tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh vn93 - 1 và vc1973a bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

ĐỘ MẤT NƯỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƯỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH .... Nhận xét về khả năng chịu mất nước bằng xử lý thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu.... Chương trình ch

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÙI HỒNG XUYẾN

TẠO VẬT LIỆU PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở GIỐNG ĐẬU XANH VN93 – 1 VÀ VC1973A

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Mậu

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tâm, TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

và các anh chị Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào),

CN Hoàng Văn Mạnh (Viện khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên) đã giúp

đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp

và các thầy cô giáo, cán bộ của khoa

Tôi xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác – Viện Ngô Trung ương

đã cung cấp các giống đậu xanh làm vật liệu nghiên cứu trong luận văn

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Tác giả

Bùi Hống Xuyến

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

NAA Axit naphthyl acetic (Naphthyl acetic acid)

PCR Polymerase Chain Reaction

RADP Random Amplified polymorphic ADN ( Đa hỡnh cỏc phõn đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên)

TAE Tris acetate EDTA

SDS Sodium Dodecyl Sulphat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Trình tự các nucleotit của 10 mồi RADP được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 3.1 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi sử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi). 26

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi. 28

Bảng 3.3 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô 30

Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R0, R1 của giống đậu xanh VC1973A 33

Bảng 3.5 Thời gian sinh trưởng và phát dục của cây (ngày) 34

Bảng 3.6 Các dòng chọn lọc từ R1 37

Bảng 3.7 Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của 6 mẫu đậu xanh 40

Bảng 3.8 Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu đậu xanh khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 42

Bảng 3 9 Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên 43

Bảng 3.10 Hệ số sai khác di truyền của các dòng chọn lọc và giống gốc 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô 27

Hình 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh 28

Hình 3.3 Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô. 30

Hình 3.4 Ảnh mô sẹo khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A) 35

Hình 3 5 Một số hình ảnh cây tái sinh sau khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A) 35

Hình 3.6 Một số hình ảnh quần thể R0, R1 ngoài đồng ruộng 38

Hình 3.7 Một số hình ảnh các dòng cây tái sinh và Quần thể cây VC1973A đối chứng 38

Hình 3.8 Kết quả điện di ADN tổng số tách từ 6 mẫu đậu xanh 40

Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M1 44

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M2 45

Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M3 45

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M5 46

Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M6 46

Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M7 47

Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M8 48

Hình 3.16 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống gốc . 49

Hình 3.17 Các dòng đậu xanh ưu việt ở R1 53

MỤC LỤC

Trang

Mở đầu 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ . 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh 4

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 8

1.2.1 Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật 8

1.2.1.1 Tính chịu hạn của thực vật 8

1.2.1.2 Nguyên nhân gây hạn và tác động của hạn đến thực vật 9

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 12

1.2.2.1 Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn 12

1.2.2.2 Cơ sở sinh hoá của tính chịu hạn 13

1.2.2.3 Cơ chế phân tử của tính chịu hạn 16

1.3 Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị xoma 18

1.4 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức phân tử 19

1.4.1 RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA). 19

1.4.2 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng RAPD 20

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 23

2.2.1 Hóa chất 23

2.2.2 Thiết bị 23

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24

2.3.1.1 Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh 24

2.3.1.2 Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo 26

2.3.1.2.1 Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô 26

2.3.1.2.2 Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây 26

2.3.1.2.3 Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc 27

2.3.1.2.4 Phương pháp ra cây 27

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng 28

2.3.3 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 28

2.3.4 Phuơng pháp sinh học phân tử 28

2.3.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh 29

2.3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RADP 29

2.3.4.3 Phân tích số liệu RADP 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 THĂM DÕ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY 31

3.2 ĐỘ MẤT NƯỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƯỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH 31

3.2.1 Mức độ mất nước của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô 32

3.2.2 Khả năng chịu mất nước của mô sẹo 33

3.2.3 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô 34

3.2.4 Nhận xét về khả năng chịu mất nước bằng xử lý thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu 38

3.3 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC QUẦN THỂ R0, R1 38

3.4 ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GÔC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC 44

3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 44

3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 46

3.4.2.1 Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản 46

3.4.2.2 So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử 53

3.4.3 Nhận xét về kết quả phân tích đa hình ADN trong hệ gen của các dòng đậu xanh nghiên cứu 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học là

Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trò quan trọng thứ ba sau cây đậu tương

và lạc (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày) Theo Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau quả châu Á (AVRDC), trong phần ăn được của hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 64,12% hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B1, B2, C và một số nguyên tố khoáng như K, Na, Mg, P, Fe, Ca….[9] Vì thế hạt đậu xanh

có thể được sử dụng làm bột dinh dưỡng cho người hoặc thức ăn bổ sung cho gia súc Ngoài ra, hạt đậu xanh được dùng rộng rãi trong nhân dân để làm thực phẩm như các loại bánh (bánh tét, bánh đậu xanh, bánh chưng ), chè, xôi, cháo Đặc biệt hạt đậu xanh dùng để ủ giá được sử dụng nhiều nhất trong nhân dân Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được xem như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hòa ngũ tạng Giá đỗ thường được dùng cho người bị viêm thanh quản mất tiếng, vận động thể thao bị mỏi cơ, người béo phì, đái tháo đường, bệnh tim mạch, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, cholesterol máu cao, hiếm muộn, dễ xảy thai … chữa bệnh cho con người Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây được dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn và cải tạo đất Chất lượng protein trong hạt đậu xanh được đánh giá dựa trên chỉ tiêu quan trọng là thành phần axit amin trong protein, cũng như các cây họ đậu khác, protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các loại axit amin không thay thế Nghiên cứu hàm lượng các loại axit amin không thay thế và các loại axit amin giới hạn trong protein đạt tiêu chuẩn dinh dưỡng của FAO/WHO là một trong các hướng của chiến lược chọn tạo giống đậu xanh chất lượng cao

hiện nay

Cây đậu xanh thuộc nhóm cây trồng chịu hạn trung bình, chịu úng kém

và là loại cây trồng có quả chín không tập trung gây khó khăn cho quá trình thu hoạch Cùng với các nguyên nhân khác nên cây đậu xanh được trồng chưa nhiều ở nước ta, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ Chỉ trong thời gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển Tuy nhiên, cây đậu xanh chỉ được quan tâm trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi, trung du phía Bắc và Tây Nguyên, nơi có khí hậu khắc nghiệt mà đặc biệt thời gian khô hạn kéo dài nên năng suất chưa cao Chương trình chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta hiện nay còn hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh không chỉ có tiềm năng năng suất cao, ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn mà còn phải chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chịu hạn, chịu úng, chịu sâu và

chống bệnh tốt

Cho tới nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào để nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng được tiến hành và đạt nhiều thành tựu đáng kể đối với cây lúa, ngô, đậu tương tuy nhiên các công trình tương tự ở cây đậu xanh còn ít được công bố

Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc

sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VN93 -

1 và VC1973A bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro"

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tạọ dòng đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước và xác định sự thay đổi trong hệ gen của các dòng chọn lọc và giống gốc

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo, môi trường tái sinh cây từ phôi đậu xanh

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu ở mức độ mô sẹo

- Chọn dòng biến dị soma ở giai đoạn mô sẹo thông qua các ngưỡng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU XANH, TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ĐẬU XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây đậu xanh

Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm 7 chi

phụ: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loài thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu á mang những đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất

cho Vigna Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong số 16 loài của Ceratotropic đã được thuần hóa là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), đậu gạo (Vigna Umbellata(thumb) Ohwi và Ohashi, đậu adzukia (Vigna

anguilaris (Willd) Ohwi và Ohashi, đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacq),

Vigna trilobata (L) Wilczek Ceratotropic phân bố khắp các vùng nhiệt đới và

á nhiệt đới của châu á, Australia và các nước khác thuộc châu Á Thái Bình

Dương Dạng hoang dại của Vigna radiata được tìm thấy tại Madagasca và bờ

biển phía đông châu Phi [9]

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, có nguồn gốc từ

Ấn Độ và được phân bố rộng rãi ở các nước châu Á, Đông Nam Á, sau đó được mang tới hầu hết các châu lục khác

Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình khoảng 40 – 70

cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm Thân cây gồm 7 – 8 đốt Cây đậu xanh ít phân cành và thường phân cành muộn ,có trung bình từ 1 -5 cành Cành mọc từ nách lá thứ 2, 3 trên mỗi cành có từ 2- 3 mắt, từ đó mọc ra các chùm hoa [9]

