Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng DP EG 2000 năm 2013

Kết quả cấy truyền chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà.... Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN BÁ HIÊN

HÀ NỘI, 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

ðỗ Tất ðạt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ii

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học chuyên ngành Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, giảng dạy nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo trong nhà trường Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo, cô giáo; ñặc biệt là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm Khoa Thú Y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Bá Hiên, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này

Xin cảm ơn các bạn ñồng nghiệp và những người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài Rất mong nhận ñược sự ñóng góp

ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn ñồng nghiệp ñối với ñề tài nghiên cứu của tôi

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

ðỗ Tất ðạt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iii

2.1.1 Kiểm tra các chỉ tiêu về giống vi sinh vật dùng ñể sản xuất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iv

2.3.1 Phương pháp xác ñịnh khả năng thích ứng và ổn ñịnh của chủng

2.3.2 Phương pháp xác ñịnh chỉ số ELD50 (liều gây chết 50% phôi)

2.3.3 Phương pháp xác ñịnh chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi)

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất working seed 41

2.3.8 Phương pháp xác ñịnh khả năng ñáp ứng miễn dịch của vịt sau

2.3.9 Phương pháp kiểm tra ñộ dài bảo quản của vacxin nhược ñộc

3.1 Kiểm tra một số ñặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… v

3.1.1 Khả năng thích ứng và ổn ñịnh của chủng virus vacxin nhược

3.1.2 Kết quả xác ñịnh chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược

3.1.3 Kết quả xác ñịnh chỉ số EID50 của chủng virus vacxin nhược ñộc

3.3.4 Kết quả xác ñịnh khả năng ñáp ứng miễn dịch của vịt sau khi

3.3.5 Kết quả kiểm tra ñộ dài bảo quản của vacxin nhược ñộc dịch

3.4 Kết quả ứng dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000

3.4.2 Kết quả sử dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vi

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu Á 7

Bảng 3.1 Kết quả cấy truyền chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà 49

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 52

Bảng 3.3 Kết quả xác ñịnh chỉ số ELD50 của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 54

Bảng 3.4 Kết quả xác ñịnh chỉ số EID50 của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 56

Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra các ñặc tính tính sinh học của các ñời workingseed 58

Bảng 3.6a Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 64

Bảng 3.6b Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt 66

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin nhược ñộc

dịch tả vịt DP-EG-2000 67

Bảng 3.8 Kết quả xác ñịnh chỉ tiêu hiệu lực của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 73

Bảng 3.9 Kết quả ñánh giá ñộ dài miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin 3, 6, 9, 12 và 13 tháng 76

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt dạng tươi sau thời gian bảo quản 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng và 18 tháng bằng phương pháp công cường ñộc 81

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt dạng tươi sau thời gian Bảng 3.12 Kết quả sử dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 vào phòng bệnh cho vịt ở một số ñịa phương 90

Bảng 3.13 Kết quả sử dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trong can thiệp dịch tại một số ñịa phương 92

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vii

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… viii

DANH MỤC ðỒ THỊ VÀ HÌNH Trang ðồ thị 3.1 ðường biểu diễn độ dài miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin 79

ðồ thị 3.2 ðường biểu diễn hiệu lực vacxin sau thời gian lưu kho 87

Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh dịch tả vịt trên TG (2011) 5

Hình 1.2 Cấu trúc virusHerpesviridae 8

Hình 1.3 Sơ đồ chẩn đốn bệnh dịch tả vịt 19

Hình 3.1 Phơi gà xuất huyết, cịi cọc 52

Hình 3.2: Sơ đồ tĩm tắt quy trình sản xuất vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000………58

Hình 3.3 Vịt liệt chân, phù đầu 69

Hình 3.4 Gan sưng, xuất huyết 70

Hình 3.5 Ruột xuất huyết hình nhẫn 70

Hình 3.6 Dạ dày tuyến, dạ dày cơ xuất huyết vệt 71

Hình 3.7 Tim sưng, xuất huyết mỡ vành tim 71

Hình 3.8: Thực quản và diều xuất huyết, loét và loại tử 72

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Diễn giải

EID50 : 50 percent Embryo Infective Dose

ELD50 : 50 percent Embryo Lethal Dose

OIE : Office International des Epizooties

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 1

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Trong những năm gần ñây, nhờ những thay ñổi lớn về con giống, dinh dưỡng, thức ăn, kỹ thuật chăn nuôi, kỹ thuật vệ sinh phòng bệnh và cùng với sự khuyến khích chăn nuôi của ngành nông nghiệp ñã thúc ñẩy nghề chăn nuôi vịt ngày càng phát triển nhanh, mang lại hiệu quả kinh tế cao và bền vững, góp phần giúp người dân không những xoá ñói giảm nghèo mà còn xuất hiện nhiều

hộ gia ñình vươn lên làm giàu từ chăn nuôi vịt Theo số liệu thống kê của FAO (2013), tính ñến tháng 5 năm 2013 cả nước có trên 72,5 triệu con vịt, riêng ñồng bằng sông Cửu Long ñã có trên 30 triệu con chiếm gần phân nửa tổng số vịt cả nước

Tuy nhiên, khi tình hình chăn nuôi phát triển thì ñi kèm với nó là dịch bệnh cũng phát triển theo và ngày càng phức tạp Do vịt ñược chăn nuôi chủ yếu ở các vùng sông ngòi, ao hồ,…và theo quy mô nhỏ lẻ bán công nghiệp nên ñây là môi trường rất thuận lợi cho các bệnh ký sinh trùng, truyền nhiễm phát triển gây chết hàng loạt vịt Một trong những bệnh truyền nhiễm phải kể ñến ñó

là bệnh dịch tả vịt, ñây là bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi vịt Căn bệnh là một loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus Bệnh gây nên tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt ở mọi lứa tuổi ñặc biệt

là vịt trên 2 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao lên ñến 90%

