Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây dứa dại (pandanus tectorius parkins ex j p du roi) mọc hoang ở xã lộc bình – huyện phú lộc – tỉnh thừa thiên huế

Một số nghiên cứu khoa học gần đây đã chỉ ra rằng: một số hợp chất thiên nhiên phân lập từ Dứa dại có khả năng ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thư, có tác dụng hạ đường huyết.

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sĩ này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa học Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Để tích lũy vốn kiến thức quý báu, để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ này đó là ơn nghĩa sâu nặng của thầy cô, gia đình và bạn bè

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Hữu Điển đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô trong tổ Bộ môn hóa hữu

cơ cũng như các thầy cô trong khoa Hóa học – Đại học sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu, cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã rất nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bè bạn đã động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2014

Học viên K22

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÍ HIỆU

MS : Mass Spectrometry - Phổ khối lượng

1H NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng từ

hạt nhân

13C NMR : Carbon- 13 Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng

từ C- 13HMBC : Heteronuclear - Multiple Bond Coherence

HSQC : Heteronuclear - Spectrometry Quantum Coherence

DEPT : Distiotionless Enhancenmen by Polarisation Transfer

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG SỐ, SƠ ĐỒ

Trang Danh mục các hình

Danh mục các bảng số

Sơ đồ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu của mọi người, đặc biệt là trong thời gian gần đây khi mà các căn bệnh nguy hiểm như AIDS, ung thư, viêm gan B, tiểu đường đang có chiều hướng gia tăng Đây chính là vấn đề cấp bách đặt ra không chỉ cho các cán bộ ngành y dược không ngừng nghiên cứu tìm kiếm các phương thuốc mới để phòng ngừa, điều trị hiệu quả các loại bệnh tật Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận, gió hoà nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với nhiều loài thực vật là những loại dược liệu quí, trong đó có Dứa dại Từ lâu Dứa dại đã được nhân dân sử dụng làm thuốc chữa đau đầu, mất ngủ, giải độc rượu, tiêu đàm, viêm gan, tiểu đường, viêm thận, phù thũng, cảm sốt, viêm đường tiết niệu, thương tổn do chấn thương Hơn nữa, lá dứa dại có vị ngọt, tính mát, có tác dụng giải nhiệt, chữa các chứng bệnh như cảm, sốt, giã đắp vào chỗ đinh râu Một số nghiên cứu khoa học gần đây đã chỉ ra rằng: một số hợp chất thiên nhiên phân lập từ Dứa dại có khả năng ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thư, có tác dụng hạ đường huyết Một số loài Dứa dại như

loài Pandanus odorus, P.amaryllifolius, Pandanus odoratissium, lá dứa thơm P.amaryllifolius; từ lá, quả của cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J

P du Roi đã được quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ hóa học này, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây dứa dại (Pandanus tectorius Parkins ex J P du Roi) mọc hoang ở xã Lộc Bình –

huyện Phú Lộc – tỉnh Thừa Thiên Huế” nhằm góp phần tìm hiểu giá trị khoa

học, nâng cao giá trị sử dụng nguồn cây thuốc “bình dân” này một cách hiệu quả và bền vững hơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA DẠI

1.1.1 Khái quát về họ Dứa dại (Pandanaceae) và chi Pandanus

a Họ Dứa dại Pandanaceae

Họ Dứa dại (hay còn gọi là Dứa gai) Pandanaceae là một họ thực vật có hoa, có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới phân bố ở một số nước Châu Á và khu vực Thái Bình Dương bao gồm 800 loài và có 4 chi:

- Chi Freycinetia Gaudich: Khoảng 180 loài.

- Chi Martellidendron (Pic Serm.) Callm & Chassot, còn được coi là

phân chi của chi Pandanus

- Chi Pandanus Parkinson: Khoảng 700 loài dứa dại (dứa gai, cây cơm nếp, dứa thơm )

- Chi Sararanga Hemsl: khoảng trên 10 loài.

Trong đó chi Pandanus (dứa dại) là quan trọng nhất Stone B.C [33] đã thống kê được một số loài thuộc hai chi Freycinetia và Pandanus phân bố ở

một số nước châu Á và khu vực Thái Bình Dương như sau:

- Phillippines: có 8 loài thuộc chi Freycinetia và trên 50 loài thuộc chi Pandanus.

- Thái Lan: có 3 loài thuộc chi Freycinetia và 2 loài thuộc chi Pandanus.

- New Guinea: có 60 loài thuộc chi Freycinetia và 70 loài thuộc chi Pandanus.

- New Zealand: chỉ có 1 loài thuộc chi Freycinetia.

- Borneo: có hai loài thuộc chi Freycinetia, 50 loài thuộc chi Pandanus.

- Madagascar: trên 100 loài thuộc chi Pandanus.

b Chi Pandanus

Một số loài thuộc chi Pandanus thường gặp là: Pandanus tectorius Parkins ex J P du Roi, Pandanus odoratissim, Pandanus amyrillium, Pandanus herbaceus, P.toei, P.unguiculatus [34] Loài Pandanus tectorius

Parkins ex J P du Roi, còn gọi là dứa gỗ, dứa gai phân bố rộng rãi trên các

bờ biển của Ấn Độ, Xri Lanca, Mianma, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc, Nam quần đảo Ryu Kyu, Malaixia, Micronesia, Phillippines [2,10,36,38] Theo kinh nghiệm dân gian của nhân dân các nước ven biển và hải đảo thuộc Thái Bình Dương (Marshalls, Yap, Hawaii, Tonga, Tahiti ) phần trên mặt đất của loài dứa dại này được sử dụng để chữa viêm họng, bị ngộ độc thức ăn, chữa đái dắt, đái buốt [1,10] Ở Ấn Độ, lá được dùng để điều trị bệnh phong, giang mai, ghẻ và bệnh bạch bì Tinh dầu lá dùng trị bệnh đau đầu, thấp khớp, hạt và cùi quả làm thức ăn, chồi non làm rau ăn Ở Thái Lan, rễ cây được dùng để hạ nhiệt, long đờm, lợi tiểu; cụm hoa dùng làm thuốc trợ tim

Hình 1.1 Ảnh cây và quả dứa dại Pandanus tectorius Parkin ex J.P du Roi

1.1.2 Một số đặc điểm thực vật học của loài Dứa dại (Pandanus tectorius

Parkins ex J P du Roi)

Tên khoa học: Pandanus tectorius Parkin ex J.P du Roi.

