Phát triển một số phương pháp phân tích tế bào máu và ứng dụng

Để giải quyết các bài toán phân tích hình ảnh tế bào, nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện với phương pháp và hướng tiếp cận đa dạng, được trình bày trong chương 3.. Các phương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3 

Chương 1.  Giới thiệu 8 

1.1  Giới thiệu chung 8 

1.2  Hệ thống xét nghiệm tự động 10 

1.3  Mục tiêu và đóng góp của Luận văn 12 

1.4  Cấu trúc luận văn 13 

Chương 2.  Sơ lược về bệnh Sốt rét 14 

2.1  Ký sinh trùng sốt rét 14 

2.2  Cách chuẩn bị lam máu 15 

2.3  So sách với phương pháp xét nghiệm khác 17 

2.4  Đặc điểm hình ảnh tế bào 18 

Chương 3.  Công trình Nghiên cứu liên quan 21 

3.1  Các phương pháp phân tách tế bào 21 

3.2  Các phương pháp phát hiện và phân loại ký sinh trùng 23 

3.3  Nhận xét và đánh giá các hướng tiếp cận 24 

Chương 4.  Bài toán và Hướng tiếp cận 26 

4.1  Đặt vấn đề 26 

4.2  Bài toán phân tách tế bào 27 

4.2.1 Phương pháp toán học hình thái 27

4.2.2 Phương pháp đường phân nước 29

4.2.3 Phương pháp khảo sát đường biên 30

4.2.4 Phương pháp phân tách dựa vào mô hình 32

4.2.5 Phương pháp đề nghị 35

4.3  Bài toán phát hiện ký sinh trùng 38 

Chương 5.  Hệ thống Phân tích Tự động Hình ảnh Mẫu máu 42 

5.1  Mô hình xử lý 42 

5.2  Tiền xử lý 44 

5.3  Phân tách thô 45 

5.4  Ước lượng kích thước tế bào 47 

5.4.1 Lọc nhiễu và lấp lỗ trống 48

5.4.2 Biến đổi không gian khoảng cách 49

5.4.3 Gán nhãn các vùng đối tượng 50

5.5  Phân tách tế bào 50 

Chương 6.  Thí nghiệm và Thảo luận 54 

6.1  Xây dựng thí nhiệm 54 

6.2  Kết quả thí nghiệm 56 

6.3  Thảo luận và đánh giá kết quả 63 

Chương 7.  Kết luận 65 

7.1  Tóm tắt kết quả đạt được 65 

7.2  Hướng phát triển 66 

Tài liệu tham khảo 67 

Phụ lục A 73 

Phụ lục B 76 

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1 Bản đồ ước lượng ca nhiễm sốt rét trên mỗi 1000 dân số, năm 2006 [1] 8 

Hình 1-2 Hệ thống xét nghiệm tự động 11 

Hình 2-1 Hình ảnh các chủng loại và các giai đoạn phát triển ký sinh trùng 15 

Hình 2-2 Một số mẫu đối tượng được nhuộm trong thực tế 16 

Hình 2-3 Lam máu, giọt dày (trái), giọt mỏng (phải) 17 

Hình 2-4 Artefact - các thành phần gây nhiễu 18 

Hình 2-5 Các tông màu khác nhau xuất hiện trong hình ảnh mẫu máu 19 

Hình 2-6 Đa dạng hình dạng tế bào hồng cầu 20 

Hình 2-7 Các tế bào hồng cầu nằm chồng nhau (dính nhau) 20 

Hình 4-1 Hình ảnh so sánh đặc điểm tế bào bạch cầu và hồng câu 27 

Hình 4-2 Quá trình sử dụng phép mở hình thái để tách tế bào 28 

Hình 4-3 Quá trình tạo đường phân nước 29 

Hình 4-4 Quá trình bộ trợ phương pháp đường phân nước 30 

Hình 4-5 Quá trình phân tách bằng phương pháp phân tích đường biên 31 

Hình 4-6 Các bước trong thuật toán khảo sát đường biên 31 

Hình 4-7 Phân tách tế bào bằng phương pháp phân tích đường biên 32 

Hình 4-8 Cách biểu diễn tế bào theo 16 điểm đường biên 33 

Hình 4-9 Kết quả thực hiện theo phương pháp Kyoung-Mi Lee 33 

Hình 4-10 Kết quả thực hiện theo phương pháp Gloria Diaz 34 

Hình 4-11 So sánh hình ảnh gốc và hình ảnh biến đổi theo không gian khoảng cách 36 

Hình 4-12 Cấu tạo đối tượng tế bào hình thành nhiều điểm có khả năng là trung tâm điểm 36 

Hình 4-13 So sánh tương quan hình ảnh gốc và hình ảnh biến đổi 37 

Hình 4-14 Kết quả phân ngưỡng bằng SVM trên tập mẫu huấn luyện 40 

Hình 5-1 Mô hình xử lý hình ảnh 43 

Hình 5-2 Kết quả chuẩn hóa màu 44 

Hình 5-3 Khảo sát histogram và kết quả phân ngưỡng tự động 46 

Hình 5-4 Khử nhiễu và lấp lỗ trống 48 

Hình 5-5 Biến đổi hình ảnh theo không gian khoảng cách 49 

Hình 5-6 Độ bao phủ trên các vùng đối tượng 52 

Hình 5-7 Bước chọn lựa và phân tách được thực hiện tuần tự 52 

Hình 5-8 Vùng đối tượng được sau khi thực hiện phân tách 52 

Hình 5-9 Kết quả đánh dấu các vùng phân tách trên hình ảnh gốc 53 

Hình 5-10 Kết quả sau khi thực hiện bước tái tạo nâng cao 53 

Hình 6-1 Cách so sánh kết quả với ground-truth 56 

Hình 6-2 Một số ảnh kết quả trong tập hình ảnh thí nghiệm 62 

Hình 6-3 Hình ảnh kết quả 1 63 

Hình 6-4 Hình ảnh kết quả 2 64 

DANH MỤC BẢNG

Bảng 6-1 Hiệu suất của ph/pháp phân tách tế bào - tập ảnh của PTN Singapore 57 

Bảng 6-2 Hiệu suất của ph/pháp phân tách tế bào - tập ảnh của Ross [15] 57 

Bảng 6-3 Hiệu suất của ph/pháp phân tách tế bào - tập ảnh của Thư viện CDC 58 

Bảng 6-4 Hiệu suất của ph/pháp phân tách tế bào - tập ảnh của BV Nhiệt đới HCM 59 

Bảng 6-5 So sánh ph/pháp phân tách tế bào của Boray Tek [7] 60 

Bảng 6-6 Hiệu suất ph/pháp phân tách tế bào của Kumar [19] 60 

Bảng 6-7 Đánh giá độ sai lệnh ph/pháp phân tách tế bào của Gloria Diaz [9] [10] 60 

Bảng 6-8 So sánh hiệu suất phát hiện tế bào nhiễm ký sinh trùng 61 

Chương 1

Giới thiệu

Nội dung của chương này giới thiệu về bệnh sốt két, các khó khăn trong việc xét nghiệm ký sinh trùng, sự cần thiết và khả thi xây dựng một hệ thống xét nghiệm tự động, đồng thời trình bày mục tiêu, đóng góp và tóm tắt của đề tài

1.1 Giới thiệu chung

Sốt rét (Malaria) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi ký sinh trùng trong

máu có tên khoa học là Plasmodium Theo Tổ chứ Y tế Thế giới (WHO), có khoảng từ

247 triệu ca nhiễm bệnh trong số 3.3 tỉ người có khả năng nhiễm bệnh (nằm trong vùng bệnh) trong năm 2006, trong số này có gần một triệu ca tử vong, đa số là trẻ em dưới 5 tuổi Thống kê năm 2008, vẫn còn 109 nước là nơi có khả năng nhiễm bệnh, trong đó

45 nước thuộc Châu Phi [1]

Hình 1-1 Bản đồ ước lượng ca nhiễm sốt rét trên mỗi 1000 dân số, năm 2006 [1]

Việt Nam là nước nằm trong vùng có nguy cơ bị sốt rét khá cao Theo số liệu thống kê, năm

2007 toàn quốc có 70.910 ca nhiễm sốt rét, trong đó có 20 người chết và 01 vụ dịch sốt rét cấp [2] Các địa phương điểm nóng của bệnh sốt rét: các tỉnh miền Đông Nam Bộ như Bình Phước,

Đồng Nai, Tây Ninh, Kiên Giang, Đồng Tháp; các tỉnh Tây Nguyên: Đắc Lắc, Gia Lai; và các tỉnh duyên hải miền Trung: Phú Yên, Ninh Thuận

Trên cơ sở các báo cáo cho thấy bệnh sốt rét vẫn còn tiềm tàng, diễn biến phức tạp, và nguy cơ sốt rét quay trở lại còn rất lớn [2]. Do vậy, để kiểm soát bền vững được bệnh sốt rét, chúng ta cần phải duy trì các biện pháp phòng tránh đồng thời phải nâng cao khả năng xét nghiệm nhanh chóng, chính xác và điều trị bệnh cách kịp thời, cũng như giảm chi phí đến mức thấp nhất