Hiện nay, bệnh vẫn chưa có thuốc ñiều trị ñặc hiệu, biện pháp tốt nhất

ñể kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học và sử dụng vacxin phòng bệnh.Theo Quyết ñịnh số 63/2005/Qð - BNN và Quyết ñịnh số 64/2005/Qð - BNN ñược Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 thì bệnh dịch tả vịt ñược coi là bệnh nguy hiểm của ñộng vật, phải

áp dụng các biện pháp phòng bệnh bắt buộc và là một trong 7 bệnh phải tiêm

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 2

phòng bắt buộc ựạt yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải ựạt 100%

Chắnh vì vậy, vấn ựề ựặt ra ở ựây là cần tìm ra một loại vacxin phòng bệnh có hiệu quả là việc làm cấp thiết nhằm hạn chế và tiến tới thanh toán bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam

Hiện nay bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm Khoa thú y trường đại học Nông nghiệp Hà nội ựang sở hữu chủng vi rút vacxin nhược ựộc dịch tả vịt Chủng vi rút này ựã ựược nghiên cứu về ựặc tắnh sinh học, bước ựầu nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt có hiệu quả Xuất phát từ vấn ựề trên ựược sự phân công của Khoa Thú Y và bộ môn Vi Sinh Vật Ờ

Truyền Nhiễm (VSV-TN) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài: "Nghiên

cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin nhược ựộc dịch tả vịt chủng DP -

EG - 2000"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Kiểm tra sự ổn ựịnh một số ựặc tắnh sinh học của chủng virus vacxin nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000

- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin

- đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin

- Bước ựầu ứng dụng vacxin vào thực tế sản xuất

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

- Là cơ sở ựề ra biện pháp phòng trị bệnh dịch tả vịt có hiệu quả cao

- Là cơ sở ựể sử dụng chủng virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 vào sản xuất vacxin phòng bệnh cho ựàn vịt ở Việt Nam

- Là cơ sở ựể áp dụng lựa chọn sử dụng chủng virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 qua các thế hệ (các ựời vacxin) vào sản xuất vacxin phòng bệnh cho ựần vịt ở Việt Nam

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Năm 1930, tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một trường hợp bệnh tương tự xảy ra ở một ñàn vịt 150 con Năm 1942, dịch lại tái phát ở ñất nước này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt Lần này, Boss (1943) ñã phân lập ra virus và cấy truyền 18 ñời trên vịt

Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss (1943) phân lập ñược, Jansen và Kunst ñã ñề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) Bệnh dịch tả vịt còn có các tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 4

Lan), Pest du canard (Pháp), Enteupest (ðức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006)

* Phân bố bệnh

Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt đã được Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện bệnh ở Anh Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij cơng bố bệnh dịch tả vịt xảy ra

ở ðức Do sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu

Âu, đặc biệt là ðức đã đề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005 Tuy nhiên tỷ lệ chết đã tăng đột biến trong những ngày này Tổng cộng cĩ 17/124 (14%) lồi chim trưởng thành và 149/184 (81%) lồi chim 1 năm tuổi bị chết Phản ứng trung hồ sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đã phát hiện vịt và các lồi chim chết do bệnh dịch tả vịt (Kaleta E.F & cs, 2007)

Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt được chẩn đốn lần đầu tiên ở tây bán cầu vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk, New York (Leibovitz & Hwang, 1967) Vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thuỷ cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota Vụ dịch này đã tấn cơng với sự tàn phá nhanh chĩng và khốc liệt Gần 40% của 100.000 lồi thuỷ cầm trú đơng, hầu hết là vịt trời đã

bị chết Vào thời kỳ cao điểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1000 chim Tất cả những lồi thuỷ cầm đại diện tại hồ Andes đều bị gánh chịu bao gồm ngỗng Canada, vịt trời, vịt đen, vịt lai nhọn đuơi, vịt trời Mỹ, vịt gỗ, vịt mỏ nhọn Mỹ đầu đỏ mắt vàng, vịt Nga và vịt Bắc Kinh Những lồi chim cịn sống sau vụ dịch ở hồ Andes đã phân tán rộng khắp vùng Bắc Mỹ Những mẫu máu được lấy từ những vịt sống sĩt ở hồ Andes đã chỉ ra rằng cĩ tới 30% số vịt đã bị phơi nhiễm virus Tại tiểu bang Michigan (Mỹ) bệnh dịch tả vịt đã được báo cáo vào năm 1979 trên vịt Nga và vịt trời Brand C.J., and D.E Docherty

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 5

(1984) ñã xác nhận bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Mỹ Năm 1993 bệnh dịch tả vịt lại tái phát ở hồ Finger (Mỹ)

Tại Châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn ðộ và tái phát vào năm 1963 Năm 1968, Jansen công bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc Khi nghiên cứu về bệnh này, Mukerji xác nhận chủng virus của Ấn ðộ và chủng virus của Hà Lan có cùng tính chất kháng nguyên Năm 1976, 1977 bệnh ñã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Voxapeer Suwathanaviroij, 1978) Năm

1979 ñã có báo cáo về sự xuất hiện bệnh dịch tả vịt ở ñàn vịt trời và vịt Muscovy

