Tuy nhiên, việc thu nhận và sử dụng enzyme làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất một số dược phẩm vẫn còn khá hạn chế; mặc dù sự phát triển mạnh mẽ của nhiều ngành công nghiệp đã và đang
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ tận tình, chu đáo với tinh thần trách nhiệm của các Thầy Cô, Cha Mẹ, bạn bè cũng như các đồng nghiệp Tác giả xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới:
PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu – Cô đã hướng dẫn tôi lựa chọn đề tài, động viên và truyền đạt những ý kiến, những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học
TS Lê Phi Nga – Trưởng bộ môn Sinh hóa – Khoa Sinh học, Cô đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tại
bộ môn và phòng thí nghiệm tại cơ sở Linh Trung, Thủ Đức
Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh hóa - Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã truyền đạt cho tôi các kiến thức chuyên ngành, giúp tôi thêm hiểu biết, yêu quý và trân trọng ngành học mà mình đã lựa chọn
Th.S Trần Quốc Tuấn, Th.S Vòng Bính Long, các bạn học viên cao học K17
và các em sinh viên đã hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm ở bộ môn
Cha mẹ, các anh chị em, bạn bè và các đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn
Kính gởi đến Quý Thầy Cô, các đồng nghiệp, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong lĩnh vực công tác của mình
Trân trọng!
Tác giả
Nguyễn Ngọc Sương Mai
Trang 2MỞ ĐẦU
Enzyme đã được ứng dụng từ rất lâu trong nhiều ngành nghề truyền thống như: làm bánh mì, bánh kẹo, chế biến thức uống như rượu, bia, nước ép trái cây, dầu ăn, phômai, mỹ phẩm, các ứng dụng khác trong ngành công nghiệp giấy, dệt may Trong những thập niên gần đây, enzyme còn được sử dụng hiệu quả trong lĩnh vực y dược để điều trị bệnh và điều chế dược phẩm
Ở Việt Nam, trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích chế tạo thuốc điều trị bệnh cũng đã được tiến hành Tuy nhiên, việc thu nhận và sử dụng enzyme làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất một số dược phẩm vẫn còn khá hạn chế; mặc dù sự phát triển mạnh mẽ của nhiều ngành công nghiệp đã và đang tạo nên một lượng lớn các phế phụ liệu, đây chính là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc sản xuất các enzyme có giá trị
Theo thông tin từ Hội nghị trực tuyến ngành Dược toàn quốc ngày 23/6/2009, 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước phải nhập khẩu từ nước ngoài trong khi thuốc sản xuất trong nước chủ yếu là các thuốc điều trị thông thường, bào chế ở dạng đơn giản và hiệu quả kinh tế chưa cao Như vậy, việc nhanh chóng tìm được nguồn nguyên liệu ổn định với giá cả hợp lý đang trở thành vấn đề thách thức đối với ngành Dược phẩm Việt Nam nói chung
Hơn thế nữa, việc tận dụng được các phế phụ phẩm của một số ngành công nghiệp chế biến để sản xuất enzyme ứng dụng trong dược phẩm sẽ mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và xã hội cho nước ta trong giai đoạn hiện nay
Xuất phát từ một số thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Thu nhận
và khảo sát đặc tích của một số enzyme hydrolase ứng dụng trong dược phẩm”
với mục tiêu: - Thu nhận một số enzyme hydrolase có ứng dụng trong Dược phẩm, - Khảo sát đặc tính enzyme của các chế phẩm thu nhận và so sánh với các enzyme có trong thành phần của một số Dược phẩm đang lưu hành trên thị trường
Trang 3Trên cơ sở các kết quả đạt được và so sánh với tiêu chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam, đề tài có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về một
số nguyên liệu (enzyme) phục vụ cho lĩnh vực dược phẩm tại Việt Nam
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi chỉ đi sâu hướng thu nhận và khảo sát đặc
tính của các enzyme sau: pancreatin, pepsin và papain
Trang 4DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tỷ lệ hấp thu một số enzyme trong cơ thể 9
Bảng 1.2: Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý 11
Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng của trái đu đủ chín 13
Bảng 1.4: Thành phần amino acid của papain 16
Bảng 1.5: Thành phần amino acid của pepsin 22
Bảng 1.6: Lượng enzyme của tuyến tụy 29
Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ albumin và giá trị ∆OD 750nm 62
Bảng 3.2: Hàm lượng protein trong chế phẩm papain thu nhận và Dược phẩm 63
Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ tyrosin và giá trị ∆OD 660nm 63
Bảng 3.4: Hoạt độ enzyme papain của chế phẩm thu nhận và Dược phẩm 64
Bảng 3.5: Hoạt độ riêng của enzyme papain từ chế phẩm và Dược phẩm 66
Bảng 3.6: Hoạt độ của chế phẩm papain ở nhiệt độ 30 – 40oC 67
Bảng 3.7: Hoạt độ của chế phẩm papain ở các giá trị pH khảo sát 68
Bảng 3.8: Hiệu suất thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày heo 69
Bảng 3.9: Hàm lượng protein hòa tan trong CP enzyme thu nhận và trong Dược phẩm 70
Bảng 3.10 : Hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận và pepsin Dược phẩm 71
Bảng 3.11 : Hoạt độ riêng của chế phẩm pepsin thu nhận và Dược phẩm 72
Bảng 3.12: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở nhiệt độ 30 – 40oC 73
Bảng 3.13: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở pH 1,5 – 4,0 74
Trang 5Bảng 3.14: Hiệu suất thu nhận chế phẩm pancreatin từ tụy heo 75 Bảng 3.15: Mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ∆OD 560nm 77 Bảng 3.16: Hàm lượng protein hòa tan của CP pancreatin thu nhận và các Dược phẩm 78 Bảng 3.17: Hoạt độ trung bình các enzyme của chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 79 Bảng 3.18: Hoạt độ riêng của chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 80 Bảng 3.19: Hoạt độ của các enzyme các enzyme của CP pancreatin ở pH 7,0 – 8,5…81 Bảng 3.20: Hoạt độ các enzyme của CP pancreatin ở nhiệt độ 30 – 40oC 81 Bảng 3.21: Khả năng tiêu đạm của các chế phẩm protease 83 Bảng 3.22: Hàm lượng Nitơ tổng số (g/100g) của các nguyên liệu dùng thủy phân 84 Bảng 3.23 : Lượng NF (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi papain 85 Bảng 3.24: Lượng NF (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi pepsin 87 Bảng 3.25: Lượng NF (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi
pancreatin 88
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Vườn đu đủ sai trái ở Bắc Giang 12 Hình 1.2: Giải phẫu tuyến tụy 28 Hình 1.3: Cấu trúc của chuỗi glucose liên kết α-1,4 và 1,6 35
Trang 6DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Đường chuẩn albumin 62
Đồ thị 3.2: Đường chuẩn tyrosin 64
Đồ thị 3.3: Hoạt độ của CP papain tại nhiệt độ và pH khảo sát 68
Đồ thị 3.4: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở pH và nhiệt độ khảo sát 74
Đồ thị 3.5: Đường chuẩn tinh bột 77
Đồ thị 3.6: Hoạt độ các enzyme của chế phẩm pancreatin tại pH và nhiệt độ khảo sát 82
Đồ thị 3.7: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP papain 86
Đồ thị 3.8: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP pepsin 87
Đồ thị 3.9: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP pancreatin 89
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình tách chiết và khảo sát đặc tính các enzyme 40
Sơ đồ 2.2: Quy trình trích ly enzyme từ Dược phẩm 41
Sơ đồ 2.3: Quy trình thu chế phẩm papain 43
Sơ đồ 2.4: Quy trình thu chế phẩm pepsin 45
Sơ đồ 2.5: Quy trình thu chế phẩm pancreatin 46
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Hoạt độ của enzyme papain từ mủ đu đủ và Dược phẩm 65
Biểu đồ 3.2: Hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận và Dược phẩm 71
Biểu đồ 3.3: Hoạt độ của các enzyme trong chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 79
Trang 7DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
∆OD Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng
UI Đơn vị hoạt độ enzyme
Trang 8-1-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về ứng dụng của enzyme:
Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, gluco-oxydase… được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử" [5]
1.1.1 Ứng dụng trong y dược:
Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: [5]
• Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự
hỗ trợ của enzyme
• Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật
• Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu Dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa protein và một số loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…
Trang 9-2-
1.1.2 Ứng dụng trong hóa học:
Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn cố định enzyme nhằm xúc tác cho phản ứng nhiều giai đoạn và tái sử dụng, ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn cố định vi sinh vật lên chất mang để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid…Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid … Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích [5]
1.1.3 Ứng dụng trong công nghiệp:
Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp rất đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn Các lĩnh vực sử dụng enzyme protease có thể kể đến: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Enzyme amylase đã được dùng trong sản xuất bánh mì, công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật, glucose, sản xuất các sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ em, sản xuất các mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy… [5]
1.1.3.1 Công nghiệp thực phẩm:
Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng protease trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm
để chế biến thịt bò, nấu chân giò với đu đủ xanh, kết hợp thức ăn nhiều thịt với đu
đủ để trị chứng khó tiêu hóa và táo bón…mà thực chất là sử dụng các enzyme papain, bromelain, ficin Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẩy mầm
để làm mềm thịt [5]
Trang 10-3-
Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả bởi tính năng của protease
Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi Người ta còn khai thác tính đông tụ sữa của renin, pepsin vào công nghiệp sản xuất phomat
Enzyme pectinase đã được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau: sản xuất rượu vang, sản xuất nước quả và nước uống không có rượu, sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt, sản xuất nước giải khát, sản xuất cà phê
Cellulase với công nghiệp thực phẩm:
Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung làm cho chất lượng thực phẩm được tăng lên Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…[5]
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó
có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men
Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase đã được dùng phổ biến trong một số lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose, rượu , bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã làm thay đổi hoàn toàn chất lượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp sử dụng chế
Trang 111.1.3.3 Công nghiệp thuộc da:
Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làm sạch lông và da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt
da Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn sau khi xử lý So với phương pháp hóa học thì việc
xử lý bằng enzyme có số lượng lông tăng 20-30% Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịch enzyme [5]
1.1.4 Ứng dụng trong nông nghiệp:
Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Ở Nhật hàng năm đã sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại để dùng trong nông nghiệp Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia Ở nước ta việc dùng enzyme
Trang 12-5-
vi sinh vật trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học [5]
1.2 Enzyme trong công nghiệp Dược phẩm:
Nguồn enzyme ứng dụng trong công nghiệp Dược phẩm có thể thu nhận từ rất nhiều nguồn khác nhau, bao gồm động vật (thường là heo, bê), thực vật (dứa, đu đủ), vi sinh vật (vi khuẩn, vi nấm)… [14]
1.2.1 Nguồn thu nhận:
1.2.1.1 Enyzme động vật:
Cơ thể người có nhiều loại enzyme, trong đó, một số loại cũng được tìm thấy
ở các động vật khác; ví dụ như enzyme trypsin, do tuyến tụy tiết ra, cũng tìm thấy ở nhiều loài có xương sống khác như côn trùng, tôm và một số vi sinh vật khác như
Streptomyces griseus Dù khác nhau từ nguồn thu nhận, nhưng các trypsin này đều