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thuỳ với các hình dạng như ovan, thuôn dài, lưỡi mác Trên thân chính của cây có từ 7 – 8 lá, khi cây có

lá thứ 5 thì nụ hình thành Số lá, hình dạng lá có thể thay đổi tuỳ theo giống, đất trồng và thời vụ Diện tích của các lá tăng từ dưới lên đến giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn

Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút Hoa đậu xanh có màu tím hoặc màu vàng nhạt Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên người ta chia hoa đậu xanh thành 3 nhóm chính:

- Nhóm ra hoa không tập trung: hoa nở liên tiếp trên 30 ngày

- Nhóm ra hoa tập trung: hoa nở kéo dài trong khoảng 16 ngày trở lại

- Nhóm ra hoa trung gian: hoa nở trong khoảng từ 16- 30 ngày

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 – 10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng 0,3 – 0,4 mm Mỗi cây có từ 8-35 quả, mỗi quả có từ 8- 15 hạt [9]

Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh, ovan, tròn, thoi Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng), xanh tối (nâu), vàng rơm Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g

Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ con, rễ chính sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là sát rễ chính hình thành nhiều nốt sần (30- 40 nốt sần/ 1 cây) Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ, trung bình mỗi vụ 1 ha đậu xanh có thể

để lại cho đất khoảng 58- 107 kg nitơ [9] Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là

dễ bị thối khi gặp úng

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả Châu Á (AVRDC) đã có tập đoàn giống đậu xanh lớn nhất thế giới với hơn 5000 mẫu giống, trong đó

có giống cho năng suất 18-25 tạ/ha và thâm canh có thể đạt gần 40 tạ/ha

Theo kết quả điều tra của AVRDC, hàng năm trên thế giới có trên 20 nước sản xuất đậu xanh Trong đó Thái Lan, ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanka… được coi là các trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng [9]

Trong những năm 1950, Trung Quốc là nước chính về sản xuất đậu xanh, năm 1957, diện tích gieo trồng là 1,64 triệu ha và sản lượng là 800 000 tấn tuy nhiên, năng suất còn thấp chỉ vào khoảng 488kg/ha Sự sản xuất đậu xanh ở Trung Quốc suy giảm qua những năm 1960 và những năm 1970 Sau

đó, chính phủ Trung Quốc đã có những thay đổi về chính sách nông nghiệp liên quan đến sản xuất đậu xanh, áp dụng khoa học kĩ thuật tiên tiến trong sản xuất nên sản xuất đậu xanh lại được phục hồi vào những năm 1980 và đến

năm 2000, diện tích trồng là 772000 ha, sản lượng đạt 891000 tấn và năng

suất bình quân đạt 1154 kg/ha Các giống đậu xanh như: Zhong Lu (VC1973A) đạt năng suất trung bình từ 1500 – 2250 kg/ha, tối đa có thể đạt 4500kg/ha; Zhong Lu (VC2719A) đạt năng suất trung bình từ 1800 – 2250 kg/ha, tối đa có thể đạt 4050kg/ha; Er Lu (VC2778A) đạt năng suất trung bình

từ 1950 kg/ha, Su Lu (VC2768A) đạt năng suất trung bình từ 1500 – 2250 kg/ha tối đa có thể đạt 3000kg/ha; Yu Lu (VC1562A), Ji Lu (VC 2719A), Nan Lu, Wei Lu…là những giống tốt đang được gieo trồng phổ biến tại các địa phương

Năm 1986, giá trị nhập khẩu đậu xanh ở Trung Quốc là 13,6 triệu USD (0,25% tổng giá trị nhập khẩu nông nghiệp) Trong đó, Trung Quốc nhập từ Myanma 3885 tấn tương ứng 78% tổng lượng đậu xanh nhập vào Trung Quốc, từ Australia 559 tấn và từ Thái Lan 436 tấn Đến năm 2000, giá trị nhập khẩu đậu xanh ở Trung Quốc giảm xuống chỉ còn 1,4 triệu USD (0,01% tổng giá trị nhập khẩu nông nghiệp) Từ năm 1986 đến năm 2000, giá trị nhập khẩu đậu xanh hàng năm ở Trung Quốc giảm 14,4% Hiện nay, hàng năm Trung Quốc xuất khẩu đậu xanh tới hơn 60 nước và khu vực trên thế giới Năm 2000, thị trường xuất khẩu đậu xanh lớn nhất của Trung Quốc có thể kể đến là Nhật Bản (40000 tấn/ 88000 tấn), sau đó là Mỹ (8144 tấn), Việt Nam (7645 tấn), Hàn Quốc (7199 tấn), Đài Loan (4466 tấn), Anh (2479 tấn), Canada (2495 tấn), Pháp (1289 tấn)…Từ năm 1986 đến năm 2000, giá trị xuất khẩu đậu xanh hàng năm ở Trung Quốc tăng 5,8% tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp Trong đó, năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104 triệu USD (72% tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức rất cao tới 109 triệu USD (93% ) [9]

