nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (carica papaya linn)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hồ Thị Hà NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ Carica papaya Linn Chuyên ngành: Công nghệ s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hồ Thị Hà

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP

CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2014

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên

TS Lê Quang Hòa

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Hoàng Anh

Phản biện 2: PGS.TS Vũ Đình Hoàng

Phản biện 3: PGS.TS Hà Huy Kế

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Do Thi Hoa Vien, Ho Thi Ha (2013) Research on anti-cancer

activity of some extracts from Vietnamese carica papaya leaves

Proceeding of the 7th SEATUC Symposium, 4-6 March 2013, Bangdung, Indonesia, ISSN 2186 – 7631, OS4-4

2 Hồ Thị Hà, Lê Quang Hòa, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai

Hương, Nguyễn Thùy Linh, Châu Văn Minh, Đỗ Thị Hoa Viên

(2013) Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học lá cây đu đủ

carica papaya họ đu đủ (caricaceae) Tạp chí hóa học, T 51

(6ABC), ISSN 0866 - 7144, pp 59 – 63

3 Hồ Thị Hà, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Quang Hòa (2014) Nghiên cứu

hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ

(Carica papaya L.) Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, bộ

Khoa học và Công nghệ, số 2+3, ISSN 1859 – 4794, pp 119-122

4 Hồ Thị Hà, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Quang Hòa, Phạm Văn Cường,

Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Thùy Linh, Châu Văn Minh (2014)

Carpainone: alkaloid mới từ lá cây đu đủ Tạp chí khoa học và

công nghệ, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tập

52, số 5, ISSN 0866708X, pp593 - 598

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả được trồng ở

các nước vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, có hoạt tính kháng khuẩn tốt Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau Đã có thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu Ngoài ra, nước lá cây đu đủ còn có tác dụng điều hòa miễn dịch Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch chiết và chưa xác định được thành phần nào là hoạt chất Vì vậy, việc chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt

Nam làm thuốc điều trị bệnh ung thư Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên

cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn”

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất mới có trong lá đu đủ

- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập làm cơ sở khoa học chứng minh cho việc người dân ở một số nước trên thế giới sử dụng lá đu đủ chữa trị một số loại bệnh trong đó có bệnh ung thư

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ

- Xác định cấu trúc của một số hợp chất phân lập được

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ lá

đu đủ

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được

(DPPH), thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA), chống oxy hóa in vitro trên

tế bào gan chuột phân lập

- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá

đu đủ

- Đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất phân lập từ lá đu

đủ

4 Tính mới của đề tài

Phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới từ lá đu đủ (Carica

papaya Linn) được đặt tên là carpainone

Đã xác định hoạt tính gây độc lên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ, trong đó hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư rõ rệt

Lần đầu tiên xác định được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine trên tế bào ung thư phổi LU-1

Đánh giá được khả năng chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm

và khả năng kích thích miễn dịch của một số hợp chất phân lập từ lá đu đủ

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 113 trang: Đặt vấn đề (3 trang), chương 1: tổng quan (29 trang) Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang) Chương 3: kết quả và thảo luận (56 trang với 6 bảng và 54 hình) Kết luận và kiến nghị (2 trang) Danh mục các công trình công bố (1 trang) Tài liệu tham khảo (10 trang gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu tiếng Anh)

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây đu đủ

Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có 1 chi và một loài Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta,

đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…

1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ

Trong lá đu đủ có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,… Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, … Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,

N C

H 2C

C H2CC

H H H

C H3 ( C H 2)7

O

C = O

N C

H 2C

C H 2 C C

H H C H3 H ( C H2)7

O

C = O

N C

CC H2C H 2 C

H H ( C H 2)7

C H 3 H

H

C = O O

Carpaine Pseudocarpaine

1.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ

Một số nhóm chất trong lá đu đủ có hoạt tính chống ung thư Ví dụ: nhóm glucosise bao gồm các chất benzyl glucosinolate, benzyl isothiocyanate

có hoạt tính chống nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Nhóm các chất phenol bao gồm các chất: 5,7-dimethoxy coumarin, axi protocatechui, axit ρ-coumaric, axit caffeic, kaempferol, quercetin Nhóm các chất này đã được chứng minh là có hoạt tính: ưc chế sự tăng sinh tế bào, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào, ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn, cảm ứng quá trình tự chết Nhóm các chất carotenoid các chất: β-carotene, lycopene, β-cryptoxanthin Nhóm các chất này có tác