là enzyme hydrolase và cùng cơ chế tác dụng Enzyme nguồn gốc động vật thường được trích ly từ gan, tuyến tụy hoặc dạ dày bò, heo; bao gồm protease, amylase, lipase Các enzyme được biết đến nhiều nhất là trypsin, chymotrypsin, rennin, pepsin, pancreatin (gồm nhiều enzyme: protease, lipase, amylase) [14]
1.2.1.2 Enzyme thực vật:
Bên cạnh các enzyme có nguồn gốc động vật, nguồn enzyme bổ sung còn được thu nhận từ thực vật, có thể kể đến một số loại như dứa (bromelain), đu đủ (papain), sung (ficin), lúa mạch (malt diastase)…Các enzyme thường có giá trị ở dạng tinh khiết, nhưng phần lớn enzyme thực vật cũng được tìm thấy trong dịch trích ly của thực phẩm chức năng [14]
1.2.1.3 Enzyme vi sinh vật
Enzyme có nguồn gốc vi sinh vật thường là từ vi khuẩn hoặc vi nấm Trong những năm gần đây, vi sinh vật trở thành nguồn cung cấp enzyme chủ yếu, do đáp
Trang 13-6-
ứng những yêu cầu trong sản xuất công nghiệp, đó là chi phí thấp và sản lượng dồi dào Theo công bố của Tony Godfrey và Stuart West trong tác phẩm “Enzyme công nghiệp”, xuất bản lần thứ 2 năm 1996, enzyme nguồn gốc vi sinh vật chiếm khoảng 90% tổng sản lượng enzyme thương mại
Các vi sinh vật thường được sử dụng nhiều trong lên men sản xuất enzyme
bổ sung được biết đến nhiều nhất là Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus niveus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis và một số chủng nấm men Saccharomyces [14]
1.2.2 Vai trò của enzyme trong công nghiệp dược phẩm:
Enzyme có nhiều công dụng kỳ diệu trong việc duy trì, cải thiện sức khỏe con người, trong điều trị bệnh và chữa lành các vết thương Đó là kết quả nghiên cứu từ nhiều công trình trên enzyme thực vật, động vật và vi sinh vật trong những thập niên gần đây Với vai trò là một chất xúc tác sinh học, enzyme được đề cập đến nhiều nhất như là chất trợ tiêu hóa và điều trị các bệnh liên quan đến hệ thống tiêu hóa Trong trị liệu, đôi khi enzyme cần phải được hấp thu vào máu, phương pháp
này gọi là liệu pháp enzyme hệ thống (systemic enzyme therapy) [14]
1.2.2.1 Chất trợ tiêu hóa
Enzyme bổ sung thường được sử dụng làm chất trợ tiêu hóa Trên thực tế, đu
đủ đã được sử dụng làm chất trợ tiêu hóa từ nhiều thế kỷ do chứa enzyme papain Vai trò chủ yếu của enzyme tiêu hóa là phân cắt thực phẩm thành những tiểu phần nhỏ hơn, giúp cơ thể dễ hấp thu Quá trình này được hoàn tất chủ yếu ở dạ dày, và sau đó là ruột non.[14]
Các enzyme được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa phần nhiều là protease, amylase, lipase Mỗi enzyme hoạt động chuyên biệt trên mỗi loại cơ chất của mình Enzyme tiêu hóa carbohydrate sẽ không tác động đến protein hay chất béo trong thức ăn Nếu thức ăn của bạn nhiều chất béo, việc bổ sung enzyme lipase sẽ thúc
Trang 14-7-
đẩy tiêu hóa nhanh hơn, trong khi đó, enzyme protease giúp quá trình tiêu hóa protein (bò, heo, gà…) tốt hơn, amylase phân cắt carbohydrate (bánh mì, rau, khoai tây, đường…) nên có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa nhóm thực phẩm này…
Tuy nhiên, ngoài vai trò hỗ trợ tiêu hóa, các enzyme còn thực hiện những chức năng khác trong cơ thể Do có khả năng phân cắt protein, carbohydrate, chất béo, các enzyme trợ tiêu hóa còn giúp kích thích sự phát triển của các vi khuẩn có lợi trong ruột, giải độc và làm sạch ruột kết, vì thế, góp phần cải thiện một số điều kiện tiêu hóa như dị ứng thức ăn, thải loại chất độc ra khỏi cơ thể Quá trình này xảy
ra ở mức tế bào, trong các bào quan và nhiều hệ thống khác nhau của cơ thể [14]
1.2.2.2 Liệu pháp enzyme hệ thống (Systemic enzyme therapy):
Enzyme cần thiết cho mọi quá trình sống Khi thiếu enzyme, cơ thể sẽ mắc bệnh Liệu pháp enzyme hệ thống là phương pháp điều trị các rối loạn bằng việc sử dụng enzyme Hàng trăm loại rối loạn trong cơ thể, bao gồm ung thư, các bệnh liên quan đến tim mạch, viêm nhiễm có thể được điều trị bằng liệu pháp này [14]
Không như các enzyem trợ tiêu hóa, enzyme sử dụng cho liệu pháp này cần được hấp thu vào máu để đảm bảo hiệu quả điều trị Vì thế, các enzyme nguồn gốc động – thực vật cần được bao áo hoặc được bảo vệ theo cách nào đó nhằm kháng lại acid khi tiếp xúc với dạ dày Enzyme vi sinh vật có thể được thiết kế và sản xuất với đặc tính kháng acid để có thể chịu được điều kiện acid của dạ dày trước khi đi vào ruột non [14]
1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme:
pH
Thông thường, pH ở miệng là trung tính, trong khi ở dạ dày là acid và ở ruột
là kiềm Về đặc tính, mỗi enzyme có khoảng pH tối ưu khác nhau, có thể rộng hoặc hẹp Đối với enzyme nguồn gốc vi sinh vật, pH của một enzyme cũng có thể thay đổi tùy vào phương pháp thu nhận, đối tượng thu nhận là vi khuẩn hay vi nấm Ví
Trang 15-8-
dụ, lipase từ Aspergillus oryzae có pH tối ưu trong khoảng 6.0 - 6.5; pH tối ưu của lipase Candida Cylindracea là 7.0 - 7.5; lipase Rhizobus arrhizus và Aspergillus niger có pH tối ưu là 5.6 trong khi lipase từ Geotrichum candidum có pH gần
khoảng 6.0 [14]
Sự hấp thụ enzyme trong cơ thể
Enzyme dùng cho mục đích trợ tiêu hóa không cần phải hấp thu vào máu, chúng chỉ hoạt động trong dạ dày hoặc ruột non; nhưng các enzyme sử dụng trong liệu pháp hệ thống cần được hấp thu vào máu và không bị phân hủy trong đường tiêu hóa [14]
Có ít nhất ba cơ chế để enzyme được hấp thụ vào ruột non Cơ chế thứ nhất gọi là sự thẩm bào (pinocytosis) Trong cơ chế này, màng tế bào ruột non phát triển thành những túi nhỏ, bao lấy enzyme cũng như một số phân tử lớn khác và hướng chúng đi vào máu Cơ chế thứ hai là persoption, các phân tử dinh dưỡng lớn được đẩy vào trong tế bào ruột non nhờ sự co bóp nhu động, sau đó chúng tiếp tục được đẩy vào mạch máu Enzyme cũng có thể được đưa vào máu qua hệ bạch huyết Lớp biểu mô của ruột non chứa các tế bào M, những tế bào này sẽ vận chuyển enzyme tới hệ bạch huyết, tại đây, lympho bào kết dính với chúng, vận chuyển chúng qua mạch bạch huyết và đi vào máu [14]
Những cơ chế hấp thu này áp dụng cho tất cả các phân tử lớn, không phải chỉ riêng với enzyme Vì thế, có một vấn đề hạn chế trong hấp thu enzyme, đó là khả năng các phân tử lớn khác được hấp thu vào máu trước và enzyme bị bỏ lại Vì lý