Ở Srilanka, tình hình sản xuất đậu xanh từ 1997 đến 2001 có xu hướng

giảm: về diện tích trồng từ 16636 ha (1997) xuống 10976 (2001), sản lượng

từ 15000 tấn (1997) xuống 10072 tấn (2001) và tăng nhập khẩu từ 2091 tấn (1997) lên 8916 tấn (2001) Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh hàng năm ở Srilanka khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn trong nước Do đó, lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm

2000, 2001 Các giống đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất trung bình 1200 kg/ha, MI – 5 năng suất trung bình 1500kg / ha, Ari năng suất trung bình 1700 kg/ha

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng ở nhiều địa phương trong cả nước, tùy thuộc vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu có thể phân chia các vùng trồng cây đậu xanh như sau:

- Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh Thời vụ gieo trồng từ tháng 4, 5 thu hoạch tháng 7, 8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm thuận lợi cho sinh trưởng của cây Tập quán canh tác đơn giản, ít thâm canh, năng suất thấp

- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá Đậu xanh ở vùng này được gieo trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ thu đông Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn Đây là những điều kiện cơ bản trong phát triển sản xuất

- Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên Đây là vùng có diện tích

và sản lượng gieo trồng đậu xanh lớn Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm Hàng năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ yếu Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng

- Vùng Đông Nam bộ Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nước Tuy nhiên, do không có thâm canh

và việc sử dụng các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn thấp

Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044 (VC2768A) năng suất vụ hè khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây thấp, cứng, chịu mưa và chống đổ tốt Giống ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ; giống V123 (3V123) năng suất 1800 -

2000 kg/ha, thâm canh có thể đạt 2000 – 7000 kg/ ha, có thể trồng 3 vụ/ năm; T135 năng suất 2900 kg/ha, 28% protein, ruột vàng thơm ngon, trồng ở các tỉnh phía Bắc; giống V91 – 15 (VC3528A) năng suất từ 1200 – 1400 kg/ ha, cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhều loại đất ở các tỉnh phía Nam; giống HL – 115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ ha trong vụ hè và

1400 – 2200 kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía Nam, cây cứng, ít đổ …

1.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ CHỌN DÕNG BIẾN DỊ SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đang là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng theo hướng tăng cường khả năng chống chịu Cho đến nay đã có rất nhiều công trình khoa học được công bố về kết quả nghiên cứu khả năng chịu mặn, chịu nóng, chịu hạn, chịu muối, chịu nhôm ở các đối tượng cây trồng

1.2.1 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma

Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu stress môi trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [1] Mundy và cs (1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [33] Bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105, Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và

ổn định ở thế hệ R2 [21] Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị Phòng và cs (1998, 2001) đã chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [14]

Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8 Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo

ứng từ 5,8 – 2,71, tác giả cũng chọn được một số giống địa phương như pokaly, cườm, chiêm bầu và một cố giống lúa lai như tép lai, CR203 có khả năng chống chịu [1] Ngoài ra khi xử lý nhiệt độ thấp tác giả cũng chọn được

một số dòng lúa từ các loài phụ Japonica, Javanica và Indica có khả năng

chịu lạnh (10

C)

Công trình xử lý mô sẹo lúa ở nhiệt độ cao của Nguyễn Thị Tâm

C, 420C và 520 dòng cây xanh Từ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng nổi bật là HR128 với đặc điểm là cây thấp, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng protein,

đường tan, axit amin liên kết trong hạt cao, có khả năng chịu nóng, cứng cây

và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, số hạt chắc/bông, năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [15]

Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA, manitol và saccharose, Nguyễn Hoàng Lộc (1993) [8] cũng thu được 3 dòng thuốc lá SC1, SC2, SC3 (của các giống BV23-5, BG, NTH tương ứng) có khả năng chịu được sự mất nước cực đoan (mô mất nước trên 90% so với khối lượng tươi) Kết quả phân tích về các đặc điểm sinh lý – sinh hoá ở các dòng thuốc lá này cho thấy tính chịu mất nước được điều khiển bởi một nhóm gen

Bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy Thành và

cộng sự (1995) nghiên cứu khả năng chịu nhôm và axit của các giống lúa : ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm bầu, CR203, NN8, OM 861-20, OM296

và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và Cườm có khả năng chịu được AlCl3 ở 600ppm và pH là 2,71 Mô sẹo của giống Tép lai,

Chu Hoàng Mậu và đồng tác giả (2006) tiến hành xử lý bằng thổi khô

mô sẹo các giống lạc MĐ7, L17, L14, L18, ĐBG đã nhận thấy mô sẹo của 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là ĐBG và thấp nhất là L18 [12]

Nguyễn Thu Giang (2008), tiến hành xử lý thổi khô mô sẹo của 6 giống lạc L24, L23, L08, LTB, LCB, LBK, nhận thấy mô sẹo của 6 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là L24 và thấp nhất là L08 [4]

Đối với cây đậu xanh, Nguyễn Thị Luyện (2008), khi tiến hành xử lý

thổi khô ở các ngưỡng 3, 5, 7, 9, 11 giờ ở các giống đậu xanh VN93- 1, VN93- 3, VC 1973A, ĐX 06, VC 3902A, VC 6148, VC 6372, VC 2768A nhận thấy rằng độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống và sau 3 đến 5 giờ thổi khô [10] Như vậy, kỹ thuật chọn dòng biến dị soma là vấn đề rất mới trong công tác chọn và tạo giống đối với cây đậu xanh

1.2.2 Kỹ thuật tái sinh cây từ mô sẹo

Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh Rudrabhatla Sairam và

cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy

in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó

còn phụ thuộc vào genotype của giống [35] Đối với cây ngô, sự tái sinh cây

có thể thực hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây

Sorghum; tạo mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh

chồi từ mô sẹo ở cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma

từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực

hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [28] và bằng phương pháp này đã thu tần

số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [39]… Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương

là đối tượng thực vật rất khó thực hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo

mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6] Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27

giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan,

India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật

tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen

của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [34] Các kết quả nghiên

cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [26], Ignacimuthu và Franklin (1999) [25], Renato và cs (1999, 2001) [34], Mai Trường và cs (2001) [19], Sita và cs (2006) [36], Kaviraj và cs (2006) [27] Sonia và cs (2007) [37] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế

enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi khuẩn Agrobacterium được thực

hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây

Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt lá mầm của

Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả của phương pháp này [32]

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản nhờ các mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [43] và Welsh và McClelland (1991) [42] đồng thời xây dựng Thành phần và các bước phản ứng RAPD dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (PCR) chỉ khác ở kích thước mồi

và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD vào khoảng 330

C- 450C Kĩ thuật RAPD có ưu điểm là sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit Mồi có thể bám vào bất kì vị trí nào có trình tự nu bổ sung trên phân tử ADN khuôn Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất lớn Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ

băng ADN được nhân bản Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng Vì vậy, tính đa hình thường được nhận

ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [43].Kỹ thuật RAPD là phương pháp tương đối đơn giản trong đánh giá hệ gen thực vật, nó không những khắc phục được nhược điểm của phương pháp chọn giống truyền thống mà còn góp bảo tồn nguồn gen cây trồng và nâng cao hiệu quả chọn lọc

Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn (DNA template); Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là mồi oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10

nucleotit, trong đó C + G chiếm hơn 60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động của Taq polymerase phụ thuộc vào Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat

kéo dài với sự tham gia của Taq polymerase

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là ADN khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k

các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu RAPD

có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ

Kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực và đem lại nhiều thành tựu to lớn cho ngành sinh học phân tử Người ta đã dùng

kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền phân tử [22], [30], [38], [41], nhận dạng các giống cây trồng, phát hiện quan hệ phát sinh chủng loại đối với nhiều loại cây trồng, đánh giá sự thay đổi genome của các dòng chọn lọc, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [23], [29], [31], [43]

Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ

mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [15] Ngô Thị Liêm (2006), Nghiên cứu sự đa dạng di truyền

và khả năng chịu hạn của một số giống lạc, sử dụng kĩ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 168 phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen của 5 giống lạc, cả 5 mồi đều biểu hiện đa hình [7] Bùi Thu Thủy (2006) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các dòng lúa chọn lọc R1 với giống gốc

U17 cho thấy cả 5 mồi đều biểu hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt so với giống gốc từ 0,18- 0,04 [18] Nguyễn Thu Giang (2008) sử dụng kĩ thuật RAPD phân tích đa hình của 6 mẫu lạc với 10 mồi ngẫu nhiên thì

có 6/10 cho tính đa hình [4] Vũ Anh Đào (2009) phân tích đa dạng di truyền của 16 giống đậu tương bằng chỉ thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên, có 7 mồi cho tính đa hình [3]

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau Moretzohn

và CS đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [31]

Đối với đậu xanh, sử dụng kĩ thuật RAPD để nghiên cứu một số dòng đậu xanh đột biến đã được thực hiện nhằm xác định hệ số giống nhau giữa các

dòng đậu xanh đột biến [13] Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ

có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [16], [17] Tuy vậy, ứng dụng kĩ thuật RAPD nhằm xác định quan hệ họ hàng, tìm chỉ thị ADN đặc trưng của các giống đậu xanh có năng suất cao, khả năng chịu hạn tốt còn chưa được nghiên cứu nhiều

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Hai giống đậu xanh VN93-1, VC1973A do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu

Bảng 2.1 Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu

STT Tên

giống Nguồn gốc Màu sắc hạt

Hình dạng hạt

Khả năng chịu hạn

Năng suất (kg/ha)

1 VN93 - 1

Giống lai trong nước (Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo)

Xanh - không bóng Tròn Khá 1450

2 VC1973A

Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –bóng Tròn Kém 1986

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất

Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), Tris-base 1M, BME 14M, NaCl 15M, SDS 5%, EDTA 0,5M, Choloroform : isoamyl (24 :1), STAB, isopropanol, Ethanol, TE (10mM Tribase + 1mM EDTA), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, proline chuẩn, gelatin, nước dừa, agarose, glucose

2.2.2 Thiết bị

Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng Tomy (Nhật), máy đo pH, lò vi sóng, máy điện di, máy PCR

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng Công nghệ Tế bào - Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên

- Thí nghiệm ngoài đồng ruộng được thực hiện tại Xã Phúc Hà - Thành phố Thái Nguyên

- Thí nghiệm tách ADN được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Di truyền học, Công nghệ gen của Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

- Thí nghiệm phân tích đa hình ADN được thực hiện tại Viện Khoa học

Sự sống - Đại học Thái Nguyên

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.3.1.1 Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh

đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ

Tạo mô sẹo

Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8 Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250

C i là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số

tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy

Tái sinh cây

Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l) Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30

mô, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển

Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức:

sv

r c

N

N

Trong đó: R c là khả năng tái sinh cây (%)

N r là tổng số mô tái sinh cây

N sv là tổng số mô nuôi cấy

Kéo dài chồi đậu xanh

Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7 Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau

10 ngày cấy chuyển Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn

Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6 Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần

2.3.1.2 Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo

Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô

Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý

Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức:

f

d f L

W

W W

Trong đó: W L : độ mất nước (%)

W f : khối lượng mô tươi (mg)

W d : khối lượng mô sau thổi khô (mg)

Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây

Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7)

+ Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức:

t

sv v

N

N

Trong đó: R c : khả năng tái sinh cây (%)

N r : số mô tái sinh cây

N sv : số mô sống sót

Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc

Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C  10C Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6

Phương pháp ra cây

Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu

về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường Do đó

để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên

Các bước ra cây được tiến hành như sau:

- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch

- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1: 1,5: 1,5 Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm

- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS

cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc

- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi

đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp Sau 2 tuần cây sống ra

rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng

Các dòng đậu xanh được trồng thành từng lô thí nghiệm riêng Chế độ chăm sóc giống nhau ở các dòng và giống gốc Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn sinh trưởng trong vụ xuân hè Đánh giá đặc điểm nông học của các dòng qua các chỉ tiêu : Chiều cao cây, số cành/ cây, số quả/ cây, số hạt chắc/quả, thời gian ra hoa, thời gian kết quả Quả mỗi dòng

