tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã gmdreb3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam Với những giá trị kinh tế to lớn mà cây đậu tương mang lại, nó được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÀNH THỊ MAI ANH

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG

CHỊU CỦA ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2011

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU

CỦA ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62.42.70

Học viên: Bành Thị Mai Anh Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà

THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn , TS Phạm Bích Ngọc, Ths Lê Thu Ngọc cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật , Viện Công nghệ Sinh học

đã tận tình giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-KTNN và khoa Sau đại học, trường Đại học

Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2011

Học viên

BÀNH THỊ MAI ANH

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

MỞ ĐẦU……… 1

I Đặt vấn đề 1

II Mục tiêu nghiên cứu……… 2

III Nội dung nghiên cứu……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 3

1.1.1 Nguồn gốc phân loại cây đậu tương……… 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương……… 3

1.1.3 Giá trị kinh tế của cây đậu tương 5

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 7

1.3 CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN……… 11

1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn……… 11

1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn……… 12

1.3.3 Promoter rd29A……… 15

1.4 NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB……… 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 25

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA……… 25

2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA……… 26

2.2.1.3 Phản ứng PCR ……… 27

2.2.1.4 Phương pháp tách dòng gen……… 27

2.2.1.5 Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……… 29

2.2.2 Phương pháp tái sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium 30

2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium 30

2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium 32

2.2.3 Phương pháp phân tích cây chuyển gen 33

2.2.3.1 Phương pháp PCR 33

2.2.3.2 Phương pháp gây hạn nhân tạo 33

2.2.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 33

2.2.5 Phương pháp xử lý trình tự gen và amino acid 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 34

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3……… 34

3.1.1 Kết quả nhân gen DREB3 từ RNA tổng số giống đậu tương Nâu Cao Bằng 34

3.1.2 Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng ……… 35

3.1.3 Phân tích và xếp nhóm protein DREB3 dựa vào vùng bảo thủ AP2………… 39

3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ……… 42

3.2.1 Thiết kế vector ……… 42

3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… 47

3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG QUA AGROBACTERIUM……… 48

3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI ::rd29A::DREB3 vào giống thuốc lá K326……… 48

3.3.2 Kết quả phân tích và đánh giá các dòng thuốc lá thu được……… 50

3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 52

3.4.1 Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tương……… 52

3.4.2 Kết quả phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng kỹ thuật PCR…… 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 56

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN……… 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 58

PHỤ LỤC………

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DREB Dehydration responsive element binding

E coli Escherichia coli

Gus β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase)

MAP kinase Mitogen-activated protein kinases

rd29A Responsive Dehydration

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010… 6

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết……… 25

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR……… 27

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……… 27

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR……… 28

Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid……… 29

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI, SacI 29

Bảng 2.7 Môi trường nuôi cấy đậu tương……… 31

Bảng 2.8 Môi trường nuôi cấy thuốc lá……… 32

Bảng 3.1 Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid của 3 trình tự gen DREB3 thu được với gen GmDREB3 mã số DQ055133……… 38

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc 48

Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót của các mô đậu tương qua các giai đoạn chọn lọc 53

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hệ thống nhân tố phiên mã điều khiển sự biểu hiện các gen chức năng

tham gia phản ứng chống chịu với điều kiện bất lợi của Arabidopsis ………… 14

Hình 1.2 Sơ đồ về sự trả lời các tác nhân stress môi trường ……… 17

Hình 3.1 Kết quả nhân gen DREB3 ……… 34

Hình 3.2 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α …… 35

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc khuẩn lạc mang gen DREB3 ……… 36

Hình 3.4 Điện di sản phẩm cắt kiểm tra plamid bằng enzyme BamHI ………… 36

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide ……… 37

Hình 3.6 Kết quả phân tích trình tự amino acid của protein DREB3 ………… 39

Hình 3.7 Kết quả phân tích trình tự amino acid suy diễn các gen họ AP 2/ERF trên phần mềm Clustal W ……… 40

Hình 3.8 Phân tích cây phả hệ các gen họ AP2/ERF sử dụng phần mềm Cobalt 41

Hình 3.9 Mô hình mô tả các bước thiết kế vector chuyển gen ……… 42

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi DREB3-BamHI/DREB3-SacI ……… 43

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt pBI::rd29A::gus bằng BamHI và SacI 44

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu …… 45

Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid ……… 46

Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu ……… 47

Hình 3.15 Các giai đoạn phát triển của mảnh thuốc lá biến nạp ……… 49

Hình 3.16 Kết quả điện di các sản phẩm PCR các dòng thuốc lá thu được …… 50

Hình 3.17 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen……… 51

Hình 3.18 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở cây đậu tương ………… 54

Hình 3.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A và cặp mồi nhân gen virC……… 55

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng chính ở Việt Nam chỉ xếp sau

cây lúa và ngô, là nguồn nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc và cung cấp nguồn đạm thực vật cho người Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày có giá trị kinh tế cao , có tác dụng trong cải tạo đất trồng , dễ canh tác và đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau Vì vậy, cây đậu tương đã được trồng ở trên 200 quốc gia, với sản lượng trung bình hàng năm khoảng hơn 250 triệu tấn [41] Từ vị trí là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm 1980, đến nay Việt Nam đã trở thành một nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn, riêng năm 2010 là 227,651 tấn [43] Vì vậy, việc phát triển diện tích và sản lượng đậu tương là một chiến lược quan trọng trong chiến lược phát triển nông nghiệp ở Việt Nam hiện nay

Các yếu tố bất lợi của môi trường hiện đang là những thách thức lớn cho mục tiêu duy trì sự phát triển bền vững trong sản xuất lương thực cho con n gười, trong đó hạn và mặn là hai trong số những nhân tố quan trọng nhất kìm hãm sự phát triển sản xuất nông nghiệp Những năm gần đây, thế giới cũng như Việt Nam thường xuyên phải gánh chịu những biến động lớn; sự gia tăng nhiệt độ trái đất, hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thoái hóa đất gây ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất, sản lượng, chất lượng cây trồng

Đậu tương là cây chịu hạn kém [3], [10], khi thiếu nước ở các thời kỳ khác đều có ảnh hưởng xấu đến năng suất Như vậy, việc chọn và tạo được các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và được xem như định hướng nghiên cứu phát triển cây đậu tương ở Việt Nam

Cách tiếp cậ n hướng nghiên cứu về stress thực vật hiện nay đang tập trung vào phân lập và nghiên cứu đặc tính một tập hợp gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường và mối liên hệ với các stress mặn , hạn và nhiệt độ Hàng trăm gen được cảm ứng trong các điều kiện bất lợi khác nhau và sản phẩm của các gen cảm ứng với điều kiện bất lợi được chia làm hai nhóm : (1) nhóm các protein giúp thực vật chống lại bất lợi của môi trường; (2) nhóm các prot ein làm nhiệm vụ điều hòa biểu hiện gen và truyền tín hiệu

trong quá trình đáp ứng điều kiện bất lợi , nhóm này chính là cá c nhân tố phiên mã Gần đây, dựa trên những thành tựu của chương trình nghiên cứu chức năng hệ gen thực vật cùng với sự phát triển các kỹ thuật microarray , proteomic…, các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của các nhóm gen điều khiển (Transcription factor, Kinase) trong việc tăng cường tính chịu hạ n ở th ực vật Nhóm gen điều khiển mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật , nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khá c tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ chuyển một hay vài gen điều khiển, thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu của cây trồng [8]

