Nấm đối kháng trichoderma

Nấm đối kháng trichoderma

1) Nếm đối kháng: là các loài VSV sống hoại sinh trong đất mà trong quá trình sống nó sản sinh ra chất kháng sinh có tác dụng ức chế, kìm hãm cạnh tranh và tiêu diệt nấm gây bệnh 2) Trichoderma: 14 nam d6i khang dễ dàng phát triển trên tất cả các loại đấttự nhiên, đất nông nghiỆp và trong một số môi trường sống khác Chúng hiện diện với mật đỘ cao và phát

triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ

Trichoderma thuộc Ngành nấm Mỹycota, Lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes), BỘ nấm Bông (Moniliales), HQ Moniliaceae, Chi Trichoderma

Chúng tiêu diệt nấm bệnh bằng phản ứng lectin trung gian, va phân huỷ thành tế bào của nấm mục tiêu ( nấm gây bệnh) Quá trình này đã kìm hãm sự tăng trưởng

và hoạt động của các loại nấm gây bệnh Ngoài ra chúng sản xuất các enzyme

thành tế bào, trong đó cho phép trichoderma đâm xuyên vào trong nấm khác và trích xuất các chất dinh dưỡng cho sự phát triển của mình Điều này đã vô tình gây mất

sự sống trực tiếp của những vi nấm gây bệnh

Phân loại Trichoderma

+ Dựa trên sự khác biệt về hình thái, chủ yếu là hình thành bào tử đơn tính

+ Dựa trên tính đối kháng của Trichoderma

Hiện nay, có khoảng 33 loài Trong đó, có 11 loài có khả năng đối kháng cao: T.harzianum, T.aureoviride, T.atroviride, T.koningii, T.longibrachiatum, T.viride,

T.pseudokoningii, T.longipilis, T.minutisporum, T.hamatum, T.seesei

«oO»

a) _ Đặc điểm hình thái: Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng bào tử từ khuẩn ty Bào tử nấm có dạng hình trứng, màu xanh lục đính trên các sợi nấm

T harzienum

KRL:AG“

Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử Trichoderma harzianum phát triển trên

của Trichoderma môi trường PDA (vùng màu xanh chứa bào tỬ)

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển

thành một khối tròn mang cá bào tử trần, không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhày Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình khuôn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm

Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ

2-4 cm sau 4 ngày nuôi cấy Ở nhiệt độ 20 C

b) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:

- _ Môi trường sống: Trichoderma spp là nhóm vi nấm phổ biến ở đất tỰ nhiên, đất nông

nghiệp, đồng cỏ, rừng muối và đất xa mạc Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến các vùng núi cao cũng như vùng nhiệt đới Tuy nhiên, có một sự tương quan giữa

sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường

- _ Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau từ carbohidrat, amino acid đến

amonia

- Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt Tuy nhiên thường không chịu được độ ẩm thấp và điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rỆt trong nhỮng nơi có độ ẩm thấp, song các loài

Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau

- Chất chuyển hóa thứ cấp và khang sinh: Trichoderma spp san xuất nhiều loại kháng sinh, bao gồm các chất có hoạt tính: glioviridin (một dikeptopiperazin), sesquiterpenoids,

trichothecenes (trichodermin), cyclicpeptides và các chất chuyển hóa (trichoviridin) Các chất này có khả năng ức chế các VSV khác và cũng liên quan đến sỰ tăng trưởng yếu kém cỦa sinh vật bậc cao hơn (gây bệnh còi ở cừu thông qua hoạt động ức chế VSV phân cellulose trong da dày cỏ của chúng) Ngoài ra chúng cũng sinh ra nhiều hợp chất ức chế dễ bay hơi có thể trợ giúp cho sự hình thành khuẩn lạc của chúng trong đất

c) Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma

e _ Tương tác với nấm bệnh:

Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại nhƯ sau:

+ Tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis)

+ Kí sinh trên cơ thể cỦa nấm bệnh (Parasitiam)

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh (Competion for nutrient)

Các cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng có thể bao gồm một tương tác hoặc nhiều hơn Ví dụ, sự kiểm soát Borritis trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và kí sinh trên hạch nấm, cả 2 tương tác đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh

- GƠ chế tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis): Các chủng Trichoderma san xuất đa dạng các chất chuyển hóa dễ bay hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế vi sinh vật khác mà không có sự tương tác vật lí Chất ức chế được gọi là chất kháng sinh Các chỦng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trường cũng tác động vào sự hình thành chất kháng sinh cả về số lượng và chất lượng Hơn nữa, các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau

- Gơ chế kí sinh trên cơ thể của nấm bệnh (Parasitiam): tức giết chết các loài gây bệnh

bằng cách xâm nhập vào bên trong loài nấm gây hại và tiết ra những chất (enzyme) để phân

hủy chúng

Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn:

+ Sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa, trong giai đoạn này các tác nhân kích thích hóa học hấp dẫn nấm đối kháng

+ Sự nhận dạng đặc hiệu bởi lectin trên bề mặt tế bào của tác nhân gây bệnh và nấm

đối kháng

+ Sự tấn công và xoắn vòng cUa sQi nam Trichoderma xung quanh vật chủ

+ Sự bài tiết các enzym phân giải thành tế bào Hệ enzym phân giải thành tế bào gồm:

Endochitinase va Glucanase1,3-beta-glucosidase va protease

Trichoderma ki sinh trén Pythium gay bénh trén ré cay

ho dau (Trichoderma nhuOm màu vàng, Pythium nhuộm màu lỤc)

‘Trichoderma

Hé soi nam Trichoderma ki sinh trén

khuẩn ty nấm gây bệnh Rhizoctonia

solani

- Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm

bệnh: Trichoderma sỬ dụng cùng một

nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian

sống) với các sinh vật gây bệnh và Trichoderma "xâm chiếm" môi trường trước khi tác nhân

không mong muốn đến

-

+ SU canh tranh cho m6 hoai sinh (Competion for necrotic tissue) : Botrytis va Sclerotinia la

mầm bệnh tấn công vào mô thực vật lão hóa hoặc chết và coi đó như nguồn dinh dưỡng, từ đây

tiếp tục tấn công vào những mô khỏe mạnh Khi đã xử lí Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm

chậm quá trình hình thành khuẩn lạc của Borrytis vào mô thực vật Sau đó làm giảm mức độ

bệnh trên cây Trichoderna đã được Ứng dụng thành công trong kiểm soat Botrytis va Sclerotinia

trên những loại rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dưa chuột

+ Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt (Competion for plant exudates):

Bệnh chết nhát (Damping-off) gây bởi Pythium uÌtimum Ở một sỐ loại ngũ cốc và rau quả được xuất phát bởi sự đáp Ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với dịch rÏ từ hạt Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống, trong vòng vài giờ Pythium đã lan tràn trong đất Xử lí bằng Trichoderna làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tượng đó gọi là sự cạnh tranh kích thích nảy mầm

+ Sự cạnh tranh trên vị trí vết thương (Competion on wound sites): Một trong những thành công đầu tiên cỦa sự kiểm soát sinh học trên vết thương gây do cắt xén là sử dụng T.viride để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostereum purpureum) Thể đưa vào được chứng minh có khả năng mọc khuẩn lạc trên cây vừa bị cắt và ngăn chặn sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ

3)Phương pháp tiến hành

- _ Các chủng vi sinh vật sử dụng:

Các chủng Trichoderma phân lập từ đất

Các chủng nấm gây bệnh cây trồng:

Vi du: Rhizoctonia solani (ki sinh trén cay tiéu)

Sclerotium solffsii (ki sinh trén than cay thudc 1a)

- Dung cu-thiét bi:

Cân điện tử

Máy lắc 150-250 vòng/phút

Máy do pH

Các dụng cụ thỦy tỉnh thông thường dùng trong phòng thí nghiém (6ng nghiém, erlen, petri ) Các dụng cụ lấy mẫu ( xẻng, dao, túi )

- Vat liéu:

Môi trường nuôi cấy Trichoderma (môi trường PDA):

Ampicilin 100ml

Môi trường thử tính đối kháng của Trichoderma (môi trường giá đỖ)

Phương pháp thu thập mẫu đất

Thu thập các mẫu đất tại các địa điểm có đặc điểm địa hình, loại cây trồng, cách canh tác khác nhau:

- Chọn một ô vuông có diện tích 1m2, xác định 4 góc và tâm cỦa ô vuông Dùng dao hay xẻng đã rửa sạch và lau cồn để lấy mẫu đất Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-3 cm trên cùng vì lớp đất

này có thể đã bị nhiễm bởi các VSV bên ngoài Sau đó lấy tỪng tảng nguyên vẹn, mỗi mẫu lấy khoảng 0.3-0.5kg, các mẫu này được trộn đều và đựng trong túi đã khử trùng, sau đó lấy ra khoảng 1kg cho vào túi giấy chống ẩm đã khử trùng rồi đặt trong một túi vải Buộc túi lại rồi cho vào một bao polyetylen Trên bao này ghi rõ vùng nghiên cứu, đặc diểm của chỗ lấy mẫu và các đặc tính của đất Giữ mẫu trong tủ lạnh cho đến khi phân tích và xác định