Họ Dứa dai: Pandanaceae.

a Mô tả: Cây nhỏ, phân nhánh ở ngọn cao từ 2- 4m, có nhiều rễ phụ thòng xuống đất Lá dài từ 1- 2m, trên gân chính và mép lá có nhiều gai nhọn Bông mo đực ở ngọn cây, thõng xuống với những mo trắng rời nhau Hoa rất thơm, bông mo cái đơn độc, gồm rất nhiều lá noãn Cụm quả có khối hình trứng dài từ 16- 22cm, có cuống màu da cam, gồm những quả hạch có góc, xẻ thành nhiều ô, ra quả vào mùa hè [1]

b Nơi sống và thu hái

Nơi sống: Loài Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi còn được gọi

là Dứa gỗ, Dứa gai phân bố rộng rãi trên các bờ biển của Ân Độ, Xri Lanca, Mianma, Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc, Nam quần đảo RyuKyu, Malaisya, Philippines…[2,10,36,38] Ở Việt Nam, Dứa dại thường phân bố trên các bãi ẩm, có cát, trong các rú bụi ven biển dọc các bờ ngòi nước mặn, rừng ngập mặn, cũng phân bố trên đất liền, dọc theo các con sông ở khắp nước ta, từ Hoà Bình, Quảng Ninh, Hà Nam, đến Quảng Nam- Đà Nẵng, Khánh Hoà, Bình Thuận Dứa dại mọc thành từng bụi lớn

Thu hái: Phần lá thu hái quanh năm, đem về phơi hay sấy khô dùng dần Rễ thu hái quanh năm; thu các rễ chưa bám đất tốt hơn là rễ ở dưới đất, đem về thái mỏng, phơi hay sấy khô dùng dần Thu hái quả vào mùa đông dùng tươi hay phơi khô

1.1.3 Công dụng của cây Dứa dại

Cây Dứa dại từ lâu đã được xem như một loại thảo dược quý, có nhiều tác dụng trong chữa bệnh và có nhiều tác dụng cho sức khoẻ con người Một

số tác dụng dược lý của cây Dứa dại như tác dụng chống viêm, kháng khuẩn,

kháng nhiều dòng tế bào ung thu (Caov- 3, Skov- 3, PC3, Hella cells), tác dụng hạ đường huyết, chữa cảm, hạ sốt, chữa sạn thận, sỏi thận, sỏi bàng quang…

Theo sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS Đỗ Tất Lợi, Dứa dại nằm trong nhóm những cây có tác dụng thông tiểu, thông mật trong đó tác dụng thông tiểu là chính Ngoài ra Dứa dại còn để chữa nhiều chứng bệnh như sán khí, tiểu tiện bất lợi, đái đường, trúng nắng, mắt mờ, mắt hoa, viêm gan, xơ gan giai đoạn đầu…[1,10] Như vậy, cây Dứa dại được xem như là một loài thảo dược phòng trị nhiều bệnh nan y được GS Đỗ Tất Lợi và các nhà khoa học đánh giá cao Để hiểu kĩ hơn về cây dứa dại này, dưới đây xin giới thiệu từng bộ phận của cây dứa dại được dùng làm thuốc trong đông

y và trong dân gian như sau:

a Qủa dứa dại: Theo đông y quả dứa có vị ngọt, tính bình, quả có tác

dụng chữa bệnh gan nhưng chỉ chữa được một số loại viêm gan, một vài thể nhất định chứ không phải là tất cả các thể viêm gan mà dùng loại thuốc nam nay Hơn nữa, nó cũng chỉ có tác dụng một số loại viêm gan cấp mới bị hay một số thể viêm gan mãn [12] Ngày nay trên thị trường đã có sản phẩm trà dứa dại được chế biến theo công nghệ hiện đại

b Hoa dứa dại: Theo đông y hoa có vị ngọt, tính lạnh Dùng hoa sắc uống có tác dụng chữa cảm mạo, sán khí, chữa đái đục, đái buốt, đái nhỏ giọt, tiểu tiện không thông, nhọt mọc sau gáy

c Đọt dứa dại: Có vị ngọt, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, chỉ huyết, sinh cơ, tán độc; dùng chữa sỏi, mụn nhọt, tiểu tiện vàng đỏ, giã nát đắp chỗ đầu đinh, lòi rom, bó gãy xương Một số bài thuốc đối với đọt non dứa dại:

- Dùng đọt non dứa dại và đậu tương giã nát đắp vào chỗ bị thương sẽ

- Dùng 2 lạng đọt non, 1 lạng xích tiểu, 3 con đăng tâm thảo, 15 búp tre đem sắc uống sẽ giúp thanh tâm giải nhiệt, chữa bồn chồn, tay chân vật vã không yên.