ức chế nhiều loại tế bào ung thư như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh bạch cầu, Dịch chiết lá đu đủ bằng nước (nồng độ 0,625-20 µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Tác giả đã chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u Sau đó tác giả sử dụng màng lọc để tách thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau Các chất có hoạt tính ức chế

tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 1000

Chất chiết lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa Các giống đu đủ khác nhau có tổng hàm lượng phenol khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa cũng khác nhau Điều đó chứng tỏ rằng các chất phenol gây ra hoạt tính chống oxy hoá Các bộ phận khác nhau của cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập

Dịch chiết lá đu đủ có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn và nấm Cao

lá đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T

rubrum và Staphylococcus aureus Ngoài ra, dịch chiết lá đu đủ còn có khả

năng kháng viêm, kháng virut sốt xuất huyết,…

5

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu thực vật

Giống đu đủ Đài Loan (Carica papaya L.) được trồng tại Nam Hồng –

Đông Anh – Hà Nội Thu hái lá trên cây đu đủ cái, dạng lá bánh tẻ, không bị sâu bệnh, không bị dập nát Lá thu hái vào tháng 10 năm 2012 Lá cây đu đủ thu hái về được sấy ở nhiệt độ 40 - 500C cho đến khô rồi nghiền thành bột 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất:

dùng phương pháp chiết ngâm, chiết bằng sóng siêu âm để thu cặn chiết từ lá

đu đủ Sử dụng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết

Sử dụng phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.2.2.1 Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay): Phép thử tiến hành

xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay

6

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB

đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong

10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm

- Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương

- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Chất thử nào có IC50 <

20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4

g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào

và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3 / 7: Được thực

hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng loại bỏ gốc tự

do DPPH

Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ

2.2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)

Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006) Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường

pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu

2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột

7

Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối chứng dương) Thêm 100 µM H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 100% Đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm

2.2.2.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm

Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp

pha loãng đa nồng độ (Multimicrodilution assay)

2.2.2.7 Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch

Động vật thí nghiệm: Thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi của viện Công nghệ sinh học

Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983))

Tế bào lympho được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml Bổ sung chất thử pha trong DMSO 10% Concavalin A được

sử dụng làm đối chứng Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37 oC, 5% CO2 Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả

về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm

Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn, soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Ce(SO4)2 và vanilin Kết quả, thu được 13 phân đoạn chính như sau:

3.2 của luận văn)

TT Kí hiệu phân đoạn Khối lượng (g)

3.2 Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn

Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân đoạn F5.2 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được

chất sạch CP1 (139,6 mg)

9

Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi Hx/EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn F8.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel

hệ dung môi Hx/EtOAc xuất hiện tinh thể Lọc rửa bằng Hx/CH2Cl2 thu được

chất sạch CP2 (6,7 mg)

Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/EtOAc gradient và HCOOH (1%) thu được 11 phân đoạn nhỏ kí hiệu F9.I.1-F9.I.11 Phân đoạn F9.I.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi EtOH và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient thu được

chất sạch CP3 (6 mg) Phân đoạn F9.I.11 được tinh chế bằng cột sephadex

với dung môi MeOH và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/axeton

geadient thu được chất sạch CP4 (16,4 mg)

Từ phân đoạn F11.II, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và CH2Cl2/MeOH/NH4OH thu được 7 phân đoạn nhỏ

kí hiệu F11.II.1- F11.II.7 Kết tinh phân đoạn F11.II.4 bằng hệ dung môi Hx/CH2Cl2 thu được chất sạch CP5 (210,1 mg) Dịch cái tiếp tục được tinh

chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và sắc

ký cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP6 (18,7 mg) 3.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 56,5 (2 x OCH3), 64,9 2), 105,0 2’ + C-6’), 124,8 (C-1’), 140,8 (C-4’), 147,1 (C3’ + C5’), 196,6 (C=O)

(C-Phân tích chi tiết các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT và so sánh với

tài liệu tham khảo cho phép xác định chất CP1 là danielone Hợp chất này

lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ

10

OCH 3

OH OCH 3

HO

O

1 2 1' 2' 3'

4' 5' 6'

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone (hình 3.3 của luận văn)

Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 (hình 3.4 của luận văn)