Hiện nay, tuy đã có phát triển thêm những kỹ thuật mới trong việc xét nghiệm và phát hiện bệnh sốt rét1, nhưng xét nghiệm bằng kính hiển vi [3] vẫn được xem là cách thức

xét nghiệm phổ biến được thực hiện tại hầu hết các phòng xét nghiệm, với chi phí trang thiết bị cũng nhưng chi phí đào tạo chuyên viên xét nghiệm không cao

Tuy nhiên, phương pháp xét nghiệm bằng cách quan sát “thủ công” qua kính hiển vi mất nhiều thời gian và quá trình xét nghiệm thường phải lặp đi lặp lại nhiều lần gây mệt mỏi cho người chuyên viên Nếu số lượng bệnh nhân đột biến, số lượng mẫu phẩm cần phải xét nghiệm tăng, người chuyên viên xét nghiệm sẽ khó đáp ứng được yêu cầu của bác sĩ Ngoài ra, với phương pháp mang tính chất chủ quan, phụ thuộc nhiều vào yếu tố con người, sẽ dẫn đến các sai lệch, nhầm lẫn, và kết quả không nhất quán, đặc biệt khi xét nghiệm được thực hiện những chuyên viên có ít kinh nghiệm, ở những vùng nghèo khó – nơi có khả năng nhiễm bệnh cao [4].

Việc xét nghiệm và phát hiện bệnh sốt rét bằng kính hiển vi yêu cầu 4 tác vụ chính như sau:

1 Xác định sự có mặt của ký sinh trùng sốt rét trong mẫu máu

2 Xác định số lượng và tỉ lệ tế bào nhiễm ký sinh trùng và hồng cầu khỏe mạnh

3 Nhận dạng loại ký sinh trùng nhiễm bệnh

4 Nhận dạng thời kỳ phát triển trong vòng đời của ký sinh trùng nhiễm bệnh Tác vụ đầu tiên, việc phát hiện ký sinh trùng (1) là nhiệm vụ quan trọng nhất nhằm xác định sự nhiễm, nghĩa là mẫu thử dương tính hay âm tính Trong khi đó, để đánh giá

1 http://en.wikipedia.org/wiki/Malaria

mức độ nhiễm bệnh cần thực hiện các bước bao gồm: (2) xác định số lượng và tỉ lệ , (3) loại ký sinh trùng và (4) thời kỳ phát triển của chúng Đây cũng là những thông tin cần thiết cho cho bác sĩ trong việc điều trị bệnh hợp lý và hiệu quả

Do vậy, một hệ thống hỗ trợ bán tự động hay tự động thực hiện tác vụ xét nghiệm và xác định mức nhiễm bệnh một cách khách quan (không có sự can thiệp của con người),

có độ chính xác cao, nhanh chóng và đáng tin cậy là điều cần thiết Với sự phát triển của máy tính cũng như những tiến bộ trong ngành nghiên cứu thị giác máy tính và phân tích hình ảnh, thì một hệ thống như vậy là khả thi

1.2 Hệ thống xét nghiệm tự động

Hệ thống xét nghiệm tự động được thiết kế dựa trên nguyên lý:

1 Từ những hiểu biết, cách thức quan sát và phát hiện bệnh sốt rét với phương pháp sử dụng kính hiển vi trên thực tế của các chuyên viên,

2 Sau đó, được biểu diễn lại bằng những quá trình xử lý đặc biệt trên máy tính

như xử lý ảnh (image processing), phân tích hỉnh ảnh (image analysis) và phát

hiện mẫu (pattern recognition)

Đối với góc nhìn của việc xét nghiệm trên thực tế sử dụng kính hiển vi, người chuyên

viên sẽ thực hiện thao tác cách quan sát mẫu máu Toàn bộ quá trình thực hiện yêu cầu khả năng phân biệt các thành phần như tế bào hồng cầu, tế bào bạch cầu, tiểu cầu và các artifact, cùng với các tế bào nhiễm ký sinh trùng sốt rét thông qua việc xử lý các thông tin quan sát được như màu sắc, kích thước, cấu trúc và thông tin tổng hợp ở mức ngữ nghĩa cao hơn Nếu mẫu máu được xác định là dương tính (có sự lây nhiễm của ký sinh trùng – tồn tại ký sinh trùng trong mẫu máu) quá trình tiếp theo là xác định loại ký sinh trùng và giai đoạn phát triển của chúng để xác định rõ hơn về mức độ lây nhiễm

Đối với góc nhìn của phương pháp thị giác máy tính, việc xét nghiệm ký sinh trùng

được chia thành nhiều bài toán nhỏ Cũng giống như trên thực tế, một hệ thống hoàn

chỉnh phải được cài đặt đầy đủ các chức năng: ghi nhận ảnh (từ camera – máy chụp hình), tiền xử lý (lọc bỏ các thông tin nhiễu và chuẩn hóa thông tin), phân hoạch vùng (đánh dấu các vùng đối tượng quan tâm) và cuối cùng là phần nhận dạng – phân loại

các đối tượng quan tâm Ngoài ra, hệ thống đầy đủ còn cần thêm một số chức năng phần cứng như điều kiển bàn quan sát của kính hiển vi (microscopy stage), chức năng canh nét nhanh, và ghi nhận hình ảnh tự động Hình 1-1 là minh họa môt hệ thống thực

tế được sử dụng tại phòng thí nghiệm ở Institute of Inforcomm Research, A*STAR, Singapore

Hình 1-2 Hệ thống xét nghiệm tự động

Hệ thống bao gồm: (1) kính hiển vi có khả năng phóng đại 10x, 20x, 40x, 100x của hãng Olympus, với hệ thống chiếu sáng bằng đèn cao áp từ bên dưới xuyên qua phiến kính chứa mẫu vật, rồi đưa hình ảnh lên ống ngắm Trên kính hiển vi lắp đặt bàn đặt mẫu vật được điều khiển bằng động cơ có khả năng di chuyển 3 chiều (2 chiều nằm ngang và một chiều đứng) với khoảng chính xác đến micromet Người dùng có thể thao tác bằng tay trên bộ điều khiển hoặc thông qua máy tính bằng phần mềm được cung cấp (2) một máy chụp ảnh liên tục/từng ảnh với độ phân giải 1024x1280 điểm ảnh, thực hiện công tác ghi ảnh và truyền vào máy tính để

xử lý (3) Và một máy tính để lưu trữ, xử lý các thông tin hỉnh ảnh được truyền từ máy chụp ảnh và hiển thị hình ảnh cũng như các kết quả phân tích được

Hệ thống như trên còn có những lợi ích khác:

1 Chuyên viên hoàn toàn có thể điều khiển kính hiển vi một cách dễ dàng và khoảng cách chính xác thông qua bảng điều khiển hoặc phần mềm trên máy tính

2 Giúp người quan sát thuận tiện hơn với hình ảnh được hiện thị trước-mặt-trên màn hình máy tính (thay vì phải nhìn vào ống ngắm của kính hiển vi)

3 Lưu trữ hình ảnh vào kho dữ liệu để tiện việc sử dụng sau này như tra cứu các hình ảnh liên quan, và cơ sở tài liệu phục vụ học tập nghiên cứu

1.3 Mục tiêu và đóng góp của Luận văn

Trong luận văn này, tôi đã tìm hiểu các công trình nghiên cứu liên quan, thực nghiệm

và áp dụng các phương thức được cập nhật trong ngành thị giác máy tính để giải quyết các tác vụ cần thiết trong việc xét nghiệm, như thuật toán phân ngưỡng tự động, các thao tác toán học theo hình thái học (morphology), và bộ phân loại (classifier) để xác định tế bào nhiễm ký sinh trùng

Đóng góp chính trong luận văn là tập trung vào bài toán phân hoạch tế bào – phân tách các tế bào dính chùm – dựa vào thông tin kích thước của hình ảnh biến đổi theo khoảng

cách Euclit và áp dụng độ đo, được gọi là độ phủ của điểm trung tâm, trong việc tính

độ ưu tiên khi chọn lựa tâm điểm của tế bào Phương pháp này kết hợp ý tưởng ‘cách

con người được huấn luyện quan sát và phát hiện tế bào’ với việc tận dụng tối đa thông tin hình dạng và kích thước có được từ hình ảnh Ngoài ra, phương pháp còn nâng cao

độ chính xác và đạt được khả năng phân tách các tế bào hồng cầu trong trường hợp phức tạp – trường hợp các tế bào nằm chồng (overlapping) hay còn gọi là tế bào dính chùm với nhau (clumping), đồng thời tối ưu hóa các bước xử lý để nâng cao hiệu suất thực hiện Với kỳ vọng ‘kết quả tốt của bước phân hoạch đối tượng sẽ tạo điều kiện cho bước phân loại và nhận dạng đối tượng đạt kết quả tốt hơn’