do này, cần đảm bảo có đủ enzyme ở vị trí hấp thu để hiệu quả hấp thu enzyme đạt cực đại Đây cũng là lý do vì sao enzyme dùng theo đường uống luôn phải sử dụng
ở liều cao và enzyme trong liệu pháp hệ thống cần được uống giữa các bữa ăn, không phải trong bữa ăn, để hạn chế enzyme đi vào hệ thống tiêu hóa [14]
Tuy nhiên, trước khi đi vào ruột non, enzyme phải trải qua những điều kiệu khá khắc nghiệt như môi trường acid ở dạ dày, môi trường kiềm ở ruột non Rất
Trang 16-9-
nhiều enzyme bị giảm hoạt tính hay bị phân hủy trong điều kiện acid Vì thế, các enzyme sử dụng trong liệu pháp enzyme hệ thống cần được bảo vệ khi đi qua các điều kiện môi trường này Thông thường, người ta sử dụng một số kỹ thuật như bao
áo, vi bao hoặc thiết lập công thức đặc biệt cho enzyme với tá dược đi kèm Theo cách này, enzyme được bảo vệ an toàn cho tới khi đi vào ruột non Tại đây, lớp áo bao thuốc bị phân giải và enzyme được hấp thu vào máu [14]
Theo GS J Seifert và cộng sự (Trường Đại học Christian Albrechts, Kiel, Đức), tỷ lệ hấp thu một số loại enzyme trong cơ thể có thể đạt 44% với amylase, nhưng chỉ khoảng 7% với papain (xem bảng 1.1)
Bảng 1.1: Tỷ lệ hấp thụ một số enzyme trong cơ thể [14]
Enzyme Hàm lượng
(mg/viên)
Hàm lượng hấp thụ (mg)
Tỷ lệ hấp thụ, %
Trang 17-10-
phải hoạt động tích cực hơn cho tới khi suy yếu và bị phân giải Điều đó có nghĩa rằng, cần bổ sung enzyme đúng thời điểm nhằm mang lại hiệu quả tốt nhất Nếu nhiệt độ cơ thể tăng nhẹ, sẽ làm tăng hoạt tính của một số enzyme có vai trò quan trọng trong việc chống lại bệnh tật Tuy nhiên, nếu nhiệt độ tăng quá cao, enzyme bị phân giải, dẫn đến sự mất cân bằng enzyme trong cơ thể và gây nên những hậu quả nghiêm trọng [14]
1.3 Một số enzyme hydrolase có ứng dụng trong công nghiệp Dược phẩm: 1.3.1 Enzyme papain:
1.3.1.1 Nguồn thu nhận:
a) Phân bố của cây đu đủ:
Đu đủ, Carica papaya L., là một trong những loại trái cây phổ biến của vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới Sản lượng thế giới năm 2004 đạt 6,8 triệu tấn trên 389.990 hecta (FAO 2004), trong đó 47% sản lượng có nguồn gốc từ khu vực Trung và Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazin), 30% từ Châu Á và 20% thuộc về Châu Phi Mặc dù được trồng (>90%) và tiêu thụ chủ yếu tại các nước đang phát triển, nhưng
Trang 18-11-
đu đủ đã nhanh chóng trở thành một loại trái cây quan trọng của thế giới, ngang tầm với nhiều loại trái cây và sản phẩm nông sản khác [24]
Bảng 1.2: Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý [24]
Vùng Diện tích thu hoạch
giữa Carica peltata và một số loài hoang dại khác (Purseglove 1968) [24]
Lịch sử phát hiện đu đủ được ghi nhận lần đầu tiên bởi Oviedo, Giám đốc vùng mỏ Hispaniola (Antilles) từ năm 1513 tới 1525 Ông đã mô tả cách thức Alphonso de Val verde thu nhận hạt đu đủ từ bờ biển Panama tới Darien, sau đó tới San Domingo và các hòn đảo khác của miền tây Ấn Độ cũng như các vùng lân cận Người Tây Ban Nha đặt tên cho nó là “papaya” và mang tới trồng ở Philipine, sau
đó lan rộng ra khắp Malaya và cuối cùng là Ấn Độ vào năm 1598 (Schery 1952) Năm 1874, cây đu đủ đã nhanh chóng được phân bố rộng khắp các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới [24]
Trang 19-12-
Cây đu đủ ở Việt Nam
Hiện nay, vùng Daklak Việt Nam đã được công ty BPI.SA (Vương quốc Bỉ) tài trợ dự án phát triển cây đu đủ Toàn bộ mủ đu đủ được xuất sang Bỉ ở dạng thô
để dùng làm thuốc và chất xúc tác trong ngành hóa thực phẩm Một đời cây đu đủ giống solo (lai giữa đu đủ Châu Phi và Thái Lan) trong điều kiện chăm sóc tốt có thể cho 1-1,5 kg mủ khô Hiện nay, BPI đã xây dựng nhà máy chế biến mủ đu đủ ngay tại địa phương [8]
b) Hình thái và sinh lý cây đu đủ
Đu đủ là một loại cây nhiệt đới, thân thảo to, mọc thẳng, thường ít hoặc không phân nhánh Lá to, phân thùy hình chân vịt Quả đu đủ có hình oval hoặc gần tròn, dài 15 - 50 cm, bề dày 10 - 20 cm và trọng lượng có thể đạt 9 kg (Morton 1987) Khi còn xanh, quả đu đủ chứa rất nhiều mủ, vỏ màu xanh và cứng Khi chín,
vỏ quả chuyển thành màu vàng nhạt - vàng đậm đến cam Trái đu đủ già chứa rất nhiều hạt hình trứng, màu xám đen, bám nhẹ vào lớp thịt quả nhờ lớp mô sợi mềm
Cây đu đủ phát triển tốt
ở pH 5.5 - 6.7 (Morton 1987)
với nhiệt độ ưa thích là 22 -
26oC, lượng mưa phân bố đều
100 - 150 cm Samson (1986)
đã công bố rằng, trái đu đủ cần
4-5 ngày chiếu sáng để chín
hoàn toàn trên cây [19]
Đu đủ thường được trồng
từ hạt Sau 2 - 4 tuần gieo, hạt
bắt đầu nảy mầm Đây là loại
cây phát triển nhanh và cho nhiều quả Khoảng 10 - 12 tháng từ lúc nảy mầm, cây bắt đầu ra hoa, kết trái; trái chín sau khoảng 5 tháng [24]
Hình 1.1: vườn đu đủ sai trái ở Bắc Giang [27]
Trang 20-13-
c) Công dụng, đặc tính dược lý của đu đủ
Ở đu đủ, cả cây cái lẫn cây lưỡng tính đều cho quả, nhưng hình dáng của chúng khác nhau Trái đu đủ từ cây cái thường tròn, trong khi ở cây lưỡng tính là dài Đu đủ gồm chủ yếu là nước và carbohydrate trong thành phần, ít năng lượng nhưng giàu vitamin và khoáng chất, đặc biệt là vitamin A, C và Kali (Chan and Tang 1979, xem bảng 1.3) [24]
Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng của trái đu đủ chín (tính trên 100g) [24]
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Protein 0,61 g Phosphor 5 mg Panto acid 0,22 mg
Carbohydrate 9,8 g Magie 10 mg Vitamin E 0,73 mg
Nguồn: USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 18 (2005)
Đu đủ thường được làm mứt, đồ chua, món tráng miệng Quả đu đủ xanh được dùng phổ biến ở Thái Lan và Việt Nam như một loại rau, lên men làm dưa chưa hoặc ngâm đường (Sankat, Maharaj 1997) Ngoài ra, dịch trích từ trái và hạt
đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh, có thể kháng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri
(Emeruwa 1982) Flath và Forrey (1977) đã xác định được 106 hợp chất dễ bay hơi
ở đu đủ Chinoy và cộng sự (1994) thí nghiệm trên chuột, đã chứng minh dịch trích
từ hạt đu đủ có thể được dùng như thuốc tránh thai, đáng chú ý nhất là 2 loại hợp chất chính MCP I và ECP I (tên mã hóa của 2 hợp chất methanol và ethyl acetate có
