cây vốn là vấn ñề ñang gây tranh cãi về an toàn sinh học của cây trồng biến ñổi gen

Tuy nhiên, kĩ thuật chuyển gen cho ñậu cove vẫn gặp những khó khăn nhất ñịnh Giống như các giống ñậu khác, khó khăn chính trong quy trình chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium là tỉ lệ tái sinh thấp trong nuôi cấy mô (Svetlev và cộng sự, 2003; Zambre và cộng sự, 2005; Colpaert và cộng sự, 2008; Arellano và cộng sự, 2009) ðiều này ñược giải thích là do chúng không có khả năng hồi phục vết thương kịp thời và sự phát sinh callus thứ cấp quá mức tại vị trí cắt (Kwapata

và cộng sự, 2010) Hơn thế nữa, khả năng ra rễ của chồi tái sinh in vitro cũng là một thách

thức do chồi của ñậu cove sản sinh một lượng lớn callus làm ngăn cản sự hình thành rễ và hợp chất phenol tạo ra có thể là nguyên nhân khiến mô chết do quá trình oxi hóa (Arnaldos và

cộng sự, 2001) Trên cơ sở ñó chúng tôi ñề xuất thực hiện ñề tài “Nghiên cứu

chuyển gen vào ñậu cove (Phaseolus vulgaris L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens ”

Mục ñích, yêu cầu

Mục ñích của ñề tài nhằm xây dựng quy trình chuyển gen gus có hiệu quả

nhất ñể từ ñó áp dụng chuyển gen mang cấu trúc amiRNA ức chế biểu hiện gen

V-ATPase của một số loài sâu hại ñậu ñỗ vào ñậu cove (Phaseolus vulgaris L) thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Yêu cầu: Trong khuôn khổ một luận án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung

nghiên cứu cụ thể các nội dung sau:

- Xác ñịnh một số giống ñậu cove có hiệu quả chuyển nạp cao

- Xác ñịnh môi trường tái sinh tối ưu cho cây ñậu cove

- Xác ñịnh ảnh hưởng của nồng ñộ kanamycin ñến sức sống của mẫu cấy

- Xác ñịnh mật ñộ quang (OD) dịch khuẩn lây nhiễm thích hợp với mô nuôi cấy

- Xác ñịnh thời gian lây nhiễm thích hợp dịch khuẩn với mô nuôi cấy

- Cải tiến quy trình chọn lọc cây ñậu cove chuyển gen

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Việc thực hiện ñề tài này không những giúp cho tác giả có tư duy logic, tầm khái quát vấn ñề, am hiểu hơn lý thuyết mà còn bổ sung nhiều kinh nghiệm quý báu trong thực nghiệm

Kết quả của ñề tài tạo nền tảng cho phát triển các nghiên cứu chuyển gen ñậu cove tiếp theo ñồng thời cũng là nguồn tài liệu tham khảo cho sinh viên cũng như cho các học giả quan tâm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây ñậu cove

ðậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gốc từ Trung Mỹ và ñược trồng cách nay hơn 600 năm, là cây hàng năm quan trọng thuộc chi Phaseolus, họ Fabaceae.

Chi Phaseolus gồm 5 loài P vulgaris, P.acutifolius, P coccineus, P lunatus và P

polyanthus Trong ñó, P vulgaris là loài ñậu quan trọng thứ 2 sau ñậu tương G max

(Dillen và cộng sự, 1997) Trái ñậu non chứa khoảng 2,5% ñạm, 0,2% chất béo, 7% chất ñường bột và ñặc biệt nhiều vitamin A, vitamin C và chất khoáng, trái có thể dùng

ăn tươi, ñóng hộp và ñông lạnh Ở các nước Châu Á như: Ấn ðộ, Miến ðiện, Nepal, Sri-Lanka, Bangladesh hạt ñậu cove khô ñược sử dụng trong các bữa ăn kiêng ðậu cove là một trong những loại hoa màu thích hợp trong hệ thống luân canh với lúa và có khả năng là nguồn thu nhập khá cao cho các nông hộ (Trần Thị Ba, 2005)

P vulgaris là một loài lưỡng bội với 11 cặp nhiễm sắc thể và kích thước bộ

gen trung bình dao ñộng trong khoảng 558 ñến 637 Mbp (Bennett và Leitch, 2005) Phụ thuộc vào từng giống khác nhau mà vỏ ñậu có màu sắc khác nhau như xanh, ñen, vàng hoặc tím Mỗi quả ñậu thường chứa từ hai tới bốn hạt và hình dáng cũng thay ñổi từ dạng hình trụ tròn tới dạng dẹt

1.2 Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây ñậu cove

Xây dựng hệ thống tái sinh ñậu cove hoàn chỉnh là ñiều kiện tiên quyết cho phát triển quy trình chuyển gen vào cây (Elsa Espinosa-Huerta, 2012) Tuy nhiên, quy

trình tái sinh in vitro ñậu cove ñược ñánh giá là khó khăn trong thực tế (Chandra and

Pental, 2003; Veltcheva và cộng sự, 2005) Hiệu quả tái sinh của ñậu cove rất thấp và khả năng tái sinh tùy thuộc vào từng giống, từng loại mẫu cấy … Các mẫu ñậu cove thường sử dụng cho chuyển gen bởi Agrobacterium gồm ñốt lá mầm (McClean và cộng sự, 1991), tế bào trần (Leon và cộng sự, 1991), phôi hạt trưởng thành (Aragao và cộng sự, 1992), ñĩa lá và trụ dưới lá mầm (Franklin và cộng sự, 1993), meristem (Russell và cộng sự, 1993; Brasileiro và cộng sự, 1996), ñỉnh chồi từ hạt nảy mầm (Lewis và Bliss, 1994), trục phôi (Kim và Minamikawa, 1995)… Hầu hết các quy

trình tái sinh in vitro của ñậu cove ñều dựa trên sự phát sinh trực tiếp của chồi từ các

bộ phận này (Nagl và cộng sự, 1997; Veltcheva và cộng sự, 2005) Còn các quy trình

tái sinh gián tiếp thì hiệu quả tái sinh chồi từ callus là vô cùng thấp (Arellano và cộng

sự, 2009; Mahamune và cộng sự, 2011) hoặc có sự lệ thuộc cao vào từng giống (Zambre và cộng sự, 1998; Mohamed và cộng sự, 1993)

1.2.1 Tái sinh in vitro thông qua tái sinh cơ quan sinh dưỡng

Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là một công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống số lượng lớn, loại bỏ mầm bệnh vi rút ñồng thời giữ nguyên ñược các tính trạng tốt của cây Sự tái sinh thành công cây con từ ñỉnh sinh trưởng của ñậu cove phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kiểu gen, các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật và môi trường nuôi cấy (Arias và cộng sự, 2010)