Các bước thực hiện của luận văn:

- Khảo sát các công trình nghiên cứu trên thế giới liên quan đến các bài toán xét nghiệm tự động bệnh sốt rét dựa vào hình ảnh mẫu máu

- Đề nghị một phương pháp mới để nâng cao hiệu quả việc phân tách đối tượng tế bào (hồng cầu) trên hình ảnh mẫu máu

- Xây dựng phương pháp phát hiện tế bào nhiễm ký sinh trùng dựa trên các đặc trưng và áp dụng SVM để xác định hàm phân ngưỡng

- Thiết kế mô hình hệ thống thực hiện các tác vụ phân tích hình ảnh mẫu máu

- Thực hiện các thí nghiệm để xác định hiệu xuất của phương pháp đã đề nghị Đây cũng được xem là một công cụ cơ bản hoàn chỉnh có thể hỗ trợ việc phân tích hình ảnh mẫu máu trong phòng xét nghiệm

- Thu thập hình ảnh làm tư liệu giúp ích cho việc nghiên cứu hình ảnh về bệnh sốt rét

1.4 Cấu trúc luận văn

Luận văn được tổ chức thành 7 chương Nội dung Chương 2 trình bày về những kiến

thức cơ sở về bệnh sốt rét để cho thấy sự tương quan, thích hợp và cần thiết của việc áp dụng máy tính vào xử lý hình ảnh y khoa Để giải quyết các bài toán phân tích hình ảnh

tế bào, nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện với phương pháp và hướng tiếp

cận đa dạng, được trình bày trong chương 3 Ở chương 4, nội dung đi sâu vào phân

tích các hướng tiếp cận hiện nay và sau đó đề nghị hướng tiếp cận khác để giải quyết hai bài toán: phân tách tế bào cũng và phát hiện tế bào có nhiễm kí sinh trùng Tiếp theo, để thực hiện thí nghiệm thuật toán đã đề ra, mô hình các bước xử lý từ hình ảnh

đầu vào đến kết quả cuối cùng được trình bày chi tiết trong chương 5 Các bước chuẩn

bị dữ liệu, các độ đo đánh giá, và kết quả thí nghiệm được trình bày và thảo luận trong

chương 6 Cuối cùng, chương 7 trình bày tóm tắt lại các kết quả đạt được của luận văn

và đưa ra những hướng nghiên cứu tiếp theo

Chương 2

Sơ lược về bệnh Sốt rét

Nội dung của chương này trình bày sơ lược về bệnh sốt rét, sự nhiễm bệnh, hình dạng ký sinh trùng sốt rét trong máu, các loại ký sinh trùng và các hình thái phát triển trong vòng đời của chúng Quá trình cần thiết và quan trọng – chuẩn bị vật mẫu hay còn gọi là lam máu – cũng được trình bày

2.1 Ký sinh trùng sốt rét

Sốt rét là một bệnh gây ra bởi ký sinh trùng loại protozoa tên khoa học là Plasmodium

lây nhiễm vào cơ thể người bởi muỗi cái Anopheles đã nhiễm trùng sốt rét Kí sinh trùng Plasmodium có nhiều loại, trong đó có 4 loại lây nhiễm vào cơ thể người và gây

ra 4 loại bệnh sốt rét: đó là khuẩn P.falciparum, P.vivax, P.ovale, và P.malaria [20]

- Kí sinh trùng P falciparum được xem là nguy hiểm nhất, xuất hiện phổ biến ở vùng nhiệt

đới châu Phi Có hơn 80% trường hợp nhiếm bệnh sốt rét là do kí sinh trùng này gây nên

và cũng gây ra số ca tử vong lớn nhất (90% ca tử vong là do ký sinh trùng này gây ra)

- Kí sinh trùng P.vivax có phân bố rộng nhất và có điểm đặc biệt là xuất hiện các triệu trứng

bệnh sau thời gian ủ bệnh lên đến 5 năm Tuy nhiên, sốt rét gây ra bởi P.vivax ít nguy hiểm (nhiệt độ sốt thấp hơn so với nhiệt độ khi sốt do ký sinh trùng P falciparum gây ra)

cấu trúc của các chấm bên trong tế bào lây nhiễm [3] Sự khác biệt giữa các thời kỳ phát triển của mỗi loại ký sinh trùng cũng được xác định giống như phân loại ký sinh trùng, dựa vào hình thái, kích thước, và sự tồn tại của sắc tố (pigment) của ký sinh trùng sốt rét Tuy nhiên, sự phát triển của ký sinh trùng là liên tục nên xuất hiện một số dạng trung gian và gây khó khăn khi phân biệt các thời kỳ phát triển liền kề nhau

Hình 2-1 Hình ảnh các chủng loại và các giai đoạn phát triển ký sinh trùng

2.2 Cách chuẩn bị lam máu

Khi sử dụng kính hiển vi để việc quan sát phát hiện và nhận dạng ký sinh trùng được khả thi và hiệu quả, thì mẫu máu phải được thực hiện qua một quá trình xử lý hóa học

gọi là nhuộm (staining) Phương pháp nhuộm thông dụng trong xét nghiệm bệnh sốt rét

là Giemsa, cách làm này tạo cho màu sắc của tế bào hồng cầu (RBC) có màu hồng (hoặc tím, hoặc nâu) nổi trên nền xám nhạt, trong khi đó, làm đậm các thành phần có

chứa nhiễm sắc thể (DNA) như ký sinh trùng (parasite), tế bào bạch cầu (WBC), tiểu

cầu (platelet) và một vài artefact Hình 2-2 minh họa một số đối tượng trong lam máu

sau khi được nhuộm Geimsa

Hình 2-2 Một số mẫu đối tượng được nhuộm trong thực tế

Với hình trên (a) và (b) là tế bào bạch cầu (white blood cell), có cấu trúc khối nguyên chất đậm đặc và kích thước trung bình to gấp 3 lần hồng cầu; (c) và (d) là tiểu cầu, có cấu trúc xốp và kích thước nhỏ hơn hồng cầu rất nhiều (bằng khoảng 1/5); (e) hình dạng artefact; (f) là hai tế bào hồng cầu bị nhiễm ký sinh trùng P falciparum và đang ở thể nhẫn, (g) thể tự dưỡng của ký sinh trùng P falciparum; và (h) là thể phân liệt của ký sinh trùng P falciparum, các tế bào có màu nhạt hơn là các tế bào hồng cầu khỏe mạnh

Nguồn: dữ liệu của Ross [15], dữ liệu của Bệnh viện NUH, Singapore, và dữ liệu của Khoa nhiễm sốt rét Bệnh viện Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh.

Vật mẫu dùng để xét nghiệm trên kính hiển vi được tạo ra trên một phiến thủy tinh

mỏng được gọi là lam máu (blood smear / blood film) (Hình 2-3) Lam máu dùng để

xét nghiệm gồm hai dạng:

- Giọt dày (thick blood film) cho phép người chuyên viên sử dụng quang trường

40x – khả năng phóng đại 40 lần – để có thể quan sát trên một vùng lớn Hình ảnh quan sát chỉ tồn tại các vùng nhuộm màu, nên khả năng phát hiện được ký sinh trùng dễ dàng và nhanh chóng Tuy nhiên, cách thức tạo giọt dày làm phá hủy các tế bào hồng cầu và như vậy làm cho việc nhận dạng loại ký sinh trùng trở nên khó khăn

- Giọt mỏng (thin blood film) ngược lại với giỏi mỏng, phương pháp tạo giọt

mỏng bảo toàn được hình dạng của tế bào hồng cầu và ký sinh trùng Như vậy việc định dạng loại ký sinh trùng dễ dàng hơn, bù lại việc quan sát đòi hỏi người

chuyên viên phải sử dụng sử dụng quang trường 100x – khả năng phóng đại 100 lần – để phân tích kỹ lưỡng hơn, mất nhiều thời gian hơn

Hình 2-3 Lam máu, giọt dày (trái), giọt mỏng (phải)

Cách thức xét nghiệm trong thực tế thông thường được bắt đầu bằng việc quan sát giọt dày Quá trình này sẽ quyết định sự nhiễm bệnh: âm tính hay dương tính, tức là xác định sự có mặt của ký sinh trùng sốt rét trong lam máu Tiếp theo, quá trình nhận dạng loại ký sinh trùng và thời kỳ phát triển của chúng được thực hiện trên giọt mỏng