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 6

gây bệnh ựiển hình cho vịt và không có ựặc tắnh ngưng kết hồng cầu gà Vũ đình Tiếu và Mai Anh cho biết dùng vacxin dịch tả vịt ựể tiêm cho vịt có thể ngăn chặn ựược dịch Từ ựó bệnh dịch tả vịt chắnh thức ựược công nhận

có tại Việt Nam Tiếp theo, dịch ựã phát ra ở Hà Nội, Thanh Hoá, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Hà Tây (cũ), Nam Hà (cũ), Thái Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Cao Bằng, Hải Hưng (cũ)

Năm 1971, dịch lại phát ra ồ ạt ở các tỉnh Ninh Bình, Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc (cũ) và thành phố Hải Phòng Nhờ có tiêm phòng vacxin nên diện dịch ựã bị thu hẹp lại, chỉ còn âm ỉ ở một số cơ sở chăn nuôi phân tán

Năm 1980, dịch phát ra mạnh mẽ ở Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hoá và ựồng bằng sông Cửu Long Từ ựó dịch lan ra tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang, Hậu Giang, đồng Tháp

Năm 1989, Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh cho biết ựàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi Các tác giả ựã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên ựàn vịt ở Phú Khánh

Năm 1999, Nguyễn đức Hiền ựã chẩn ựoán xác ựịnh virus gây bệnh dịch tả vịt ở Cần Thơ và theo kết quả chẩn ựoán lâm sàng bệnh dịch tả vịt vào năm 2000-2002 của chắnh tác giả và cộng sự thì trên 1176 vịt ựược mổ khám

có 455 vịt ựược chẩn ựoán là mắc bệnh dịch tả vịt

Theo thống kê của OIE (2006), Việt Nam là một trong những nước bị bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất Năm 1999, bệnh ựã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt Năm 2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết 15.680 con và năm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 7

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 8

1.1.2.1 Hình thái, kắch thước

Virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa Về kắch thước, virus hoàn chỉnh (có màng nhân bao quanh) có ựường kắnh trung bình 60nm Virus chưa hoàn chỉnh (không có màng nhân bao quanh) có ựưòng kắnh trung bình là 100nm Virus có ựường kắnh tăng dần khi cấu trúc dần ựược hoàn thiện ở những tế bào ựược gây nhiễm virus, sau

24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi Trong nhân, hạt virus có ựường kắnh

là 93,5 nm; trong nguyên sinh chất là 136 nm và thành thục ở không bào với ựường kắnh 250 nm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 9

Theo Trần Minh Châu (1980) ở Việt Nam, virus dịch tả vịt cường ñộc chủng 769 có hình thái và cấu trúc giống như virus mà Proctor S.M., Pearson G.L., Leibovitz L (1975) ñã mô tả

Virus dịch tả vịt qua ñược lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua ñược màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc, Hess và Dardini (1968) ñã nhận xét, virus dịch tả vịt nhược ñộc chủng Jansen và virus cường ñộc có kích thước 150 - 250 nm

1.1.2.2 Sức ñề kháng

Với nhiệt ñộ, ở 220C virus giảm dần tính gây nhiễm ñến 30 ngày thì chết Virus bị mất hoạt tính ở 500C sau 2 giờ 30 phút Nếu ñược sấy khô bằng CaCl2 thì sau 9 ngày virus bị chết (Hess, 1968) Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) ở 00C - 40C virus không bảo quản ñược 3 tháng nhưng ngâm trong dung dịch Glyxerin 50% thì virus giữ ñược ñộc lực trong thời gian trên Theo Nguyễn Như Thanh (2001) trong ñiều kiện lạnh từ -100C ñến -200C, virus có thể tồn tại rất lâu Làm ñông khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm mà còn không làm mất ñộc lực của virus

Với pH môi trường, virus ổn ñịnh ở pH từ 5-10 và bị bất hoạt khi pH <

3 hoặc pH > 10 Với một số nhân tố hoá học, virus dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform Dưới tác dụng của 2 chất này, virus bị phá huỷ Kunst (1967) cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh hưởng tới virus Theo Nguyễn Thát (1975) thì cồn 750 diệt virus trong 5-

30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút NaOH 2% và NH4OH 0,5%

ở 220C cũng giết chết virus sau 30 phút

Với một số enzym, virus dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tuỵ phá huỷ (Dardini A.H and W.R Hess, 1968)

Ở môi trường ngoài, với ñiều kiện nhiệt ñộ phòng thí nghiệm, virus

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 10

có thể tồn tại tới 30 ngày (OIE, 2006) Trong ựiều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài, 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt nó vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987)

1.1.2.3 độc lực

đã xác ựịnh ựược một số chủng virus dịch tả vịt có ựộc lực khác nhau:

- Hà Lan có chủng O ựộc lực mạnh nhất, sau ựó ựến các chủng W59, W60, N (Jansen, 1968)

- Việt Nam có chủng 769, 880 có ựộc lực mạnh nhất, sau ựó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987)

Nguyễn đức Hiền (2005) phân lập một chủng virus gây bệnh dịch tả vịt

ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có ựộc lực cao, có khả năng gây bệnh

và gây chết vịt ở phòng thắ nghiệm khi tiêm bắp với liều 103ELD50/ml

Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc điểm (2005) cũng ựã phân lập thành công chủng virus cường ựộc dịch tả vịt VG-2004 Qua bước ựầu khảo sát ựặc tắnh sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-

2004 có ựộc lực mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập

1.1.2.4 đặc tắnh nuôi cấy

Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu Trong tế bào phôi gà, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình thành Plague Khi có mặt bổ thể, kháng thể dịch tả vịt có khả năng làm tan tế bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus

* Nuôi cấy trên phôi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 11

Theo Jansen (1968) virus dịch tả vịt sau khi ñã tiêm truyền trên phôi vịt

sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi gà Tuy vậy, khi nuôi cấy trên phôi vịt, tỷ lệ chết của phôi không cao và theo kinh nghiệm thì virus dịch tả vịt của Việt Nam có vẻ như khó nuôi cấy trên phôi gà (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Về khả năng nhân lên trên phôi của virus dịch tả vịt, Trần Minh Châu (1980) cho rằng màng nhung niệu là ñường tiêm truyền tốt nhất Theo Nguyễn Như Thanh (2001), nuôi cấy virus trên màng niệu ñệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, ñầu, gan và quả tối có ñiểm xuất huyết

và hoại tử Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày

Virus dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3-5 ngày Virus cường ñộc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền ñầu tiên trên phôi gà ðối với phôi gà 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 ñời liên tiếp virus mới thích nghi

Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà ñộc lực của virus

sẽ giảm dần với vịt Người ta sử dụng những chủng virus nhược ñộc này qua phôi gà, phôi vịt ñể chế tạo vacxin

* Nuôi cấy trên tế bào

Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi

gà một lớp và gây ra biến ñổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) Burgess (1981) công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến ñổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 12

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường ñộc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải ăng ten Lớp tế bào này sẽ bị phá huỷ hoàn toàn vào ngày thứ 4

Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng ñộ loãng, có thể phát hiện ñược Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc ñỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền ñỏ, hình tròn, bờ không gọn và có ñường kính 1-2 mm (Trần Minh Châu, 1987)

Theo Dardini và Hess (1968) Plague của virus dịch tả vịt cường ñộc hình tròn, to nhỏ không ñều, có ñường kính từ 1-8 mm Plague của virus dịch tả vịt nhược ñộc thì ñều hơn, có bờ gọn và sáng, ñường kính là 3-4 mm Nguyễn Như Thanh (2001) mô tả, với các chủng virus nhược ñộc, Plague ñều, gọn và sáng rõ, ở ngày thứ 3 có ñường kính 3 mm, sau 6 ngày là 4-7 mm và sau 14 ngày sẽ là 10 mm

Sự xuất hiện Plague trên các môi trường nuôi cấy khác nhau là khác nhau Virus cường ñộc thì nhân lên và hình thành các Plague ñẹp theo thứ tự các môi trường sau: tế bào xơ phôi ngan và uyên ương, xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt ñen, vịt ñầu ñỏ; còn Plague trên tế bào xơ phôi vịt mốc và vịt bãi là kém nhất Virus dịch tả vịt nhược ñộc của Hà Lan lại có thứ tự các môi trường thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi gà, trĩ Mông Cổ, cun cút (Ronald Atlanasio, Robert Olson, James C Johnson, 1980) (Trần Minh Châu, 1987) ðối với virus nhược ñộc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi trường tế bào xơ phôi gà Chỉ sau 24 giờ nuôi cấy virus, tế bào ñã bắt ñầu có hiện tượng huỷ hoại Tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 13

trung thành từng ñám và có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học (Nghiên cứu của bộ môn VSV-TN trường ðHNNHN)

* Nuôi cấy trên ñộng vật cảm thụ

Có thể dùng vịt 1 ngày tuổi ñể nuôi cấy virus 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích ñiển hình của bệnh Hoặc ngan, ngỗng, gà con mới nở

1.1.3 Truyền nhiễm học

1.1.3.1 Loài mắc bệnh

Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt ñầu

ñỏ, … Các loài thuỷ cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Friend, 1973), (Docherty D.E & Franson C.J., 1992) Vịt là loài cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi ñều có thể mắc bệnh Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết có thể lên tới 100% Mức ñộ cảm nhiễm có thể khác nhau tùy theo giống vịt Loài vịt nhọn ñuôi ñược coi là

ít cảm nhiễm nhất ñối với bệnh (Sandhu T.S & Leibovitz L., 2003) Theo Vandorssen (1955) thì trong họ Anatideae, chỉ loài vịt xám ñược coi là ñề kháng với bệnh Các ñộng vật khác như bồ câu, công và ñộng vật có vú không cảm thụ với bệnh

Kaleta EF & cs (2007) cho biết tại vụ dịch ở châu Âu vào năm 2005, ngoài 34 loài thuộc bộ Anseriformes còn có thêm 14 loài thuỷ cầm cảm nhiễm với bệnh dịch tả vịt

Trong phòng thí nghiệm, vịt con là ñộng vật thí nghiệm cảm nhiễm nhất ñối với bệnh Virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968)

1.1.3.2 Mùa vụ phát bệnh

Bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4-6 Sự bùng nổ dịch bệnh phụ thuộc vào ñiều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh hưởng của nhân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 14

tố stress (Sarmah R & Sarmah A.K., 1996)

Theo Phạm Sỹ Lăng (2002), ở Việt Nam, bệnh dịch tả vịt xảy ra quanh năm nhưng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu hoạch lúa: Vụ chiêm tháng 5-6, vụ mùa tháng 10-11

1.1.3.3 Lứa tuổi mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt từ 15 ngày tuổi trở ñi bị nhiễm nhiều nhất (Nguyễn Xuân Bình, 2006)

1.1.3.4 Chất chứa virus

Ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất

là ở gan, lách và óc Tại Việt Nam ñã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt bị gây nhiễm nhân tạo Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, virus ñã nhân lên, xâm nhập vào máu nhưng số lượng còn ít ðến 48 giờ, virus ñã xuất hiện trong nước mắt, nước mũi Và ñến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt ñầu ỉa chảy thì tế bào niêm mạc ñường tiêu hoá do tác ñộng của virus bị huỷ hoại, tróc ra cùng với dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987) Vịt bệnh mang virus rất lâu và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính Người ta có thể phát hiện bệnh bằng kiểm tra nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi vịt