Kiểu gen ñóng vai trò vô cùng quan trọng trong nuôi cấy in vitro ñỉnh sinh

trưởng Kwapata và cộng sự (2010) ñã sử dụng 10 giống ñậu cove và tiến hành thử nghiệm chúng trên 63 công thức môi trường khác nhau Kết quả ñã chỉ ra rằng số lượng chồi tái sinh khác nhau ñáng kể giữa các giống ñược ñánh giá ðối với giống Olathe, có hơn 20 chồi tái sinh quan sát ñược trên một mẫu còn giống Condor thì chỉ có 9 chồi/mẫu Những kết quả tương tự cũng ñược chỉ ra bởi Quintero và cộng

sự (2010) với thí nghiệm chỉ ra tỉ lệ tái sinh dao ñộng khoảng 13-100 % tùy thuộc từng loài Một nghiên cứu khác của Arias và cộng sự (2010) cho thấy số lượng chồi tái sinh trung bình trên một mô nuôi cấy là khác nhau giữa các giống, cụ thể là giống Brunca có tỉ lệ tái sinh cao nhất còn Huetar tỉ lệ tái sinh thấp nhất

Cytokinin chính là nhân tố chính cho quá trình tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng Kartha và cộng sự (1981) ñã tiến hành thí nghiệm tái sinh ñậu cove với các nồng ñộ 6 – Benzylaminopurine (BAP) khác nhau và kết quả cho thấy môi trường

bổ sung (BAP) thúc ñẩy sự phát triển của chồi từ ñỉnh sinh trường và nồng ñộ 1,0µM BAP cho tỉ lệ tái sinh cao nhất Mohamed và cộng sự (1992a) tái sinh thành công cây từ chồi bất ñịnh của phôi mầm trong môi trường bổ sung 5,0µM BAP Kwapata và cộng sự (2010) giành ñược những kết quả nhất ñịnh với việc tái sinh thành công ña chồi từ trục phôi trên môi trường MS bổ sung 11,1µM BAP và 0,57µM Indole-3-acetic acid (IAA) Ngược lại, Benedicic và cộng sự (1997) chỉ ra

rằng 6-y, y- Dimethylallylamino purine (2iP) có kết quả tốt hơn BAP trong việc cảm ứng chồi từ ñỉnh sinh trưởng

ðể tìm ra những môi trường tối ưu cho việc tái sinh ñỉnh sinh trưởng, Quintero và cộng sự (2010) tiến hành nuôi cấy trục phôi từ hạt thành thục trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1992) hoặc môi trường B5 (Gamborg và cộng sự,

1968) chứa 10mg/l BA có bổ sung hoặc ko bổ sung adenine hemisulphate (20mg/l)

Kết quả là có sự khác biệt ñáng kể trong hiệu quả tái sinh giữa hai môi trường: môi trường B5 kích thích tạo chồi 98 -100% và tái sinh thành cây hoàn chỉnh 93% còn

ngược lại kết quả cho thấy chỉ có 15-73% mẫu nuôi cấy và 29% chồi in vitro ñược

tái sinh trên môi trường MS

Bên cạnh mẫu cấy là mô phôi, thì các mẫu không phải mô phôi cũng ñược

sử dụng Hầu hết thí nghiệm ñược tiến hành với việc nuôi cấy lá mầm và ñốt lá

mầm từ hạt nảy mầm in vitro (Zambre và cộng sự, 1998; Ahmed và cộng sự,

2002; Veltcheva và cộng sự, 2005)

McClean và Grafton (1989) tiến hành tái sinh ñậu cove từ ñốt lá mầm của cây nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 5,0µM BAP Những nghiên cứu trước ñó chỉ ra rằng chồi phát sinh từ tế bào nhu mô biểu bì dưới của ñốt lá Malik và cộng

sự (1991) tiến hành tái sinh thành công cây từ lá non chứa một phần mỏng cuống lá

của P vulgaris L Mohamed và cộng sự (1992) thực hiện quá trình tái sinh chồi

bằng việc nuôi cấy ñốt lá mầm trên nền môi trường có bổ sung pyridyl- N’- phenylurea (CPPU) hoặc thidiazuron (TDZ) có nồng ñộ 0,25µM hoặc 1µM Ahmed và cộng sự (2000) phát triển quy trình tái sinh từ cây con và mô ñốt lá mầm với kết quả 100% mô nuôi cấy tái sinh chồi trên môi trường MS chứa 4,44µM BAP và 0,54µM α-Naphthalene acetic acid (α-NAA) Số lượng chồi tái sinh từ cây con là cao hơn ñáng kể so với mẫu ñốt lá mầm Họ cũng chỉ ra rằng hầu hết chồi tái sinh xuất phát từ ñỉnh sinh trưởng của lá mầm

N-2-chloro-4-Carvalho và cộng sự (2000) tiến hành nuôi cấy trụ trên lá mầm ñể tái sinh chồi Sự phân chia và phát triển của chồi ñược kích thích bằng việc nuôi cấy các mẫu này trên nền môi trường MS bổ sung BAP và nitrate bạc

Veltchva và cộng sự (2005) xây dựng hệ thống tái sinh cơ quan sinh dưỡng

từ cuống lá của cây ñậu cove con nảy mầm trong môi trường MS bổ sung BAP khoảng 7 ngày, sau ñó các mẫu cuống lá ñược ñặt trong tối trên môi trường MS bổ

sung 2µM TDZ, 0,6µM α-NAA và 2µM paclobutrazol và ra rễ cho chồi in vitro trên

môi trường MS bổ sung với 22,2µM BAP và 0,057µM IAA

P vulgaris cũng có thể ñược tái sinh từ phôi hợp tử ở giai ñoạn hình tim

hoặc hình cầu thông qua nuôi cấy phôi (Geerts và cộng sự, 1999; Geerts và cộng sự, 2000) Tuy nhiên, những quy trình này lại không hiệu quả với những phôi 8 ngày sau khi thụ phấn hoặc nếu sử dụng phôi 2 ngày sau thụ phấn, tỉ lệ tái sinh là rất thấp (2,8%) Schryer và cộng sự (2005) cung cấp một quy trình tái sinh cho tiền phôi từ phôi một ngày sau thụ phấn bao gồm cả vỏ và tỉ lệ tái sinh cây con là 12,5%

Phôi sinh dưỡng ñược cảm ứng thành công theo ñường hướng trực tiếp (Klu, 1997; Svetleva và cộng sự, 1999) hoặc gián tiếp thông qua hình thành callus (Martins và Sondahl, 1984; Jacobsen và Kysely, 1986) quá trình này phụ thuộc vào kiểu gen, loại mẫu và các chất ñiều hòa sinh trưởng