Tuy nhiên, các nghiên cứu về hình ảnh ký sinh trùng sốt rét trên máy tính hiện nay, tất

cả đều sử dụng hình ảnh ghi nhận từ lam máu giọt mỏng làm đối tượng nghiên cứu vì chúng chứa nhiều thông tin để khai thác và phân tích hơn so với hình ảnh ghi nhận từ lam máu giọt dày Các hình ảnh tế bào và ký sinh trùng trong Hình 2-2 đều được chụp

từ giọt mỏng của lam máu

2.3 So sách với phương pháp xét nghiệm khác

Phương pháp phân tích và xét nghiệm nhiễm bệnh sốt rét bằng kính hiển vi được xem

là kỹ thuật phổ biến, kinh tế và tin cậy Bên cạch khả năng phát hiện và phân biệt các loại kí sinh trùng, phương pháp này còn cho phép quan sát các giai đoạn phát triển của

kí sinh trùng trong máu, đây được xem là ưu điểm lớn nhất của phương pháp này Hơn nữa, chí phí trang thiết bị và đào tạo tương đối thấp, sẽ đảm bảo được khả năng trang bị cho các nước đang phát triển, nơi dịch bệnh phát triển [3]. Trở ngại của phương pháp quan sát kích hiển vi là việc phân biệt chủng loại ký sinh trùng và thời kỳ phát triển của chúng gặp không ít khó khăn và nhầm lẫn, vì hình thái biểu hiện tương tự nhau

Một kỹ thuật mới phát triển gần đây gọi là PCR (Polymerase chain reaction), sử dụng các phương pháp biến đổi chuỗi phản ứng hóa học, và kết quả có được thông qua độ đo của sản phẩm tạo thành, thay vì thông qua độ đo của hình ảnh được quan sát bằng mắt thường Kỹ thuật này có khả năng phát hiện ký sinh trùng nhạy hơn và rõ ràng hơn so với kỹ thuật quan sát kính hiển vi Hơn nữa, phương pháp này giải quyết được vấn đề phát hiện đa nhiễm, nhiễm nhiều chủng loại ký sinh trùng cùng một lúc Hiện nay, người ta cho rằng phương pháp này có thể thay thế phương pháp xét nghiệm bằng kính hiển vi Tuy nhiên, chi phí của phương pháp PCR nhiều tốn kém, yêu cầu các thiết bị đắt tiền và điều kiện phòng xét nghiệm ở mức cao [21][22].

Ngoài ra, một kỹ thuật khác, được gọi là phát hiện nhanh như dạng que thử Rapid Diagnostic Tests, không cần đến các thiết bị xét nghiệm hay sự huấn luyện đặc biệt nào Độ nhạy phát hiện được ký sinh trùng, dĩ nhiên, thấp hơn độ nhạy của phương pháp sử dụng kính hiển vi, nhưng trong một số trường hợp nó vẫn được chấp nhận

2.4 Đặc điểm hình ảnh tế bào

Qua việc quan sát thực tế, các hình ảnh mẫu máu có các đặc điểm như sau:

Hình ảnh giọt mòng được quan sát và chụp ở những mức độ phóng đại – quang trường 100x Tuy nhiên, độ phân giải của máy chụp ảnh có thẻ bị thay đổi làm cho kích thước của các đối tượng quan tâm không cố định

Hình 2-4 Artefact - các thành phần gây nhiễu

Yếu tố nhiễu trong hình ảnh gây ra sự sai lệch trong việc phát hiện tế bào nhiễm ký sinh trùng Thông thường, nhiễu là các thành phần artifact trong mẫu máu, bao gồm

các loại tế bào lạ vô định hình, vết dơ, vết bụi, vết bẩn hóa học trong lúc chuẩn bị mẫu vật (Hình 2-4)

Vì độ sáng của nguồn sáng cũng như nồng độ của thuốc nhuộm làm cho hình ảnh có nhiều biến đổi về màu sắc như tông màu (độ màu nóng lạnh), độ tương phản và độ sáng tối Các tông màu thường thấy trong các ảnh chụp mẫu máu là xám, xanh, tím, hồng, và vàng Độ sáng tối thường bị thay đổi từ trung tâm ra biên của ảnh do hiệu ứng quang học của thấu kính (Hình 2-5)

Hình 2-5 Các tông màu khác nhau xuất hiện trong hình ảnh mẫu máu

Hình dạng và sự xuất hiện của đối tượng quan tâm – tế bào máu – cũng có nhiều thay đổi trong hình ảnh

- Tế bào hồng cầu thông thường sẽ có một vùng sáng ở trung tâm, nhưng trong một số trường hợp chúng lại không có vùng sáng Hình 2-6 (a) và (b) Điều này thường xảy ra khi mẫu máu được kẹp bởi 2 lam máu dùng để lưu trữ lâu dài

- Tế bào hồng cầu thông thường sẽ có hình dạng tròn, dạng bầu dục, dạng elip Đôi khi chúng có đường viền dạng răng cưa nhưng vẫn ở dạng tròn Trong một

số trường hợp tế bào bị biến dạng bóp méo, xảy ra khi vùng quan sát có mật độ

tế bào cao Xem Hình 2-6 (c) và (d)

- Điều quan tâm là tế bào có nhiều khả năng nằm chồng lên nhau (dính nhau), thông thường 2-3 tế bào và có thể kết thành một chùm hoặc một dây (Hình 2-7)

Hình 2-6 Đa dạng hình dạng tế bào hồng cầu

Với hình trên (a) các tế bào được thấy phổ biến trong các hình ảnh mẫu màu – tồn tại

điểm sáng ở vùng trung tâm tế bào; (b) các tế bào hồng cầu bình thường, nhưng trong

trường hợp này vật mẫu được ép giữa hai phiếm kính, do vậy phần sáng ở trung tâm tế

bào không còn được thấy; (c) tế bào hồng cầu có đường biên răng cưa; (d) tế bào hồng

cầu có hình dạng méo khi mật độ cao.

Hình 2-7 Các tế bào hồng cầu nằm chồng nhau (dính nhau)

Chương 3

Công trình Nghiên cứu liên quan

Nội dung của chương này trình bày những hướng tiếp cận và phương pháp giải quyết các bài toán trong việc xét nghiệm tự động bệnh sốt rét bằng hình ảnh mẫu máu Với các kỹ thuật xử lý ảnh trong ngành thị giác máy tính như hình thái học, dò cạnh (edge detection), biến đổi trạng thái (transformation)… và các thuật toán trong ngành máy học nhằm tập trung giải quyết hai bài toán: phân tách (segmentation) và phân loại (classification) tế bào nhiễm ký sinh trùng

3.1 Các phương pháp phân tách tế bào

Quá trình phân tách (segmentation) theo định nghĩa khoa học máy tính được xem là

quá trình chọn lựa trong khối dữ liệu lớn và phức tạp, đồng thời giảm thiểu các thông tin gây nhiễu để thu được các thông tin cần thiết, đáng quan tâm Đây là sẽ là thông tin cung cấp cho các quá trình xử lý tiếp theo như rút trích đặc trưng, phân loại, nhận

dạng… Phân tách hình ảnh được xem là quá trình chia nhỏ hình ảnh thành các vùng (region) hay các đối tượng (object) có cùng đặc điểm hay cấu tạo nào đó Các vùng/đối

tượng này được xác định tùy vào yêu cầu của bài toán và quá trình kết thúc khi các vùng/đối tượng quan tâm trong hình ảnh được phân tách riêng rẽ Tuy nhiên, quá trình phân tách sẽ không vượt quá mức chi tiết đến mức có thể xác định được đối tượng là gì [26]. Ví dụ, trong hình ảnh mẫu máu, các tế bào hồng cầu và bạch cầu là những vùng/đối tượng quan tâm cần phải phân tách

Quá trình phân tách là một trong những tác vụ khó khăn trong quá trình xử lý hình ảnh

Độ chính xác của quá trình phân tách quyết định sự thành công hay thất bại của các quá tình phân tích hình ảnh khác [26]. Các thuật toán phân tách hình ảnh đều dựa trên

hai tính chất cơ bản của độ lớn điểm ảnh: độ không liên tục và độ tương tự Với tính

chất đầu tiên, cách tiếp cận để phân tách hình ảnh dựa vào sự thay đổi đột ngột của giá trị độ màu, kết quả tạo thành là các cạnh của đối tượng.Với tính chất thứ hai, cách tiếp

cận dựa trên việc lựa chọn các điểm ảnh có độ màu tương tự với nhau hoặc tương đồng với giá trị định sẵn, kết quả tạo thành là các vùng đối tượng Các thuật toán và kỹ thuật

có thể kể đến là phân ngưỡng (thresholding), loang vùng (region growing), cắt/ ghép

vùng (split and merge) và dò cạnh (edge detection)

Một số đặc điểm đáng quan tâm khi phân tách hình ảnh tế bào là: các đối tượng có thể nằm chồng chéo lên nhau, có hình dạng và kích thước biến đổi Ngoài ra, do độ sáng tối không đồng nhất, sự tương phản giữa biên của tế bào và phần nền cũng thay đổi theo vùng ảnh

Phân tách cũng được xem là một tác vụ phân loại các điểm ảnh Hình ảnh bao gồm các

vùng điểm ảnh có độ màu (intensity) khác nhau sẽ được gán vào các lớp khác nhau dựa vào kỹ thuật phân loại như: kỹ thuật gom cụm (clustering), phân loại có kiểm soát

(supervised) và phân loại không kiểm soát (unsupervised)