- Địa điểm thu thập mẫu đất phải đáp Ứng các yêu cầu:

-Phải đặc trưng cho loại đất của vùng

-Phải ở khu vực dễ xác định trên bản đồ hành chính, bản đồ phân loại đất

-Phải thuận tiện cho việc tiến hành lấy mẫu về giao thông và lỘ trình chuyến đi

Phương pháp chuẩn bị mẫu để phân tích VSV:

- Lấy mẫu đất trải lên một miếng kính thủy tinh đã lau cồn và hơ trên ngon lửa Trộn đất thật

kĩ bằng bay rồi trải đều ra Dùng bay lấy một ít đất từ những điểm khác nhau trên tấm kính cho vào một chén sứ đã khử trùng và biết rõ trọng lượng để cân trên cân kĩ thuật 1g maauxtrung

bình của đất

- Chuẩn bị 2 erlen vô trùng dung tích 250ml, một bình có sẵn 100ml nước cất, bình kia để

không Lấy từ bình thứ nhất 0.4-0.Bml nước cho vào một chén sứ có đựng đất đã cân để làm cho đất có được trạng thái bột nhão Nghiền nát trong 5 phút bằng một chày cao su vô trùng hoặc bằng tay có mang găng cao su vô trùng Lấy nước vô trùng ở bình thứ nhất chuyển hỗn hợp đất đã nghiền nát vào bình không, phải sử dụng hết lượng nước này ( Chú ý nghiền đất và

trút nước cất vào bình ngay dưới ngọn lửa Đặt bình có dịch huyền phù đất lên máy lắc và lắc trong 5 phút Sau đó lấy ra để yên trong 30 giây để làm lắng các hạt lớn và ngay sau đó được dùng để chuẩn bị tiêu bản hoặc để pha loãng tiếp Khi đó ta coi dịch huyền phù đất nhận được

đầu tiên này có đỘ pha loãng 100 lần (1:100)

Phương pháp phân lập và phân lập thuần khiết vi nấm Trichoderma trên môi trường PDA

* Nguyên tắc:

- Tách rời các tế bào vi nấm

- Nuôi cấy trên môi trường PDA các khuẩn lạc riêng rễ, cách biệt nhau

* Cách tiến hành gồm 3 bước cơ bản:

- Phân lập vi nấm Trichoderma thuần khiết trên môi trường PDA: Hút 0.1ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường PDA, dùng que gạt thỦy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri còn

lại

Đặt các petri ở nhiệt độ phòng, sau 2-3 ngày nhận được khuẩn lạc riêng rễ đặc trưng cho Trichoderma

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rễ tỪ quần thể vi nấm ban đầu trên môi trường PDA

Tiến hành pha loãng mẫu cần phân lập để làm cho số lượng vi sinh vật ít đi Cấy chúng trên

môi trường PDA, có bổ sung chất kháng sinh để ức chế vi khuẩn

- Kiểm tra độ tinh khiết các giống mới phân lập:

Sử dụng phương pháp kiểm tra bằng mắt nhằm quan sát sỰ sinh trưởng dọc theo vết cấy trên môi trường PDA Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc riêng rẽ.

Phương pháp xác định số lượng nấm mốc bằng cách đếm các khuẩn lạc nấm mốc mọc trên môi trường PDA

* Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu trên môi trường đặc trưng trong đĩa petri và sau đó đếm số khuaamr lạc mọc lên sau khi ủ Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào

* Cách tiến hành:

Trước tiên phải ghi độ pha loãng và ngày cấy trên đĩa petri

Sử dụng dịch huyền phù (nồng đỘ 10? ) đã chuẩn bị trước Pha loãng ở 2 nồng độ (103, 10)

Ở mỗi nồng đỘ, hút 0.5ml dịch cho vào giỮa mặt thạch trong dia petri dàn đều bằng que gạt thủy tinh vô trùng Mỗi độ pha loãng cấy 3 petri lặp lại

Nồng độ pha loãng là tốt nhất khi ở nồng độ đó có từ 30-300 khuẩn lạc

Số lƯợng tế bào có trong 1 øg mẫu được tính theo công thức:

Số tế bào/g= Mx2 x10" xN

Trong đó: M_ : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri

10? : ĐỘ pha loãng

N : hệ số tính theo trọng lượng khô của mẫu

Phương pháp thử tính đối kháng của Trichoderma đối cới các chủng nấm gây bệnh

* Nguyên tắc:

Trong quần thể vi sinh vật, các loài vi sinh vật tác động qua lại, loại này có khả năng kiểm soát điều hòa số lượng của loại khác qua cơ chế cạnh tranh

e Cách tiến hành:

- Rót môi trường giá đỖ vào đĩa petri để nguội và kiểm tra nhiễm tạp sau 24h

- Kẻ 1 đưởng giữa petri (ở đáy)

- Cấy nấm Trichoderma và một trong 3 chủng nấm bệnh trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ, mỗi mẫu lặp lại 3 lần, mỗi lần làm 3 petri

Cách lấy điểm thử đối kháng Trichoderma với nấm

bệnh

- Ú ở nhiệt độ phòng Theo dõi tốc đỘ sinh trưởng và phát triển của Trichoderma và chủng nấm gây bệnh thực vật

© Chi tiéu theo déi:

- Chỉ tiêu 1: theo dõi các chủng đối kháng cho đến khi có ít nhất một chủng Trichoderma

ức chế hoàn toàn nấm gây bệnh thực vật Lúc này, so sánh khả năng đối kháng giỮa các chủng Trichoderma với nấm gây bệnh

- Chỉ tiêu 2: theo dõi các mẫu thử đối kháng cho đến khi các chủng Trichoderma thể hiện khả năng đối kháng tối đa trong thời gian tối đa 14 ngày

e - Quy ước về khả năng đối kháng của Trichoderma với các chẳng nấm bệnh:

Sau khi tiến hành thử đối kháng, theo dõi các đĩa đã cấy cho tới khi hai khuẩn lạc của Trichoderma và nấm gây bệnh tiếp xúc nhau.Ghi nhận kết quả nấm đối kháng theo quy

Uc sau:

1+: Bào tử của Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh Hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dẫn Hiệu quả ức chế từ 40-60%

2+: Tương tỰ (1+), hiệu quả ức chế 60-80%

3+: Tương tự (1+), hiệu quả ức chế 80-90%

4+ Tương tự (1+), hiệu quả ức chế >90%

-: _ ngoài các trường hỢp trên

* Công thức tính hiệu quả ức chế:

H =(dB-d)/dB *100%

Trong đó: H: hiệu quả ức chế

dB : đường kính khuẩn lạc nấm bệnh ban đầu

d: đường kính sau khi đối kháng của khuẩn lạc nấm gây bệnh

Kết quả đối kháng tương ứng với hiệu quả “-“

Kết quả đối kháng tương Ứng với hiệu quả “1+”

Kết quả đối kháng tương Ứng với hiệu quả “2+”

Kết quả đối kháng tương ứỨng với hiệu quả “3+“

Kết quả đối kháng tương Ứng với hiệu quả “4+” 4) Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hoạt động của Trichoderma spp

1.pH của môi trường : Ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và khả năng đối kháng của Trichoderma Các chủng Trichoderma.spp điều có mức đỘ pH thích hợp khác nhau nhưng hầu hết đều phát triển tỐt trong môi trường pH từ 4- 8 Sự phân giải Cenllulose xảy ra nhanh trong môi trường pH>4 và chậm lại khi pH< 4,pH thích hợp cho sv hình thành bào tử là 5-5,8 và tùy mức pH khác nhau có thể tạo ra các dạng bào tử khác nhau

2.Nhiệt độ: Nhiệt độ tối thích cho các loài thuộc chi Trichoderma là 25-300C Tuy nhiên chúng có

thể thích nghi khi sống ở vùng có nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn

Nhiệt độ thích hợp cho quá trình tiết chitinase là400 C, B-1,3-glucanase tiết nhiều ở nhiệt độ 350C

3.Oxy và khí cacbonic: Trichoderma là SV hiếu khí, tuy nhiên chúng có khả năng tổn tại Ở nơi có hàm lượng oxy rấtt hấp Nguồn oxy & hoạt động của khuẩn ty là yếu tỐ quan trỌng trong việc điều tiết sự thành lập enzyme cellulase Có khả năng chịu được sự tích lũy CO2 cao hơn nhỮng

4.Ảnh hưởng của nguồn cacbon : Nguồn cacbon rất cần thiết để Trichoderma phát triển tốt Ảnh hưởng đến khả năng tạo enzyme của nấm Trichoderma Nguồn cacbon được sử dụng cho nấm được nghiên cứu là D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-fructose

5 Độ ẩm: độ ẩm đất tác động gián tiếp lên sựt hoáng khí, sự di chuyên của các dướng chất hòa

tan và là nhân tố chính tác động đến sự phân bố của Trichoderma Trichoderma thường thích sống

Ở nơi có ẩm đỘ cao Liên quan đến khả năng mọc mầm và phát triển ống mầm của Trichoderma Ảnh hưởng đến khả năng tiết & hoạt động của các enzyme như B-glucosidae, cellobihydrolase