Trong mối quan hệ phát sinh phôi soma, nhiều yếu tố hóa học và vật lý ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái Ví dụ: cấu trúc hình cầu ñược phát triển từ nuôi cấy callus trên môi trường MS chứa 2,3µM kinetin, 0,9µM 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và 50mg/l casein hydrolysate Tuy nhiên các phôi soma này ñều không thể phát triển tiếp ñược (Martin và Sondahl, 1984) Những kết quả tương tự thu ñược bởi Saunders và cộng sự (1987) Họ tìm ra 45,2µM hoặc 135,7µM 2,4-D kích thích sự phát triển của cấu trúc hình cầu nhưng những cấu trúc này không phát triển ñược thành phôi soma khi chúng ñược chuyển sang môi trường MS bổ sung hoặc không bổ sung 2,4-D Cũng cho kết quả tương tự, Hoyos (1990) không thấy ñược sự khác biệt về số lượng và chất lượng của phôi soma tái sinh trong môi trường bổ sung 45,2 - 135,7µM 2,4-D và sau ñó chuyển sang hoặc môi trường tương tự hoặc tới môi trường bổ sung IBA Tác giả ñồng thời cũng chỉ ra sự không khác biệt của callus phát sinh phôi dưới ñiều kiện ánh sáng hoặc trong tối

Gần ñây, những cố gắng ñể tái sinh cây thông qua phát sinh phôi soma tập

trung vào giai ñoạn tiền nuôi cấy cho cây khởi ñầu trong môi trường giàu cytokinin Quá trình tái sinh cây giành ñược sau giai ñoạn tiền nuôi cấy của cây cho trên nền môi trường ñược bổ sung với CPPU (Mohamed và cộng sự, 1992b) ðây có thể là một trong những phương pháp ñể thay ñổi thể trạng sinh lý của mô và khởi ñộng quá trình tái sinh phôi sinh dưỡng

Kwapata và cộng sự (2010) tiến hành tái sinh phôi sinh dưỡng của mười giống ñậu cove từ trục phôi nhưng sự hình thành cây từ phôi soma là tương ñối khó khăn với hiệu quả tái sinh thấp và thời gian tái sinh kéo dài khi so sánh với việc tái sinh chồi từ chồi bất ñịnh

Mohamed và cộng sự (1992b) sử dụng ñốt lá mầm và mầm sơ cấp tách ra từ cây ñậu cove con 14 ngày tuổi ñể thử nghiệm tái sinh chồi và kết quả cho thấy số lượng chồi phát sinh là cao nhất từ mẫu tách ra từ cây con nảy mầm trong ñiều kiện tối Những ñáp ứng này tối ưu trên môi trường chứa 5µM BAP trong suốt thời kì phát triển của cây con và giai ñoạn nuôi cấy sau ñó Số lượng chồi/mẫu nuôi cấy trên môi trường chứa 0,25-1,0µM CPPU hoặc TDZ cao hơn từ 2 tới 5 lần so với môi trường bổ sung 5µM BAP

Dang và Wei (2009) ñã phát triển thành công quy trình tái sinh cho P

vulgaris từ ñốt lá mầm của cây con 6 ngày tuổi ðốt lá mầm ñược cắt ra từ cây con

6 ngày tuổi nảy mầm trên môi trường MS bổ sung thêm thidiazuron và N6benzylaminopurine (BA) Sau ñó nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 5,0mg/l BA

-ñể cảm ứng hình thành cụm chồi với tần suất cảm ứng 71,9% sau 4 tuần nuôi cấy Các chồi sau ñó ñược chuyển sang môi trường phát triển chồi chứa 1,0mg/l BA, 0,1mg/l GA3 và 2,0mg/l AgNO3 Môi trường ra rễ là môi trường ½ MS bổ sung 0,75mg/lIBA và0,02mg/l BA với tỉ lệ ra rễ là 84,3% Cây tái sinh rễ sinh trưởng tốt

và chuyển ra ñất thành công

Ninh Thị Thảo và cộng sự (2012) cũng ñã xây dựng hoàn thiện quy trình tái sinh cho cây ñậu cove Tác giả ñã nghiên cứu ảnh hưởng của hai loại mẫu khác nhau: ñốt khởi nguyên và ñốt lá mầm ñến khả năng phát sinh hình thái Kết quả cho

thấy cả hai loại mẫu có tỉ lệ cảm ứng hình thành chồi tương ñương nhau tuy nhiên

số chồi/mẫu của ñốt lá mầm cao hơn so với mẫu ñốt khởi nguyên Mẫu tốt nhất sử dụng cho chuyển gen là ñốt lá mầm Môi trường nhân nhanh tốt nhất là MSB5 bổ sung 2,5mg/l BAP + 0,1mg/l α-NAA Sau 4 tuần nuôi cấy các chồi ñủ tiêu chuẩn sẽ ñược ra rễ trong môi trường MSB5 bổ sung 1mg/l GA3 + 1mg/l IBA

1.2.2 Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus

Dillen và cộng sự (2000) cho rằng tái sinh gián tiếp thông qua cảm ứng hình thành callus phù hợp cho chuyển gen ñậu cove bằng vi khuẩn Agrobacterium hơn tái sinh trực tiếp chồi từ meristem Tuy nhiên cho tới nay, chỉ có bốn báo cáo ñược

công bố về việc tái sinh chồi P vulgaris từ callus Phát sinh hình thái chồi từ callus

với ñối tượng ñậu cove ñược báo cáo lần ñầu tiên bởi Mohamed và cộng sự (1993) Trong nghiên cứu này, callus ñược cảm ứng từ cuống nhỏ trên môi trường B5 hoặc

MS bổ sung với 2,3 hoặc 4,5µM TDZ riêng biệt hoặc kết hợp với những nồng ñộ khác nhau của IAA Những biểu hiện sớm của quá trình tái sinh chồi hình thành trên môi trường B5 chứa 4,4µM BA Sự biểu hiện ổn ñịnh của sự phát triển chiều cao và sự trưởng thành sớm ñược xác ñịnh thông qua dòng R2 từ cây tái sinh Tuy nhiên, quy trình này chỉ thành công với hai giống Tara và Xan-159 Zambre và cộng

sự (1998) cũng ñã công bố quy trình tái sinh in vitro từ callus cảm ứng từ lá mầm

của giống Xan-159 trong ñó 39% mẫu sản sinh ra mô phân sinh màu xanh thu ñược trên môi trường MSB5 bổ sung 0,45µM TDZ và 0,29µM IAA nhưng số lượng của chồi tái sinh không ñược ñưa ra Arellano và cộng sự (2009) ñã phát triển một quy