Các công trình nghiên cứu về phân tách tế bào tiêu biểu được kể đến như:

Công trình của Cecilia Di Ruberto [12][13], sử dụng hình ảnh RGB, phân tách tế bào hồng cầu từ kênh màu xanh, định kích thước trung bình của hồng cầu bằng phân tích

ma trận hạt trên ảnh mức xám Sau đó, sử dụng thuật toán đường phân thủy và thông tin độ dốc màu sắc để phân tách các tế bào dính nhau

Kumar [28] đã sử dụng phép phân tách đường biên tế bào bằng cách sử dụng phép tính năng lượng Teager Phương pháp này được dùng để phân tách các tế bào bạch cầu trong mẫu máu

Theera-Umpon [29] đề nghị một kỹ thuật phân tách tế bào dựa trên thuật toán fuzzy Mean (FCM) và các phép toán hình thái cơ bản Đây cũng là một phương pháp được áp dụng để phân loại các điểm ảnh của tế bào bạch cầu

C-Bằng phương pháp phân ngưỡng để thu được đường biên dạng tròn của tế bào, từ đó xác định chính xác vị trí của tế bào Liao [30] cố gắng định vị tế bào bằng cách thức xác định hình dạng, tuy nhiên, cách thức chỉ đúng với những trường hợp đường biên của tế bào có dạng tròn

Jiang [31] đưa ra một cách phân tách dựa vào bộ lọc kích thước và phân cụm theo histogram không gian màu HSV Jiang cũng đề nghị một quy trình phân tách tế bào trên không gian ảnh màu dựa trên kỹ thuật gom cụm theo không gian đặc điểm, kết hợp với bộ lọc không gian kích thước và gom cụm đường phân nước

Ongun [32]đã thực hiện quá trình phân tách tế bào bằng phép toán hình thái trước, sau

đó sử dụng kỹ thuật đường biên linh hoạt (active contour) để tìm ra giới hạn biên của

tế bào Thuật giải là chỉ áp dụng để phân tách các dạng tế bào đơn lẻ như tế bào bạch cầu Leyza phát triển tiếp công trình của Ongun, sử dụng các phép toán hình thái học

và khảo sát tính chất không gian kích thước để tăng mức độ chính xác của thuật toán phân tách tế bào

Ritter [33] giới thiệu một cách thức xác định đường biên các đối tượng sau đó sẽ thực

hiện phân tách tế bào theo vùng sử dụng phép loang (flooding) Trở ngại của phương pháp này là việc xác định điểm mấu chốt (seed) là dựa vào thông tin màu sắc – một yếu

tố có độ biến động cao

3.2 Các phương pháp phát hiện và phân loại ký sinh trùng

Không có nhiều công trình nghiên cứu về cách thức phát hiện và phân loại tế bào nhiễm ký sinh trùng Ba công trình của Tek [7], Ross [15], Di Ruberto [12] mô tả các phương pháp về phân loại tế bào nhiễm ký sinh trùng Hai công trình của Halim [16]

và MinhTam-Le [17] được sử dụng để phát hiện và phân biệt tế bào hồng cầu khỏe mạnh và tế bào nhiễm bệnh Các phương pháp phân tích hình ảnh cũng như phân tính mẫu máu ở thực tế đều bắt đầu từ việc phân biệt kí sinh trùng trong các đối tượng có nhuộm màu với tế bào bạch cầu, tiểu cầu và artefact, rồi sau đó mới tiến hành phân loại các loại ký sinh trùng cũng như thời kì phát triển của chúng trong chu kỳ sống Ngoài yếu tố về việc sử dụng bộ phân loại (classifier), thì việc lựa chọn đặc điểm và phương pháp rút trích đặc trưng (feature extraction) là vấn đề quan tâm nhiều trong các công trình nghiên cứu

Di Ruberto [12] có cách phân loại bạch cầu và giao bào của kí sinh trùng dựa vào thông tin diện tích Tiếp theo, ông cũng đề nghĩ một cách thức phân loại các thời kỳ

phát triển của kí sinh trùng dựa vào mức độ tương đồng của độ sáng để phân loại thể nhẫn và thể phân liệt Rao [35] cũng sử dụng ý tưởng này để thực hiện một quá trình phân loại dựa theo luật gồm có thông tin về diện tích và sự có mặt của điểm đặc trưng

tế bào chất để phân loại các thời kỳ của ký sinh trùng

Ross [15] đưa ra một cách tiếp cận khác, giải quyết phân loại qua 2 bước Ông đưa ra hai tập đặc trưng khác nhau tương ứng với hai quá trình phát hiện và nhận dạng loại ký sinh trùng Các đặc trưng đề nghị bao gồm các thông tin về màu sắc và đặc điểm hình học Ví dụ, về thông tin màu sắc, ông sử dụng cường độ màu trung bình, cường độ đỉnh, độ nghiêng, và độ tương tự từ các kênh màu đỏ xanh lam cũng như với các thành phần màu sắc, độ bão hòa, và cường độ trong hình ảnh Với đặc điểm hình học, ông sử dụng tỉ lệ tròn, độ khúc khủy và thông tin kích thước (diện tích) để làm đặc trưng Sau khi có được tập đặc trưng khoảng 70-100 đặc điểm, ông sử dụng mạng nơ ron lan truyền ngược (back propagation neutral network) để huấn luyện và phân loại

Với Boray Tek [7], sử dụng kỹ thuật KNN để phát hiện tế bào nhiễm kí sinh trùng Sau

đó, Tek mở rộng phương pháp này để phân loại ký sinh trùng cũng như xác định trạng thái phát triển của ký sinh trùng Ông sử dụng các đặc điểm chung như chỉ định màu sắc trong histogram, phép quay Hu, ma trận hạt cục bộ và vector đặc điểm ràng buộc

để tạo ra tập đặc trưng

3.3 Nhận xét và đánh giá các hướng tiếp cận

Hiện tại có 3 bài toán chính có liên quan đến nghiên cứu ‘phân tích tự động hình ảnh mẫu máu để đánh giá sự nhiễm bệnh do ký sinh trùng sốt rét’:

1 Phân tách tế bào hồng cầu (đánh dấu các mặt nạ hay đường biên ngoài của các

tế bào) bao gồm việc đếm số lượng cũng như phân tách các cụm tế bào dính chùm

2 Phát hiện kí sinh trùng sốt rét trong tế bào hồng cầu

3 Phân loại ký sinh trùng và thời kì phát triển của chúng trong chu kỳ sống

Bài toán này với bài toán 2 có thể gộm thành một bài toán chung.

Các hướng tiếp cận được trình bày ở hai phần trên cho thấy sự đa dạng về phương pháp Các kết quả của các công trình nghiên cứu nêu ra có mức độ tương đối cao, tuy nhiên chưa có một so sách chính thức nào giữa các phương pháp Mỗi công trình sử dụng dữ liệu riêng của mình và chưa có dữ liệu chung Ngoài ra dữ liệu cũng còn ở mức hạn chế về loại ký sinh trùng, do vậy mà còn ít công trình trình bày về các phương pháp phân loại ký sinh trùng Hầu hết các hướng tiếp cận đều sử dụng các thông tin cấp thấp mức độ điểm ảnh và đường biên Các công thức còn dựa vào nhiều yếu tố là bất định hay ngưỡng cố định, nên khi có thay đổi trong dữ liệu sẽ xảy ra nhiều sự sai lệch Trong luận văn này, vấn đề phân tách tế bào hồng cầu được tập trung tìm hiểu và cải

tiến Chúng tôi đề nghị một đặc trưng gọi là độ bao phủ Đặc trưng này được tính toán

đơn giản cùng với việc tận dụng tối đa các thông tin có được trong hình ảnh sẽ giúp cho việc phân tách được thực hiện nhanh chóng Và kết quả của phần phân tách được dùng để thử nghiệm một phương pháp phát hiện ký sinh trùng Phương pháp này sử dụng dữ liệu để huấn luyện và tìm ra hàm phân ngưỡng Tuy nhiên, với đặc trưng đơn giản, phương pháp chỉ đáp ứng nhu đầu phát hiện được tế bào có nhiễm ký sinh trùng, chưa thực hiện chức năng phân loại ký sinh trùng

Chương 4

Bài toán và Hướng tiếp cận

Nội dung của chương này trình bày, phân tích và đánh giá các hướng tiếp cận của hai bài toán: phân tách tế bào và phát hiện tế bào nhiễm ký sinh trùng Thông qua phân tích các hướng tiếp cận của các công trình nghiên cứu, hiểu rõ cách làm cũng như các mặt còn hạn chế của các giải pháp, chúng tôi đề nghị một cách tiếp cận mới, đây cũng là những đóng góp khoa học của luận văn

4.1 Đặt vấn đề

Hệ thống tự động xét nghiệm, như trình bày ở phần 1.2, được xây dựng nhằm mục đích

hỗ trợ người kỹ thuật viên có thể quan sát mẫu vật một cách hiệu quả hơn trên mành hình máy tính, đồng thời cho phép xác định nhanh chóng và chính xác số lượng hồng cầu cũng như vị trí các tế bào nhiễm bệnh