Shawky S., Schat K.A (2002) cho biết virus dịch tả vịt có thể tiềm tàng trong cơ thể vịt và có khả năng tái hoạt ñộng trở lại Sau 3 tuần gây nhiễm không tìm thấy virus dịch tả vịt trong lỗ huyệt nhưng 7-9 tuần sau gây nhiễm, bằng phản ứng PCR, tác giả ñã phát hiện thấy DNA virus dịch tả vịt trong thần kinh trung ương, hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức và túi Bursa

1.1.3.5 ðường xâm nhập và cách lây lan

Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi

Trong tự nhiên, ñường xâm nhập chủ yếu của virus dịch tả vịt là ñường

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 15

tiêu hoá Vịt bệnh bài xuất căn bệnh theo phân, nước mắt, nước mũi làm ô nhiễm thức ăn nước uống và bệnh lây lan sang vịt khoẻ và các ñộng vật cảm nhiễm khác Jansen (1964) cho biết, nguồn nước và các ñộng vật thuỷ sinh trong ñó cũng ñóng vai trò nhất ñịnh trong việc truyền lây căn bệnh Khi dịch xảy ra, việc bán chạy vịt bệnh, mổ thịt vịt ốm ñều làm cho bệnh lan ñi rất nhanh và xa Bệnh lây lan rất nhanh và mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess E.C & TM Yuill, 1981)

1.1.4 Triệu chứng và bệnh tích

1.1.4.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh ñối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần ñầu tiên xảy ra hay ñã từng xảy ra ñối với ñàn vịt

Ở ñàn vịt con bệnh thường bắt ñầu bằng những dấu hiệu: Nhiều con tự nhiên lờ ñờ, không thích vận ñộng, không muốn xuống nước ở vịt lớn khi lùa

ăn một số con rớt lại sau ñàn Bắt xem thấy chân có dấu hiệu liệt, thân nhiệt cao ở ñàn vịt ñẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống, có khi ngừng ñẻ hẳn

Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, ñứng một chân, ñầu rúc vào cánh Trong ñàn vịt nhiều con có tiếng kêu khản ñặc Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt ñỏ Lúc ñầu chảy nhiều nước mắt làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt Sau nước mắt ñặc lại có màu vàng như mủ ñóng ñầy khoé mắt và có khi làm 2 mi mắt dính lại với nhau Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc ñầu trong, sau ñặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi Nhiều con ñầu sưng to, sờ nắn có cảm giác ñầu mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 16

thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết ñầy phân (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác ñáng chú ý như: Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh Vịt tì mỏ xuống ñất Vịt ñực bị

sa dương vật, niêm mạc có những vết loét Vịt ñẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm Quang Hùng, 2003) Sau khi xuất hiện triệu chứng ñược 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy rạc, tứ chi liệt, nằm một chỗ, rũ cánh, thân nhiệt giảm dần rồi chết

1.1.4.2 Bệnh tích

Xác chết gầy, bẩn; da vùng ñầu, cổ, ngực, bụng, ñùi xuất huyết lấm tấm Tổ chức liên kết dưới da vùng ñầu, cổ thuỷ thũng, có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng Mổ khám các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ tim thì thấy ở các cơ quan này ñều biểu hiện bệnh tích sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những ñiểm hoại tử màu trắng ñục, to bằng ñầu ñinh ghim hoặc to hơn (Trần Kim Anh, 2004)

Bệnh tích ñặc trưng là ở ñường tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài vào thấy

có màu nâu hoặc tím rất ñặc trưng (Trần Minh Châu, 1996)

Phạm Quang Hùng (2003) cho biết ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những ñặc trưng riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết

mô và tổn thương bộ máy sinh sản Còn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các Lymphoid

Nguyễn ðức Hiền (2005) công bố tỷ lệ bệnh tích ñặc trưng trên vịt thực nghiệm, trong ñó: Niêm mạc mắt xuất huyết (95,45%); phổi viêm, tụ máu, thuỷ thũng (95,45%); dạ dày tuyến xuất huyết (100%); ruột non xuất huyết

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 17

viêm loét (100%); ruột già xuất huyết viêm loét (97,73%); lách tụ máu cĩ nốt hoại tử và gan xuất huyết cĩ nốt hoại tử (100%)

1.1.5 Chẩn đốn

ðể chẩn đốn bệnh dịch tả vịt cĩ nhiều phương pháp được sử dụng, dưới đây là sơ đồ chẩn đốn bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nơng nghiệp và phát triển nơng thơn 10 TCN 815-2006

1.1.5.1 Chẩn đốn lâm sàng

Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, bệnh sử và truyền lây của bệnh như: Bệnh xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi; bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày

Kiểm tra triệu chứng: Vịt giảm ăn, mất thăng bằng, ỉa phân lỗng, xù lơng Mắt vịt cĩ dử, mí mắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi

Kiểm tra bệnh tích: Vịt trưởng thành cĩ hiện tượng gan bị bạc màu Con đực trưởng thành cĩ thể xảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí ở con cái quan sát thấy các nang trứng bị xuất huyết Mạch máu bị tổn thương, tổn thương hệ bạch huyết, thối hố nhu mơ, ống tiêu hố cĩ nhiều chất nhờn ðối với bệnh tích vi thể thấy xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các biểu mơ của hệ thống tiêu hố