trình tái sinh in vitro cho giống P vulgaris Negro Jamapa trong ñó sử dụng ñường

hướng phát sinh cơ quan gián tiếp Trong thí nghiệm này, mô phân sinh ñỉnh chồi

và ñốt lá mầm ñược sử dụng cho cảm ứng callus trên môi trường chứa 1,5µM 2,4-D

và môi trường chứa 22,2µM BAP ñược sử dụng cho tái sinh chồi

Mahamune và cộng sự (2011) xây dựng quy trình tái sinh phù hợp cho ñậu cove từ những mẫu nuôi cấy mô khác nhau như nách lá, chồi, ñốt, lóng và rễ thông qua cảm ứng callus trên môi trường chứa 6,7µM BAP và 2,9µM IAA Tuy nhiên,

sự hình thành chồi từ callus không ñược báo cáo

1.3 Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật

Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng súng bắn gen, dùng xung ñiện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con ñường ống phấn,… Tuy nhiên, hai phương pháp thường

sử dụng cho chuyển gen ñậu cove là chuyển gen trực tiếp thông qua súng bắn gen

và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn ñất gram âm Agrobacterium bị mất ñộc tính (Dillen và cộng sự 1995; Kim và Minamikawa 1997; Aragao và cộng sự, 2002; Rech và cộng sự, 2008) Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium

là một phương pháp rất ñược ưa chuộng trong việc tạo cây chuyển gen với nhưng

ưu ñiểm như: sự tái tổ hợp tốt, số lượng bản sao thấp, hiệu quả ñồng thể hiện của gen chuyển cao (Gheysen và cộng sự, 1998)

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens

A tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong ñất gây ra bệnh khối u ở các vị trí

tổn thương của thực vật hai lá mầm Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ

Liliaceae và Amaryllidaceae bị bệnh này Mô khối u tổng hợp amino acid và các

dẫn xuất của ñường ñược gọi là opine Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi ñầu sự hình thành khối u Những opine phổ biến nhất là

Octopine và nopaline Do ñó nhiều dòng A tumefaciens phổ biến ñược thiết kế theo

kiểu octopine hoặc nopaline

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một

ñoạn ADN (T-DNA) của nó vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn ñược hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách

có hiệu quả và sử dụng nó ñể ñảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn

ðể khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các

nhà khoa học ñã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay thế vào ñó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của

T-ADN và các gen vir Gen chuyển ñược xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN Nó sẽ

ñược chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens ựã ựược kiểm tra

ựối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển ựặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp là loại mô ựược

biến nạp, giai ựoạn phát triển của mô, mức khởi ựầu của vi khuẩn A tumefaciens sử

dụng, môi trường ựể nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker ựược sử dụng ựể chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Trong thế giới ựộng-thực vật ựều tồn tại các thể plasmid đó là các vòng DNA tự do sinh sản ựộc lập Ở vi khuẩn và ựộng-thực vật, plasmid liên quan tới yếu

tố giới tắnh của tế bào, ựến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,Ầ đặc ựiểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách ựộc lập

Hình 1.1 Ti-Plasmid (http://www.patentlens.net)

Ti-plasmid ựược tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây ựộc, có

kắch thước khoảng 200-250 kb Chúng ựược duy trì ổn ựịnh trong Agrobacterium ở nhiệt ựộ dưới 30oC Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản ựồ chuỗi kép di hợp (heteroduplex mapping), người ta ựã xác ựịnh ựược Ti-plasmid có 4 vùng tương ựồng Kết quả phân tắch di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA) và vùng

gây ñộc (virulence) liên quan ñến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan ñến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium

Trong khi hình thành khối u, T-ADN ñược chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-ADN ổn ñịnh trong genome nhân Lai Ti-plasmid với ADN của khối u ñã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song song với T-ADN trong Ti-plasmid của Agrobacterium Kết quả này chứng tỏ không có

sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u ñược tạo thành Một hoặc nhiều bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các ñoạn lặp nối tiếp Chúng cũng có thể tách

ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật Vị trí hợp nhất của ADN vào ADN thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên

T-1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN

T-ADN là một ñoạn ADN có kích thước 25 kb, trong ñó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN ñược giới hạn bằng bờ phải (RB - Right Border) và bờ trái (LB - Left Border) Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho việc tái

sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một ñoạn liên tục dài 22kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một ñoạn gen liên tục dài 13kb T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan ñến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinine

Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN ñược nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt ñộng của các gen nằm trong vùng vir dưới tác ñộng kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein ñặc hiệu như virE2, virB, virD,

virD2,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết

là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các ñoạn T-ADN, bao bọc che chở các ñoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn

như: hydroxy-acetosiryngone Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens

nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Quá

trình này ñược sự trợ giúp ñặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt ñộng và tăng cường biểu hiện

Khi Agrobacterium tiếp xúc với các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc

acetosyringone tinh khiết ñã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone

và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen

virC Sau ñó protein virC ñã biến ñổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E

không hoạt ñộng và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các ñiểm ñứt sợi ñơn trong các

trình tự biên 25bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi ñơn mạch

thẳng tương ứng với T-ADN Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính

endonuclease Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN ñược chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn ñịnh vào ADN nhân

1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid

Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-plasmid ñã ñược phát triển Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển ADN vào nhân của nó Các vector không gây ung thư

hiện ñang sử dụng có thể ñược chia làm hai loại là cis và trans, dựa vào việc có hay

không các vùng T-ADN nằm ở mép các trình tự lặp lại trực tiếp 25 bp trên cùng ñơn

vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán Trước ñây,

loại vector thường ñược ñề cập ñến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần ñây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn

+ Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid ñã loại từ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất

opine nhưng vẫn giữ lại vùng gen vir và vùng bờ trái, bờ phải Thay vào những gen

bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian)

ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid Plasmid trung gian là một plasmid

tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược ở Agrobacterium Plasmid này

có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vị việc chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình thành nên vector

liên hợp Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và

hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn ñất

+ Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector

(plasmid) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium Một plasmid tách dòng

từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải nằm giữa chúng là các gen chỉ

thị và vùng gắn gen cần chuyển Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ

vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữa lại vùng gen vir Plasmid

này ñược gọi là plasmid hỗ trợ Hệ thống vector này cũng hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu

1.3.6 Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc

Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử ñộc các nhân tố

ức chế trao ñổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ Các gen chỉ thị sàng lọc

thường ñược sử dụng là các gen β-glucuronidase (gus A), luciferase và gần ñây hơn

là gen mã hóa protein huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa

Gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II (neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase)

Gen npt II: Gen nptII là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme neomycin phosphotransferase (npt II), là một enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử

khoảng 25kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148 Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP ñược gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt

do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome

Bảng 1.1 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes)

và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)

A Một số gen chỉ thị chọn lọc

B Một số gen chỉ thị sàng lọc

cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol ñánh dấu

Gen bar: Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất ñộc tính của phosphinothricin (PPT),

là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta Gen bar ñược tạo dòng ñầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Phương pháp ñơn giản nhất ñể kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp Mô, tế bào hoặc

cây chuyển gen ñược ñặt trên môi trường có các nồng ñộ phosphinithricin khác nhau (hoặc thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây ñối chứng ñặt trên cùng môi trường