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế

vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [Glycine Max (L.) Merrill]”

II Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập được cDNA của gen DREB3 từ cây đậu tương

- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3

- Đánh giá hoạt động của cấu trúc rd29A::GmDREB3 trên cây thuốc lá chuyển gen

- Kiểm tra khả năng hoạt động của promoter rd29A trên cây đậu tương chuyển gen

III Nội dung nghiên cứu

- Tách dòng, xác định và phân tích trình tự cDNA của gen DREB3

- Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3

- Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3 và đánh giá khả

năng chịu hạn của cây thuốc lá chuyển gen tạo được

- Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc pBI::rd29A::gus

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Nguồn gốc phân loại cây đậu tương

Đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều chỉ ra rằng đậu tương có nguyên sản ở châu Á

và có nguồn gốc từ Trung Quốc Đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung Quốc vào khoảng thế kỉ 17 trước công nguyên Sau đó, nó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ 8, du nhập vào nhiều nước châu Á khác như Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó Đậu tương được trồng ở châu

Âu vào thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ thế kỷ 18 Và ngày nay, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới, chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ…[41]

Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ Đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm

Papilionoideae, chi Glycine Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merr Có

nhiều hệ thống phân loại khác nhau, trong đó hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây

dựng được công nhận rộng rãi Theo cách phân loại này thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja Chi Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương trồng Glycine Max (L) Merr [3]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Đậu tương (Glycine max (L.) Merril) là cây hai lá mầm, thân thảo Thân cây có

nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này Nếu thân có màu xanh, hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ Chiều cao của thân từ 0,3 – 1m tùy theo giống Khác với những cây trồng khác thân cây đậu tương phát triển mạnh nhất lại chính vào lúc cây ra hoa rộ nhất Đây là lúc mà giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng

và sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng dinh dưỡng Vì vậy, trồng trọt cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây trước khi chúng bước vào giai đoạn này [3]

Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép Mỗi lá kép thường có 3 lá chét

Lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ Hình dạng của lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp Những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn [3]

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa đậu tương mọc thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3-5 hoa Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5-1% Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn phụ thuộc vào từng giống đậu tương Căn cứ vào phương thức ra hoa người ta chia đậu tương ra làm hai nhóm: nhóm ra hoa hữu hạn, hướng ra hoa từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong và nhóm ra hoa vô hạn, hướng ra hoa từ dưới lên trên

và từ trong ra ngoài [3]

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2-7cm Mỗi quả thường có 2-3 hạt Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục,… giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100-200g Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống [3]

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả

của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt sần có thể dài 1 cm,

đường kính 5-6 mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0-20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30-60kg/ha [3]

Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90-100 ngày, chín trung bình thu hoạch sau 100-110 ngày, chín muộn trung bình cho thu hoạch sau 110-120 ngày, chín muộn cho thu hoạch sau 130-140 ngày, chín rất muộn cho thu hoạch sau 140-150 ngày

Thời gian sinh trưởng của mỗi giống được đánh giá theo từng vùng và vụ trồng nhất định do thời gian sinh trưởng của nó chịu ảnh hưởng nhiều bởi thời gian chiếu sáng và nhiệt độ [3]

1.1.3 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt

Giá trị về mặt thực phẩm: hàm lượng protein cao cũng như nhiều hợp chất có giá

trị có trong hạt đậu khiến nó trở thành một trong những loại thực phẩm quan trọng nhất trên thế giới Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35-50% (phụ thuộc vào giống

và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần tạo cholesterol Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa thành phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Ngoài ra trong hạt đậu còn chứa sắt, canxi, phospho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa Vitamin trong đậu tương có nhiều nhóm B, đáng kể là vitamin B1, B2, B6, ngoài ra còn có vitamin

E, pholic acid Thành phần có trong đậu tương được nhắc tới nhiều và giúp ích cho sức khỏe con người gồm có phytosterol, lecithin, isoflavon và phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein [3]

Giá trị về mặt nông nghiệp: toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể

dùng làm thức ăn cho gia súc, sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N 6,2%; P2O5 0,7%; K2O 2,4% là nguồn thức ăn rất tốt cho gia súc Một kilogram hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Đậu tương còn

có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng Một hecta đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30-60kg N Thân, lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu [3]

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

Với những giá trị kinh tế to lớn mà cây đậu tương mang lại, nó được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng sau lúa mì, lúa nước và ngô

Do có khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi khắp năm châu lục , tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ tiếp đến là châu

Á Diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương liên tục tăng trong những năm qua Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc [41]

Ở Việt Nam, đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây đậu xanh và đậu đen Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương Vì vậy, diện tích và sản lượng đậu tương của nước

ta phát triển chậm [43]

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010 [42]

Năm Chỉ tiêu

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Diện tích (1000 ha) 165,6 183,8 204,1 185,6 187,4 192,1 146,2 197,8

Sản lượng (1000 tấn) 219,7 245,9 292,7 258,1 275,2 267,6 213,6 296,9

(Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011)

Về diện tích , đậu tương được gieo trồng trên diện tích chỉ chiếm 1 tỉ lệ rất thấp khoảng 1,5-1,6 %, xét về tốc độ thì diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm Năm 1980, diện tích trồng đậu tương là 48,8 nghìn ha, như vậy tính đến năm 2010, diện tích đã tăng

lên gấp 4,05 lần Về năng suất: năng suất bình quân của đậu tương ở nước ta là rất thấp, chỉ bằng 50% - 70% năng suất đậu tương của thế giới [42]

Với sản lượng đậu tương chưa đủ phục vụ nhu cầu , hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ nước ngoài Lượng đậu tương nhập khẩu này , ¾ dành cho sản xuất thức ăn chăn nuôi, ¼ còn lại sản xuất sản phẩm phục vụ con người [42]

Như vậy, việc phát triển diện tích và sản lượng đậu tương là rất cần thiết và yêu cầu đặt ra là phải chọn tạo ra giống đậu tương có năng suất cao hơn thông qua các biện pháp truyền thống và đặc biệt là việc áp dụng công nghệ gen

1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây Những cây có khả năng duy trì

sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện hạn gọi là cây chịu hạn Khả năng của thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn

Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào, dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài Hạn không khí thường

có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp hơn 62% Hạn không khí thường gây nên hiện tượng héo tạm thời, vì rễ cây không hút đủ nước mà quá trình thoát hơi nước quá nhanh do nhiệt độ môi trường cao Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước nhưng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế bào

và môi trường bên ngoài nên rễ cây không có khả năng hút nước [10]

Hạn hán là một trong những áp lực môi trường nghiêm trọng và ảnh hưởng đến hầu như tất cả các chức năng thực vật Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và liên quan đến các gen chịu hạn Hạn thường làm giảm 40% năng suất đậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển , từ nảy mầm đến ra hoa , tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành [23], [29]