Thông qua phần phân tích các yếu tố liên qua và đặc điểm thay đổi trong hình ảnh mẫu máu trong phần 2.4, hệ thống cần phải phải thực hiện được các yêu cầu sau:

- Phân tách các đối tượng nhanh chóng và chính xác, đặc biệt trong các trường hợp các tế bào nằm chồng chéo và che khuất nhau, giúp người quan sát có thể biết được số lượng tế bào hồng cầu ‘một cách tương đối’ không cần phải quan sát và đếm thủ công

- Định vị các đối tượng bất thường nhanh chóng và chính xác, giúp người quan sát định vị được vị trị tế bào nhiễm ký sinh trùng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh trong hình ảnh mẫu máu

Với các yêu cầu nêu trên, hình thành hai bài toán: phân tách tế bào và phát hiện kí sinh

trùng Các bài toán này lần lượt được trình bày và phân tích ở phần tiếp theo

4.2 Bài toán phân tách tế bào

Hầu hết, các công trình nguyên cứu hiện nay đều có khả năng thực hiện tốt việc phân tách tế bào, nhưng chỉ mới thực hiện tốt ở mức tế bào đơn lẻ, chủ yếu phân tách trên tế bào bạch cầu, vì tế bào bạch cầu có kích thước lớn nhất, có hình dạng đặc trưng, mật

độ thấp, nằm tách nhau, và dễ bắt màu nhuộm hình ảnh mẫu máu (Hình 4-1) Trong khi đó, các tế bào hồng cầu có đặc điểm kính thước nhỏ hơn, hình dạng và màu sắc tương tự nhau, mật độ cao và có nhiều khả năng chồng lắp lên nhau, thì các phương pháp phân tách chưa đạt hiệu quả cao

Để phân tách được tế bào nằm chồng nhau có những hướng tiếp cận được đề nghị như sau:

1 Phương pháp toán học hình thái

2 Phương pháp đường phân nước

3 Phương pháp hình học – khảo sát đường biên

4 Phương pháp phân tách dựa vào mô hình

Hình 4-1 Hình ảnh so sánh đặc điểm tế bào bạch cầu và hồng câu

Trong hình có 3 tế bào bạch cầu, chúng có màu sắc nổi trội, kích thước to gấp 3 lần

các tế bào hồng cầu xung quanh, các tế bào hồng cầu có kích thước nhỏ hơn và có

nhiều cụm tế bào nằm chồng lên nhau

4.2.1 Phương pháp toán học hình thái

Phương pháp phổ biến, dễ cài đặt, mang tính chất nhanh gọn và được sử dụng rộng rãi

trong việc phân tách các đối tượng dựa trên thông tin hình dạng là phương pháp toán

học hình thái (mathematical morphology) Kỹ thuật này dựa trên lý thuyết và ý tưởng

của phép mở hình thái học (opening morphology)

Toán học hình thái dựa trên lý thuyết tập hợp [26], các phép toán này được thực hiện trên hình ảnh nhị phân – tập hợp điểm ảnh trắng hoặc đen, mang giá trị cường độ sáng tương ứng là 0 hoặc 1 Phép toán mở (opening) hình thái học được kết hợp bởi hai

phép toán cơ sở là phép lan (dilation) và phép co (erosion) Với công thức như sau:

 

Trong đó, A là hình ảnh gốc, s là cấu trúc cơ sở,  là phép co và  là phép lan, công thức phải được thực hiện lần lượt phép co trước, phép lan sau Ngược lại với phép mở

là phép đóng hình thái (closing), cách tính cũng giống như phép mở nhưng thực hiện

phép lan trước và phép co sau

Hiệu ứng của phép mở hình thái cho phép biết đổi hình dạng các thành phần trong hình ảnh nhị phân theo chiều hướng của hình dạng của cấu trúc cơ sở bằng cách xóa bớt các điểm ảnh Bằng cách này, để phân tách hai tế bào hồng cầu (dạng tròn), một cấu trúc

cơ sở dạng đĩa tròn được áp dụng trong phép toán mở, và kết quả các điểm ảnh ở biên của đối tượng - tế bào chồng lắp lên nhau – sẽ được xóa bỏ, và tách thành các đối tượng nhỏ hơn (Hình 4-2)

Hình 4-2 Quá trình sử dụng phép mở hình thái để tách tế bào

(a) Ảnh nhị phân (b) Các điểm ảnh được xóa bởi phép mở hình thái (c) Tế bào được phân tách Phương pháp này đã được sử dụng trong các công trình của Dorini [27], Fabio Scotti [34], và Rao Mohana [35] Ưu điểm của phương pháp này là xử lý tính toán nhanh và thực hiện tốt đối với các cụm tế bào có độ dính nhau thấp Hạn chế của phương pháp này là khó khăn trong việc xác định độ lớn cấu trúc cơ sở, nếu kích thước của cấu trúc

cơ sở nhỏ thì sẽ không tách được các tế bào dính nhau, trong khi đó, khi đặt kích thước

của cấu trúc cơ sở lớn thì phép toán sẽ xóa đi rất nhiều điểm ảnh – gây mất mát thông tin

4.2.2 Phương pháp đường phân nước

Phương pháp đường phân nước (watershed) dựa trên các phép toán hình thái học, được Beucher và Meyer đề nghị [36], với ý tưởng cơ bản là để đối tượng phóng to từ một điểm trũng bằng phép lan hình thái học và không để các đối tượng gắn liền (merge) với nhau bằng đường phân nước (hay còn gọi đập nước) Một cách hình tượng, hình ảnh là một địa hình được phủ đầy nước, nước sẽ tích lũy vào các vùng thấp nhất và tạo thành các ao hồ Khi nước dâng lên các ao hồ sẽ gắn liền với nhau, nhưng chúng ta ngăn lại bằng cách xây các đập ngăn nước Các đập ngăn nước là các đường biên phân cách giữa các ao hồ – được xem là các đối tượng Mỗi đập ngăn nước sẽ hình thành một vòng đường biên đóng cho các đối tượng (Hình 4-3)

Hình 4-3 Quá trình tạo đường phân nước

(a) Ảnh nhị phân (b) Dạng biến đổi dựa trên khoảng cách (c) hình ảnh 3 chiều cho thấy độ sâu của ao hồ (d) kết quả hình thành đường phân nước

Phương pháp phân tách dựa vào đường phân nước trên hình ảnh nhị phân sử dụng biến đổi theo khoảng cách, muốn có được kết quả tốt thì các tế bào phải ở dạng tròn và đường biên phải đều (ít lồi lõm) Tuy nhiên hình dạng của tế bào có nhiều biến đổi vì nhiều lý do khác nhau Do vậy, trong trường hợp này, cách thức đường phân nước sẽ làm phân tách thành nhiểu vùng nhỏ (gọi là over-segmentation) Để khắc phục tình trạng này, một cách thức bổ trợ được thực hiện, các vùng phân tách nhỏ sẽ được liên kết với nhau dựa vào thông tin diện tích và chu vi phần đường viền liền kề với nhau Mỗi vùng phân tách nhỏ có diện tích còn nhỏ hơn diện tích tế bào chuẩn, sẽ được kết với một vùng khác liền kề với đường biên ngăn cách nhau dài nhất Ngoài ra, hai vùng

được kết với nhau còn phải thỏa mãn một ngưỡng khoảng cách cho trước, để tránh trường hợp việc liên kết không tạo thành một tế bào Quá trình này lặp lại nhiều lần cho đến khi không còn kết các vùng với nhau được nữa [38]

Hình 4-4 Quá trình bộ trợ phương pháp đường phân nước

(a) Ảnh gốc nhị phân (b) sau khi áp dụng thuật toán hình thành có nhiều đường phân nước

(c) sau khi gộm các thành phần nhỏ có đường biên kề nhau dài nhất Với đặc tính của đường phân nước, nhiều công trình chọn lựa phương pháp này để phân tách các đối tượng tế bào như Di Ruberto [13], Borey Tek [25], Jiang [31], và Norberto [37] Khuyết điểm của phương pháp này, như phân tích ở trên, điều kiện để kết hợp các phần nhỏ cần thông tin kích thước – diện tích – của đối tượng, việc xử lý ghép các phần nhỏ lại với nhau có xử lý phức tạp và mất nhiều chi phí so sánh Trong một số trường hợp có thể bị sai lệch gây ra bởi việc chọn lựa và kết hợp các thành phần nhỏ

4.2.3 Phương pháp khảo sát đường biên

Phương pháp này dựa trên các nguyên lý hình học và đặc điểm hình dạng của tế bào Đối tượng tế bào dính nhau (chồng lắp) sẽ được phân tách bằng đường thẳng nối hai

điểm ảnh trũng nằm trên đường viền của đối tượng này Cách thức này dựa vào rất

nhiều vào 2 yếu tố: (1) cách xác định điểm trũng và (2) hàm lượng giá để phát hiện