- Đem 15- 20g đọt non sắc uống sẽ chữa đái rắt, đái buốt, đái ra máu

- Chữa sỏi thận: Đọt non dứa dại 20g, cỏ bợ 30g, ngải cứu 20g, đường phèn 10g tất cả rửa sạch, thái nhỏ, giã nát, gạn nước uống

- Chữa tiểu rắt, tiểu buốt có máu: đọt non 20g, mầm rễ cỏ gừng 20g, sắc uống

- Chữa kinh phong ở trẻ em: Đọt non dứa dại 12g, lá chua me, lá xương rồng, búp mít mật, cỏ nhọ nhồi mỗi thử 8g, hạt nhân đào 5 cái Tất cả giã nhỏ, hoà với một chén nước đun sôi để nguội, gạn lấy nước trong thêm ít đường, uống cách 2 giờ một lần cứ mỗi tuổi uống 1 thìa nhỏ

- Dùng để đắp ngoài: Đọt non dứa dại, lá đinh hương (lượng bằng nhau) đắp chữa đinh râu rất tốt

d Rễ dứa dại: Rễ dứa dại tươi giã nát, đem đắp vết thương có tác dụng lành vết thương, chống viêm nhiễm Theo đông y, rễ dứa dại có vị ngọt nhạt, tính mát Có tác dụng làm ra mồ hôi, lợi thuỷ, hạ sốt Dùng chữa các bệnh như cảm mạo, sốt dịch, viêm gan, viêm đường tiết liệu, phù thũng, thương tổn

do bị ngã, bị đánh chấn thương [1,2,7,8,10] Một số bài thuốc với rễ dứa dại:

- Chữa phù thũng, xơ gan cổ trướng: Theo kinh nghiệm dân gian, dùng

rễ dứa dại 30- 40g, phối hợp với rễ cỏ xước 20- 30g, cỏ lưỡi mèo 20- 30g sắc nước uống trong ngày

- Chữa ngã, đánh chấn thương: Theo kinh nghiệm dân gian, dùng rễ dứa dại, giã nát đắp vào chỗ bị thương rồi băng cố định lại

- Chữa đau đầu mất ngủ: Rễ dứa dại 20 – 30g, sao thơm, sắc lấy nước, chia 2 lần uống trong ngày

- Chữa sỏi thận, tiết niệu: Rễ dứa dại hoặc dứa quả dại 12 – 20g, hạt quả chuối hột 10 – 12g, rễ cỏ tranh 10 – 12g, bông mã đề 8 – 10g, kim tiền thảo (lá đồng tiền hay gọi lá mắt trâu) 15 – 20g, rễ cây lau 10 – 12g, củ cỏ ống 10 – 12g, sắc lấy nước uống làm 2 – 3 lần trong ngày vào trước bữa ăn.

- Trị viêm thận phù thũng: Rễ dứa dại 30 – 60g, thịt lợn nạc 150 – 200g, nấu thành canh ăn ngày một lần, một tuần cần ăn 3 – 4 lần Kết hợp hằng ngày dùng rau dừa nước khô 30 – 60g, rau má 12 – 16g, bông mã đề 10 – 12g, bồ công anh 12 – 16g, sắc với nước uống trước bữa ăn ngày 2 lần, mỗi lần 150 ml

- Trị viêm gan, xơ gan cổ trướng: Rễ dứa dại hoặc quả dứa dại 20 – 30g, lá quao nước 20 – 30g, lá cây ô rô 12 – 20g, sắc lấy nước thuốc uống ngày 2 lần, mỗi lần khoảng 150 ml vào trước bữa ăn

e Củ dứa dại: Với người cao tuổi thận khí kém, lại mắc bệnh mãn tính như: ho, táo bón, làm việc trong tư thế đứng nhiều Người bệnh mệt mỏi, đau lưng, mỏi gối, váng đầu ù tai, tiểu tiện nhiều lần, đại tiện bí…Phương pháp chữa là bổ thận, bổ máu, nhuận tràng Dùng bài: bạch đồng nữ 20g, mai mực 16g, đỗ đen 30g, vừng đen 15g.Tất cả các vị đều sao vàng Sắc uống ngày 1 thang chia 2 lần, sau khi ăn khoảng 2 giờ, uống nóng [1, 7, 8]

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỨA DẠI

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Pandanus

Dứa dại là một loại dược liệu quý, trong Đông y đánh giá rất cao, vì thế các nhà khoa học ở Việt Nam và các nước trên thế giới đang tích cực tìm tòi

và nghiên cứu Tuy vậy, các công trình khoa học nghiên cứu về thành phần

hoá học của các loài thuộc chi Pandanus không nhiều, đặc biệt là về loài Dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi.

a. Nghiên cứu của thế giới

Các nhà khoa học của của Trung Quốc, Pháp, Thái Lan, Indonexia, Austraylia…đã tập chung nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài như:

Pandanus latifolius, P.veitchii, P.amaryllifolius.Roxb, P.odoratissimus… Hầu

hết các công trình nghiên cứu đều chỉ ra rằng: thành phần chính hóa học chính

của chi Pandanus là các ancaloit, tecpenoit, sterol, các axit hữu cơ và các

lignan Trong hoa và lá chứa nhiều tinh dầu mà thành phần chủ yếu là các ete

của β- phenyletyl ancol, các benzyl benzoat, salisylat, acetate, các tecpenoit

như: geraniol, linalool, linalyl axetat, guaiacol…Kết quả nghiên cứu của rễ,

thân, lá của cây dứa thơm Pandanus amaryllifolius cho thấy: thành phần hoá

học chính là 2- acetyl- 1- pyroline ancaloit (2AP) chất tạo mùi thơm cho dứa Các nhà khoa học đã phân lập được trên 20 ancaloit từ lá, rễ cây dứa thơm, một

số hợp chất phenolic, flavonoid từ quả của Pandanus tectorius Từ lá, rễ, thân cây dứa thơm Pandanus amaryllifolius các nhà khoa học đã phân tích phần tinh

dầu, cặn chiết dung môi hữu cơ tách được các chất đó là các pandamarilactone-

A, B, C, D; các norpandamarilactonine- A, B, C; các pandamanine, pandamarilactone- 31, pandamarilctone- 32…[15,16,26,27,32,34]

H H

N H

O O

Norpandamarilactonine A (1) 6E- Pandanamine (2)

6Z- Pandanamine (3)

N N

N O H

H N

O O

O

Hình 1.2 Một số ancaloit từ dứa thơm Pandanus amaryllifolius

4 Khung cơ bản 2AP 5 (+)- Pandamarine 6 Pandamarinlactam

Từ tinh dầu lá Dứa dại của Pandanus odoratissimus các tác giả [24] đã

tách ra được ethyl formate và 3- methyl- 1- butanal đã được tìm thấy và từ tinh dầu của hoa tách ra được rượu phenylethyl, methyl ether, axetat Bên

cạnh đó, các tác giả còn tách từ quả của loài Dứa dại Pandanus tectorius các

hợp chất este sau: 3- metyl- 3- buten- 1- yl axetat, 3- metyl- 3- buten- 1yl xinnamat, 3- metyl- 2- buten- 1yl axetat, 3- metyl- 2- buten- 1- yl xinnamat

Năm 1965, các nhà khoa học CH Pháp đã chiết tách từ P.veitchii được hợp chất axit 2(S), 4(S)- γ–hiđroxi- γ –metylglutamic[23].