Tác động của hạn đến hệ rễ : Đậu tương thường xuyên chịu đựng s ự thiếu nước

lớn Thực vật nói chung , đậu tương nói riêng có thể thích ứng bằng cách phát triển rễchính dài hơn, hệ thống lông rễ lớn có thể tìm nước ở các lớp đất phía dưới ẩm hơn và hút dinh dưỡng như phospho Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến độ sâu của hệ rễ đậu tương là tỉ lệ kéo dài rễ Rễ cái là dạng rễ đầu của đậu tương, xác định kiểu hình của rễ cái dưới điều kiện không stress có thể cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ Kaspar và

cs đã lấy ra 105 kiểu hình khác nhau của đậu tương từ các nhóm có tính trưởng thành khác nhau Độ dài của rễ cái trong mỗi nhóm trưởng thành biến thiên vào khoảng 1,3 cm

d-1 Các kết quả trên cho t hấy nhóm các giống có tỉ lệ kéo dài rễ nhanh hơn thường có thể hút nước trong đất ở sâu 120 cm dưới bề mặt Dưới điều kiện hạn , số lượng rễ mới /một đơn vị chiều dài rễ cái tăng lên đáng kể , nhưng không tăng chiều dài h ay đường kính rễ cái Bởi vì, sự sinh trưởng rễ và sự phân phối nước là quyết định để duy trì chức năng trong các điều kiện môi trường khác nhau , đặc tính mềm dẻo của rễ là yếu tố quyết định khả năng tìm được các nguồ n nước Stress nước hướng tới sự gia tăng phân chia khối lượng hợp chất sinh học đến rễ, gia tăng tỉ lệ rễ : thân Các cây không được tưới nước cho thấy sự gia tăng kích thước rễ khi so sánh với cây được tưới nước, xuất hiện tương quan đặc trưng giữa sức chịu đựng hạn với các đặc điểm đa dạng của rễ như khối lượng khô , kích thước toàn bộ hệ rễ , khối lượng và số lượng rễ phụ [23] Phân tích proteomic của rễ cây đậu tương xử lý hạn, phát hiện 35 protein được tạo ra và có nhiều thay đổi quan trọng

ở vùng rễ bị stress mất nước khi so sánh với điều kiện bình thường Số lượng của một số protein gia tăng , như là ferritin, trong khu vực kéo dài của rễ bị xử lý stress , có vai trò quan trọng bảo vệ tế bào chống lại các dạng oxy hoạt hoá Thông tin từ proteomic đã cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa sinh tổng hợp phenylpropanoid và sinh trưởng của rễ trong điều kiện thế nước thấp , như sự gia tăng lớn của lượng isoflavon và các bức vách phenolic, bao gồm lignin lần lượt ở vùng chóp rễ và vùng cơ bản [29]

Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm : Nitơ liên kết trong cây họ đậu rất

nhạy cảm với đất khô Trong điều kiện hạn , cây đậu tương không chỉ bị mất cân bằng lượng CO2 tích lũy và làm giảm sự phát triển diện tích lá , mà lượng nitơ liên kết cũng

không còn được giữ vững Đất khô làm giảm của hàm lượng nitơ cho quá trình tạo ra protein, làm giảm năng suất cây trồng và chất lượng hạt giống Một vài yếu tố liên quan đến ức chế nitơ liên kết trong điều kiện hạn bao gồm : hạn chế lượng oxy đi vào ; giảm dòng cacbon đến nốt sần ; giảm hoạt động tổ ng hợp đường trong nốt sần ; đồng thời tăng tích lũy urê và các amino acid tự do [23], [29] Hoạt động của nitrogenase cho thấy giảm 70% trong 4 ngày đầu gây hạn , trong khi quang hợp chỉ giảm 5%, điều này cho thấy stress nước tạo một tác động đến hoạt động của nitrogenase , mà không phụ thuộc tỉ lệ quang hợp Nó cũng cho thấy sự thiếu nước tác động đến hoạt động của nốt sần thông qua sự gia tăng khả năng chịu đựng sự khuếch tán oxy đến bacteriod Khả năng chống lại sự khuếch tán oxy được tăng cường ; giảm hô hấp nitrogenase liên kết và hoạt động các enzyme; tích lũy các chất nền hô hấp và lipid bị oxy hóa ; điều tiết ngược các gen chống lại oxy hóa; cùng với hoạt động tập trung hô hấp của bacteriod bị làm suy yếu trong điều kiện hạn, và sự hư hại oxy hóa xảy ra trong nốt sần trước khi đến tác động nào tới sinh tổng hợp đường hay leghemoglobin Đất khô thường điều khiển sự tích lũy của urê trong

lá cây đậu tương và được biết tới như một nhân tố hạn chế sự tạo nốt sần [29]

Tác động của hạn đến hình thái lá : Lông tơ lá thường là một đặc điểm phổ biến

của thự c vật chịu hạn , cũng như mộ t vài loại câ y trồng , trong đó có đậu tương Thông thường, độ dày lông tơ lá gia tăng hệ số phản xạ từ lá , dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong điều kiện chiếu sáng cao Độ dày lông tơ lá là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu tương dưới điều kiện hạn Lông tơ dày đặc được tăng cường sức sinh trưởng , rễ dày đặc hơn và mở rộng xuống sâu hơn Sự gia tăng độ dày lông tơ lá có thể làm tăng lớp ranh giới chống lại stress lên hơn 50%, giảm nhiệt độ của lá , hạn chế thoát hơi nước và tăng cường quá trình quang hợp Hơn nữa, sự gia tăng độ dày lông tơ có thể làm giảm đi đáng kể phạm vi ảnh hưởng bệnh khảm virus của đậu tương [29]

Tác động của hạn đến đặc điểm sinh lý của t hân: Một trong những đặc điểm

sinh lý liên quan đến thân có thể tác động đến khả năng chịu hạn là sự suy giảm lượng nước sử dụng trong toàn bộ cơ thể thực vật khi đất bị thiếu nước Khi sự mất nước ở đất gia tăng, thực vật phải chịu đựng một thời kỳ chuyển tiếp từ trạng thái bão hòa nước , khi

mà lượng nước toàn bộ cơ thể thực vật sử dụng không phụ thuộc vào lượng nước trong đất; sang trạng thái thứ hai khi mà nước sử dụng liên quan tr ực tiếp tới lượng nước dùng được trong đất Việc chuyển trạng thái này được kết hợp với sự giảm chỉ số dẫn truyền trung bình ở khí khổng, và có thể xảy ra phụ thuộc lượng nước trong đất khác nhau, trong nhiều loài khác nhau Tính dẫn truyền của khí khổng tác động quan trọng đến sự thay đổi sự trao đổi khí của lá và thoát hơi nước Các tác động của hạn đến sinh trưởng của lá , sự dẫn truyền của khí khổng và mối quan hệ với lượng n ước trong cây đã được nghiên cứu trong cây đậu tương Nó cho thấy rằng hạn làm giảm tương đối tỉ lệ mở rộng của lá , sự dẫn truyền của khí khổng và sức căng của lá , trong khi đó nó tăng cường lượng abscisis acid trong lá và mạch xylem Sự giảm tính dẫn của khí khổng xảy ra đồng thời với sự gia tăng abscisis acid trong xylem và xảy ra trước bất cứ sự thay đổi quan trọng nào về sức căng của lá , nó chỉ ra rằng các dấu hiệu hóa học (abscisis acid - nguồn gốc từ rễ ) điều khiển hoạt động khí khổng ở trạng thái mất nước vừa phải [9], [29]

Tác động của hạn đến áp suất thẩm thấu : Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm

thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu được các phân

tử nước hiếm hoi có trong đất nhờ vậy thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ Khi

tế bào mất nước, các chất hoà tan sẽ được tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nước, tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipid hoặc protein trong màng ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein Các chất hoà tan có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao bao gồm các ion K +