được đánh dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng vụ tiếp theo

2.3.3 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu (S x), với n ≤ 30, α = 0,05 Các số liệu được xử

lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [11]

2.3.4 Phuơng pháp sinh học phân tử

2.3.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh

- Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá đậu xanh theo

phương pháp của Gawel và cs(1991)

- Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%

- Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ Biomate3 ở bước sóng 260nm/280nm Nồng độ ADN trong dung dịch tách

chiết được tính theo công thức:

Độ sạch ADN = OD260 / OD280 (2.6)

HSPL: Hệ số pha loãng

50: Hằng số

OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm

OD280 : Chỉ số đo dược ở bước sóng 280nm

2.3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, các mồi có trình tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự

các mồi được trình bày ở bảng 2.1

Phản ứng RAPD được tiến hành theo phương pháp của William và CS (1990) [55] Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch chứa 12,5µl

Phản ứng RAPD được tiến hành trên máy PCR Amplied Bio Systems (USA/ Singpore)

Điện di ADN tổng số và sản phẩm RAPD trên gel agarose 0,8% và 1,5%, nhuộm Ethiđium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel

2.3.4.3 Phân tích số liệu RAPD

Bảng 2.2 Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD

được sử dụng trong nghiên cứu

Số 1: xuất hiện các phân đoạn ADN

Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN

Các số liệu này được xử lý trên máy tính bằng chương trình NTSYpc version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998), để lập ra biểu đồ so sánh

sự khác nhau giữa dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ CHỌN DÕNG CHỊU HẠN Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU

3.1.1 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của hai giống đậu xanh

Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 10 ngày nuôi cấy Sau 10 ngày

và cấy trên môi trường tái sinh Khả năng tái sinh được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy

Kết quả cho thấy, cả 2 giống đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy và tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống khá cao từ 86,36% - 95,67%, trong đó tỷ lệ tạo mô sẹo của giống VN 93-1 là 86,36%; còn giống VC 1973A

là 95,67% Tỷ lệ tái sinh lại thấp hơn rất nhiều, dao động từ 12,54% - 18,32% Trong đó giống VN 93-1 có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 18,32% Giống VN 93-1 có

tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn nhưng tỷ lệ tái sinh lại cao hơn so với giống VC – 1973A

Mô sẹo của hai giống đậu xanh có màu vàng trắng, mô sẹo cứng và khô

có khả năng tái sinh cao hơn so với những mô có màu nâu đen, mô sẹo mọng nước Chúng tôi nhận thấy rằng khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo

phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống [12], [15]

3.1.2 Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi các giống đậu xanh

Để xây dựng quy trình chọn dòng chịu hạn, chúng tôi đã xác định ngưỡng chịu hạn của mô sẹo Khi tiến hành xác định khả năng chịu hạn của

các giống ở mức độ mô sẹo thông qua các chỉ tiêu về mức độ mất nước, khả năng chịu mất nước và tái sinh cây của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật

thổi khô mô sẹo với các ngưỡng 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục

3.1.2.1 Mức độ mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô

Để chọn ra các dòng tế bào có khả năng chịu mất nước, các nhà khoa học tiến hành cho các tế bào mô sẹo bị mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy Ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục, lượng nước trong mô giảm dần tới mức không thể bay hơi được nữa

Kết quả xác định khả năng chịu mất nước của mô sẹo dưới tác động của thổi khô đối với các giống VN93-1; VC1973A ở các ngưỡng thời gian là 0, 3,

5, 7, 9,11 giờ liên tục được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng

thổi khô (% khối lượng tươi)

Độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống Ở các ngưỡng xử lý từ 3 giờ đến 9 giờ, giống VC1973A đều có mức độ mất nước cao hơn giống VN93-1 Tuy nhiên, ở ngưỡng 11 giờ thổi khô mức độ mất nước của mô sẹo giống VN93-1 là 98,32% cao hơn so với giống VC1973A (95,84%) Sự khác biệt này có thể do mô sẹo giống VC1973A chứa hàm lượng chất khô lớn hơn Mức độ mất nước cao nhất ở ngưỡng xử lý 3 giờ và 5 giờ Ở các ngưỡng thổi khô 7 giờ, 9 giờ, 11 giờ, độ mất nước của mô giảm dần Nhìn chung, tốc độ mất nước giữa các giống không có sự sai khác đáng