Năm 1998, các nhà khoa học từ Trường đại học Chung- hsinh Đài

Trung (Đài Loan), đã phân lập được 15 hợp chất từ rễ cây dứa dại Pandanus odoratissiumus, trong đó có 3 hợp chất phenolic, 1 hợp chất benzofuran mới,

6 lignans, 4 steroid, vanillin [36]

Theo tài liệu [23] hàm lượng carotenoit chứa một lượng đáng kể trong quả của Dứa dại Khi quả chuyển màu da cam là thời điểm hàm lượng carotenoit trong quả là cao nhất

b. Ở Việt Nam

Lần đầu tiên thành phần hoá học của cây Dứa dại đã được PGS.TS Lê Thị Anh Đào nghiên cứu Tác giả đã sơ bộ nghiên cứu thành phần hoá học của

tinh dầu hương nếp lấy từ cây dứa thơm Pandanus amaryllia.Roxd- Việt Nam

Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng phương pháp chiết tách và đã khẳng định được chất có mùi hương nếp là 2- axetyl- 1- pyroline, bước đầu tác giả đã tách biệt được 3- metyl- 2(5H)- furanone và 2- axetyl- 1- pyroline [5]

Đầu năm 2008, Lại Thị Kim Dung và các cộng sự [4] đã phân lập được flavonoit tổng Đào Hùng Cường (ĐHSP Đà Nẵng) và các cộng sự [3] đã phân lập được metyl este của axit 9- octadec-12-enoic, 9-isopropylidenbixiclo [3.3.1] nonan-2-on và một ancoloit có tên là pandamarilactonine A từ lá dứa

thơm P amryllifolius, thu hái tại xã Đại Quang, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng

Nam

1.2.2 Nghiên cứu về Dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi

a Trên thế giới

Năm 2011, các nhà khoa học Trung Quốc [40] đã nghiên cứu về quả

Dứa dại Pandanus tectorius Pankins.ex J.P.du Roi.Kết quả đã phân lập và xác

định được cấu trúc của 15 hợp chất: trong đó có 10 hợp chất phenolic và 5 hợp chất flavonoit

OH HO

HO trans- ethyl caffeate (2)

HO HO O

Hình 1.3: Một số hợp chất phenolic và flavonoit phân lập từ quả Dứa dại

Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi.

Bên cạnh đó các tác giả [31] còn phân lập được một hợp chất cirsileol

cũng từ lá Dứa dại Pandanus tectorius Parkins.ex J.P.du Roi:

Cirsileol (22)

Năm 2008, theo tài liệu [35] từ phân đoạn chiết clorofom của lá Dứa

dại Pandanus tectorius Parkins.ex J.P.du.Roi, các tác giả đã phân lập được

một tritecpen mới có khung tirucallan: 24, 24- đimethyl- 5β- tirucalla- 9(11),

25- đien- 3β- on (23), squalene (24) và hỗn hợp của 2 phytol: stigmasterol (25) và β- sitosterol (26).

b Ở Việt Nam

Năm 2011 Nguyễn Văn Đậu và các cộng sự [13] đã phân lập được β-

sitosterol (26) từ lá cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi

Năm 2013, học viên cao học K21 Trần Thị Huyên [9] đã nghiên cứu về thành

phần hoá học và hoạt tính sinh học của rễ cây Dứa dại Pandanus tectorius mọc

hoang ở xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, Thừa Thiên Huế Tác giả đã phân lập và

xác định được cấu trúc của 4 hợp chất là β- sitosterol (26), stigmast - 5, 22- đien- 3β-ol (25), δ- lacton 2- (1, 2- đihiđroxyletyl)- 4, 5- metylenđioxibenzoic (27) và 5- (2- Hiđroxi- 4- metoxiphenyl)- 3- hiđroxitetrahiđroxifuran (28).

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

1.3.1 Ở Việt Nam

Nguyễn Thị Minh Thanh cùng các cộng sự [11] đã nghiên cứu tác dụng

hạ đường huyết của quả dứa dại (Pandanus odoratissimus L.) Các tác giả đã

nghiên cứu khả năng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm với 4kg mẫu quả dứa dại thu hái ở bãi biển tỉnh Thừa Thiên Huế dưới dạng chế phẩm cao toàn phần (CT) và chế phẩm flavonoit tổng số (FT) Kết quả, về ảnh hưởng của các chế phẩm CT và FT, thì tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết quả dứa dại

có thể do tác dụng của các flavonoid So sánh với các loại dược liệu khác đã được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm như quả

và thân mướp đắng, thổ phục linh, quả chuối hột, dây thìa canh… thì tác dụng

hạ đường huyết của dịch chiết quả dứa dại là tương đối tốt

Gần đây, kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng KB cho

thấy cao chiết n- hexan và cao chiết etyl axetat từ rễ cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J P du Roi có khả năng gây độc tế bào ung thư KB mức

trung bình với giá trị IC50 tương ứng là 7, 4 μg/ml và 22 μg/ml [9]