Chẩn đốn phân biệt bệnh dịch tả vịt với một số bệnh sau:

Bệnh viêm gan do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1-3 tuần tuổi Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt, ít cĩ hiện tượng hoại tử

Bệnh tụ huyết trùng và phĩ thương hàn: Do Pasteurella và Salmonella gây nên ðây là những vi khuẩn thường trú trong cơ thể vịt, ngay cả ở vịt khoẻ Cho nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khĩ khăn cho việc chẩn đốn bệnh Tuy nhiên nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phĩ thương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 18

hàn ñơn thuần thì khi ñiều trị bằng kháng sinh ñặc hiệu có thể nhanh chóng dập tắt dịch

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19

- Ly tâm 2.000 vòng/15ph

- Lấy dịch trong ở trên

- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc thạch máu

b Phân lập virus

* Phân lập trên vịt con

Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm ñã ñược xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích ñặc trưng của bệnh dịch tả vịt giống như ñã mô tả ở phần 2.1.3

* Phân lập trên trứng vịt có phôi

- Tiêm 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý vào xoang niệu mô hoặc màng nhung niệu phôi vịt 11-12 ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm

- Trứng ñược ấp tiếp ở tủ ấp 370C Soi trứng Loại bỏ những phôi chết

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 20

trong khoảng 24h sau khi tiêm

- Virus dịch tả vịt gây chết phôi sau 4-10 ngày với ñặc trưng: Xuất huyết lan rộng

- Thu hoạch gan phôi và nước niệu ñể giám ñịnh virus

* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc ñĩa nuôi cấy (ñĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập

- Quan sát bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): ñặc trưng với ñám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau ñó

- Thu hoạch hỗn dịch tế bào, ñông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám ñịnh virus

c Phương pháp giám ñịnh virus

* Phương pháp trung hoà trên trứng vịt có phôi (VN-Virus Neutralization):

- Chuẩn bị:

+ Pha loãng virus phân lập: Nồng ñộ 10-1-10-9 với dung dịch PBS + Lô ñối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với các nồng ñộ virus ñã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô ñối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng ñộ virus ñã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ ủ hỗn hợp trên ở nhiệt ñộ 370C/1h

- Tiến hành:

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 21

+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng ựộ

+ Phôi ựược ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngày Loại bỏ những phôi chết trước 24h

+ Phôi chết trong 4-10 ngày, có bệnh tắch còi cọc, xuất huyết lan rộng

- đánh giá kết quả:

+ Tắnh toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu kết quả phân lập và giám ựịnh dương tắnh với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp trung hoà VN), kết luận có virus dịch tả vịt

* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):

- Chuẩn bị:

+ Tế bào DEF trên ựĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ ựã nuôi cấy ựược 2-3 ngày + Pha loãng virus phân lập: các nồng ựộ 10-1-10-9 với môi trường MEM + Lô ựối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tắnh dịch tả vịt với các nồng ựộ virus ựã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô ựối chứng âm: trộn huyết thanh âm tắnh với các nồng ựộ virus ựã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

- Tiến hành:

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào ựĩa ựã nuôi cấy tế bào DEF (ựĩa 96 lỗ), 100ộl/lỗ, 8 lỗ/nồng ựộ

+ ủ ựĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h

+ đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100ộl/lỗ

+ Tiếp tục ủ ựĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 22

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co tròn và tụ lại thành ựám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử

- đánh giá kết quả:

+ Tắnh toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu thuỷ cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hoà SN), kết luận thủy cầm ựã nhiễm virus dịch tả vịt

1.1.5.3 Chẩn ựoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Năm 1999, Pritchard L.I & cs ựã phát triển phương pháp PCR ựể phục

vụ cho việc phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chắnh xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khắ quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở ngỗng

Phương pháp PCR hay phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt ựộ, dựa trên nguyên tắc sử dụng ựoạn mồi chuyên biệt ựể tổng hợp nên một mạch DNA mới bổ sung với ựoạn DNA khuôn mẫu Phương pháp PCR dựa trên hoạt ựộng của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới tử mạch khuôn Tất cả những DNA polymerase ựều cần những ựoạn mồi, là những ựoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một ựầu của mạch khuôn đoạn mồi này sau ựó sẽ ựược nối dài ra nhờ hoạt ựộng của DNA polymerase ựể hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003); (Võ Thị Thương Lan, 2002)

Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia:

1) DNA làm khuôn;

2) Hai ựoạn mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược);

3) Enzym DNA-polymerase chịu nhiệt;

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 23

4) Môi trường ñệm cung cấp ion Magiê (Mg++);

5) Phần nucleotid ở dạng deoxynucleotid (ký hiệu dNTP);

6) Nước tinh khiết

Có 3 giai ñoạn (ba bước ñiều chỉnh nhiệt ñộ) cho 1 chu kỳ:

1) Bung liên kết của DNA: ðược thực hiện ở nhiệt ñộ 90°C- 98°C trong vài giây ñến vài phút, các phân tử DNA xoắn kép sẽ bị tách ra, tạo nên các sợi ñơn dùng ñể làm khuôn cho các ñoạn mồi bám vào và enzym DNA- polymerase xúc tác tổng hợp

2) Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi): Nhiệt ñộ ñược hạ xuống 37- 68°C, ñể các ñoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn

3) Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài): Nhiệt ñộ ñược nâng lên 68°C- 72°C trong vài chục giây ñến vài chục phút, ñể các sợi DNA vừa ñược tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA sợi kép, chính là sản phẩm PCR

Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25- 35- 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối cùng, có một chu kỳ bổ sung ñược duy trì ở nhiệt ñộ 72°C trong 5- 10 phút sao cho tất cả các sợi ñơn DNA mới xoắn lại, tạo nên sản phẩm PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA Cuối cùng, nhiệt ñộ hạ xuống 4°C ñể bảo quản sản phẩm Kết quả là từ một ñoạn DNA bất kỳ có thể ñược nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần (2n sau n chu kỳ) mà không cần ñến tế bào sinh vật

Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA ñược kiểm tra bằng cách chạy ñiện di trên thạch agarose nồng ñộ 0,8%-2%,

Kỹ thuật ñiện di trên gel là hết sức quan trọng ñối với người làm kỹ thuật di truyền, vì ñó là cách chủ yếu làm cho các ñoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một ñặc tính là các phân tử acid nucleic ở

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 24

pH trung tính, chúng tích ñiện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic Khi ñặt chúng vào ñiện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch ñặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc ñộ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn Kiểu loại gel dùng trong ñiện di có tác dụng rất quan trọng ñối với mức ñộ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel ñược sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid Agarose ñược chiết xuất từ tảo biển, có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt ñộ trên 45°C, trong dung dịch ñệm ở nồng ñộ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v) Khi làm nguội (dưới 45°C), agarose ñông lại thành gel Gel agarose thường ñược dùng ñể chạy trong máy ñiện di Gel polyacrylamid thường ñược dùng ñể phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn ðiện di ñược thực hiện bằng cách ñưa các mẫu acid nucleic vào gel và ñặt một ñiện áp vào ñó Trạng thái ñó ñược duy trì cho ñến khi chất nhuộm ñánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi ñưa vào gel chạy tới ñầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh ñược và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và ñược quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại Kích thước các băng DNA ñược so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) ñược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002)

Theo Vũ Minh Thục (2004), nhược ñiểm chính của phương pháp PCR

là sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả

“dương tính sai”, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999)

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 25

đã khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đã được kiểm tra với bộ gen khuơn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gà, Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn khơng cho sản phẩm ðiều này

cĩ nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt Với hai đoạn mồi sẽ cĩ khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đốn bệnh dịch tả vịt bằng nuơi cấy tế bào

1.1.6 Biện pháp can thiệp và phịng bệnh dịch tả vịt

1.1.6.1 Biện pháp can thiệp

Bệnh dịch tả vịt là bệnh chưa cĩ thuốc điều trị đặc hiệu Biện pháp tốt nhất nên giết chết và chơn sâu những vịt bị bệnh quá nặng hoặc chết Tuy nhiên, với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì cĩ thể can thiệp bằng cách vacxin nhược độc cho tồn đàn với liều gấp 2 – 3 lần liều sử dụng Những vịt nào đã bị nhiễm virus thì sẽ phát bệnh ngay, cịn những vịt chưa bị nhiễm virus sẽ được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sĩc đàn vịt tốt thì cĩ thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980) Nên tăng cường thêm các biện pháp chăm sĩc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt

Theo Archie Hunter (2002) nếu cĩ ổ dịch xảy ra, vịt khoẻ mạnh cĩ tiếp xúc với mầm bệnh phải được tiêm phịng vì vịt phát triển miễn dịch chỉ trong một ngày sau khi tiêm phịng

1.1.6.2 Phịng bệnh

* Vệ sinh phịng bệnh

ðối với những nơi chưa cĩ bệnh tốt nhất nên tự túc con giống Khi tạo đàn khơng nên nhập chung nhiều đàn nhỏ lại Lị ấp trứng cũng khơng nên ấp trứng của quá nhiều đàn Sau mỗi lần ấp trứng cần tẩy uế lị ấp rồi sát trùng kỹ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 26

bằng hơi formol (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Lê Hồng Mận (2005) khuyến cáo: Không chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi

có nhiều nguồn nước chảy tới ñể ñề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước Tuyệt ñối không cho các loại gia cầm, thuỷ cầm khác vào trại Nên tẩy uế sát trùng ñịnh kỳ chuồng nuôi

Phạm Quang Hùng (2003) nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ sinh như sau:

- Chuồng trại vịt cách xa khu dân cư Cổng trại phải có hố sát trùng (thường sát trùng bằng Cloramin 3%) Hạn chế người ñi lại, người ra vào trại phải sát trùng giày dép, tay chân

- ðiều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ Thức ăn, nước uống phải vệ sinh Thực hiện tiêu ñộc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại

- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ

* Tiêm phòng bằng vacxin

- ðể phòng bệnh dịch tả vịt có 2 loại là vacxin vô hoạt và vacxin nhược ñộc

+ Vacxin vô hoạt:

ðể vô hoạt virus dịch tả vịt, trước ñây thường dùng hoá chất là formol, gần ñây sử dụng chất BPC (õ propiolactone) Tại Việt Nam ñã chế thử vacxin

vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan Theo OIE (2000) vacxin vô hoạt tạo ñược miễn dịch cho ñàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược ñộc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa ñược áp dụng trong sản xuất

+ Vacxin nhược ñộc:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27

Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus nhược ñộc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt và virus dịch tả vịt chủng Jansen thích nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp ðây là 2 loại vacxin có ñộ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin ñược chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin ñông khô (Lê Hồng Mận 1999)

+ Theo Quyết ñịnh số 63/2005/Qð-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn việc tiêm phòng vacxin bắt buộc ñối với bệnh dịch tả vịt gồm:

ðối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi

Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia ñình trong phạm vi cả nước