, proline, acid hữu cơ , các loại đường Khi bắt đầu mất nước , hàm lượng proline và abscisic acid tăng , tăng tổng hợp protein, nhưng nếu hạn kéo dài sẽ xảy

ra hiện tượng thuỷ phân protein Quá trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [23], [29]

Abscisic acid (ABA) được tạo ra dưới stress mất nước và đóng vai trò quan trọng trong việc chống chịu đối với hạn hán Trong trường hợp có mặt ABA quá trình đóng mở

lỗ khí được điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nước Hầu hết gen cảm ứng stress hạn

cũng được gây ra bởi tác động ABA (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki năm 1997,

2000) Tuy nhiên, trong các thể đột biến Arabidopsis aba (thiếu ABA) hoặc abi (không

nhạy cảm với ABA) có một số gen khác đã được gây ra bởi hạn hán, muối và lạnh Điều này cho thấy một số gen lại không yêu cầu ABA cho biểu hiện của chúng dưới các điều kiện mặn, hạn hán và lạnh [25]

1.3 CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn

Hạn, mặn và lạnh làm giảm tình trạng nước trong tế bào thực vật và gây tổn

thương cho cây, có thể dẫn đến chết cây Ở mức độ phân tử , điều kiện hạ n sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và tích lũy của các gen /protein chống chịu stress Một

số gen được tăng hoạt động và một số khác bị giảm hoạt động trong cây bị stress hạn Sự điều chỉnh này xảy ra ở các mức riêng biệt, từ thời điểm phát hiện stress đến việc sản xuất các protein hoạt tính sinh học (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki, 2007) Các cơ chế bảo vệ tham gia vào quá trình này là khá giống nhau trong giới thực vật Do đó, nghiên

cứu sử dụng cây mô hình, như A.thaliana và thuốc lá (Nicotiana tabacum), có thể giúp

xác định những gen có chức năng quan trọng trong cơ chế bảo vệ trong các loài thực vật khác Các gen mã hóa protein tham gia vào phản ứng của thực vật với các tác nhân stress được phân thành hai nhóm dựa vào chức năng của các sản phẩm mà chúng mã hóa [8], [19], [25]

(1) Nhóm protein chức năng tham gia trực tiếp đáp ứng điều kiện hạn , bảo vệ các đại phân tử và màng (protein LEA, osmotin, protein chống đông , chaperonin và protein liên kết mRNA…) và duy trì nước tự do qua màng (protein kênh vận chuyển nước và các kênh xuyên màng…), các enzyme xúc tác các quá trình sinh tổng hợp các chất thẩm thấu (proline, betain và đường ) và các enzyme khử độc cho phép các hoạt động sinh lý trong tế bào hay sự chuyển hóa sinh học duy trì mức bình thường (glutathinone S-transferase, epoxide hydrolase hòa tan, catalase, superoxide và ascorbic peroxidase…)[16], [25] Khả năng chống chịu với hạn hay mặn có thể được tăng cường bằng cách chuyển gen mã hóa protein LEA, protein trong tổng hợp hoặc tổng hợp betain…[25]

(2) Nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn , các nhân tố phiên mã bám vào trình tự DNA đặc hiệu trên vùng khởi động (promoter) của các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này và kết quả là tăng cường tính chịu hạn của thực v ật Các nghiên cứu về gen đã chứng minh vùng khởi động của nhiều gen chức năng chứa một hoặc nhiều trình tự DNA đặc hiệu là điểm bám của một nhân tố phiên mã Điều này chứng tỏ một nhân tố phiên mã có thể hoạt hóa biể u hiện của nhiều gen chức năng Các nghiên cứu biểu hiện gen đã chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn , chứng tỏ nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và biểu hiện của các gen tăng cường tính kháng hạn ở thực vật [8] Sản phẩm gen thuộc nhóm hai bao gồm các yếu tố phiên mã (bZIP, MYC, MYB và DREB… ); protein kinase (MAP kinase và CDP kinase, protein kinase thụ quan, protein kinase ribosome và protein kinase liên quan phiên mã…); proteinase (photphoeterase và phospholipase C…) [25], [30]

1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn

Quá trình từ DNA đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là phiên mã Các nhân tố phiên mã bám và trình tự DNA đặc hiệu trên vùng khởi động của các gen đích và

điều hòa biểu hiện của các gen này

Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở đậu tương, hơn 2000 yếu tố phiên mã từ các

mô và cơ quan chính đã đượ c xác định khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ liên quan

tính chịu hạn [29]; hệ gen của Arabidopsis có khoảng 5,9% mã hóa cho trên 1500 yếu tố

phiên mã [10], [34]

Các yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng lại stress của thực vật được chia thành các nhóm như là: AP2/ERF, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 và WRKY [31] Đặc điểm đặc trưng của các protein điều khiển (nhân tố phiên mã ) là có hai vùng hoạt động : vùng hoạt hóa các protein chức năng và vùng gắn với các trật tự DNA đặc hiệu trên promoter của gen [9] Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen chịu hạn phân loại dựa vào trật tự DNA

đặc hiệu mà chúng liên kết Vùng khởi động (promoter) của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa mộ t hoặc nhiều trật tự DNA đặc hiệu phổ biến là ABRE (yếu tố đáp ứng ABA ) và DRE /CRT (yếu tố đáp ứng hạn /đoạn lặp C ), NAC, MYB… với chức năng tương ứng là điểm bám của các protein điều khiển quá trình phiên mã biểu hiện

phụ thuộc và không phụ thuộc vào ABA [8], [19]

Nhóm nhân tố phiên mã không phụ thuộc ABA

NAC: các nhân tố phiên mã họ NAC chứa trình tự đồng nhất gọi là vùng hoạt động

NAC ở đầu N Đây là một họ gen đặc trưng ở thực vậ t, có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi, biệt hóa các cơ quan rễ, hoa trong sinh trưởng phát triển thực vật, phản ứng lại điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công [9] Hệ gen

Arabidopsis có ít nhất 100 gen họ NAC, và hệ gen lúa có 75 gen đã được phân lập nhưng

chỉ một số ít gen trong số này được nghiên cứu chức năng [34], ở đậu tương cũng có hơn

100 gen NAC được tìm thấy trong hệ gen [30] Phần lớn protein củ a các gen trong họ NAC có chứa một vùng liên kết DNA ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, một trình tự tín hiệu định vị nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi

Nhóm nhân tố DREB: trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự

lõi là A /GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen rd29 ở Arabidopsis và sau này được phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen của các gen

biểu hiện trong điều kiện hạn và l ạnh khác Các gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm AP 2 (APETALA2)/ethylene – responsive element-binding factor (ERF) bám vào

trình tự DRE và được đặt tên là : DREB1/CBF và DREB2 [19] AP2/ERF là một họ lớn bao gồm các yếu t ố phiên mã quan trọng Các protein AP 2 của Arabidopsis được chia

thành 5 nhóm dựa vào sự giống nhau trong vùng gắn DNA của chúng : họ AP2 (14 gen), họ RAV (liên quan tới ABI3/VP1) (6 gen), họ DREB (55 gen; nhóm A), họ ERF (65 gen, nhóm B), và các gen khác (4 gen), một gen rất đặc biệt AL079349 [14], [15], [16], [18] Ở đậu tương cũng có 5 nhóm gen tương tự , hiện nay có hơn 380 gen AP2/ERF được phát hiện ở hệ gen đậu tương [30] Các protein họ AP 2 chứa đựng hai vùng AP2/ERF, và các gen trong họ này tham gia điều tiết các quá trình phát triển Họ protein RAV chứa một

vùng AP2/ERF và một vùng B3, cái mà khác với các chức năng sinh học và liên quan đến các loại khác của quá trình ph iên mã Trong thực tế , các thành viên họ RAV liên quan phản ứng lại ethylene , brassinosteroid, và các stress môi trường và sinh học Đối lập với

các thành viên họ AP 2 và RAV, các protein họ DREB/CBF và ERF chỉ chứa một vùng AP2/ERF Hệ gen Arabidopsis mã hóa 145 protein liên quan DREB/CBF Các gen của họ

DREB/CBF giữ vai trò quyết định trong sự chống lại stress vô sinh ở thực vật bằng cách

nhận ra nhân tố phản ứng lại sự mất nước và lạnh (DRE/CRT) với mô hình trung tâm A/GCCGAC Họ ERF liên quan chính đến phản ứng lại stress sinh học như khi phát sinh

bệnh bằng cách nhận ra nhân tố hoạt động cis AGCCGCC hay gọi là hộp GCC Nhiều

thành viên họ ERF cũng gắn với các nhân tố DRE/CRT [39]

Hình 1.1 Hệ thống nhân tố phiên mã điều khiển sự biểu hiện các gen chức năng tham

gia phản ứng chống chịu với điều kiện bất lợi của Arabidopsis [8]

Các nhân tố phiên mã phụ thuộc ABA

Nhóm nhân tố ABRE /ABF: trật tự DNA đặc hiệu ABRE có trình tự lõi

ACGTGGC, lần đầu tiên được phát hiện nằm trên vùng điều khiển gen Em ở lúa mỳ, gen

rab16 ở lúa Hai nhóm protein điều khiển quá trình phiên mã ABRE /ABF bám vào trật tự

DNA đặc hiệu ABRE trên vùng khởi động gen và hoạt hóa sự biểu hiện các gen liên quan

tính kháng hạn của các cây chuyển gen Trên cây mô hình Arabidopsis, biểu hiện gen

ABF3 và AREB2/ABF4 đều tăng cường tính kháng hạn của cây chuyển gen , trong khi đó

biểu hiện của gen ABF2 lại đồng thời làm tăng cường tính kháng hạn , mặn và nhiệt độ cao của cây chuyển gen [19]

Nhóm nhân tố MYB và MYC : hai gen điều khiển quá trình phiên mã ở

Arabidopsis có tên gọi AtMYC2 và AtMYB2 cũng được công bố bám vào trật tự DNA đặc

hiệu MYC (CANNTG) và MYB (C/TAACNA/G) trên đoạn điều khiển gen rd22 Gen rd22

mã hóa protein đồng nhất với protein ở hạt và có vai trò quan trọng trong quá trình sinh

tổng hợp protein Biểu hiện các gen AtMYC và AtMYB làm cho cây Arabidopsis chuyển

gen có biểu hiện mẫn cảm với ABA và có tính kháng hạn cao [31]

Nhóm gen điều khiển đáp ứng hạn khác

Gần đây , các nhóm gen điều khiển khác như protein kinase và cá c gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ABA cũng là vấn đề được quan tâm trong các nghiên cứu nhằm tăng cường tính kháng hạn của thực vật Các proten kinase xúc tác việc chuyển một gốc phosphate từ các hợp chất giàu năng lượng như ATP tới các protein trong tế bào thông qua phản ứng phosphoryl hóa và chuyển các protein đó từ trạng thái bất hoạt sang dạng hoạt động Vì vậy , các protein kinase đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng hoặc giảm hoạt tính protein và trong quá trình truyền tín hiệu từ các tín hiệu bề mặt tế bào đến các protein điều khiển , các protein chức năng trong tế bào Về khía cạnh chịu hạn, các protein kinase tham gia vào con đường truyề n tín hiệu từ môi trường đến các nhóm gen điều khiển phiên mã và hoạt hóa các gen này , qua đó hoạt hóa các gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn Ngoài ra, các protein kinase cũng trực tiếp hoạt hóa các gen chức năng tham gia vào phản ứng kháng hạn của thực vật [8]

Sự biểu hiện của gen rd29A (cor78 hay LTI78) là khác nhau dưới các điều kiện

hạn, mặn, lạnh, hay xử lý ABA ngoại bào Trong trình tự đoạn promoter đầy đủ kích

thước khoảng 1300bp của gen rd29A có ít nhất hai loại nhân tố cis [9], [25], ABRE liên

quan đến phản ứng lại stress kết hợp với ABA , và DRE phản ứng lại stress k hông phụ

thuộc ABA Sự biểu hiện gen rd29A là khác biệt với các gen rd khác, khi phân tích promoter của chúng đã xác định rằng nhân tố cis DRE (TACCGACAT) liên quan đến sự biểu hiện nhanh đầu tiên của gen rd29A dưới stress hạn , mặn, lạnh Nhân tố cis ABRE liên quan đến sự biểu hiện thứ hai chậm hơn của gen rd29A dưới các điều kiện stress này Gen rd29A có thể gây ra bởi các stress khi nhân tố cis ABRE được loại bỏ khỏi vùng

promoter

DRE: Hai nhân tố hoạt động cis DRE tìm thấy trong vùng promoter rd29A [9],

[16] Vùng lặp 9bp chính xác là (TACCGACAT), với CCGAC là vùng trung tâm , nhóm

lại thành nhân tố DRE , có chức năng phản ứng nhanh ban đầu của rd29A chống lại hạn , mặn, lạnh [16], [22], [36] DRE là nhân tố cis cần thiết cho sự điều tiết rd29A được gây ra

bởi phản ứng lại sự mất nước không phụ thuộc ABA ở Arabidopsis Các mô hình liên

quan đến DRE đã được báo cáo trong promoter của vài gen điều tiết bởi stress thẩm thấu

và nhiệt độ, bao gồm kin1, cor6.6/kin2, và rd17/cor47 ở Arabidopsis [22], [26], [36] Một

mô hình giống như vậy cũng được tìm thấy trong vùng promoter của gen gây ra bởi lạnh

và sự mất nước cor15A Trong nghiên cứu gần đây, 16 gen chứa đựng

5’-TACCGACAT-3’ hay mô hình CCGAC được xác định trong vùng promoter của các gen gây ra bởi stress

hạn ở Arabidopsis [21], [35]; giống các yếu tố phiên mã DREB1A và DREB2

ABRE: Hầu hết , không phải tất cả các gen gây ra bởi sự mất nước đề u gắn với hoocmon thực vật Sự khác biệt phần lớn dựa vào các nhân tố cis xuất hiện trong

promoter của các gen gây ra bởi ABA Các cách phụ thuộc ABA quan tâm đến gen biểu hiện trung gian thông qua nhân tố ABRE và yếu tố phiên mã b -ZIP, trong khi cách khác thông qua các nhân tố MYC và MYB và các yếu tố phiên mã [16], [22] Nhiều nhân tố