Gen gusA: là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme glucuronidase

β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm ñặc trưng, dễ nhận biết β-glucuronide thường

dùng nhất trong phản ứng ñể nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) Dung dịch X-gluc không màu dưới tác ñộng của enzyme β-glucuronidase sẽ huyển sang màu xanh chàm ñặc trưng

Gen lacZ: Enzyme β-galctosidase (lacZ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối thích 7-7,5 ñược mã hóa do gen lacZ Gen lacZ ở E.coli ñược dùng rất phổ biến

trong công nghệ gen vi sinh và ñã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất

nhạy với thuốc thử X-Gal Sự tồn tại hoạt ñộng của lacZ trong tế bào thực vật ñã ñược khẳng ñịnh Vì vậy, trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaradehyde

Gen cat: ðược phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung Gen cat ñã ñược dùng rộng rãi trong công nghệ gen ñộng vật và thực vật vì gen cat mã hoa cho enzyme

chloramphenicol acetyltransferase (CAT) Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt

1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp

ðối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens thì tần số biến nạp

phụ thuộc vào các yếu tố liên quan ñến vi khuẩn và các yếu tố liên quan ñến thực vật Các yếu tố liên quan ñến vi khuẩn gồm: chủng vi khuẩn, mật ñộ vi khuẩn, thời gian

lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các câu chủ và loại vector

- Ảnh hưởng của kiểu gen: Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài ða số các báo cáo, tài liệu về chuyển gen chỉ

ñề cập ñến ảnh hưởng của kiểu gen ñến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng

nuôi cấy in vitro

- Ảnh hưởng của dạng mẫu mô ñích: các dạng mô ñược sử dụng làm mô ñích

ñể biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù tế bào Mẫu quá non hay quá già ñều ảnh hưởng ñến khả năng biến nạp Nếu mẫu non, sức sống kém dẫn ñến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn ñịnh dẫn ñến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn

- Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A.tumefaciens cho thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn

ñược sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm ñó là LBA4404, C58 ñã bị bất hoạt và EHA101 và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) (Cheng và cộng sự, 2004) Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-plasmid dạng octopin

- Nhiệt ñộ: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy ñến hiệu quả chuyển T-ADN ñã ñược phát hiện ở các loài cây hai lá mầm Nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình chuyển T-ADN có thể thay ñổi ñối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất ñịnh Nhiệt ñộ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải ñược ñánh giá với mỗi dạng mẫu mô ñích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp Ở các loài cây một lá mầm nhiệt ñồng nuôi cấy thường là 24-25oC, một số trường hợp là

28oC Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp (dưới 23oC) ñến khả năng chuyển T-ADN và

chuyển gen bền vững ñã ñược ñánh giá Biểu hiện gen bền vững gen gus tạm thời

trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi ñạt ñược cao nhất ở 22oC Tần số chuyển gen cao hơn ñã nhận ñược ở phôi ngô non sau biến nạp ñược ñồng nuôi cấy ở 20oC so với 23oC (Frame và cộng sự, 2006)

- Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và ñồng nuôi cấy: Thành phần môi trường cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến hiêu quả chuyển gen

Việc bổ sung acetosyringone chất kích thích sự hình thành các gen vir, ñã có

trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm Trong trường hợp không

có acetosyringone, mức ñộ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh

ñược cây lúa và cây hành chuyển gen

Gần ñây, việc sử dụng L-Cys bổ sung vào môi trường ñồng nuôi cấy ñã cải thiện hiệu suất chuyển gen của 3 dòng ngô (Frame và cộng sự, 2006)

- Ảnh hưởng của các chất kháng sinh ñể loại bỏ Agrobacterium: Các chất kháng sinh như: cefotaxime, Car, timentin thường ñược sử dụng loại bỏ vi khuẩn

sau khi ñồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium (Stachel và cộng sự, 1986) Hiện nay, Car ñang ñược sử dụng chủ yếu trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng ñộ 100 mg/ (Cheng và cộng sự, 2004) Và ñối với ñậu tương là cefotaxime 200mg/l, Car 250mg/l (Xue và cộng sự 2006)

- Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn: Mật ñộ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững Tuy nhiên, mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết ñối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể ñược cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường ñồng nuôi cấy (Wei D và Zhi-ming W, 2007)

Trong hầu hết các trường hợp, nếu quá trình chuyển T-ADN hiệu quả sẽ dẫn ñến khả năng chuyển gen bền vững cao Mặc dù vậy, trong nhiều ñiều kiện quá trình chuyển T-ADN tăng ñã không có kết quả trong chuyển gen bền vững Nguyên nhân có thể là do thiếu sự tương tác giữa quá trình chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững ðể có ñược sự phối hợp giữa chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững thì các ñiều kiện lây nhiễm, ñồng nuôi cấy phải thích hợp cho việc chuyển T-ADN và tái sinh cây chuyển gen (Cheng và cộng sự, 2004)

1.4 Các nghiên cứu về chuyển gen vào ñậu cove

Hiệu suất chuyển gen vào ñậu thông qua Agrobacterium rất thấp khoảng 0.1 - 5% (Atkin và Smith, 1997; Veltcheva và cộng sự, 2005) Quy trình chuyển gen có hai bước chính ðầu tiên, gen chuyển phải ñược biến nạp vào tế bào Không có khó khăn

trong bước này với ñối tượng Phaseolus (Mc Clean và cộng sự, 1991) Thứ hai là tế

bào chứa gen chuyển phải tổ hợp ổn ñịnh và tái sinh trong cây chuyển gen Bước này chính là khó khăn chính khi thực hiện trên ñối tượng ñậu (Dillen và cộng sự, 2000)