đường phân tách [19] (Hình 4-5)

Phương pháp khảo sát đường biên được thực hiện tuần tự các bước sau: (1) xác định đường biên của đối tượng theo chiều kim đồng hồ (hoặc ngược lại), (2) xác định vùng trũng, (3) xác định các đường có khả năng là đường phân tách, và (4) lọc và chọn

đường phân tách tốt nhất

Hình 4-5 Quá trình phân tách bằng phương pháp phân tích đường biên

(a) Ảnh nhị phân (b) đường biên của đối tượng (c) phát hiện hai điểm trũng

(d) đường nối hai điểm trũng phân tách đối tượng thành 2 tế bào Xác định vùng trũng dựa vào định nghĩa sau

để xác định các đường có khả năng là đường phân tách, xem Hình 4-6 (b) Sau khi có được tập hợp các đường có khả năng là đường phân tách, hàm lượng giá ‘khoảng cách’ giữa 2 điểm trũng tạo nên đường phân tách sẽ chọn ra đường phân tách có giá trị nhỏ nhất là đường phân tách tốt nhất Quá trình được lặp lại cho đến khi không còn đường phân tách được lập ra từ các điểm trũng, xem Hình 4-6 (c)

Hình 4-6 Các bước trong thuật toán khảo sát đường biên

(a) Xác định vùng trũng (b) xác định vùng ngắm của điểm trũng (c) lựa chọn đường phân tách tốt nhất Phương pháp phân tích đường biên được Yeo [39] đề nghị, sau đó được Wang [40] và Kumar [19] tiếp tục phát triển và cải tiến Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn mắc một số lỗi: (1) Việc đặt ngưỡng D T ảnh hưởng rất nhiều vào việc xác định vùng trũng, nếu D T lớn một số vùng trũng sẽ bị bỏ qua, ngược lại nếu D T nhỏ sẽ có nhiều vùng

trũng được tạo lập và đối tượng sẽ bị phân chia thành nhiều phần nhỏ, xem Hình 4-7 (a) và (b); (2) phương pháp này thích hợp với các đối tượng phân tách dạng dây, với đối tượng dạng cụm kết quả phân tách sẽ bị mất mát thông tin, xem Hình 4-7 (c) và (d)

(c)

(d)

Hình 4-7 Phân tách tế bào bằng phương pháp phân tích đường biên

(a) Kết quả phương pháp phân tích đường biên 2 thành phần (b) Kết quả mong đợi của hình a) 4 thành phần

(c) đối tượng phân tách dạng dây (d) đối tượng phân tách dạng cụm

4.2.4 Phương pháp phân tách dựa vào mô hình

Phương pháp dựa trên cách làm ‘tự nhiên’ của con người, sử dụng một mô hình có biểu diễn tổng hợp từ các tế bào đơn lẻ, sau đó dò tìm trên hình ảnh, phần nào có độ tương

tự cao – nghĩa là gần giống với mô hình nhất – được xem là tế bào đơn và tách phần tế bào đó ra khỏi vùng các tế bào chồng nhau

Kỹ thuật này bao gồm các bước cơ bản sau:

1 Xây dựng mô hình tế bào dựa trên tập hợp tế bào mẫu

2 Dò tìm vùng có khả năng trên hình ảnh

3 So khớp với tế bào mô hình

4 Phân tách tế bào khi tìm được so khớp tốt nhất,

Lập lại bước 2 cho đến khi không tìm được đối tượng để so khớp nữa

Phương pháp này đã được áp dụng thử nghiệm trong các công trình nghiên cứu gần đây của Kyoung-Mi Lee [24], Gloria Diaz[10] Các công trình này đưa ra hướng tiếp

cận là xây dựng một cách biểu diễn (representation) và mô tả (description) tập hình ảnh

tế bào mẫu từ thành một mô hình tế bào có khả năng lưu trữ thông tin hình dạng của tế bào, ví dụ như theo kích thước và đường viền tế bào

Kyoung-Mi Lee đã đề nghị phương pháp mô hình hóa tế bào như sau:

1 Cách mô hình hóa: Với mỗi tế bào trong tập mẫu sẽ rút ra 16 khoảng cách tương ứng với 16 khoảng cách từ tâm tế bào đến 16 điểm trên đường biên của tế bào ở

16 hướng cách đều và đối nhau (Hình 4-8)

Hình 4-8 Cách biểu diễn tế bào theo 16 điểm đường biên

2 Cách huấn luyện dữ liệu: Các tế bào có hình dạng giống nhau, nghĩa là độ sai lệch về kích thước nhỏ và nhỏ hơn mức độ  sẽ được đặt thành một mô hình mẫu (gọi là template), các tế bào có độ sai lệch lớn sẽ hình thành một mô hình mẫu mới Kết quả thu được là một tập các hình dạng, mỗi mô hình tế bào biểu diễn cho một tập các tế bào có hình dạng giống nhau

Hình 4-9 Kết quả thực hiện theo phương pháp Kyoung-Mi Lee

Hạn chế của phương pháp Kyoung-Mi Lee là phụ thuộc nhiều vào kích thước tế bào, chỉ xử lý tốt những hình ảnh có kích thước tế bào trung bình tương tự nhau Ngoài ra,

cách dò tìm và xác định tâm của tế bào là một bài toán khó, mà tác giả không đề cập đến trong báo cáo

Công trình nghiên cứu của Gloria Diaz đã đưa ra một tiếp cận khác để mô hình tế bào bằng cách sử dụng thông tin toàn bộ tế bào

1 Cách mô hình hóa: Với mỗi tế bào (dạng nhị phân), thông tin các điểm ảnh (dạng 0, 1) sẽ được biểu diễn thành một mô hình xác suất dựa theo thuật toán

EM Sau đó mô hình gốc được phóng to và thu nhỏ với theo mức độ kích thước bằng 0.9 và 1.1 để có được một số mô hình bổ sung

2 Cách so khớp và phân tách: Sử dụng biểu diễn chuỗi mã của đường biên (boundary chain code) để so khớp đường biên của đối tượng dính nhau với đường biên của mô hình Khi có được so khớp tốt nhất (best matching) tế bào sẽ được tách ra, vùng tế bào này sẽ được xóa khỏi vùng đối tượng dính nhau Quá trình dò tìm tiếp tục, cho đến khi số lượng diện tích còn lại nhỏ hơn 0.2 diện tích đối tượng ban đầu

Hình 4-10 Kết quả thực hiện theo phương pháp Gloria Diaz

(a) ảnh gốc, (b) ảnh nhị phân, (c) (d) (e) các so khớp tốt nhất lần lượt, (f) kết quả cuối cùng Phương pháp của Gloria Diaz cho kết quả tốt hơn phương pháp của Kyong-Mi Lee, tuy nhiên phương pháp Gloria Diaz phải tạo thêm một số mô hình bổ sung với kích thước khác nhau để tăng độ chính xác cho việc so khớp, như vậy chi phí do tìm tăng lên đáng

kể

4.2.5 Phương pháp đề nghị

Nhận xét chung ở các phương pháp trình bày ở trên:

 Ảnh nhị phân được chọn để xử lý đều vì các phương pháp chủ yếu xác định thông tin hình dạng và kích thước của đối tượng;

 Do kích thước đối tượng biến động, các mô hình bổ sung được yêu cầu xây dựng

để phục vụ việc dò tìm, dẫn đến chi phí tính toán nâng cao

 Thông tin đường biên của đối tượng mang tính chất quan trọng quyết định hình dạng của tế bào

 Bên cạnh đó, thông tin về diện tích trung bình của các tế bào đơn lẻ cũng được quan tâm trong các phương pháp

Thông qua việc tìm hiểu các phương pháp cũng như đánh giá và nhận xét từng phương pháp này, chúng tôi đề nghị một kỹ thuật khác Ý tưởng xuất phát từ công trình dựa trên phương pháp phân tách theo mô hình, song cách thức hoàn toàn khác Quan sát cách con người được huấn luyện trong việc phán đoán và phân tích hình ảnh để phân tách tế bào, chúng ta thấy rằng: (1) đầu tiên con người sẽ được học nhiều mẫu hình tế bào đơn lẻ và tổng hợp thành một kiến thức trừu tượng; (2) sau đó, bằng cách dò tìm tuyến tính trên toàn bộ hình ảnh, (3) khi bắt gặp một vùng có độ tương tự cao với hình ảnh đã được học, người ta sẽ chọn vùng đó là tế bào

Nhưng nếu làm đúng quy trình này cho máy tính sẽ mất rất nhiều chi phí tính toán, vì phải thực hiện phép so khớp ảnh thí nghiệm với ảnh mô hình rất nhiều lần, theo phương pháp trượt cửa sổ (sliding window) Con người thực hiện nhanh hơn vì biết cách bỏ qua các vùng không khả quan và xác định nhanh các trung tâm của đối tượng