1.3.2 Trên thế giới

Năm 2009 Londonkar R và A Kamble [24] đã nghiên cứu khả năng

chống oxi hóa của cao chiết metanol từ rễ cây Pandanus odoratissium Ở Trung

Quốc, hai tác giả Ting- Ting Jong và Shoung- Whang Chau khi chiết tách phần

rễ của Dứa dại P odoratissimus đã phân lập được các hợp chất phenolic, bốn

loại hợp chất lignan cộng với một dẫn xuất benzofuran mới Trong số đó,

pinoresinol và 3, 4- bis(4- hyđroxy- 3- metoxybenzyl) tetrahyđrofuran thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa khá tốt [36] Axit 4- hyđroxibenzoic phân lập từ cao

chiết nước của rễ cây dứa dại Pandanus odorus có tác dụng hạ đường huyết trên

chuột gây đái tháo đường thực nghiệm [28] Theo tài liêu [25], hợp chất 24, 24-

đimetyl- 5β- tirucalla- 9(11), 25- đien- 3- on (23) có khả năng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư chủng Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MIC =

64 μg/mL) theo phương pháp thử nghiệm vi phiến MABA

Hợp chất Cirsileol (22) phân lập từ lá cây dứa dại Pandanus tectorius

Parkins.ex J P du Roi có hoạt tính kháng nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như: Caov- 3, Skov- 3, PC3 và Hela cells [31]

Theo tài liệu [34], các tác giả ở Trung Quốc đã nghiên cứu được một

loại protein mới là Pandanin (29) chiết xuất từ lá Dứa dại P amaryllifolius

Roxb có hoạt tính kháng virut chủng HSV- 1 và virút cúm chủng H1N1 với các giá trị EC50 tương ứng là 2, 94 và 15, 63 µM

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá cây Dứa dại được thu hái tại xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 6/2012 Tên khoa học của mẫu cây được ThS Nguyễn Thế Anh, Viện hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN

Việt Nam giúp xác định là Pandanus tectorius Parkins ex J P du Roi Sau

khi thu hái, lá được cắt nhỏ, phơi và sấy khô, sau đó nghiền thành bột

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xác định tên khoa học của cây Dứa dại

2 Khảo sát định tính các lớp chất có trong lá Dứa dại

3 Chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp phần trong lá Dứa dại

4 Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của cao tổng và tinh chất

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp thu hái và xử lí mẫu

2 Phương pháp ngâm chiết để thu lấy dịch chiết

3 Phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng để chiết tách các lớp chất

4 Phương pháp TLC và CC

5 Xác định cấu trúc của các cấu tử phân lập được bằng một số phương pháp vật lý hiện đại như đo nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, 1H NMR, 13C NMR, DEPT, HSQC, HMBC, MS, EI- MS

6 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học: thử kháng độc tế bào ung thư dòng KB và thử hoạt tính kháng sinh

7 Các thiết bị thử hoạt tính sinh học: Tủ ấm CO2 (INNOVA CO- 170);

tủ cấy sinh học an toàn cấp II; máy li tâm (Universal 320R); kính hiển vi ngược (Zeizz); tủ lạnh sâu - 250C, - 800C; buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kì); máy quang phổ (Genios Tecan); bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng

cụ thí nghiệm thông thường khác của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam

2.2.2 Hóa chất

- Dung môi: Metanol, n- hexan, clorofom, etylaxetat, butanol, DMSO

Dung môi dùng để ngâm chiết đều dùng loại tinh khiết, khi dùng cho sắc kí cột hay sắc kí bản mỏng điều chế đều cần dung môi tinh khiết

- Thuốc hiện hình: vanilin trong H2SO4 10% và sấy ở trên bếp điện để phát hiện các chất

2.2.3 Dụng cụ

- Sắc ký cột, chất hấp thụ silicagel (hãng Merck- 60), kích thước hạt

40- 60, với hệ dung môi rửa giải là n- hexan: etylaxetat tăng dần độ phân cực.

- Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel F-

254 (hãng Merck)

2.3 THỰC NGHIỆM

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách

a Thu hái: Phần lá cây dứa dại Pandanus tectorius Parkins ex J P du

Roi được thu tại xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên- Huế vào tháng 6/2012

b Xử lí mẫu: Lá dứa dại được đem sấy nhanh ở 110oC trong vòng 2 phút để diệt mầm nấm men rồi đem sấy khô ở 60- 70oC (có thể phơi dưới ánh nắng mặt trời), sau đó thái nhỏ và đi đem nghiền thành dạng bột

Lấy 5,0 kg mẫu khô nghiền nhỏ của lá Dứa dại đem cho vào bình ngâm chiết liên tục bằng hỗn hợp metanol: nước theo tỉ lệ 9:1 khoảng 3 tuần Lọc để thu lấy dung dịch có màu xanh đậm Phần bã còn lại đem ngâm lại trong metanol: nước Tiến hành tương tự như thế 7 lần Thu lấy tất cả các dung dịch lọc được đem cất cô quay chân không để cất đuổi dung môi thu được cao tổng Để phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cao tổng thu được ở trên chúng tôi sử dụng qui trình chiết bằng phễu chiết thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng Đó là qui trình chiết phân đoạn bằng các dung môi n- hexan, etyl axetat và butanol Qui trình chiết như sau:

+ Lấy cao tổng hòa trong n- hexan, dùng phễu chiết để chiết lấy dịch n-

hexan Phần bã còn lại tiếp tục chiết với n- hexan tương tự như thế thêm 4 lần Dịch chiết n- hexan qua 5 lần chiết được gom lại Phần bã còn lại gọi là bã 1

+ Tiếp tục chiết bã 1 bằng etyl axetat Làm 5 lần sau đó gom dịch chiết etyl axetat vào Phần bã còn lại sau khi chiết etyl axetat gọi là bã 2

+ Phần bã 2 đem chiết 5 lần bằng n- butanol Làm 5 lần sau đó gom dịch chiết n- butanol.Các dịch chiết thu được thì dịch chiết của n- hexan, dịch chiết

của etyl axetat và butanol có màu xanh đen Sau khi cất đuổi dung môi thu được

các cặn chiết tương ứng: cặn n- hexan, cặn etyl axetat, cặn n- butanol.