Trang 21Mủ đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế sự tăng trưởng của nấm, đặc biệt
là nấm Candida albicans (Giordani và Siepai 1991), vì thế thường được sử dụng trị
bệnh eczema trên da do nấm gây ra Ở Mauritius, khói từ lá đu đủ khô có tác dụng cắt các cơn hen suyễn, trong khi ở Úc, người ta cho rằng một số bệnh ung thư có thể được cải thiện sau khi uống dịch trích lá đu đủ
Đu đủ thường được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Theo Reed (1976), mủ đu đủ rất công dụng cho việc điều trị chứng khó tiêu, đắp vết bỏng ngoài da Okeniyi và cộng sự (2007) cho rằng trái và hạt đu đủ có thể tẩy giun sán
và amip Ở Ấn Độ, trái đu đủ xanh hoặc chín vừa được ăn hoặc đưa vào tử cung để phá thai Gần đây, một công trình nghiên cứu trên chuột cho thấy ở các giai đoạn phát triển của bào thai, việc tiêu thụ đu đủ xanh hay gần chín có thể không an toàn cho sự phát triển của thai, nhưng đu đủ chín lại không gây nên nguy cơ nào (Adebiyi et al 2002) Ngoài ra, quả, mủ, phấn hoa đu đủ cũng gây dị ứng tùy vào sự nhạy cảm của mỗi người (Blanco et al 1998) Mủ đu đủ dùng ngoài da có thể gây kích ứng, làm giộp da, nhưng khi vào cơ thể, nó lại có tác dụng trị viêm loét dạ dày [24]
d) Tính chất hóa học, sinh hóa và sinh lý:
Đu đủ chứa rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Hai hợp chất quan trọng nhất là chymopapain và papain, được sử dụng nhiều trong điều trị các chứng bệnh
Trang 22-15-
rối loạn tiêu hóa và dạ dày Huet cùng cộng sự (2006) đã chứng minh rằng papain, chymopapain, glycine endopeptidase trích từ đu đủ vẫn có thể tồn tại được dưới những điều kiện pH acid và tác dụng phân giải của pepsin Tuy nhiên, ở pH thấp, có
sự biến đổi hình thể dẫn đến mất ổn định và nhanh chóng bị phân giải bởi pepsin
Vì vậy, chúng cần được bảo vệ để tránh bị biến tính bởi acid và phân giải trước khi tới ruột non khi được sử dụng cho mục đích trị bệnh [24]
Ngoài papain và chymopapain, C papaya còn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác C papaya lipase, CPL, một hydrolase, liên kết rất chặt với các
thành phần không tan trong nước của mủ đu đủ, và vì thế, được xem như một enzyme “cố định một cách tự nhiên” Chất ức chế trypsin trích ly từ đu đủ, là một glycoprotein có trọng lượng 24 kDa, khi tinh sạch, ức chế trypsin bò ở tỷ lệ mol 1:1 (Azarkan et al 2006) Gần đây, một chất ức chế α-amylase mới từ hạt đu đủ đã được công bố, có tác dụng kháng hiệu quả một loại mọt trên đậu đũa
(Callosobruchus maculatus) (Farias et al 2007) [24]
1.3.1.2 Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của enzyme papain
Được tách từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động Papain là một sulfurhydryl protease, đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khô
Theo Danh pháp quốc tế, papain mang mã số E.C.3.4.4.10, có hoạt tính xúc tác tương tự như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung)
G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzyme Ông công bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal” Đến năm 1879 Wrutz và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ papain để diễn tả tính chất phân hủy protein trong nhựa đu đủ Ngày nay, thuật ngữ
“papain” được sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khô được dùng rộng rãi trong công
nghiệp và cả trong chế phẩm enzyme thủy phân dạng kết tinh từ mủ đu đủ [8]
Trang 23-16-
a) Cấu tạo hóa học và tính chất của papain:
Papain là một endoprotease có chứa 16,1 % N và 1,2% S Papain là một protease thiol Theo nghiên cứu của R.L Hill và E.L Smith, papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton
Bảng 1.4: Thành phần amino acid của papain [8]
Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng
ở vị trí 25 [8]
Thành phần chính của papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine Khi hoạt hóa papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của
Trang 24-17-
enzyme và thio cyanatalanine do sự tương tác giữa cyanur và cysteine Sau đó, thio cyanatalanine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin Khi có oxy không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại, tức là cystein kết hợp với nhóm sulfurhydride của papain hoạt hóa tạo thành sản phẩm không hoạt hóa [8]
β-• Cấu trúc không gian
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữaY và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain
Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase [8]
• Hoạt hoá papain:
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do
Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ [8]
Trang 25-18-
• Bất hoạt:
Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O2,
O3, H2O2, iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó [8]
Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M/l)
b) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:
• Nhiệt độ:
Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính
kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn [8]
Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá Papain dạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ở trạng thái khô có thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90% [8]
• pH:
Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có
Trang 26c) Ứng dụng [17]
Trong y học, papain được sử dụng để chữa bệnh giun kim, giun đũa
Là thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu
Dùng tiêu huỷ các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể Hỗn hợp papain- bromelin - cellulase được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận
Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dịch trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4 liều độc của toxin uốn ván
Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng
Ngoài ra, papain là một loại protease được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác
Trong công nghiệp thực phẩm, protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thịt, cá và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn
Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phân protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài
và ở nhiệt độ thích hợp Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzyme, đặc biệt là papain không những rút ngắn thời gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu của nó là 70oC
Trang 271.3.2.2 Cấu tạo, đặc tính và ứng dụng của pepsin trong y học:
Năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm
là có ”sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị” Sau này, Braconnol và đặc biệt Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến 1836, Schwann mới phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị [8]
Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, tiền pepsin bằng cách trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm, sau đó dùng acid để chuyển pepsinogen thành pepsin Đến năm 1930, Nothrop đã thu nhận được pepsin dạng tinh thể
Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) Số phân loại: E.C.3.4.4.1, pepsin có tên hệ thống là peptide-peptidohydrolase [8]
Trang 28-21-
a) Cấu tạo, thành phần: [8]
Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản, có thể cuộn lại làm thành hình cầu,
tỷ lệ bán trục = 3 - 3.6, rất ít xoắn dạng cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc 4 cũng gồm 4 tiểu phẩn
Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S Chỉ có 3 liên kết S-S trong phân tử pepsin, người ta nhận xét
ít nhất một trong những liên kết đó không cần thiết cho hoạt động enzyme Liên kết hydro có thể không đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định phân tử [8]
Pepsin gồm một mạch polypeptide họp thành bởi 329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucin Theo Williamson và Dassmamn, nhóm N cuối của pepsin là chuỗi liên kết peptide gồm sáu amino acid như sau:
Leu - Gly - Asp - His - Glu
Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi Van Vunatics và Herriott (1966) và bởi Williamson, thứ tự là:
Val - Leu - Ala
Nói chung, việc nghiên cứu cấu trúc của pepsin cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết Về cấu trúc bậc 1, chỉ mới có phần đầu C và N, cũng như phần của phân tử nằm kề các amino acid kiềm tính (Arg, Lys) và gốc phosphoserin
là được nghiên cứu chi tiết (Korka và cộng sự 1970), với cấu trúc như sau:
Glu - Ala - Thr - SerP - Glu - Glu - Leu
Thứ tự trong phần kề cận gốc phosphoserin của pepsin đã được xác định bởi Flavin (1968) bằng phương pháp sắc ký những phosphopeptide sinh ra từ sự thủy phân acid, được biết đến là:
Thr - Ser - Phos - Glu
Trang 29-22-
Trong phân tử pepsin có chứa S tạo thành ba cầu disulfur và một gốc acid phosphoric kết hợp với nhóm hydroxyl của một trong các gốn serin (Nothrop 1930, Flavin 1954)
Sự hiểu biết về cấu trúc tâm hoạt động của pepsin cũng còn rất nhiều hạn chế Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carboxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin
Thành phần hóa học: hàm lượng N trong phân tử pepsin là 14,7%
(Rajagopalan và cộng sự, 1966)
Thành phần amino acid: pepsin chứa nhiều amino acid có tính acid nên
pepsin thể hiện tính acid mạnh Phân tử pepsin heo chứa khoảng 36 nhóm carboxylase tự do, trong khi đó chỉ chứa hai gốc arginine, một gốc lysine, hai gốc histidine Pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước (Perlmann, 1959) [8]
Bảng 1.5: Thành phần amino acid của pepsin [8]
Acid glutamic 11,90 28 Tryptophan 2,40 4
Trang 30Pepsin được tách từ các nguồn động vật khác nhau (heo, bò) và các pepsin khác nhau của cùng một nguồn (A, B, C, D) thì có đôi chút khác nhau về tính chất
và thành phần hóa học
Pepsinogen có ba loại A và hai loại C gọi là pepsinogen A-1, A-2, A-3, C-1, C-2; được kết tinh từ dạ múi khế dê trưởng thành Mức độ liên quan của chúng trong dạ múi khế của dạ dày tương ứng là 27, 19, 14, 25 và 15% Thành phần amino acid hoàn toàn giống nhau giữa các izozymogen của các loại tương ứng, nhưng khác nhau giữa hai loại đặc biệt ở Glx/Asx và Leu/Ile
Trọng lượng phân tử của pepsin là 34.500 Dalton Pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng 35.000 Dalton [8]
b) Đặc tính:
Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đục, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chưa, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt (dược điển Việt Nam) [8]
Trang 31-24-
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn 95o, ester, chloroform Pepsin ở cả hai dạng: kết tinh và thô (pepsin thô là hỗn hợp của pepsin, gelatin và cathesin)
Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH 1 Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng, từ 1 - 4 pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường pH trong khoảng từ 1,9 - 2,2 Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác của pepsin hơi chuyển vùng có pH kiềm
so với protein nguyên thể Điều đó có thể do sự biến tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân (theo Northrop, 1922)
Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4-5, nhưng trong vùng pH này, hoạt lực của enzyme có phần thay đổi giảm đi Từ pH 5,5 trở lên, pepsin không hoạt động
Chế phẩm pepsin thô có thể giữ được trong nhiều năm ở nhiệt độ 0 - 4oC Pepsin dạng dung dịch không bền ở pH 6 Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả trong điều kiện môi trường nhiệt độ thường, dung dịch pepsin kém bền nhất là ở pH quá thấp Khi đó, xảy ra hiện tượng tự tiêu của enzyme, kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ (Ceply và cộng sự 1980), vì pepsin là một protease hoạt động mạnh trong môi trường khá acid [8]
c) Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin
Enzyme về bản chất cũng là các protein, là chất xúc tác hữu hiệu nhất của cơ thể sống Enzyme được tổng hợp ở dạng bất hoạt phù hợp để dự trữ hoặc để vận chuyển từ vị trí tổng hợp đến vị trí hoạt động mong muốn như trường hợp pepsin, trypsin, chymotrypsin và carboxydase Hoạt động của những enzyme này được hoàn thành theo một trong hai con đường chủ yếu: (i) - sự tự hoạt hóa như trường hợp của pepsin, trypsin và (ii) yêu cầu một hoặc vài ion kim loại chuyên biệt để hoạt hóa [8]
Trang 32-25-
Pepsinogen: pepsinogen được khám phá do Langley Ở phần màng nhầy dạ