điều tiết cis được xác định như là nhân tố phản ứng lại ABA (ABRE) Trong số chúng ,

(C/T)ACGTG(G/T)C có chức năng giống ABRE ở nhiều gen Nhân tố trung tâm của

ABRE là CACGTG hay hộp G có chức năng điều tiết các gen thực vật , làm cho chúng hoạt động bởi các dấu hiệu môi trường đa dạng Các nghiên cứu có hệ thống sự gắn DNA cho thấy rằng các nucleotide bên cạnh vùng trung tâm ACGT g ắn DNA đặc hiệu và theo

sau hoạt hóa gen Tuy nhiên, trong các promoter như là CDeT27-45 và CDeT6-19, phân lập từ C.plantagineum, hộp G liên quan ABRE không xuất hiện để làm yếu tố chính quyết

định phản ứng lại hạn hay ABA [16]

Hình 1.2 Sơ đồ về sự trả lời các tác nhân stress môi trường [26]

Hiện nay, promoter rd29A thường được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen liên

quan đến tính chịu hạn , nhằm tăng cường tính chống chịu của cây chuyển gen với c ác

stress môi trường Promoter rd29A có vai trò điều hòa hoạt động của gen chuyển , nhằm

mục đích tăng cường hoạ t động của gen từ đó tăng cường hoạt động chống lại stress của cây trồng [9]

Tác giả Trần Thị Cúc Hòa khi chuyể n cấu trúc vector pPNT ::rd29A::DREB1A bằng phương pháp biến nạp thông qua Agrobacterium vào giống đậu tương Meverick ,

trong giai đoạn tạo chồi thì khoảng 50% chồi phát triển chậm, lá dày, thân chồi ngắn hơn

so với cây đối chứng khô ng chuyển gen Khi ra cây có 12 cây trong đó 3 cây dạng hình thấp, lá cứng và dày hơn cây đối chứng không chuyển gen [7] Như vậy, trong điều kiện không xử lý stress , cấu trúc gen chuyển trong điều kiện bình thường sẽ không hoạt động tuy nhiên có thể chèn lên các cấu trúc khác từ đó đã ảnh hưởng tới hình thái của cây đậu tương chuyển gen

Phân tích so sánh các dòng cây chuyển gen rd29A::GmDREB3 ở cây Arabidopsis

và thuốc lá với cây đối chứng trong đi ều kiện xử lý stress cho thấy : Khi xử lý hạn , tất cả

các cây đối chứng bị chết , trong khi đó 85% các dòng mang cấu trúc rd29A::GmDREB3 còn sống sót Kết quả cho thấy sự biểu hiện của GmDREB3 cải thiện tính chịu hạn của

cây chuyển gen Các phân tích tính chịu muối cho thấy sinh trưởng của các cây đối chứng

bị hạn chế, trong khi các cây chuyển gen duy trì sinh trưởng bình thường , chiều dài trung bình của rễ và các phần trên mặt đất của cây ch uyển gen đều lớn hơn so với cây đối chứng Đánh giá về sự biến đổi kiểu hình cho thấy , ở giai đoạn trưởng thành và giai đoạn

cây non, chiều cao trung bình của cây chuyển gen rd29A::GmDREB3 giống với cây đối chứng Vì vậy, sự biểu hiện chủ yếu của GmDREB3 trong Arabidopsis gây ra hiện tượng

cây lùn không mong muốn , trong khi đó sự biểu hiện của GmDREB3 điều khiển bởi

promoter gây ra bởi stress rd29A hạn chế tối thiểu tác động tiêu cực đến sinh trưởng bình

thường của cây chuyển gen trong điều kiện bình thường Đánh giá sự biến đổi sinh lý của cây chuyển gen cho thấy: khối lượng tươi, hoạt động thấm thấu, hàm lượng chlorophyll trong

lá cây của cây đối chứng và cây chuyển gen trong điều kiện bình thường là giống nhau; còn trong điều kiện xử lý hạn, mặn, lạnh thì cây chuyển gen cao hơn nhiều so cây đối chứng Khi xem xét đến hàm lượng proline tự do, cây chuyển thuốc lá chuyển gen tích lũy mức cao hơn

so với cây đối chứng dưới điều kiện hạn Các kết quả trên cho thấy cây chuyển gen

GmDREB3 tăng cường tính chống chịu của cây thuốc lá trong điều kiện hạn và mặn [15]

1.4 NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB

Protein liên kết với yếu tố phản ứng lại sự mất nước (DREB) là những yếu tố phiên

mã quan trọng liên quan đến stress môi trường và khả năng chịu đựng stress của cây

trồng Nghiên cứu cấu trúc các protein họ DREB đã chỉ ra rằng chúng có chứa vùng bảo

thủ duy nhất để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ ERF, cho phép chúng tương tác với một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và các yếu tố phiên mã có chứa nó được tìm thấy ở nhiều loài thực vật [32],

[38] Vùng bảo thủ AP2/ERF của protein DREB có khoảng 60 amino acid Thông qua đặc điểm cấu trúc của các yếu tố phiên mã DREB, có thể chia chúng thành 6 nhóm nhỏ từ A1 đến A6 [15], [20] Các protein DREB của các nhóm khác nhau giữ nhiều vai trò ở thực vật

Khi so sánh trình tự amino acid của các protein DREB từ nhiều loài khác nhau cho

thấy trình tự giống nhau cao trong vùng AP2/ERF Tuy nhiên, trình tự giống nhau ít hơn ở

vùng đ ầu N và đầu C của các protein DREB Các nhóm protein DREB, ngoại trừ các

thành viên nhóm A4 và A5, đều có một mô hình bảo thủ cao ở vùng cuối của các trình tự protein, lần lượt là LWSY (A1), GDDGFSLFxY (A2), GSIWDxxDPFF (A3) và KYPSxEIDW (A6) [ 40] Vùng giữa các yếu tố phiên mã DREB có vùng bảo thủ giàu

Ser/thr gần kề vùng AP 2/ERF, gắn với DNA chịu trách nhiệm phosphoryl hóa protein

DREB dưới các điều kiện khử nước [32], [40]

Các yếu tố phiên mã DREB có thể xác định và gắn nhân tố hoạt động cis

CRT/DRE (A/GCCGAC) trong các promoter và điều tiết sự biểu hiện của các gen liên quan đến stress môi trường ở thực vật bậc cao Bảy vị trí quan trọng liên quan tới sự tương tác đặc trưng cao với nhân tố CRT /DRE trong vùng AP2/EREBP lần lượt là 4 Arg (R), 2 Trp (W) và 1 Val (V) [40] Hai nhân tố quan trọng YRG và RAYD định vị trong vùng AP2/EREBP có thể gắn với trình tự promoter hoặc các protein tương tác khác Nhân tố YRG là vùng có thể hút nước trong khu đầu N của vùng AP 2/EREBP, chứa đựng 19 đến 22 amino acid [40]