Các quá trình trên được mô tả bằng sơ đồ thực nghiệm dưới đây:

Mẫu lá dứa dại khô (5kg)

Ngâm trong metanol trong 3 tuần

Bã

Cặn n- hexan (LH)

Cặn etyl (LE)Cặn n- butanol (LB)

Cao tổng (320gam)Dịch chiết DịchSấy khô ở 60- 70oc

Lọc

n- BuOH

EtOAc

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết từ cặn tổng lá Dứa dại

Chiết trong các dung môi

Chiết bằng các dung môi khác nhau

n- Hexan

Dưới đây là khối lượng các cặn chiết thu được và thành phần % các cặn chiết so với mẫu khô.

Bảng 2.2: Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu khô

thu được (g)

% So với mẫu khô

Cột sắc kí được rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan: etyl axetat (H:E)

với tỉ lệ tăng dần độ phân cực tăng dần từ 100:0 đến 0:100, được 6 phân đoạn,

kí hiệu LH1- LH6 Kiểm tra trình tự các chất ra khỏi cột sắc kí bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (dùng bản mỏng, đế nhôm, tráng sẵn silica gel của hãng Meck; thuốc hiện hình là vanilin trong dung dịch H2SO4 10%), sau đó thu

gom các phân đoạn có Rf giống nhau, cất cô quay chân không để đuổi hết dung môi Cặn thu được tiếp tục đem chạy sắc kí cột lặp lại.

Ở phân đoạn H:E=4:1, có 2 chất kết tinh màu trắng Lọc, rửa, kết tinh lại nhiều lần 2 kết tinh đó chúng tôi thì thu được 20mg chất rắn màu trắng,

dạng bột kí hiệu là LH1.Tiến hành kiểm tra trên bản mỏng không thấy phát

quang trên đèn điện tử ở các bước sóng, nhưng khi hiện hình và đốt lên thấy xuất hiện một chấm tròn màu tím đen có Rf= 0, 45 Tương tự, sau khi xử lý tinh thể thứ hai, chúng tôi thu nhận được chất rắn màu trắng, dạng bột, có khối lượng 15mg và giá trị Rf=0, 55, kí hiệu LH2

b Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat

*Lấy 63, 39 gam cao chiết etyl axetat đem chạy cột sắc kí silica gel, hệ

dung môi rưả giải n- hexan: etyl axetat tỉ lệ từ 4:1 đến 0: 100, được 11 phân

đoạn, kí hiệu LE1- LE11 Ở phân đoạn H:E=1:1 thấy xuất hiện kết tinh, tiến hành rửa kết tinh lại trong etyl axetat lạnh nhiều lần, chúng tôi thu được một

chất rắn màu vàng nhạt, khối lượng 2mg, kí hiệu là LE5.Tiếp tục tiến hành

tách chất trên cột thô cặn etyl axetat, với phân đoạn hệ dung môi rửa giải H:E=0:100 thấy xuất hiện kết tinh vô định hình màu vàng rơm Tiến hành rửa kết tinh lại nhiều lần trong etyl axetat lạnh thì thu được chất rắn màu vàng

rơm, vô định hình (20mg), kí hiệu là LE2.

2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

a Phương pháp thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thư dòng KBPhương pháp này áp dụng cho cao chiết phân đoạn và một số chất tinh sạch từ Dứa dại Dòng tế bào ung thư KB được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện (5% CO2; 37OC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Sau thời gian cấy chuyển, tế bào phát triển ở pha loãng sẽ được sử dụng để thử độc tính

Thử độc tính tế bào: 200 ml dung dịch tế bào ở pha loãng nồng độ 3.104

tế bào/ ml vào mỗi giếng(đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt được nồng độ cuối cùng là 128µg /ml; 32µg/ml;

8µg /ml; 2µg /ml; 0, 5µg /ml ủ ở 370C trong CO2 trong 3 ngày.Giếng điều khiển(đối chứng dương) chỉ gồm 200 dung dịch tế bào 3.104 tế bào/ml Ellipticine(Sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm)

Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0, 2 mg/ml ở 370C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN Mức độ kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy phổ TECAN theo công thức sau:

control(-) - OD control(+)

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

b Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng nấm, kháng khuẩn

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được

cung cấp bởi ATCC bao gồm: Bacillus subtilis(ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 13709), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Candida albicans (ATCC 10231), Lactobacillus fermentum (Lp B14), Enterococcus faecium (B650) Môi trường nuôi cấy:MHB

(Mueler- Hilton- Broth), MHA(Mueler- Hilton- Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm

Hoạt tính vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên pha loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và IC50 (nồng độ ức

- Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành 05 mẫu nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.Nồng đọ thử cao nhất là 128µg /ml; 32µg /ml; 8µg /ml; 0, 5µg /ml.

- Thử hoạt tính: chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm có nồng độ 5.105CFU/ ml khi tiến hành thử

Lấy 10 mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200 dung dịch nấm và vi khuẩn, ủ ở 370C Sau 24 giờ đọc MIC bằng mắt thường Gía trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn

sự phát triển của vi sinh vật.Gía trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data

- Chất tham khảo kháng sinh Ampicillin cho các chủng Gram(+) và chủng E.c với giá trị IC50 trong khoảng 0, 05- 2 µg /ml Kháng sinh Pen/ Step cho chủng Pa với IC50 trong khoảng 4- 5µg/ml Amphotericin B cho vi nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0, 5- 1µg /ml

2.4 ĐẶC TRƯNG VẬT LÍ VÀ PHỔ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 2.4.1.Hợp chất LH1 (25)

- Chất rắn kết tinh vô định hình, màu vàng rơm, không tan trong các dung môi thông thường, chỉ tan tốt trong DMSO.