dày của động vật, có các tế bào chứa zymogen hay pepsinogen (dạng tiền pepsin không hoạt động) Phần môn vị heo của bao tử gồm những tế bào đỉnh vách, có thể tiết acid HCl Chính acid này dẫn đến sự tiết pepsinogen và chuyển hóa nó bằng khả năng tự hoạt hóa để thành pepsin với nồng độ acid tự nhiên của môi trường trong dạ dày Quá trình này xảy ra ở pH < 6 Khi trong môi trường có pH cao hơn, có thể xảy
ra tự tái kết hợp ngược lại [8]
Northrop và Herrriot đã thu được pepsinogen dạng tinh thể hình kim và xác định pepsinogen không những có trong dịch vị mà còn hiện diện trong máu, nước tiểu, tinh dịch Lượng pepsinogen trong máu tăng giảm theo một tỷ lệ nhất định với lượng pepsinogen trong dịch vị Từ môi trường trung tính chuyển sang môi trường acid, đầu tiên, pepsinogen sẽ chuyển thành pepsin ở pH 5,1; 40oC Ở pH 4,1 mức độ chuyển hóa tăng gấp mười lần [8]
Sự hoạt hóa pepsinogen:
Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức là pepsinogen bất hoạt Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin
Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptide giữa acid glutamic 41 và isoleucin 42, giải phóng peptide kìm hãm (Ông và cộng sự, 1968) Thành phần amino acid của peptide kìm hãm này tương ứng với 41 amino acid của pepsinogen (Koen và cộng sự, 1968) và phản ứng được xúc tác bởi ion H+
và cũng chính bởi pepsin [8]
Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác quá trình giải phóng peptide kìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động Vì vậy, quá trình này mang tính chất của một quá trình tự xúc tác Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH < 5,6 Khi pH > 5,6 peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp không hoạt động [8]
Trang 33-26-
d) Sự tự tiêu của pepsin:
Pepsin vừa là protein, vừa là enzyme phân giải protein nên có khả năng phân giải chính nó Sự tự tiêu đã được coi là nguyên nhân của tính không đồng nhất khi điện di nhiều chế phẩm pepsin Sự tự tiêu của pepsin thường xảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều thành phần
có phân tử lượng nhỏ hơn pepsin, giảm lượng tyrosin và chỉ thành phần nào có đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động [8]
e) Hoạt động xúc tác của pepsin
Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein Pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên và có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có trong phân tử protein tạo thành chủ yếu các peptide chứa từ 5 - 8 amino acid [8]
Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein, tạo sản phẩm pepton có trọng lượng phân tử nhỏ Đôi khi pepsin phân cắt protein tạo thành những dạng peptide đơn giản hơn như oligo protein và một số amino acid tự do như leucine, alanine, tyrosine nhưng đây không phải trường hợp thông thường
Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, nó không phải là một esterase
và không tác dụng vào những mối liên kết amid Pepsin phân cắt dễ dàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, [8]
f) Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin
• pH [8]
Pepsin là một protease acid điển hình, hoạt động ở vùng pH acid từ 1 4,
pH thích hợp cho pepsin khoảng 1,5 2,4 Đối với mỗi cơ chất, pH thích hợp có thể thay đổi
Trang 34-27-
Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bền tối đa ở pH 4 5, nhưng trong vùng pH này, hoạt lực của enzyme rất thấp Từ pH > 5,5 pepsin không hoạt động vì có sự biến tính của protein enzyme mà cụ thể là phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử, làm cho cấu trúc của enzyme bị biến đổi Ở pH quá thấp thì xảy ra hiện tượng tự phân của pepsin Pepsin đã bị vô hoạt trong môi trường kiềm,
có thể phục hồi hoạt tính một phần khi đưa pH về vùng thích hợp với nó
• Nhiệt độ: [8]
Pepsin chịu ảnh hưởng của nhiệt độ giống như những enzyme khác nói chung Pepsin cũng là một enzyme hoạt động ở nhiệt độ khá cao Nhiệt độ hoạt động tối ưu cho pepsin khoảng 40 - 50oC Ở 70oC, pepsin mất khả năng tiêu đạm Tốc độ xúc tác phản ứng thủy phân của pepsin không cao bằng các protease khác nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao hơn, nhất là khi cơ chất có mặt một số ion kim loại đặc biệt như Ca2+
• Muối và các dung môi hữu cơ: [8]
Tùy theo bản chất hóa học của muối mà ảnh hưởng ít nhiều đến hoạt động
xúc tác của pepsin
Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hóa của pepsin Trong sự pepton hóa, HCl là acid gây ra sự thủy phân mạnh nhất, kế đó là HNO3, HBr, H2SO4, H3PO4; các acid lactic, formic gây tác động kém hơn
Các muối kim loại nặng ở nồng độ thấp vẫn có thể gây kết tủa và làm biến tính enzyme Nguyên nhân là do muối kim loại nặng tạo nên các phức hệ với các nhóm quan trọng của protein - enzyme, làm thay đổi cấu trúc protein dẫn tới sự biến tính của enzyme
Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ cấu trúc bậc ba và làm tăng độ xoắn của mạch polypeptide trong phân
tử pepsin (Tizgensons và cộng sự), do đó làm giảm hoạt tính của pepsin
Trang 35Pepsin còn được dùng để phân giải các protein tạp lẫn với kháng thể trong huyết thanh miễn dịch, làm tinh sạch huyết thanh miễn dịch mà không làm giảm hoạt tính của kháng thể
Ngoài ra, pepsin còn được dùng để sản xuất peptone là sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn của protein, có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng nhiều trong y học, vi sinh học
Trang 36-29-
Pancreatin là hệ enzyme thủy phân xúc tác các phản ứng chuyển hóa đạm, đường, chất béo, acid nucleic và một số chất khác trong ruột Các enzyme này gồm: trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, carboxyl peptidase A và B, amino peptidase, amylase, lactase, saccharase, lipase, ribonuclease, desoxyribonuclease
Tỷ lệ các enzyme này trong dịch tụy người không thay đổi ngoại trừ vài trường hợp thiếu hụt có chọn lọc của lipase và trypsinogen 1mg pancreatin có khoảng ≥ 25 đơn
vị hoạt tính protease, ≥ 25 đơn vị hoạt tính amylase và ≥ 2 đơn vị hoạt tính lipase Dịch tụy ở người khá gần với heo với tỷ lệ lipase và α-amylase cao hơn so với các động vật hữu nhũ khác Vì thế, dịch chiết enzyme tụy tạng ở heo (pancreatin) cho đến ngày nay vẫn được sử dụng như nguồn enzyme thích hợp trong liệu pháp trị bệnh thay thế tuyến tụy [8]