Nghiên cứu ñầu tiên về sự mẫn cảm của ñậu cove với vi khuẩn A tumefaciens

ñược thực hiện bởi Mc Clean và cộng sự (1991) Trong thí nghiệm này, 19 kiểu gen

khác nhau của P.vulgaris ñược lây nhiễm bởi ba chủng vi khuẩn A tumefaciens khác

nhau Mẫu sử dụng là ñốt lá mầm và trụ dưới lá mầm Và kết quả ñã cho thấy một số lượng lớn các kiểu gen của ñậu cove mẫn cảm với sự lây nhiễm của ba dòng vi

khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên không thu ñược cây chuyển gen nào và quy trình

này không còn ñược sử dụng trong các phòng thí nghiệm khác nữa

Franklin và cộng sự (1993) ñã tạo ñược ra callus kháng kanamycin từ ñĩa lá

và trụ dưới lá mầm của ñậu cove lây nhiễm với dòng A tumefaciens EHA101 có chứa gen gus Những phân tích về hóa sinh và phân tử ñã chỉ ra sự tổ hợp ổn ñịnh

và biểu hiện của gen gus và sự không có mặt của Agrobacterium trong callus

chuyển gen nhưng không thu ñược cây chuyển gen nào Nagl và cộng sự (1997) tiến hành quy trình chuyển gen trên nhiều mô khác nhau của cây với Agrobacterium (trục phôi, trụ dưới lá mầm, mẩu trụ trên lá mầm, ñốt lá mầm, ñốt sơ cấp và lá sơ cấp) Sau khi gây vết thương và lây nhiễm, chồi tái sinh từ ñốt lá sơ cấp ñược chuyển sang môi trường chọn lọc Tuy nhiên, cũng không thu ñược cây chuyển gen nào Barros và cộng sự (1997) cũng ñưa ra báo cáo về tái sinh chồi cây ñậu có chứa

gen gus bằng chuyển gen vào lá mầm bởi Agrobacterium và cũng không thu ñược

cây chuyển gen Liu và cộng sự (2005) cũng ñã miêu tả một quy trình chuyển gen

sử dụng Agrobacterium cho ñậu thận ñể tạo ra cây chuyển gen T2 Gần ñây, Amugume và cộng sự (2011) ñánh giá tiềm năng của hai giống ñậu cove Mwitemania và Rose coco với phương pháp chuyển gen sử dụng dòng vi khuẩn

A.tumefaciens LBA4404 bằng việc sử dụng phôi hạt trưởng thành làm mẫu lây

nhiễm Tuy nhiên, biểu hiện gen gus không ñược quan sát ở giống Rosa coco nhưng phôi của giống Mwitemania lại cho thấy biểu hiện của gen gus

Hiện nay trong chuyển gen cây họ ñậu người ta thường sử dụng 3 chủng

A.tumefaciens phổ biến là EHA101, EHA105 và LBA 4404, tuy nhiên hiệu quả của

từng chủng ñối với mỗi ñối tượng cụ thể là khác nhau, phụ thuộc vào nồng ñộ lây nhiễm, thời gian lây nhiễm, loại vật liệu lây nhiễm, các chất kích thích liên quan… Các tài liệu liên quan nghiên cứu về khả năng lây nhiễm của các chủng vi

khuẩn A.tumefaciens phải ñược kể ñến Suratman và cộng sự (2010) khi các ông thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào lá mầm của Citrullus vulgaris Nghiên cứu ñã chỉ ra

chủng A.tumefaciens EHA101 có hiệu quả hơn trong chuyển gen dưa hấu so với

chủng LBA4404 ðồng thời việc bổ sung thêm 200µM acetosyringone vào môi trường giai ñoạn ñồng nuôi cấy cũng làm tăng hiệu quả chuyển gen

ðậu cove là cây 2 lá mầm có thể tạo ra lượng lớn hợp chất phenol, chất ñược phát hiện và sử dụng ñể kích thích vi khuẩn chuyển gen Báo cáo của Balasubramani

và cộng sự (2005), Wu và cộng sự (2008) cũng ñưa ra khi bổ sung từ 10µg/l - 50µg/l acetosyringone vào dung dịch vi khuẩn khi lây nhiễm làm tăng hiệu quả chuyển gen

1.5 Các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của V – ATPase ở côn trùng

Các loại V-ATPase ñã ñược biết ñến hơn 30 năm với 2 nhóm chính là ATPase và V-ATPase Chúng là các cấu trúc vòng tròn nhỏ có chức năng giúp chuyển ñổi năng lượng của ATP thủy phân ñể trở thành năng lượng tiêu dùng cho các chức năng sinh học trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn, bao gồm cả thực vật, ñộng vật và nấm Chúng hoạt ñộng theo nguyên tắc của các bơm ion xuyên màng và chúng ñóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng quan trọng do ñây là nơi sẽ cung cấp nguyên liệu (các cation hay H+ cần cho các cấu trúc cũng như hoạt ñộng khác) Ví dụ như ở thực vật và nấm thì nó ñóng vai trò quan trọng trong việc là kênh vận chuyển Cl- ở không bào, còn ở ñộng vật là trong cấu trúc của lysosome tại quá trình axit hóa của các khoang endosoma

F-Cấu trúc của V-ATPase ñược tìm thấy ñầu tiên ở trên màng endosoma, và hiện nay chúng ñược tìm thấy ngày càng nhiều trên màng plasma tại các bơm xuyên màng Theo mô tả của ña số các nhà nghiên cứu V - ATPases bao gồm một phức V1 bên trong tế bào chất, phức này chịu trách nhiệm về sự thủy phân của ATP, và một phức tạp V0 gắn trên màng có chức năng vận chuyển các ion từ trong ra ngoài

và ngược lại Các tiểu phần của phức V1 ñã ñược nghiên cứu kỹ càng về chức năng

ít nhất là 7 tiểu phần từ A ñến G Ngược lại, các thành phần tiểu ñơn vị của V0 rất phức tạp và chưa ñược nghiên cứu rõ ràng

Chú thích:

+ Phức V0 gắn trên màng ruột có chức năng vận chuyển ion H+ ñược

ký hiệu là các tiểu phần a, c, d + Phức V1 phần màu vàng gồm các tiểu phần từ A ñến H nằm trong tế bào chất có chức năng thủy phân ATP giải phóng năng lượng

Hình 1.2 Cấu trúc của H+ V – ATPase (Kawasaki Nishi và Forgac, 2003)

Theo nghiên cứu của Sarjeet S Gill và cộng sự (1992) ñã thành công trong việc tách ñược 2 tiểu phần A và c của V - ATPase từ ruột giữa và ống Malpighian của muỗi bằng cách sử dụng các trình tự amino acid bảo thủ cho việc thiết kế mồi oligonucleotide, nhân dòng cDNA cho hai tiểu ñơn vị của V-ATPase từ ruột giữa và

ống Malpighian của ấu trùng muỗi Aedes aegypti Các cDNA có kích thước 3,1 kb

của tiểu phần A, khu vực ngoại vi V1 xúc tác mã hóa cho một protein có khối lượng 68,6 kDa Protein này có cấu trúc bảo thủ, bao gồm một ATP/GTP liên kết với nhau, tìm thấy trong tất cả các tiểu ñơn vị A khác Phân tích Southern bằng cách sử dụng các tiểu phần A như là một mẫu dò cho thấy chỉ có một bản sao duy nhất của

gen trong muỗi Aedes aegypti Các cDNA có kích thước 0,85 kb của tiểu ñơn vị c

của màng H+ ở vùng V0 mã hóa cho một protein Protein này có bốn vùng xuyên màng và chứa một acid glutamic bảo thủ cũng như ñể liên kết cho

dicyclohexylcarbodiimide Phân tích Southern bằng cách sử dụng các tiểu phần phụ

c là mẫu dò ñể thăm dò cho thấy sự hiện diện của gen liên quan nhiều hơn một

trong bộ gen của muỗi Aedes aegypti Phân tích Pileup về các tiểu ñơn vị A khác

nhau và các tiểu ñơn vị c cho thấy rằng những tiểu ñơn vị thuộc các cụm riêng biệt, trong ñó tất cả các protein của ñộng vật ngành chân ñốt thuộc cùng một nhóm Nghiên cứu của Hans Merzendorfer và cộng sự (1999) trong biểu mô ruột

giữa ấu trùng của côn trùng Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae), H+ type V -