- Phổ IR, 1H NMR, 13C NMR: xem Bảng 3.8, Bảng 3.14, Hình 3.9, Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.12, Hình 3.13 và Phụ lục 3, Phụ lục 4, Phụ lục 12

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ DÒNG KB CỦA CÁC CAO CHIỂT TỪ LÁ DỨA DẠI

Lá cây Dứa dại được thu hái tại xã Lộc Bình, huyện Phú Lộc, Thừa Thiên - Huế vào tháng 6/2012 ThS Nguyễn Thế Anh, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam, giúp xác định tên khoa học của cây Dứa dại là

Pandanus tectorius Parkins ex J.P.du Roi Sau khi thu hái thì phần lá của Dứa

dại được cắt nhỏ, phơi sấy khô và nghiền thành bột, sau đó đem ngâm chiết với metanol, cất cô quay chân không dịch chiết, thu được cao tổng Sau đó tiến hành chiết phân đoạn và chạy cột sắc kí như đã mô tả trong mục 2.3

Kết quả thử hoạt tính tế bào ung thư KB của 4 cao chiết từ lá Dứa dại theo phương pháp nuôi cấy trên thạch [30] - được chỉ ra trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng KB của 4 cao chiết phân

đoạn từ lá Dứa dại Pandanus tectorius Parkins.ex J.du Roi.

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

3.2.1 Các chất phân lập từ cao chiết n- hexan

3.2.1.1 Hợp chất LH1 (25)

Phổ ESI- MS cho một pic ion giả phân tử [M- H]- với số khối m/z= 411,

3 Kết hợp với các phương pháp phổ khác phổ IR của 2 cho thấy có một vân hấp thụ ở cường độ khá lớn tại bước sóng 3450 cm- 1 được gán cho dao động hoá trị của nhóm OH; hai vân hấp thụ khác, cường độ trung bình ở bước sóng 1646cm- 1 và 1464cm- 1 được gán cho dao động của liên kết đôi >C=C<

Phổ 1H NMR (Phụ lục 1), cho thấy hợp chất 1 có cả thảy 48 proton, cộng hưởng chủ yếu ở vùng trường cao (δH 0, 68- 2, 34ppm), khá đặc trưng cho các proton trong khung steroid với 6 nhóm metyl cụ thể δH(ppm): 0.68 (3H, s, H- 18), 1.00 (3H, s, H- 19), 0.92 (3H, d, J=5.5Hz, H- 21), 0.83 (3H, d, J=7.1Hz, H- 26), 0.84 (3H, d, H- 27), 0.86 (3H, t, H- 29)

Vùng steroid

Hình 3.2: Phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất LH1

Ngoài ra, còn có 2proton ở vùng trường trung bình: một ở δH5, 35ppm

53ppm (1H, m), được gán cho proton cacbinol H- 3 (HC- OH), hai vân bội nhọn cường độ 1H δH5, 02 và δH5, 14ppm được gán cho 2proton olifenic Điều này chứng tỏ hợp chất 1 có thêm một liên kết đôi (xem Bảng 3.4).

Hình 3.3: Phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất LH1

Từ những chứng cứ trên và so sánh với tài liệu [20], chúng tôi xác định được hợp chất 1 là stigmast- 5, 22- đien- 3β- ol, C29H48O (25), một trong những steroit phổ biến trong hầu hết các loài thực vật

Bảng 3.4: Một số giá trị đặc trưng trên phổ 1H NMR của hợp chất LH1 so

sánh với 1H NMR của stigmast- 5, 22- đien- 3β- ol [20]

H6

13 14

17 18 19

Trên phổ IR (Phụ lục 11) ta thấy có một vân hấp thụ ở cường độ khá

lớn tại bước sóng 3450cm- 1 (- OH); hai vân hấp thụ khác cường độ trung bình

proton.Tương tự như phổ 1H NMR của LH2 ở vùng ở vùng trường cao δH 0,

68 đến 2, 32ppm là các cụm proton trong các nhóm CH2 no, CH no, khá đặc trưng cho các proton của khung steroid với 6 nhóm metyl tương tự như trên

phổ LH1.

Chỉ khác trên vùng trường trung bình, ta thấy chỉ xuất hiện vân bội giống

như LH1 một vân bội ở δH 5, 32 ppm được gán cho proton olefinic H- 6, một

vân bội cường độ 1H δH3, 52ppm được gán cho proton cacbinol (HC- OH)

H6

H3

Hình 3.6: Phổ 1H NMR(CDCl3, 500MHz) của chất LH2

Từ kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H NMR và so với tài liệu tham khảo

[20] chúng tôi đi đến kết luận là hợp chất LH2 là β- sitosterol (26) C29H50O,

một trong số các steroit phổ biến trong thực vật

11

13 14

17 18 19

với 1H NMR của β- sitosterol [20]

1H NMR, 13C NMR, HSQC, cho thấy LE2 có công thức phân tử là C21H20O10.

Phổ IR của LE2 (Phụ lục 12) có một vân tù hấp thụ khá mạnh ở bước

sóng 3389- 3249cm- 1(- OH), một vân có cường độ khá lớn ở bước sóng 1655cm- 1 (C=O), một số vân đặc trưng khác trong bảng dưới đây:

Bảng 3.8: Bảng các vân phổ IR đặc trưng của chất LE2

STT γ cm - 1 Đặc điểm vân hấp thụ Loại dao động đặc trưng

Từ phổ hồng ngoại cho thấy hợp chất LE2 có nhiều nhóm OH, có

nhóm cacbonyl tạo liên kết hidro yếu với OH nên vân hấp thụ nhọn, có tần số giảm khoảng 40- 60cm- 1 so với các nhóm cacbonyl độc lập

Phổ 1H NMR (Phụ lục 3) nhận thấy đây là hợp chất flavonon- glycozit với 6 proton thơm, không no và 7 proton monosaccarit và 7 proton hyđroxyl phân bố chủ yếu ở vùng trường trung bình và yếu; ở vùng trường trung bình

có một cụm vân đáng chú ý: cụm vân bội δH từ 3, 26ppm đến 4, 7ppm được

gán cho 7 proton gốc đường α- D- glucopiranozơ.