Phân tích protein cho thấy rằng cấu trúc vùng AP 2/EREBP chứa đựng 3 dải chuẩn không tương đương β và dải xoắn ốc α chạy song song với dải β [18], [40] Hai dải β đầu tiên thuộc vào nhân tố YRG , V14 và E19 trong dải β thứ hai giữ vai trò quan trọng trong

việc gắn các nhân tố cis DRE [18], [40] Kết quả các đột biến thực nghiệm phát hiện ra

rằng các đột biến E19 không tác động đến việc gắn giữa yếu tố phiên mã DREB1A và nhân

tố cis DRE, nhưng vị trí đột biến tại vị trí V 14 hầu như điều khiển sự mất hoạt động của

protein DREB1A gắn với nhân tố cis DRE Trong khi đó, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra

rằng E19 không bảo thủ trong DREB1 từ lúa và lúa mạch và thay vào đó bởi valine Trong

hầu hết các loại protein OsDREB1, valine được tìm thấy ở cả vị trí 14 và 19, ngoại trừ

DREB1C Các protein loại protein DREB1 khác trong phân lớp một lá mầm (lúa mạch ,

lúa mỳ và lúa mạch đen ) đều có một valine ở vị trí 19 Hơn nữa, qua so sánh các trình tự

protein DREB trong nguồn dữ liệu Arabidopsis thaliana với các loài khác tìm thấy ở tất

cả các loài có valine ở vị trí 14 trong khi không thường xuyên có glutamate ở vị trí 19, từ đó đưa ra đề xuất rằng V14 giữ vai trò quan trọng trong việc gắn các yếu tố phiên mã với

nhân tố hoạt động cis DRE hơn E19 [14], [27], [32], [37], [38] Nhân tố RAYD khác trong đầu C của vùng AP2/EREBP có chiều dài 42 đến 43 amino acid Vùng 18 amino acid trung tâm bảo thủ cao của RAYD được dự đoán là dạng xoắn α có hai đầu phân cực trong vùng AP2 Nghiên cứu cho thấy rằng, A37 bảo thủ trong xoắn α của vùng AP2/EREBP có thể giữ vai trò quyết định trong việc gắn DNA hoặc sự ổn định của vùng AP2/EREBP Một dải β thứ

3 trong vùng AP2/EREBP chứa đựng mô hình WLG , thuộc vào RAYD Chức năng chính

của nhân tố RAYD là để điều tiết hoạt động gắn đặc trưng của các yếu tố phiên mã DREB

bằng cách tác động thể cấu tạo của nhân tố YRG hay tương tác với các protein khác [40]

Sự biểu hiện ra ngoài chủ yếu của DREB1A trong cây chuyển gen Arabidopsis gây

ra biểu hiện mạnh của các gen phản ứng lại stress theo chiều thuận dưới điều kiện không

có stress, tăng cường khả năng chịu lạnh và sự khử nước Tuy nhiên, sự biểu hiện ra ngoài

chủ yếu của DREB2A trong cây chuyển gen Arabidopsis không đủ để gây ra sự cảm ứng các gen gây ra bởi stress Phân tích các vùng của gen DREB2A của Arabidopsis khám phá

ra rằng sự hiện diện của khu vực điều tiết âm trong vùng trung tâm (136 đến 165 aa); loại

bỏ vùng điều tiết âm kích hoạt DREB2A thành dạng hoạt động DREB2A-AC Sakuma và

cs báo cáo rằng sự hiện diện của trình tự peptide (RSDASEVTSTSSQSEV CTVETPGCV) trong vùng điều tiết âm chứa đựng nhiều vị trí mục tiêu p hosphoryl hóa

cho protein kinase như là PKC và CK 2 [40] Trình tự peptide này hoạt động như peptide dấu hiệu cho sự suy biến protein và nó thay đổi khi có stress hạn, mặn

Mỗi yếu tố phiên mã DREB có một vùng AP 2 bên trong các tr ình tự protein khác

nhau, và nó có khoảng 60 amino acid cho thấy sự giống nhau cao về trình tự giữa các loài khác nhau Trong một số nghiên cứu mở rộng gần đây , vùng AP2 đã bất ngờ được tìm thấy trong các protein bên ngoài g iới thực vật , ví dụ , trong vi khuẩn , bacteriophage và trùng lông mao thường mã hóa vị trí đặc trưng endonuclease [17], [40] Các hiện tượng này cho thấy rằng vùng AP 2 ở thực vật có thể bắt nguồn từ vi khuẩn hay virus trong gen chuyển thông qua quá trình chuyển đoạn hay xác định vị trí Phân tích trình tự của tất cả

các gen DREB1 cho thấy rằng chúng là các gen không có intron và sự sao chép của chúng

có thể gây ra bởi một họ đa gen trong quá trình tiến hóa của loài [40]

Hiện nay có hơn 10 thành viên thuộc họ gen mã hóa các yếu tố phiên mã dreb

được phát hiện trong hệ gen đậu tương DREB1-AF514908, DREB2-DQ208968, DQ208969, DREB3-DQ055133, DREB5-EF583447, DREB6-EF5 51166, DREB7- EF551167, DREBa-AY542886, DREBb-AY296651, DREBc- AY244760 trong đó 7 gen

DREB3-GmDREB được gây ra bởi ABA, mặn, hạn và lạnh [30]

Nghiên cứu trên cây đậu tương trong điều kiện vị stress, Li Xue – Ping và cs đã

phân lập được 3 trình tự gen DREB từ hệ gen là GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc; lần

lượt mã hóa cho các mạch polypeptide có 211, 312 và 198 amino acid với khối lượng

phân tử dự đoán là 23, 35 và 21 kDa Khi so sánh trình tự amino acid của 3 gen GmDREB với các protein DREB đã được công nhận; cho thấy giữa 3 protein GmDREBa, GmDREBb

và GmDREBc quan hệ gần , với 91% xác định trong đoạn AP 2 của mỗi protein với 64

amino acid Phân tích khả năng điều tiết phiên mã của các protein này trong nấm men

thấy rằng là GmDREBa và GmDREBb có thể kích hoạt sự biểu hiện của gen truyền đạt thông tin, trong khi GmDREBc không có chức năng này Sự sao chép của GmDREBa và

GmDREBb xuất hiện khi xử lý stress bởi hạn, mặn và lạnh trong lá cây đậu tương non Sự

biểu hiện của GmDREBc không tác động đến lá nhưng xuất hiện trong rễ khi xử lý mặn,

hạn và ABA Các kết quả này đề xuất rằng chức năng của ba gen DREB đặc trưng trong

phản ứng lại với stress môi trường của cây đậu tương [24]

Khi nghiên cứu gây ra sự biểu hiện của nhân tố điều khiển phiên mã DREB và tác

động của nó đến khả năng chịu hạn của cây lúa mỳ chuyển gen, Wang Jun Wei và cs đã

thiết kế vector pBAC128F, mang gen DREB được điều khiển bởi promoter rd29B gây ra bởi hạn và gen bar được điều khiển bởi promoter CaMV 35s và gen Adhl intron ở ngô, đã

được chuyển vào mô nuôi cấy của cụm hoa và phôi còn non của cây lúa mỳ đông lục bội CV.8901, 5-8, 99-92 và 104 bằng cách bắn gen trực tiếp Hơn 70 dòng cây chuyển gen đã