để so sánh với mô hình mẫu Để giảm thiểu chi phí tính toán của máy tính, cần xác định các trung tâm điểm của đối tượng để thực hiện so khớp một làn vùng đối tượng

này với hình mẫu Quan sát và so sánh hình ảnh đầu vào và hình ảnh biến đổi theo

không gian khoảng cách (Euclidean distance transform), ta nhận thấy các điểm trung

tâm của đối tượng là các điểm có giá trị lớn tương ứng trong hình ảnh biến đổi (Hình 4-11)

(a) (b)

Hình 4-11 So sánh hình ảnh gốc và hình ảnh biến đổi theo không gian khoảng cách

(a) Anh gốc và các điểm trung tâm (b) Hình ảnh qua phép biến đổi theo không gian khoảng cách Như vậy ta có cách xác định các điểm trung tâm như sau:

Gọi N là tập 8-điểm liền kề xung quanh điểm ảnh (x, y) và

D là hình ảnh biến đổi theo không gian khoảng cách của

hình I Tập trung tâm điểm I c được tính theo công thức sau:

Hình 4-12 Cấu tạo đối tượng tế bào hình thành nhiều điểm có khả năng là trung tâm điểm

Khi có được tập điểm I c có khả năng là điểm trung tâm, độ đo đường biên được đưa

vào mỗi điểm trung tâm, được gọi là độ bao phủ của điểm này

Độ bao phủ được định nghĩa như sau:

Gọi R là tập hợp các điểm của đường tròn có tâm là điểm trung tâm (x, y), bán kính được tính là độ lớn của của giá trị điểm (x, y) trong D, với D là hình ảnh biến đổi theo không gian khoảng cách của hình I Độ bao phủ của điểm này được tính theo công thức

Hình 4-13 So sánh tương quan hình ảnh gốc và hình ảnh biến đổi

Đường kể trên cho thấy sự sai lệch nếu chọn điểm có giá trị cao

Đường kẻ dưới cho thấy các các điểm trung tâm có thể có giá trị bằng nhau

Do các thông tin cần thiết để dò tìm và phân tách khá đầy đủ, nên việc xây dựng một

mô hình để so khớp là không cần thiết Ngoài ra, việc xây dựng mô hình sẽ gặp lại vấn

đề lựa chọn kích thước và nảy sinh nhiều chi phí tính toán giống như phương pháp của Gloria Diaz

Với giả thiết điểm trung tâm có độ phủ lớn nhất sẽ cấu tạo thành một đội tượng tế bào riêng lẻ, vùng tế bào này sẽ được tái tạo như sau: (1) phần riêng của vùng tế bào được tái tạo hoàn toàn, phần chung – phần dao với vùng đối tượng còn lại – được tái tạo giả định dựa vào thông tin kích thước trung bình của tế bào Sau khi tái tạo được vùng tế bào đơn lẻ, các điểm trung tâm nằm trong vùng này sẽ được xóa ra khỏi vùng đối tượng dính nhau Và quá trình được tiếp tục lặp lại cho đến xét hết các điểm trung tâm Thuật toán của quá trình phân tách được trình bày cụ thể ở phần 5.5

4.3 Bài toán phát hiện ký sinh trùng

Quá trình nhuộm làm nổi bật các đối tượng ký sinh trùng, tiểu cầu, bạch cầu và artefact trên hình ảnh mẫu máu giọt mỏng Để xác định được toàn bộ tế bào nhiễm kí sinh trùng, cần thiết thực hiện 2 bước: xác định được các điểm ảnh là kí sinh trùng và tìm được vùng đối tượng tế bào chứa ký sinh trùng đó Cho đến nay, bước phát hiện kí sinh trùng vẫn còn là một vấn đề khó, bởi vì, trong hình ảnh mẫu máu thực tế có chứa nhiều thành phần nhạy với màu nhuộm (như đã nêu ở trên) Do vậy, quá trình phát hiện tế bào nhiễm ký sinh trùng chỉ dừng ở mức độ tương đối và mang tính chất hỗ trợ người chuyên viên xác định nhanh chóng các vùng ảnh khả nghi để tập trung vào quan sát

Di Ruberto [12] đã sử dụng phép toán hình thái cực đại vùng (morphological regional extrema) để phát hiện các điểm ảnh được nhuộm (các điểm ảnh này có giá trị cường độ màu lớn hơn nhiều so với các điểm màu xung quanh) Công trình cũng trình bày khả năng nhận dạng các đối tượng bạch cầu, tiểu cầu, và thể phân liệt bằng cách so sánh kích thước của chúng với kích thước trung bình của tế bào Tuy nhiên cách làm này có thể gây ra lỗi khi hình ảnh không chứa điểm anh nhuộm nào thì một số điểm ảnh theo thuật toán vẫn được tạo ra Ngoài ra, việc dựa vào thông tin kích thước để xác định bạch cầu cũng không hoàn toàn đúng, vì trong một số loại kí sinh trùng nhiễm bệnh làm tăng kích thước của hồng cầu Ví dụ như kí sinh trùng Plasmodium vivax có thể phình to tế bào hồng cầu lên đến 2.5 lần (Phụ lục A)

Ross [15] sử dụng một phương pháp tương tự như Di Ruberto, sử dụng 2 mức ngưỡng (toàn cục và cục bộ) để định vị các điểm ảnh nhuộm Rao [35] cũng sử dụng phân ngưỡng để phát hiện các điểm ảnh, tuy nhiên Rao đã tiền xử lý hình ảnh để xóa đi các

giá trị màu sắc có độ chênh lệch lớn - chính là các điểm ảnh nhuộm, để hạn chế lỗi xảy

ra khi trong hình ảnh không có điểm ảnh nhuộm Trong thuật toán, Rao đã giả thiết điểm ảnh nhuộm tối hơn điểm ảnh bình thường

Boray Tek [25] đã đề nghị mô hình xác suất dựa vào histogram màu sắc đề phân lớp các điểm ảnh nhuộm và không nhuộm Với phương pháp hày Tek đã loại bỏ được hạn chế về sự phân biệt điểm ảnh nhuộm sáng hơn/tối hơn so với điểm ảnh bình thường Các phương pháp nêu trên đều có chung một cách tiếp cận: tìm các điểm ảnh có màu nhuộm trước, sau đó dựa vào các điểm ảnh nhuộm làm mặt nạ để tái tạo lại tế bào bằng phương pháp hình thái học

Với công trình của MinhTam-Lê, 2 quá trình song song được thực hiện : (1) quá trình tìm các điểm ảnh nhuộm bằng phương pháp phân ngưỡng histogram và (2) quá trình phân tách riêng các vùng tế bào Sau đó, kết hợp 2 thông tin của hai quá trình để được vùng tế bào có khả năng nhiễm ký sinh trùng

Trong cách thức thực hiện trong luận văn, vì các đối tượng đã được phân tách ở bước trước, trong bước này chỉ cần xét trong vùng đối tượng có xuất hiện điểm ảnh nhuộm hay không Cách xác định các điểm anh nhuộm theo cách thức này dựa trên đặc điểm của mỗi vùng tế bào, chứ không phải dựa trên đặc điểm toàn cục như các cách thức đã nêu Bằng quan sát và thực nghiệm trên nhiều vùng đối tượng tế bào, có một vài nhận xét như sau:

- Vì các vùng đối tượng tế bào đã được tách nhỏ, sự khác biệt giữa histogram cường độ màu của tế bào bình thường và tế bào nhiễm ký sinh trùng (có chứa điểm ảnh nhuộm) không rõ rệt

- Nếu xét vùng lân cận các điểm ảnh của ký sinh trùng trong tế bào máu, ta thấy rằng sự chuyển tiếp màu sắc ở đây rất rõ rệt Ngược lại ở tế bào bình thường cường độ sáng trải đều và không có sự biến đổi đột ngột

Để phát hiện được sự khác biệt này, hai đặc trưng được lựa chọn, với giả thiết rằng nếu

có mặt kí sinh trùng trong tế bào, thì điểm có cường độ sáng nhất nằm trong vùng chứa

kí sinh trùng, đặt điểm đó là C xy Gọi W là vùng cửa số MxN chứa C xy Hai đặc trưng được định nghĩa như sau:

 Trung bình gradient g của W:

Gọi I là ảnh mức xám (ở đây là ảnh grayscale của W), khi đó độ chênh lệch cường độ màu (intensity gradient) tại điểm ảnh (i, j) và trung bình độ chệnh lệnh

được tính bởi công thức sau:

 Khác biệt d về cường độ màu giữa vùng trong và ngoài W:

Ở đây, giá trị màu Hue được chọn để đặc trưng cho màu sắc của các điểm ảnh

Gọi h là giá trị hue của điểm tối nhất, thì h mean và h cov lần lượt là trung bình và

phương sai của tập giá trị hue của các điểm ảnh nằm ngoài W Khi đó, khác biệt

d được tính dựa trên công thức tính khoảng cách Mahalanobis:

) (

)

mean h h h h

h

Hình 4-14 Kết quả phân ngưỡng bằng SVM trên tập mẫu huấn luyện