ATPase ñược tìm thấy trên ñỉnh của tế bào hình cốc, có chức năng sinh năng lượng cho alkalinization của màng ruột duy trì ñộ pH cao hơn 11 ðối với phức V1, trình tự axit amin trong năm tiểu ñơn vị A, B, E, F, và G ở V ATPase của côn trùng ñã ñược lấy ra từ cDNAs nhân dòng và bằng chứng về sự tồn tại của tiểu ñơn vị D ñã ñược xác ñịnh nguồn gốc là từ các acid amin ðối với phức V0, cho ñến nay xác ñịnh ñược duy nhất chuỗi proteolipid 17-kDa và tiểu phần M40 có nguồn gốc từ cDNAs Dựa trên một phần trình tự axit amin thu ñược từ một chuỗi polypeptide 20-kDa có mặt trong gel sau khi SDS-PAGE2 của holoenzyme côn trùng, ñã nhân dòng ñược trình tự cDNA mã hóa một protein 9,7-kD là một protein liên kết với phức V0 Cấu trúc và chức năng của H+ V- ATPase trong côn trùng ñã ñược nghiên cứu và mô tả rõ ràng nhất trong các nghiên cứu của Helmut và cộng sự, (1999); U Klein, (1999); Helmut, (2000) H+ V-ATPases (V-ATPases) ñược tìm thấy tại hai ñịa ñiểm chính, trong màng endoplasma và plasma Các V-ATPase trên màng

plasma từ ruột giữa của ấu trùng Manduca sexta là nguồn cung cấp năng lượng

duy nhất của tất cả các quá trình vận chuyển trung gian Có 2 ñặc ñiểm quan

trọng: thứ nhất là nơi rất giàu enzyme như: holoenzyme, cytosolic và chất hòa tan

Thứ 2 các quá trình vận chuyển ion của ruột giữa ñược kiểm soát chặt chẽ bởi các

V – ATPase Cũng trong nghiên cứu này ñã ñưa ra V- ATPase gắn trên ñỉnh tế bào

hình cốc trong ruột giữa ấu trùng Manduca sexta là nơi liên kết các hoạt ñộng và

cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển K+, tạo nên dòng vận chuyển trong ruột giữa Tương tự các ông ñã nghiên cứu về vai trò của V - ATPase ñối với vận chuyển Na+ và Cl- Tạo nên kênh vận chuyển ion hoàn chỉnh trong côn trùng Như vậy ta thấy bất kỳ tác ñộng nào vào cấu trúc hay chức năng của V- ATPase ñều có thể làm ảnh hưởng rối loạn ñến các quá trình chuyển hóa năng lượng, hấp thu dinh dưỡng của côn trùng

1.6 Các nghiên cứu về chuyển gen RNAi vào cây trồng kháng côn trùng

MiRNA là những ñoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotide ñã ñược phát hiện từ lâu trong di truyền vi sinh vật, ñộng vật, thực vật và người Nhưng mãi ñến năm 1993, lần ñầu tiên, việc tách ly và phân tích ñịnh tính miRNA lin-4 và let-7 của

tuyến trùng Caenorhabditis elegans mới ñược hoàn tất

Hai miRNA này giữ vai trò quan trọng trong việc ñiều tiết ở thời kỳ phát triển nhộng (larval development) của loại tuyễn trùng này Mặc dù công trình nghiên cứu về vai trò của miRNA trong tế bào chưa ñược hoàn toàn thành công, nhưng các chuyên gia ñã có bằng chứng cho thấy sự hiện diện của miRNA có liên quan ñến sự tăng trưởng của mô và tế bào Khác với RNA thông tin (mRNA – messenger RNA), miRNA không tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein, nên ñã ñược ñặt tên là non-protein coding RNA (RNA không mã hoá protein) Trong quá trình sinh học, miRNA Gene ñã ñược tác ñộng bởi enzyme RNA Polymerase II, chuyển hoá và tạo ra microRNA nguyên thủy, ñược gọi là pri-miRNA ðây là chuỗi RNA dài hàng nghìn base, và mang ñầu 5'-CAP, và ñầu 3' là gốc ña A (Poly-A, AAAA )

Pri-miRNAs chứa ñựng ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc (Hairpin), mỗi vòng dài khoảng ~ 70 nucleotides Cũng như tất cả các RNA khác (kể cả mRNA), pri-miRNA bị tác ñộng cắt ñoạn bởi hai enzyme là DROSHA ở trong nhân và DICER ở trong tế bào chất (Cytoplasm) Sự cắt ñoạn này tạo ra các ñoạn miRNA có hoạt tính tương tự như siRNA (small interfering RNA) MiRNA kết hợp với RNA Interference (RNAi) dưới sự hiện diện của phức hợp RISC (RNA-induced Silencing Complex) sẽ tác ñộng lên một phần của mRNA dưới dạng kết hợp cặp base (Base-pairing) ñể tiết chế việc tiếp tục sinh sản hay phân giải mRNA ñã phát sinh trong tế bào

John và Daniel (2011), Niu và cộng sự (2010), ñã nghiên cứu sự bảo vệ cây trồng chống côn trùng gây hại sử dụng can thiệp RNAi ðưa ra, sự can thiệp của RNA (RNAi) gây ra bởi sợi ñôi RNA (dsRNA) ngoại sinh ñã phát triển mạnh mẽ thành một kỹ thuật ñể ñiều hòa biểu hiện gen trong một loạt các sinh vật Nghiên

cứu ñầu tiên là trên Caenorhabditis elegans ðộ nhạy của các small RNA (siRNAs)

can thiệp phụ thuộc vào cách chuyển bằng con ñường cho ăn hay thậm chí ngâm cơ

thể C elegans vào dung dịch chứa dsRNA Tuy nhiên nó không ñược lặp lại ở các

sinh vật khác Sau phát hiện ñầu tiên trong tuyến trùng, sự hấp thu của dsRNA ñược

giới hạn trong loài côn trùng mô hình Drosophila melanogaster (ruồi), hiệu ứng can

thiệp RNA ñã ñược quan sát liên tục Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần ñây cho thấy ñầy ñủ các hiệu ứng can thiệp RNAi có thể xảy ra ở tất cả côn trùng, mặc dù họ ñang thay ñổi nghiên cứu trong cùng loài và từ loài sang loài