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28

Tiêm phòng ñịnh kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi

Liều lượng, ñường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin

+ Với ñàn vịt bố mẹ ñược tiêm vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, Nguyễn Xuân Bình (2006) cho rằng không cần tiêm cho vịt con trước 2 tuần tuổi Do trong thời gian này, vịt con vẫn còn tồn tại kháng thể ñược truyền qua lòng

ñỏ trứng nên có khả năng xảy ra phản ứng trung hoà làm giảm hiệu lực của vacxin

1.1.6.3 Một số thông tin về vacxin dịch tả vịt ở Việt Nam

Năm 1969, chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt ñã ñược sử dụng ñể sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam Khi nuôi cấy trên phôi vịt, virus gây bệnh tích phôi ổn ñịnh, thời gian chết phôi trung bình là 100 ± 24 giờ Trong nước niệu nang, hàm lượng virus có ELD50 lúc 72 giờ là 10 -4,75/0,2 ml Vacxin khi sử dụng pha 1/200 tiêm vào dưới da cho vịt con với liều 0,2 ml/con và tiêm cho vịt lớn với liều 1 ml/con Vacxin tạo ñược miễn dịch tốt cho ñàn vịt Vịt con 1 ngày tuổi sau khi tiêm vacxin ñược bảo

hộ chắc chắn 100% ñến 45 ngày tuổi, vịt lớn kéo dài miễn dịch tới 9 tháng

Trần Minh Châu (1987) ñã nghiên cứu chủng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà Tác giả cho biết, chủng virus này gây chết phôi gà rất ổn ñịnh, thời gian chết phôi 72-120 giờ Virus vacxin có ELD50 từ 10-3,31/0,2 ml ñến 10-4,5/0,2 ml Vacxin khi sử dụng an toàn cho vịt nhưng về hiệu lực cần nghiên cứu thêm Tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vô hoạt và ñưa ra kết luận: Vacxin vô hoạt cũng tạo ñược miễn dịch cho ñàn vịt nhưng ñáp ứng miễn dịch không mạnh mà giá thành lại cao

Lê Văn Lãnh (1991) nghiên cứu ñặc tính sinh học của virus vacxin dịch

tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn ñịnh khi nuôi cấy trên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29

phôi gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp; chỉ số ELD50 biến ñộng trong khoảng từ

10-3,31/0,2 ml ñến 10-3,36/0,2 ml; CPE50 biến ñộng từ 10-4,36 ñến 10-4,54 Vacxin

an toàn cho mọi lứa tuổi vịt, hiệu lực của vacxin cao Vacxin ñược chế biến dưới 2 dạng là vacxin tươi và vacxin ñông khô

Vacxin tươi thường ñược ñóng ở ampoul 100 liều, chỉ bảo quản tối ña

là 4 tháng ở kho lạnh và phải dùng không quá 6 giờ khi ñã pha loãng vacxin bằng nước sinh lý Vacxin ñông khô thì thời gian bảo quản dài hơn (khoảng

1 năm) và ít bị mất hiệu lực khi gặp ñiều kiện bất lợi Vacxin ñông khô có thể ñóng ampoul 100 liều hoặc chai có từ 500-1000 liều (Nguyễn Như Thanh, 2001) Tuỳ theo liều ñóng vacxin mà pha loãng với nước sinh lý ñủ cho 0,2ml/vịt con và 0,3-0,5ml/vịt lớn ðường tiêm chủ yếu là dưới da hoặc bắp lườn

Nguyễn ðức Hiền (1999) nghiên cứu và kết luận phương pháp nhỏ mắt hoặc tiêm bắp hoặc kết hợp cả hai ñều cho ñáp ứng miễn dịch tương ñối giống nhau và ñạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%

Nguyễn Ngọc Huân (2006) khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt ñông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi

ở nông hộ

Theo Quyết ñịnh số 04/2006/Qð-BNN ngày 12 tháng 01 năm 2006 công bố danh mục vacxin, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hoá chất dùng trong thú y ñược phép lưu hành tại Việt Nam thì tại Việt Nam ñang lưu hành 2 dòng sản phẩm vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ñều ở dạng ñông khô ñóng lọ từ 100 ñến 1000 liều mang số ñăng ký TW-XI-14 và TW-IV-5

Từ năm 2000 ñến nay, bộ môn VSV-TN, Khoa Thú Y trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã và ñang có những nghiên cứu về việc chế tạo vacxin mới với chủng virus cường ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 có xuất xứ từ nước

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30

ngoài Những kết quả thử nghiệm ban ựầu khá khả quan, dần ựáp ứng ựược yêu cầu trong nghiên cứu và sản xuất

1.2 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt

1.2.1 đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu

Khả năng ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của vịt ựối với virus dịch

tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không ựặc hiệu, bao gồm:

* Interferon: Là một chất do tế bào sinh ra có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông ựiệp của virus ở Ribosome của tế bào (Nguyễn đường, 1990)

Jansen (1968) khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản nhiễm ựã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt ựã bị nhiễm virus dịch tả vịt cường ựộc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường ựộc dịch tả vịt trước 4 giờ thì trong 10 vịt ựược can thiệp bằng vacxin

sẽ sống 8 con Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus trước 8 giờ, 15 vịt phát bệnh nhưng còn sống 3 con Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù tiêm vacxin vịt vẫn không ựược bảo hộ Như vậy rõ ràng interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus dịch tả vịt và hiện tượng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch ựể nhanh chóng dập tắt dịch

* Tế bào NK: Tăng cường hoạt ựộng diệt những tế bào ựã bị nhiễm virus do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào ựắch (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tắn hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào ựắch (Vũ Triệu An, 1997)

* Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh Từ ựó tạo ựiều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và