Pancreatin được mô tả trong nhiều Dược điển khác nhau, là một chất bột màu nâu nhẹ, không kết tinh, mùi vị đặc trưng, tan trong nước, không tan trong cồn
và chloroform
Bảng 1.6: Lượng enzyme của tuyến tụy [8]
STT Enzyme
Lượng enzyme tính theo phần trăm trọng lượng khô của tuyến tụy (đã loại mỡ)
Trang 37-30-
1.3.3.2 Tính chất chung của pancreatin:
Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh; hoạt động mạnh nhất từ 2 đến 3 giờ sau khi ăn để thực hiện quá trình tiêu hóa ở ruột non Pancreatin có thể pepton hóa nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương dễ tiêu hóa [8]
1.3.3.3 Hệ enzyme tuyến tụy:
Trypsin: [8]
Được thu nhận từ tụy tạng bò vào năm 1936, bởi Kunitz và Northrop Trọng lượng phân tử là 23.800; gồm 223 amino acid pH tối ưu là 7,8 Trypsin cắt liên kết peptide tại amino acid base, sản phẩm phân cắt chứa arginine hoặc lysin ở đầu C Ngoài khả năng phân cắt liên kết peptide, trypsin còn có khả năng cắt các liên kết ester và amide
Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ thể nhưng nó vẫn
có thể hoạt động tốt ở trong khoảng nhiệt độ 30 – 40oC Ở nhiệt độ này và pH 8.5 – 9.0, trypsin có khả năng thủy phân mạnh các loại cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin Trypsin có tác dụng trên hầu hết các cơ chất protein không kể đó là protein có trọng lượng phân tử lớn hay trọng lượng phân tử nhỏ nhưng tác dụng của
nó trên protein đã bị biến tính tốt hơn là trên protein chưa bị biến tính
Trang 38-31-
Chymotrypsin: [8]
Là một protease được tiết ra từ tuyến tụy, chymotrypsin là một protease kiềm tính quan trọng sau trypsin Chymotrypsin được tụy tiết ra dưới dạng không hoạt động là chymotrypsinogen, sau đó được chuyển sang dạng hoạt động là chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin
Cấu trúc của chymotrypsin được xác định vào năm 1967, do David và các cộng sự phân tích tinh thể bằng tia X Đây là protease đầu tiên được biết rõ cấu trúc Chymotrypsin được cấu tạo từ 3 sợi polypeptide, các sợi này liên kết với nhau bởi cầu nối disulfite Sự hiện diện của cầu nối disulfite là một đặc trưng của những protein có thể thể hiện hoạt tính ngoại bào
Chymotrypsin là một protease kiềm tương tự như trypsin, hoạt động trong điều kiện pH 7 – 9, điểm đẳng điện pI = 5.4 Trong ruột non, chymotrypsin thủy phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hóa một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngắn và các amino acid tự do Hoạt tính của chymotrypsin tương đối yếu hơn trypsin nhưng lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn
b) Lipase:
Chất béo trong thức ăn chủ yếu gồm triglyceride, phospholipid, cerebroside, sterol và các steroid, chất sáp, carotenoid Do enzyme tụy tiêu hóa chủ yếu triglyceride, phospholipid và cholesterol ester nên trong phần này chỉ đề cập đến việc thủy giải các chất này [16]
Sự phân giải triglyceride:
Các triglyceride trong thức ăn chủ yếu bao gồm các ester glycerol của acid béo mạch dài, thường từ 16 – 18 C Chuỗi hydrocarbon có thể là bão hòa (palmitic acid và stearic acid), hoặc không bão hòa (oleic, linoleic, linolenic acid) Các triglyceride của acid béo mạch dài thường không tan trong nước, nhưng enzyme lipase tụy (thủy giải chúng thành các mono và diglyceride) lại tan trong nước Phản ứng enzyme – cơ chất xảy ra ở mặt phân giới giữa nước – chất béo [16]
Trang 39-32-
Ở tuyến tụy, lipase được tìm thấy trong các hạt zymogen Trọng lượng phân
tử là 35.000 – 42.000 Lipase tụy khác các esterase khác ở khả năng phân cắt các liên kết ester kỵ nước của acid béo mạch dài Để hoạt động, lipase tụy cần bề mặt phân giới nước – chất béo (enzyme này có cả phần ưa nước và kỵ nước) Lipase chứa hai nhóm – SH có vai trò quan trọng trong hoạt động Đây chính là phần kỵ nước của lipase SH1 nằm gần vị trí chịu trách nhiệm tấn công mặt phân giới chất béo và SH2 nằm gần trung tâm xúc tác
Hiện nay, vẫn chưa có bằng chứng cho thấy lipase trong tụy tồn tại ở dạng bất hoạt, cũng chưa có chất ức chế lipase tụy nào được công bố Theo đó, cơ chế duy nhất bảo vệ lipase tụy khỏi sự tự tiêu là việc đóng gói enzyme thành các hạt zymogen Nhờ vậy, enzyme lipase không bị trộn lẫn với các thành phần khác của tế bào [16]
Các enzyme tiêu hóa chất béo khác ở tụy: hiện nay, những hiểu biết về các
enzyme này vẫn còn nhiều hạn chế Cholesterol esterase cắt các cholesterol ester,
và phospholipase cắt acid phosphoric khỏi phospholipid Phospholipase A đã được chứng minh tìm thấy ở tụy và được tiết ra dưới dạng các proenzyme bất hoạt Sau
đó, được hoạt hóa trong tá tràng nhờ các enzyme protease Sau khi được hoạt hóa,
nó xúc tác quá trình biến đổi lecithin thành lysolecithin và acid béo [16]
c) Amylase:
Các carbohydrate chủ yếu trong thức ăn của người bao gồm cellulose, hemicellulose, tinh bột, glycogen, disaccharide (sucrose, maltose, lactose) và monosaccharide (glucose, fructose) [16]
Hoạt động chủ yếu của amylase liên quan đến tinh bột và glycogen Amylase được tiết ra ở tuyến nước bọt và tuyến tụy, nhưng đôi khi cũng được tiết ra bởi các
cơ quan khác như gan Sự tiêu hóa tinh bột và glycogen bắt đầu ở tuyến nước bọt, nhưng α-amylase ở nước bọt nhanh chóng bị bất hoạt khi tiếp xúc với pH acid của
Trang 40Glycogen là polysaccharide chủ yếu trong cơ thể người Đáng chú ý là nó tương tự amylopectin nhưng mạch nhánh α-1,6 thường xuất hiện giữa phân tử glucose thứ 11 và 18 của mạch thẳng [16]
Cả α-amylase ở nước bọt và tụy đều chỉ cắt liên kết α-1,4 giữa C1 và nguyên
tử oxy trong phân tử, trái lại phần đuôi liên kết 1,4 của mạch thẳng và liên kết 1,6 của amylopectin, glycogen không bị cắt bởi enzyme này Theo đó, sản phẩm cuối của mạch thẳng là maltose, maltotriose (tương ứng 2 và 3 phân tử glucose liên kết α-1,4); còn sản phẩm cuối của mạch nhánh là maltose, maltotriose và các chuỗi glucose phân nhánh (α-1,6), α-dextrin Trước khi được hấp thu, maltose, maltotriose
α-và dextrin phải được tiếp tục thủy giải bởi các enzyme trong ruột non [16]ed frvong
Hình 1.3: [16]
(A) Cấu trúc của chuỗi glucose liên kết α-1,4 (B) Cấu trúc nhánh liên kết α-1,6 của 2 chuỗi liên kết α-1,4