Quy ñịnh cụ thể của biểu hiện gen thông qua cung cấp các dsRNA ñể có thể gây ra tử vong côn trùng, thông qua một loạt các thay ñổi kiểu hình, chẳng hạn như

sự can thiệp vào quá trình phát triển, hoặc sự trao ñổi chất, hoặc phản ứng với môi trường, và hiệu ứng can thiệp của hệ thống RNAi ñã ñược theo dõi liên tục, ñáng

chú ý là các rối loạn hầu hết thuộc bọ cánh cứng Tribolium confusum Trong khi

tiêm dsRNA vẫn là phương pháp ñược lựa chọn ñể chuyển vào côn trùng, thì một số loài bằng con ñường cung cấp dsRNA thông qua ăn cũng ñã ñược nghiên cứu thể hiện ñể tạo ra hiệu ứng can thiệp của RNAi Hơn nữa, biểu hiện của gen dsRNAs chống lại côn trùng trong cây trồng chuyển gen ñã ñược chứng minh tác dụng can thiệp của RNAi ñủ khả năng bảo vệ chống lại côn trùng gây hại Công nghệ này có tiềm năng là cơ sở tạo ra một thế hệ cây trồng mới, cây trồng biến ñổi gen chống lại các loại dịch hại, bổ sung cho công nghệ hiện có Phát triển hơn nữa ñể cải thiện hiệu quả bảo vệ và mở rộng phạm vi của các loài bị ảnh hưởng là ñiều cần thiết Baum và cộng sự (2007) ñã ñề xuất một phương pháp kiểm tra, với gen từ WCR (western corn root - worm) ñược xác ñịnh từ thư viện cDNA và gen mã hóa cho các chuỗi polypeptide ñã ñược dự báo ñể cung cấp các chức năng sinh học chủ yếu ñược phân loại và trở thành các gen mục tiêu Tổng cộng có 290 mục tiêu tiềm năng ñược xác ñịnh và tương ứng với dsRNAs ñược tổng hợp trong ống nghiệm, tác ñộng của chúng trên các ấu trùng ñược xác ñịnh thông qua chế ñộ ăn nhân tạo ñể thử nghiệm Sử dụng cách này có tổng cộng 14 gen từ danh sách ban ñầu ñã ñược chứng minh cụ thể ở cuối ñường hướng biểu hiện của các trình tự mục tiêu ở nồng ñộ dsRNA thấp, kết quả là làm cho côn trùng không phát triển và tử vong Trong nghiên cứu này các ông ñưa ra dsRNAs trực tiếp có khả năng tác ñộng vào ba gen mục tiêu (b-tubulin, V-ATPaseA và V-ATPase E) thông qua WCR dẫn ñến tử vong ấu trùng cao Hiệu quả nhất của dsRNA là gen mã hóa cho V-type ATPase A, nó chứng tỏ cho khả năng knockdown nhanh chóng mRNA nội sinh trong vòng 24 giờ sau khi uống vào và kích hoạt một phản ứng RNAi cụ thể với nồng ñộ thấp của dsRNA

Một cách tiếp cận khác ñưa ra bởi Mao và cộng sự (2007) khi nghiên cứu sự tương tác giữa sâu ñục quả bông và quả bông ñã phát hiện ra gen CYP6AE14 trong P450 của cytochrome Gen này tìm thấy có nồng ñộ cao trong ruột giữa của côn

trùng có biểu hiện tương quan tới sự phát triển của ấu trùng khi có Gossypol, là một hợp chất thứ cấp trong quả cây bông Gen này giúp cho côn trùng có thể ñồng hóa Gossypol Vì vậy tác ñộng ức chế biểu hiện của gen này sẽ làm cho ấu trùng nhạy

cảm với hệ thống phòng thủ của cây Sử dụng thuốc lá và Arabidopsis tạo dsRNAs

nhằm ức chế gen CYP6AE14 chống lại sâu ñục quả ðiều thú vị là dsRNA tạo ra từ

Arabidopsis dicer ñột biến (loại trực tiếp từ các gen DCL2, DCL3,DCL4 của A

Dicer) có tác ñộng ức chế biểu hiện của gen CYP6AE14 Nhóm của Mao và cộng

sự gần ñây ñã báo cáo rằng họ ñã thiết kế thành công tạo cây bông chuyển gen kháng sâu ñục quả bông thông qua RNA mạch kép - CYP6AE14 và các cây chuyển

gen cho thấy khả năng kháng Helicoverpa armigera

1.7 Các nghiên cứu sử dụng RNAi cho các mục tiêu khác

Trên cơ sở lý thuyết thì miRNA có thể áp dụng cho tất cả các ñối tượng dựa vào cơ chế của nó Hiện nay việc áp dụng công nghệ miRNA ñang ñược áp dụng rộng rãi trên nhiều ñối tượng và trong nhiều lĩnh vực:

Một chuỗi peptide mã hóa cho protein có cấu trúc xơ trong lông roi của một

số vi khuẩn Pseudomonas ñược tìm thấy là nguyên nhân gây ra sự tích tụ các miR393 trong Arabidopsis, miR393 bình thường là một mRNAs trong hộp F tiếp

nhận auxin Kết quả là trong cây khi chuyển cấu trúc miR393 vào có tính kháng lại

các vi khuẩn P.syringae (Navarro và cộng sự, 2006)

Sử dụng vector amiRNA ñể ức chế mục tiêu 2b của virus khảm dưa chuột (CMV), một chất tương tác ức chế với khối các phần hoạt ñộng của AGO1 cũng cho thấy tính kháng nhiễm CMV trong thuốc lá chuyển gen Như trong mối tương quan giữa khả năng kháng virus và amiRNA 2b- ñặc biệt cũng ñược hiển thị trong thực vật (Quetal, 2007)

Ở Việt Nam gần ñây ñã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học do Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà ñứng ñầu, là nhóm nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam ñã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả của ñề tài cấp Viện KH&CN Việt Nam ñược tiến hành trong 2

năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng

chuyển gen kháng bệnh virus” là ñã tạo ñược các cây thuốc lá chuyển gen kháng

virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng ñồng thời cả 2 loại virus trên

Kỹ thuật RNAi cũng ñã ñược tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong ñề tài trọng ñiểm cấp nhà nước thuộc chương trình phát triển công nghệ sinh học (KC04-03/06-10) với mục ñích tạo cây ñu ñủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng bệnh virus

ðề tài ñã ñược nghiệm thu cấp nhà nước trong tháng 9/2010 Một trong những kết quả ñạt ñược của ñề tài là ñã tạo ra ñược các dòng ñu ñủ chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus ñốm vòng