Trên 13C NMR (Phụ lục 4) xuất hiện rõ 6 tín hiệu của cacbon thuộc gốc

đường α- D- glucopiranozơ từ δC từ 61, 4ppm đến 82, 0ppm cụ thể là các vân

ở (61, 4; 70, 6; 70, 9; 73, 4; 78, 7; 82, 0ppm), trong đó proton tại δH 4, 7ppm

(1H, d, J=10Hz) có thể qui kết đó chính là proton gắn với nguyên tử - O- của gốc đường chỉ có thể gán cho H- 1’’ và tương ứng với δC là 73, 4ppm.

Hình 3.9: Phổ 1H NMR(DMSO, 125MHz) của chất LE2

Cụm vân ở vùng trung bình với δH từ 6, 3 đến 8, 03ppm thuộc về tín hiệu cộng hưởng của các proton thơm, cụ thể như sau: có 2 vân đôi cường độ mỗi vân 2H, trong đó một vân đôi cường độ 2H ở δH 6, 9ppm (J=8, 5Hz), một

tương đương nhau, có hiệu ứng mái nhà điều đó chứng tỏ đó là 4 proton thơm thuộc về 2 cặp C- H ở vị trí liền kề (vị trí octo của nhau): H3’- H5’ và H2’- H6’ Mặt khác, trên 13C NMR xuất hiện hai tín hiệu cường độ cao gấp đôi so với các tín hiệu khác tại δC 129ppm và 115, 9ppm đây chính là 2 cacbon tương đương nhau: C- 2’- C- 6’ và C- 3’- C- 5’ (Hình 3.12) Một vân đơn cường độ 1H, δH 6, 28ppm, được gán cho proton duy nhất còn lại của vòng benzen thứ hai, một vân đơn thứ hai không bị tách cường độ 1H δH 6, 78ppm được gán cho proton olefilic (=CH) liên kết với 2cacbon bậc bốn liên kêt với nguyên tử có độ âm điện cao như –O- hay =O từ đây có thể gán cho H- 3.Một proton khác có tính axit, có cường độ 1H, δH13, 17ppm, ở vùng trường rất yếu, điều này chứng tỏ proton này đã tạo liên kết hidro nội phân tử khá mạnh với nhóm C=O gần kề.

Hình 3.10: Phổ 1H NMR(DMSO, 125MHz) của chất LE2

Trong phổ 13C NMR (Phụ lục 3) của chất LE2 có 19 pic phân bố chủ

yếu ở vùng trường trung bình và yếu, với các δC dao động từ 61, 4 đến 182, 1 ppm, trong đó có hai cặp giá trị δC trùng nhau (115, 9 và 129, 0) Điều này chứng tỏ hợp chất 3 có cả thảy 21 nguyên tử Cacbon cụ thể như sau:

H6

H3 H3 ’ , H5 ’

H2 ’ , H6 ’

H5

Vùng trường trung bình, có vân bội với δC từ 61, 4ppm đến 82, 0ppm

cụ thể là các vân ở (61, 4; 70, 6; 70, 9; 73, 4; 78, 7; 82, 0ppm), trong đó có 1 tín hiệu Cacbon ở 61, 4ppm, 4 tín hiệu ở khoảng 70, 6- 78, 7ppm, 1 tín hiệu ở

82, 0ppm, nên chỉ có thể là 6 Cacbon của khung đường α- D- glucopiranozơ

(Hình 3.11)

Trên phổ HSQC (Phụ lục 5) của LE2 ta thấy được sự tương quan giữa proton tại δH 4, 7ppm (1H, d, J=10Hz) với δC73, 4ppm nên có thể qui kết đó chính là proton gắn với nguyên tử - O- của gốc đường chỉ có thể gán cho H-

1’’ tương quan trực tiếp với C1’’

.Ngoài ra trên 13C NMR còn có xuất hiện 3 cacbon ở vùng trường yếu tại δC(160, 4; 161, 2; 162, 7ppm) được gán cho cacbon bậc bốn của vòng thơm liên kết với oxi của nhóm –OH hay –O- có thể gán cho C- 2, C- 5, C- 7

Hình 3.11: Phổ 13C NMR (DMSO, 125MHz) của chất LE2

Kết hợp với phổ HSQC (Phụ lục 5) ta còn thấy: có hai tín hiệu cacbon vòng thơm tương đương có cường độ gấp đôi các tín hiệu khác ở δC 115, 9 (C-

3’, C- 5’) và δC 129.0 ppm (C- 2’, C- 6’) có mối tương quan với 4 proton thơm

từ hai cặp có vị trí octo đối với nhau (H- 3’, H- 5’) và (H- 2’, H- 6’), điều đó

chứng tỏ vòng thơm có gắn hai nhóm thế đối xứng nhau Ngoài ra, trên HSQC còn xuất hiện một vân tại δC 121, 6ppm không có tương quan với H nào cả, chứng tỏ đây là cacbon bậc 4 của vòng benzen có thể gán cho C- 1’.

Hình 3.12: Phổ 13C NMR (DMSO, 125MHz) của chất LE2

C2 ’ , C6 ’

C1 ’

C3 C3 ’ , C5 ’

Hình 3.13: Phổ 13C NMR (DMSO, 125MHz) của chất LE2

Từ kết quả các phổ 1H NMR, 13C NMR, HSQC kết hợp với phổ LC-

MS (Phụ lục 6) của chất 3 cho một pic giả ion phân tử [M+ H ]+ với số khối là m/z=433, 04, suy ra M=432và so sánh với tài liệu tham khảo [27] (xem Bảng

3.14) chúng tôi nhận thấy có sự trùng khớp tốt về phổ của hợp chất LE2 với

của 8- β- D- glucopyranosyl- 5, 7- đihyđroxy- 2- hyđroxyphenyl)- 4H- 1-

benzopyran- 4- on hay còn gọi là Vitexin (30), vì vậy chúng tôi kết luận hợp chất LE2 chính là Vitexin (30).

C7

C=O