được thu nhận Phân tích PCR hệ gen và RNA điểm đã cho thấy rằng gen DREB đã xuất

hiện trong hệ gen lúa mỳ của cây chuyển gen ở T0 và T1, và cũng đã được biểu hiện trong hạt giống thế hệ con cháu của các dòng chuyển gen khác Lượng proline ở lá và hạt của các dòng chuyển gen T2 đã được phân tích Trong 16 dòng chuyển gen kiểm tra, 10 dòng thu được lượng proline ở lá lớn gấp hai lần so với cây đối chứng Dưới điều kiện hạn, sau khi dừng tưới nước 15 ngày thì lá của các dòng chuyển gen vẫn xanh, trong khi cây đối chứng đã héo Sau khi tưới phục hồi 10 ngày, lá của dòng cây chuyển gen vẫn duy trì màu xanh của chúng, trong khi tất cả cây đối chứng đã chết Nghiên cứu kết luận rằng một

lượng mới yếu tố phiên mã DREB được tạo trong cây lúa mỳ đã gây ra tác động làm tăng

khả năng chịu hạn [37]

Phân tích mức biểu hiện của yếu tố phiên mã DREB1 (GmDREB1) có kích thước

604 bp trong giống đậu tương chịu hạn (MG/BR46-conquista) và giống không chịu hạn (BR16) trong quá trình hạn nhân tạo Khi so sánh với trình tự trên GenBank có mã số AF514908.1 cho thấy hoàn toàn giống nhau Phân tích biểu hiện trong điều kiện hạn cho

thấy: GmDREB1 tăng cường biểu hiện ở lá và rễ của cả hai giống và mức độ biểu hiện

thay đổi tương quan thuận với độ dài của khoảng thời gian thiếu nước Tuy nhiên, sự gia tăng không giống nhau ở hai giống , MG/BR46 gia tăng ở mức sau xử lý 1 giờ gần giống với BR16; ở mức 3 giờ và 5 giờ thì giống MG /BR46 giảm tập trung biểu hiện ở lá , mà tăng cường tập trung biểu hiện ở rễ ; trong khi đó ở giống BR 16 thì sự biểu hiện ở lá vẫn tăng chậm trong khi sự biểu hiện ở rễ giảm mạnh so với mức 1giờ [33]

Trong nghiên cứu của mình , Nguyễn Hiệp Hòa và cs đã tách dòng và đọc trình tự

thành công gen DREB5 từ RNA tổng số của giống đậu tương địa phương Xanh Tiên Đài Khi so sánh trình tự nucleotide 924 bp thu được với gen DREB5 mã số EF 583447 trên

Genbank cho thấy chỉ số giống nhau đạt 90,4% Tiến hành phân tích trình tự amino acid

suy diễn của gen DREB5 của giống Xanh Tiên Đài với EF583447 bằng phần mềm Bioedit

cho thấy sự tương đồng đạt 87,8% [6]

Chen và cs đã nghiên cứu một gen DREB, GmDREB3 (mã số DQ208969.1), thuộc

nhóm A5, được phân lập từ hệ gen đậu tương có kích thước đầy đủ là 597 bp, mã hóa cho

199 amino acid Phân tích trình tự chuỗi protein suy diễn cho thấy protein này chứa đựng một vùng bảo thủ AP2 có 58 amino acid và một vùng NSL Phân tích vùng AP2 trong các protein AP 2/EREBP phân lập được từ đậu tương , Arabidopsis, ngô, lúa, cà ch ua, lúa mạch, bông và thuốc lá ; cho thấy rằng gen GmDREB3 được xếp vào nhóm A 5 của họ

DREB Protein GmDREB3 cũng có valine ở vị trí 14, nhưng ở vị trí 19 là leucine thay cho

glutamic acid [15] Trình tự promoter của GmDREB3 có chiều dài 1587 bp được phân lập từ hệ gen đậu tương Vài nhân tố cis liên quan tới sự điều tiết phiên mã ; giữa chúng là

một hộp TATA đặc trưng định vị ở -35 bp ngược chiều với điểm khởi đầu phiên mã, 10 vị trí yếu tố phiên mã MYC được thừa nhận thuộc vào 7 nhóm (MC-1 đến MC-7), và 7 vị trí yếu tố phiên mã MYB được thừa nhận thuộc 5 nhóm (MB-1 đến MB-5) Giữa các vị trí MYC được thừa nhận , MC-1, MC-4 và MC-7 chia sẻ cùng một trình tự bảo thủ l ần lượt

với MC-2, MC-3 và MC-4 trong promoter của DREB1A/CBF3 Phân tích loại bỏ đầu cuối 5’ của promoter cho thấy rằng promoter GmDREB3 phản ứng lại với stress lạnh, và không

thấy trong điều kiện bình thường, mặn hay xử lý ABA Vùng từ -1403 đến -1058 làm suy

giảm phản ứng lại lạnh của promoter GmDREB3 và vùng này có thể chứa đựng các nhân

tố kìm hãm sự phiên mã phản ứng lại với lạnh [15]

Dựa trên các nghiên cứu khác nhau cho thấy các protein DREB là những yếu tố

phiên mã quan trọng trong việc điều chỉnh gen liên quan đến stress môi trường và giữ vai trò quyết định trong truyền đạt sức chịu đựng stress cho thực vật

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

Nguyên liệu thực vật

Giống đậu tương địa phương Nâu Cao Bằng , giống DT 84 do trung tâm thực nghiệm đậu đỗ cung cấp

Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA

Vector pBI 101 do Đại học Tổng hợp Nebraska , Hoa Kỳ cung cấp Vector tách

dòng pBT, các chủng vi khuẩn E coli (DH5α) và A tumefaciens CV58C1, mồi pUC18, vector pBI101::rd29A::gus (Nguyễn Thị Thúy Hường và cs ) do phòng Công nghệ tế bào

thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Hóa chất

Kit tinh sạch DNA (AccuPrep®

Gel Purification Kit ), kit tinh sạch plasmid (Plasmid Extraction Kit ) của hãng Bioneer (Hàn Quốc ) Các loại enzyme hạn chế của Fermentas (Hàn Quốc)

Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, Nước khử ion Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime, carberiline và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose, ) của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…

Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior , Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech , Thụy Điển ), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức),

máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA

Quy trình tách chiết DNA tổng số: Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng

bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần)

Thêm 600 µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt

Thêm 50 µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370

C trong 30 phút Bảo quản DNA tổng số ở -200

C

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Hạt đậu tương đem trồng vào các chậu có giá thể

TN1, đến khi cây được 4-5 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo, không tưới nước đến khi đất trong chậu khô thì bắt đầu tính ngày gây hạn Mẫu thu để tách RNA là các mẫu lá đã bắt đầu bị héo trong quá trình gây hạn Lá sau khi thu được bảo quản trong tủ - 800

C

Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều được khử DEPC 0,01%

(1) Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng

(2) Bổ sung 1ml trizol regents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút

(3) Bổ sug 500µl chloroform: isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút (4) Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40

C

(5) Lấy 600µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml

(6) Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút (7) Ly tâm 8000v/p trong 20 phút ở 40

C

(8) Loại bỏ dịch nổi, thu tủa

(9) Rửa RNA bằng cồn 700C (đã pha trong DEPC 0,01%)

(10) Ly tâm 15 phút 7000-10000v/p trong 10 phút Lặp lại 2 lần

Đảo đều nhẹ nhàng, sau đó ủ 650

C Sau 5 phút, lấy ra cho vào đá

(2) Thành phần phản ứng: Đệm 5X 4µl

2.2.1.4 Phương pháp tách dòng gen

Tinh sạch và gắn đoạn gen/promoter vào vector tách dòng pBT: Gen được làm

sạch (thôi gel) theo quy trình QIAquick Gel Extraction Kit (Bioneer); sau đó được gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng