Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả năng probiotic, sinh tổng hợp gamma - aminobutyric acid và ứng dụng

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯƠNG MINH KHẢI NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG PROBIOTIC, SINH TỔNG HỢP GAMMA - AMINOBUTYRIC ACID VÀ ỨNG DỤNG LUẬN VĂ

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

DƯƠNG MINH KHẢI

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG PROBIOTIC, SINH TỔNG HỢP GAMMA - AMINOBUTYRIC ACID VÀ ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã Số: 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học 1 : TS Nguyễn La Anh

Người hướng dẫn khoa học 2 : GS.TS Nguyễn Quang Thạch

Hà Nội – 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cám ơn và các thông tin ñược trích dẫn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, gia ñình, bạn

bè, ñồng nghiệp và người thân

Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn La Anh – Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm ñã tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này

ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn GS.TS Nguyễn Quang Thạch - Viện Sinh học Nông nghiệp - ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp ñỡ và chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, tập thể lớp K20-CNSHA, và các anh chị em trong Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh- Viện Công nghiệp thực phẩm

Cảm ơn gia ñình ñã tạo ñiều kiện về thời gian ñể tôi hoàn thành khoá luận này

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Dương Minh Khải

1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

1.2.5 Ứng dụng của chế phẩm probiotic trong bảo vệ sức khỏe con người 19

1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lac tic trong sản xuất lên men sữa chua 31

PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA 38 2.3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng probiotic 39

2.3.5 Kiểm tra khả năng sử dụng ñường của vi khuẩn lactic 45 2.3.6 Xác ñịnh mật ñộ tế bào bằng phương pháp ñếm khuẩn lạc 46 2.3.7 Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC (Thin layer chrotomagraphy) 47 2.3.8 Phương pháp ñịnh tên bằng trình tự 16S rDNA chủng NCTH24 48 2.4 Qui trình làm sữa chua sinh học bio – yorgurt trong thí nghiệm 49

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA 52 3.2 đánh giá khả năng probiotic của chủng vi khuẩn lactic NCTH24 56 3.2.1 Khả năng sống sót trong dịch dạ dày của chủng vi khuẩn NCTH24 56 3.2.2 Khả năng sống sót trong dịch mật của chủng NCTH24 57 3.2.3 Phổ tương tác với một số kháng sinh của chủng NCTH24 59 3.2.4 Xác ựịnh khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 61 3.3 Nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và ựịnh tên chủng NCTH24 62 3.3.1 Nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái của chủng NCTH24 62 3.3.2 Các ựặc ựiểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn NCTH24 63

3.3.4 Nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học phân tử của chủng NCTH24 64 3.4 Nghiên cứu ựiều kiện lên men tạo sinh khối 66 3.4.1 Khảo sát thành phần cacbon phù hợp cho lên men sinh khối 66

3.4.3 Lựa chọn nguồn nitơ phù hợp cho lên men sinh khối 69 3.4.4 Lựa chọn nồng ựộ nitơ phù hợp cho lên men sinh khối 70 3.5 Ứng dụng thử nghiệm sản xuất sữa chua sinh học có chứa GABA 72 3.5.1 Khả năng sinh GABA của sữa bio-yogurt sau 45 ngày bào quản 73 3.5.2 Xác ựịnh bán ựịnh lượng GABA trong thời gian bảo quản 74

Bảng 12: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng NCTH24 64 Bảng 13: Kết quả xác ñịnh trình tự gen 16S rDNA của chủng NCTH24 66 Bảng 14 Thành phần nguồn nitơ trong môi trường lên men chủng NCTH24 69

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hai con ñường chính lên men glucose của vi khuẩn lactic 7

Hình 4: Quy trình thử nghiệm làm sữa chua sinh học bio-yogurt 50 Hình 5: Một số hình ảnh ñịnh tính GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 55 Hình 6: Hình ảnh bám dính tế bào NCTH24 trên màng nhầy ruột invitro 59 Hình 7: Hình ảnh phổ tương tác chủng NCTH24 với một số loại kháng sinh 61 Hình 8: Hình thái vi khuẩn chụp NCTH24 chụp bằng SEM 62 Hình 9: Khảo sát nguồn cacbon ñến sự phát triển NCTH24 67 Hình 10: Ảnh hưởng nồng ñộ ñường glucose ñến sự phát triển của NCTH24 67 Hình 11: Khảo sát tỷ lệ tiếp giống trên chủngNCTH24 68 Hình 12: Khảo sát nguồn nitơ ñến sự phát triển chủng NCTH24 70 Hình 13 : Ảnh hưởng của nồng ñộ nitơ ñến sự phát triển NCTH24 71 Hình 14: Mật ñộ tế bào NCTH 24 trong sữa chua theo thời gian bảo quản 72 Hình 15: Mẫu sữa chua trang cấy kiểm tra mật ñộ tế bào ở 45 ngày 73 Hình 16: Khả năng sinh GABA của chủng NCTH24 trong sữa chua sinh học 73 Hình 17: Ảnh chụp kết quả bán ñịnh lượng GABA ở các ngày khác nhau 75

BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

ATP Adenosine 5’- triphosphate

Bio-yogurt Sữa chua sinh học

DNA Acid Deoxyribo Nucleic

BMI Body Mass Index

EMP Embden-Meyerhof-Parnas path way

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration

FOSHU Food for Specialized Use

GABA Gama - aminobutyric acid

GAD Glutamic acid decarboxylase

GRAS Generally Recognized as Safe

HGH Human growth hormone

LAB Lactic acid bacteria

MSG Monosodium glutamate

MRS De Man, RoGoSa and Sharbe

NEC Necrotizing enterocolitis

NB Nutrient broth

PP Pentose phosphat

PMS Premenstrual syndrome

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SG Sodiumglutamate

SSADH Semialdehyde succinic dehydrogenase

TLC Thin layer chrotomagraphy

VLBW Very low birth weight

WHO World Health Organization

BẢNG VIẾT TẮT CÁC LOẠI KHÁNG SINH

CLI : Clindamycin CHL: Chloramphenicol ERY: Erythromycin CEP: Cefoperzone CTR: Ceftriaxone PEN: Penicillin CAZ: Ceftazidime PB: Polymycin B GEN: Gentamycin STR: Streptomycin OFL: Ofloxacin AZI: Azithromycin

MỞ ðẦU

I ðặt vấn ñề:

Vi khuẩn lactic ñã ñược ứng dụng nhiều trong sản xuất, bảo quản thực phẩm ñặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt, rau quả Ngày nay, vi khuẩn lactic còn ñược ứng dụng cho sản xuất các sản phẩm probiotic, các sản phẩm chức năng, thực phẩm có lợi cho sức khỏe

Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA còn có khả năng probiotic khi chúng sống sót qua dạ dày- ruột, và ở ñây chúng có tác dụng hộ trợ hệ tiêu hóa và sinh

tổng hợp GABA in situ [30] Một trong các hướng ứng dụng LAB sinh GABA

có khả năng probiotic là làm sữa chua sinh học (bio-yogurt) Có nhiều phương pháp sản xuất sữa chua sinh học, nhưng khá phổ biến là lên men sữa bởi chủng giống khởi ñộng thông thường và bổ sung sinh khối vi khuẩn probiotic vào giai ñoạn sau lên men [24] Yêu cầu của các sản phẩm probiotic ứng dụng trong sữa chua sinh học là mật ñộ tế bào sống của chủng LAB phải ñạt ít nhất 106 CFU/g, tồn tại trong thời gian sử dụng sản phẩm

Gần ñây việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng

hợp GABA ñược quan tâm rộng rãi bao gồm một số chủng Lactobacillus (Lb), Lactococcus (Lc.) và Lactobacillus Brevis… ñược phân lập từ nhiều loại thực

phẩm lên men, bao gồm kim chi Hàn Quốc, paocai và sữa tươi Trung Quốc, shochu của Nhật Bản [16, 22, 40]…vv Những sản phẩm chứa GABA tự nhiên này ñược xác ñịnh là an toàn và thân thiện với môi trường qua bề dầy lịch sử lâu ñời của chúng và gần ñây ñược chứng minh là có lợi cho sức khỏe [24]

Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn probiotic Lactobacillus brevis

NCTH24 có khả năng sinh tổng hợp GABA ñược ứng dụng thử nghiệm ñể làm bio-yogurt ( sữa chua sinh học) Chủng này ñược phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống là nem chua Thanh Hóa Các nghiên cứu về ñặc ñiểm chủng giống

và khả năng tồn tại trong sữa chua ñã ñược khảo sát Xuất phát từ các vấn ñề nêu

trên em thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả năng probiotic, sinh tổng hợp Gamma- aminobutyric acid và ứng dụng”

II Mục ñích và yêu cầu và ý nghĩa của ñề tài

1 Mục ñích

Tuyển chọn ñược chủng vi khuẩn lactic có ñặc ñiểm phù hợp làm probiotic, sinh tổng hợp GABA và có tiềm năng ứng dụng trong làm sữa chua sinh học

PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Vào trước thế kỷ thứ 20 thuật ngữ vi khuẩn lactic sử dụng ñể chỉ những vi khuẩn làm sữa chua Vi khuẩn lactic có một vai trò to lớn trong tự nhiên cũng như trong ñời sống thực tiễn của con người Thực phẩm lên men lactic (dưa muối, cà muối, sữa chua…) ñã ñược sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, nhưng mãi ñến năm 1780 nhà hóa học người Thụy ñiển Scheele mới lần ñầu tiên tách ñược vi khuẩn lactic (nguyên nhân chính làm chua thực phẩm) từ sữa bò lên men chua Gần một thế kỷ sau vào năm 1857 hiện tượng làm chua sữa mới ñược Pasteur chứng minh là do một nhóm vi khuẩn ñặc biệt gọi là vi khuẩn lactic gây

ra Vào năm 1873 J Lister lần ñầu tiên phát hiện ñược một loài vi khuẩn ñặt tên

là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Lactococcus lactic) là vi khuẩn lactic (Lactococcus lactic) Từ những nghiên cứu trên người ta ñã ñưa ra những ñiểm chung về vi khuẩn lactic: là những vi khuẩn Gram dương , bất ñộng và không

sinh bào tử, là lọai vi khuẩn kị khí tùy nghi, có khả năng lên men kị khí cũng như hiếu khí và có khả năng lên men ñường ñể tạo lactic acid, có khả năng chịu ñựng cao với môi trường axit Có hoạt tính Protease thủy phân protein của sữa thành peptit và acid amin, hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thông thường trực khuẩn là cao nhất ðặc biệt có khả năng sinh chất kháng sinh ñể ức chế vi sinh vật gây bệnh Từ ñó ñến nay hàng loạt các vi khuẩn lactic ñã ñược phát hiện và những ứng dụng của chúng ngày càng ñược mở rộng ra nhiều lĩnh vực [1,2,5]

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic phân bố rộng rãi trong phân, rác, xác ñộng, thực vật phân hủy, trong niêm mạc miệng và niêm mạc ruột của người và gia súc, gia cầm, ñặc biệt tìm thấy nhiều trong các sản phẩm lên men lactic

Ngày nay với kỹ thuật công nghệ hiện ñại con ngừơi ñã miêu tả rõ hơn về hình dáng, kích thước, cấu tạo và ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Vào năm 1919, Orla-Jensen ñã ñưa ra một số ñặc ñiểm ñặc trưng ñể phân loại vi khuẩn lactic Nhờ các ñặc ñiểm này mà việc phân loại vi khuẩn lactic ñược rõ ràng hơn rất nhiều và chúng vẫn còn là một công cụ phân loại hữu ích cho ñến ngày nay Các ñặc ñiểm ñể phân loại lactic mà Orla-Jensen ñưa ra bao gồm: các ñặc ñiểm hình thái (dạng hình que, cầu hay dạng tetrad), kiểu lên men ñường glucose (lên men ñồng hình hay lên men dị hình), khả năng sinh trưởng ở các ngưỡng nhiệt ñộ (100C hay 450C) và khả năng sử dụng một số các loại ñường khác nhau Nói chung các vi khuẩn lactic không sinh sắc tố nhưng khi sinh trưởng trên môi trường có bổ sung máu thì một số loài lại có khả năng tạo nên các sắc tố hemin tương ứng [35] Dựa trên những ñặc ñiểm phân loại của

Orla – Jensen thì LAB ñược chia thành 4 chi: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, và Streptococcus Nếu phân loại theo ñịnh nghĩa phổ rộng về ñặc

ñiểm sinh lý và sinh hoá thì nhóm vi khuẩn lactic bao gồm khoảng 20 chi [32] Thực tế trong ngành công nghiệp thực phẩm thì các chi ñược coi là nhóm vi

khuẩn lactic chính bao gồm: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella Chi

Bifidobacterium thường ñược coi như vi khuẩn lactic vì nó có mang một số ñặc ñiểm của vi khuẩn lactic Các chi mới như Alloiococcus, Dilosicoccus,

Dilosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera bao gồm một số chủng có quan hệ với LAB cả

về ñặc ñiểm sinh lý cũng như hệ thống phát sinh loài [32]

Sự phân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau phần lớn dựa trên sự khác nhau về hình thái, cơ chế lên men ñường, khả năng sinh trưởng ở các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau, dạng sản phẩm lactic acid, khả năng sinh trưởng ở các nồng ñộ muối khác nhau và khả năng chịu acid hay kiềm ðặc ñiểm hoá học như thành phần acid béo và thành phần cấu tạo thành tế bào cũng ñược sử dụng ñể

phân loại Hơn nữa, các kỹ thuật phân loại ngày nay dựa trên mối quan hệ về phylogenetic, phân loại dựa trên việc xác ñịnh trình tự rRNA, mối quan hệ gần gũi ở mức ñộ loài hay dưới loài có thể ñược xác ñịnh dựa trên các nghiên cứu sự tương ñồng DNA-DNA ðể xác ñịnh sự phát sinh kiểu gen của loài và chi, thì phương pháp nghiên cứu dựa trên trình tự rRNA là phù hợp hơn cả vì nó có chứa cả các vùng có trình tự bảo thủ và ít bảo thủ

Dựa vào ñặc ñiểm hình thái thì vi khuẩn lactic ñược chia thành hai loại ñó

là dạng hình que (gồm có Lactobacillus và Carnobacterium) và hình cầu (tất cả các chi còn lại) Riêng chi Weissella theo ñịnh nghĩa thi nó gồm cả hai dạng là

hình que và hình cầu Trong dạng hình cầu lại có một số chi tồn tại ở dạng tetrad

như Aerococcus, Pediococcus, và Tetragenococcus

Dựa theo khả năng lên men ñường thì vi khuẩn lactic ñược chia làm hai nhóm: là nhóm lên men ñồng hình (Glycolysis hay là con ñường Embden-Meyerhof-Parnas) và nhóm lên men dị hình (con ñường 6 phosphogluconate / phosphoketolase) [2, 3,4] Hầu hết các LAB sử dụng quá trình ñường phân theo

con ñường Embden-Meyerhof-Parnas Ngoại trừ leuconostoc, oenococci và weissella và một số dưới nhóm lactobacilli có cơ chế lên men dị hình còn tất cả

các LAB khác ñều lên men ñồng hình [32]

Các vi khuẩn lactic lên men ñồng hình phân giải ñường theo con ñường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas path way) và cho ta sản phẩm chủ yếu là lactic acid từ 90 – 98% [39] Chỉ một phần nhỏ pyruvat ñược decarboxyl hóa thành acid axetic, etanol, axetoin và CO2 Mức ñộ tạo thành các sản phẩm này phụ thuộc vào sự có mặt của O2 ðại diện của các vi khuẩn lactic lên men ñồng

hình như: Lc lactis, E faecalis, Str salivarius, Str pyogenes, S thermophilus,

Lb helveticus, Lb acidophilus, Lb bulgaricus, Lb platarum …

Các vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai 2 enzyme chủ yếu của con ñường EMP là aldolase và triozophosphat-isomerase nên giai ñoạn ñầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con ñường PP (Pentose phosphat) Quá trình

chuyển hóa triozophosphat thành lactic acid xảy ra giống như trong lên men ñồng hình [2, 32] Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men lactic dị hình vẫn là lactic acid (40%), ngoài ra, tùy từng loài có thể tạo thêm các sản phẩm khác như: xucinic acid và rượu etylic khoảng 20%, axetic acid khoảng 10%, các

chất khí còn lại chiếm 20% [2] ðại diện các vi khuẩn lên men dị hình như: Ln mensenteroides, Ln cremoris và một số vi khuẩn lactic hình que như Lb brevis,

Lb fermentum, …

Hình 1 Hai con ñường chính lên men glucose của vi khuẩn lactic:

(A) lên men lactic ñồng hình (glycolysis hay Embden-Meyerhof-Parnas pathway); (B) con ñường lên men lactic dị hình (6-phosphogluconate/ phosphoketolase pathway) Thứ tự các enzyme ñược ñánh dấu cho phản ứng:

1 Glucokinase; 2 fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3 phosphate dehydrogenase; 4 pyruvate kinase; 5 Lactate dehydrogenase; 6 glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8

Glyceradehyde-3-phosphoketolase; 9 acetaldehyde dehydrogenase; 10 alcohol dehydrogenase

1.1.3 ðặc ñiểm sinh lý sinh hoá

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di ñộng, chịu ñược acid, chuyển hóa ñường thành lactic acid Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh ra lactic acid Lactic acid sinh

ra có thể ở dạng D(-), L(+) hay DL Khác với một số vi khuẩn khác như vi khuẩn ñường ruột cũng sinh ra lactic acid thì tất cả các vi khuẩn lactic ñều là vi khuẩn lên men bắt buộc không chứa các cytocrom và enzyme catalaza Chúng là các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, bóng, có màu môi trường, màu trắng ñục hoặc vàng kem Vi khuẩn lactic ñược

xếp chung vào họ Lactobacteriaccae Các chi bao gồm Lactobacillus ñây là chi chính của vi khuẩn lactic, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus

Vi khuẩn lactic có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường kị khí và vi hiếu khí Năng lượng dùng ñể trao ñổi chất có ñược là nhờ quá trình lên men các carbonhydrate Lactic acid luôn là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men

Ngoài ra một số loài của Lactobacillus, Leuconostoc hoặc Streptoccus có khả

năng tạo hương, sinh ra diaxetyl hoặc axetoin Ở phần lớn vi khuẩn, axetoin ñược sinh ra từ pyruvate và vì vậy là sản phẩm của quá trình trao ñổi carbonhydrate Ở vi khuẩn lactic rất ít trường hợp axetoin ñược hình thành có nguồn gốc từ carbonhydrate nếu như không có nguồn pyruvat bổ sung Thường pyruvat này có nguồn gốc từ xitrat ðây là quá trình lên men kị khí xitrat ở vi

khuẩn lactic Tuy gọi là lên men nhưng thực ra xitrat không ñược sử dụng như là một nguồn năng lượng mà chỉ dùng ñể tạo ra các sản phẩm trao ñổi chất Một số

loài Leuconostoc và Lactobacillus lên men dị hình trong môi trường trung tính

không tạo ra axetoin hoặc diaxetyl mặc dù trong môi trường này chúng vẫn sử dụng xitrat Tuy nhiên trong môi trường axit các loại này lại tạo ra một lượng ñáng kể axetoin

Mặc dù vi khuẩn Lactic có thể phát triển ñược trên môi trường hiếu khí nhưng chúng không thu nhận năng lượng nhờ quá trình hô hấp ðiều này chứng

tỏ chúng không tổng hợp ñược nhân hem, do ñó không có cytocrom hay những enzyme chứa nhân hem khác Chúng có thể tiến hành một số phản ứng oxy hoá một số ít các hợp chất hữu cơ khác nhờ flavoprotein Các phản ứng này không kèm theo việc tổng hợp ATP

Riêng ở vi khuẩn lactic tuy catalaza âm tính song lại có một enzyme khác

là peroxidaza bản chất là flavoprotein Enzyme này là trung gian xúc tác quá trình oxy hoá các cơ chất hữu cơ dưới tác dụng của H2O2 Nhờ ñó vi khuẩn Lactic vẫn có khả năng sinh trưởng trong môi trường hiếu khí ðây cũng là ñặc ñiểm quý báu ñể nhận dạng vi khuẩn Lactic vì chúng gần như là những vi khuẩn catalaza âm tính duy nhất có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxy

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactic cũng rất phức tạp, tuỳ theo ñặc ñiểm từng loài mà khác nhau Do ñó môi trường ñể nuôi cấy vi khuẩn Lactic thường chứa pepton (cao thịt, cao nấm men) và các dịch chiết từ thực vật hoặc ñộng vật khác

Một số ñặc ñiểm sinh lý ñiển hình nữa của vi khuẩn Lactic là khả năng chống chịu acid rất tốt Những vi khuẩn lactic hình cầu có thể sinh trưởng trong môi trường pH trung tính hoặc hơi kiềm, vi khuẩn hình que không có khả năng chịu môi trường có pH lớn hơn 6 Vi khuẩn lactic có khả năng chịu pH môi trường ñạt giá trị là 5 ðặc tính sinh acid và chịu acid rất tốt giúp vi khuẩn lactic

cạnh tranh với vi khuẩn khác trong môi trường giàu dinh dưỡng và do ñó chúng

là ñại diện tiêu biểu của nhóm vi khuẩn trong giai ñoạn cuối của quá trình lên men

Tuỳ thuộc phạm vi nhiệt ñộ sinh trưởng của vi khuẩn lactic, người ta chia chúng thành hai loại:

- Vi khuẩn lactic ưa ấm (mesophile): có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt ñộ 10 - 350C

- Vi khuẩn lactic ưa nhiệt (thermophile): có thể chịu nhiệt ñộ 450C

1.1.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

1.1.4.1 Nhu cầu về cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng ñược nhiều loại hydratcacbon khác nhau

ñể ñáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cacbon của chúng Tuy nhiên nguồn cacbon quan trọng nhất ñối với vi khuẩn lactic vẫn là monosaccarit và disaccarit Chúng ñược dùng ñể cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, malic, pyruvic, fumaric, axetic Nhu cầu cacbon còn tuỳ thuộc vào từng loài vi khuẩn Trong quá trình lên men ngoài việc sử dụng các hợp chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic còn có thể sử dụng các acid amin như arginin, tizonin, gluconic làm nguồn cung cấp năng lượng

1.1.4.2 Nhu cầu về nitơ

Nitơ có mặt trong tất cả các thành phần quan trọng của tế bào như protein, enzyme vì thế vi khuẩn lactic cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ ñể ñảm bảo cho quá trình sinh trưởng và phát triển, tham gia vào xây dựng cấu trúc

1.1.4.3 Nhu cầu về vitamin

Vitamin là hợp chất hữu cơ không chứa năng lượng nhưng rất cần thiết, không thể thay thể, có vai trò quan trọng trong chuyển hoá vật chất và hoạt ñộng

cơ thể Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng tự tổng hợp vitamin cho mình, ña số chúng phải sử dụng nguồn vitamin ñưa từ ngoài vào Vì thế việc bổ sung vitamin là ñặc biệt cần thiết ñối với hầu hết các nhóm vi sinh vật dị dưỡng chất sinh trưởng này Các dịch chứa vitamin thường bổ sung như nước khoai tây, ngô, cà rốt, dịch thuỷ phân nấm men và nhiều chất khác

1.1.4.4 Nhu cầu về muối khoáng

Ngoài nhu cầu về các acid amin, vitamin và cacbon, vi khuẩn lactic còn cần các yếu tố khác cho sự phát triển ñó là các bazơ nitơ như Adenin, Hypoxantin, Guanin, Uraxin, Thimin, Thimidin và các axit hữu cơ cần thiết cho

sự phát triển của vi khuẩn lactic như axetic acid, citric acid và folic acid Chúng còn cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như ñồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magiê

1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactic

1.1.5.1 Ảnh hưởng của oxi

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm hô hấp tuỳ tiện, từ kị khí ñến vi hiếu khí ðặc ñiểm này bị quy ñịnh bởi sự không có mặt của hệ enzyme oxi hoá - khử xytocrom và catalaza trong tế bào Quá trình oxi hoá ở vi khuẩn lactic xảy ra thường kèm theo sự hình thành H2O2 Ảnh hưởng của oxi ñôi khi còn phụ thuộc cả vào nhiệt ñộ

1.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tởi sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Khi nhiệt ñộ gia tăng, làm cho các phản ứng của enzim trong tế bào tăng nhanh, do ñó sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng tăng nhanh lên Mặt khác, các protein, nucleic acid và các chất khác trong

tế bào sẽ nhạy cảm với nhiệt ñô cao và có thể trở nên bất ñộng Do ñó thông thường nếu nhiệt ñộ tăng dần thì sự tăng trưởng và biến dưỡng của vi sinh vật cũng tăng theo ñến một nhiệt ñộ nhất ñịnh thì tất cả dừng lại Nếu nhiệt ñộ tăng cao hơn nữa thì hoạt ñộng của vi sinh vật sẽ xuống ñến mức không

Nhiệt ñộ có ảnh hưởng rất lớn ñến hoạt ñộng của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt ñộ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng: một số loài có thể phát triển ở

550C trong khi một số khác có thể phát triển ñược ở 50C Nói chung ña số vi khuẩn lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt ñộ từ 150C ñến 400C

1.1.5.3 Ảnh hưởng của pH

Hoạt ñộng của vi khuẩn lactic, ñặc biệt là hệ enzyme của chúng chịu tác ñộng mạnh của pH Do ñó mà pH ảnh hưởng ñến quá trình trao ñổi chất của tế bào vi khuẩn lactic Mỗi giống vi khuẩn lactic khác nhau thì có pH tối thích khác nhau

Dựa vào pH tối thích mà người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm sinh hoá là nhóm ưa acid (acid dophilus) và nhóm kị acid (acid dophobic)

- pH của môi trường có ảnh hưởng trực tiếp ñến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật bởi ion H+ và OH- trong môi trường tác ñộng trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay ñổi sự vận chuyển của cơ chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzyme ra ngoài môi trường

- Mặt khác ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng ñến hệ enzyme của vi sinh vật, tham gia vào hoạt ñộng sống, sinh tổng hợp của vi sinh vật Sự phát triển của vi sinh vật chỉ có thể rất nghiêm ngặt ở acid hay kiềm ðối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu

1.1.6 Lợi ích của vi khuẩn lactic

- Vi khuẩn lactic ñược ứng dụng rông rãi trong rất nhiều lĩnh vực, ñặc biệt

là trong các ngành công nghiệp như: Công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp sản xuất axit lactic, công nghiệp chế biến bảo quản rau quả và thức ăn gia súc

- Trong công nghiệp chế biến sữa chua, bơ, phomat, vi khuẩn lactic ñóng vai trò quan trọng và tạo hương vị cho sản phẩm Các chủng vi khuẩn lên men

lactic ñể sản xuất sữa chua như: Streptococcus, S.cremoris Sữa ñược làm chín tạo thành phomat nhờ một số chủng vi khuẩn như: Streptococcus lactic, S.cremoris, Lactococcus casei

ðể sản xuất bơ vi khuẩn ñược dùng là Streptococcus lactic Một số vi khuẩn

tạo hương vị cho sản phẩm như : Streptococcus citrococcus, S parcitrovorus

- Vi khuẩn lactic còn ñược ứng dụng trong việc bảo vệ sức khỏe con người như tăng cường tính miễn dịch, làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống ung thư và tăng cường cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh

- Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh bacterioxin, có khả năng ư

ức chế các vi khuẩn Gram (+), nhờ ñặc tính này mà vi khuẩn lactic ñược sử dụng rất hiệu quả trong viêc bảo quản thực phẩm ñể kéo dài thời gian sử dụng

Chính vì có nhiều lợi ích nên vi khuẩn lactic ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và tìm ra nhiều ñặc tính mới như có khả năng sinh tổng hợp GABA, có khả năng probiotic

Sau ñó năm 1907, Ilia Metchnikoff - người Nga, ñạt giải Nobel – ñã

chứng minh ñược rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội ñộc tố của

hệ vi sinh vật ñường ruột Ông giải thích ñược ñiều bí ẩn này qua nhận xét thấy sức khỏe của những người Cô-Dắc sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới

115 năm hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, ñiều này ñược ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [32]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là hai người ñầu tiên ñưa ra những ñề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo

về probiotic [11]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh [12] Cùng năm ñó, các nhà

nghiên cứu Hoa Kỳ ñã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng

làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học ở ñại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn ñường ruột ñóng một vai trò quyết ñịnh trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ñược [11] Sau ñó 5 năm, một trong các ñồ uống lên men – ñặt tên là “Yakult” từ sữa ñược cho là hỗ trợ sức khỏe ñường ruột (intestinal health) ñược sản xuất Khái niệm chung probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm của thập niên 80 và ñược chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic ñầu tiên ñược giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [11,12]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic ñược tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm quan trọng giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một ñịnh nghĩa thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai ñịnh nghĩa ñược cho là phản ánh khá ñầy ñủ bản chất của probiotic

và ñược sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller 1989 [11], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng

hệ vi sinh vật ñường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y

tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi ñưa vào cơ thể theo ñường tiêu hoá với một số lượng ñủ sẽ ñem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [9] Tuy nhiên ñịnh nghĩa này vừa ñược yêu cầu xem xét lại, do có những kết quả khoa học ñược công bố gần ñây cho thấy: tế bào bất hoạt hoặc những thành phần của tế bào cũng có tác dụng tốt cho sức khỏe Do ñó, theo ñịnh nghĩa cập nhật, probiotic là “chế phẩm từ tế bào vi khuẩn hoặc từ thành phần tế bào vi khuẩn có tác dụng tốt với sức khỏe và thể trạng của cơ thể chủ” [32]

1.2.2 Thành phần một số chế phẩm Probiotic

Với các phát hiện về sự hữu ích của probiotic, việc phát triển và sử dụng các loại thực phẩm chức năng (dinh dưỡng trị liệu) và các loại bổ trợ trị liệu probiotic có tác dụng tăng cường sức khỏe ngày càng ñược quan tâm trên thế giới Chế phẩm probiotic hiện nay có mặt ở nhiều dạng và các công thức khác nhau có kết hợp hoặc không kết hợp với fructooligosaccharides (FOS), chủ yếu

là các vi sinh vật như:

• Bifidobacterium sp: B longum, B bifidum, B adolescentis, B animalis,

B infantis, B thermophilum

• Lactobacillus sp: L acidophilus, L casei, L delbrueckii ssp (bulgaricus),

L curvatus, L fermentum, L lactis, L plantarum, L reuteri, L brevis, L cellobiosus

• Enterococcus sp: Ent faecalis, Ent faecium

• Streptococcus sp: S cremoris, S salivarius, S diacetylactis, S intermedius

1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn ñầu tiên là phải an toàn cho sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và tồn tại ñược trong ñường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này ñược hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ ñó sẽ tuyển chọn ñược các chủng có tiềm năng probiotic

[10]

Các chủng vi sinh vật probiotic ñược lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

• Tính bám dính trên bề mặt ñường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính ñược vào thành ruột non, khư trú tốt và sinh sôi nẩy nở trong ñường tiêu hoá Khả năng bám dính ñược xem là một yêu cầu quan trọng ñể tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ ðặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác

• Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn ñược các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là ñặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi

khuẩn gây bệnh như E coli, Salmonella và Campylobacteria… Hoạt tính

kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacterioxin

+ Làm giảm ñộ pH bởi tạo ra acid lactic

+ Tạo ra H2O2

+ Làm giảm ñộc tố theo các cơ chế khác nhau

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

• Khả năng tồn tại trong môi trường acid dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường acid pH từ 2-3 và có mặt các enzyme tiêu hoá (amylasea, protease, lysozyme…) Các chủng vi sinh vật ñược coi như là nguồn probiotic phải tồn tại ñược trong ñiều kiện này Hiện nay các công ty ñã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi ñi qua khoang miệng và dạ dày

• Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của ñộng vật dao ñộng 1-3% [27] ðể tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng ñộ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một

số chủng probiotic khác như Bacillus, Lactobacillus cũng có khả năng sinh

enzyme tiêu hoá như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase, chúng

có khả năng hỗ trợ vật chủ tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng

1.2.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới

Việc nghiên cứu hệ vi sinh vật ñường ruột và sử dụng probiotic mới thực

sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 Hiện nay ngày càng nhiều nghiên cứu ñang ñược tiến hành ñể ñánh giá hiệu quả của nó; một số tính năng của Probiotic ñã ñược chứng minh như: chống tiêu chảy do thuốc kháng sinh, hội chứng ruột kích thích, dung nạp ñường lactose, sức khỏe chung Probiotic giúp cân bằng hệ vi sinh ñường ruột, nâng cao sức khỏe và tăng cường hệ miễn dịch

Theo một báo cáo mới về nghiên cứu thị trường probiotic giai ñoạn

2009-2014, thị trường probiotic sẽ ñạt giá trị là 32,6 tỉ USD vào năm 2009-2014, trong ñó Châu Âu và Châu Á chiếm khoảng 42% và 30% Tốc ñộ tăng trưởng hàng năm khoảng 12,6% từ năm 2009 ñến năm 2014

Gần ñây, thị trường probiotic ñã là một trong những nguồn lợi chính của dòng thực phẩm chức năng Sự nhận thức về sức khỏe gia tăng và tình trạng lão

hóa ngày càng nhiều là những yếu tố giúp tăng nhanh chóng thị trường này Một yếu tố chính nữa không chỉ ở hiện tại và cho cả về sau, ñó là người phụ nữ chính

là người mua hàng nhiều trong gia ñình, ñặc biệt các mặt hàng về thực phẩm và thức uống Phụ nữ thường quan tâm ñến các sản phẩm mới và những lợi ích của các sản phẩm ñó, họ luôn thử và kết hợp những thực phẩm có lợi trong khẩu phần ăn gia ñình Do vậy, không có gì ngạc nhiên khi phụ nữ có nhiều kiến thức

về thực phẩm và thức uống probiotic hơn và họ không chỉ là người tiêu thụ mà còn là người ñóng góp ý kiến cho sản phẩm Những ñiều này quyết ñịnh tại sao trên thị trường thực phẩm, thức uống probiotic ñược trông ñợi là trên 75% trong tổng số thị trường probiotic trong năm 2009 (Probiotic còn có ở dạng dược phẩm và mỹ phẩm)

Những sản phẩm probiotic từ sữa ñược dự kiến là cao nhất trong tất cả các sản phẩm probiotic thực phẩm, chiếm gần 70% trong năm 2009 và khoảng 24 tỉ USD vào cuối năm 2014 Thị trường lớn cho các dòng sản phẩm này là Châu Âu

và Châu Á; thị trường Mỹ thì chậm hơn nhưng tăng mạnh với tốc ñộ tăng trưởng hằng năm khoảng 17% từ năm 2009 ñến năm 2014, ñóng góp lớn nhất sẽ là dòng sản phẩm sữa uống lên men probiotic Mặc dù thị trường các sản phẩm probiotic tại Mỹ là ít hơn nhưng ñược trông ñợi sẽ phát triển ở mức kinh ngạc là 14%/ năm, cùng thời ñiểm trên

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt Nam

Hiện nay, Việt Nam ñang ñẩy mạnh việc nghiên cứu ñể sản xuất probiotic phục vụ cho con người, dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản do sản phẩm tinh chế thì giá thành còn cao nên

ở nước ta hiện nay vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu là các loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp Trong vài năm trở lại ñây mục ñích sử dụng chủng probiotic có khả năng sinh các hoạt chất sinh học dùng cho con người ñược các nhà khoa học quan tâm Trong ñó có hoạt chất GABA ñược sinh tổng hợp từ

chủng lactic lại có khả năng probiotic bằng phương pháp lên men dùng cho người ñã và ñang nghiên cứu như : Nhóm tác giả Nguyễn La Anh và Nguyễn Thị Việt Anh Viện Công nghiệp thực phẩm ñã bước ñầu tìm ra nhiều chủng lactic vừa có khả năng probiotic lại vừa có khả năng sinh tổng hợp GABA, nhóm tác giả Trịnh Tất Cường ðại học khoa học tự nhiên tìm ra chủng lactic ứng dụng trong lên men cám gạo ñể trích ly GABA[6]

1.2.5 Ứng dụng của chế phẩm probiotic trong bảo vệ sức khỏe con người

Chế phẩm probiotic ngày càng ñược chú trọng nghiên cứu và ứng dụng cho con người

ðiều trị tiêu chảy

Rất nhiều chủng probiotic có khả năng ñiều trị chứng tiêu chảy Chủng

Bifidobacterium bifidum kết hợp với Streptococcus thermophilus bổ sung vào

công thức sữa bột có tác dụng làm giảm các ca nhiễm tiêu chảy do vi rút gây

bệnh viêm ruột và dạ dày [27] Phân tích tổng hợp chỉ ra rằng Lactobacillus an

toàn và hiệu quả trong việc giảm thời gian tiêu chảy cấp ở trẻ em [36] Tổng quan một cách hệ thống cho thấy probiotic mang lại hiệu quả lâm sàng cao trong chữa trị các bệnh nhiễm trùng tiêu chảy, ñặc biệt là viêm dạ dày- ruột virut ở trẻ

sơ sinh và trẻ em

Một số các chủng probiotic cho kết quả giảm số lượng ca bệnh cũng như giảm sự kéo dài ca tiêu chảy liên quan ñến sử dụng kháng sinh- hậu quả phụ của

việc ñiều trị bằng kháng sinh ñể loại trừ Helicobacter pylori trong bệnh viêm dạ

dày, giảm ca nhiễm tiêu chảy do “du lịch” Với liều thông thường của probitic

ñã có thể giúp khôi phục lại hệ vi sinh thường trú trong ruột, do ñó làm tăng hệ miễn dịch, giúp duy trì tình trạng khỏe mạnh của người bệnh Nghiên cứu của D’Souza (2002) và Cremonini (2002) ñã cho thấy hiệu quả tác dụng của việc sử

dụng probiotics (cụ thể là sử dụng S boulardii và Lactobacilli) trong trường hợp

tiêu chảy do kháng sinh [8]

Ngăn ngừa nhiễm trùng

Những nghiên cứu khác ñã tiến hành xác ñịnh hiệu quả của probiotics trong việc ngăn ngừa các loại nhiễm trùng ở trẻ em Các nghiên cứu cho thấy trẻ em dùng probiotic ít mắc tiêu chảy hoặc nếu mắc thì bị ngắn hơn trẻ em

không dùng Trường hợp dùng Lactobacillus reuteri kết quả rõ ràng hơn Tuy

nhiên, tác dụng của probiotic ñối với bệnh ñường hô hấp chưa ñược thể hiện

Việc bổ sung probiotics có tác dụng cung cấp một lượng vi sinh vật ñáng

kể làm kích thích tốt hệ miễn dịch non nớt, do vậy giúp cơ thể tăng khả năng bảo vệ, chống các bệnh dị ứng di truyền, nâng cao sự phản ứng miễn dịch theo

cơ chế không theo kiểu dị ứng di truyền Do vậy, việc tiếp xúc sớm từ vi sinh vật hội sinh có thể ñóng vai trò cơ bản, không chỉ trong việc hình thành các phản ứng miễn dịch kiểu không dị ứng di truyền, mà còn trong bảo vệ cơ thể chủ khỏi các bệnh nhiễm trùng và tự miễn

Vai trò ở trẻ chưa ñầy tháng và hiểm nguy viêm ruột non kết hoại thư (necrotizing enterocolitis - NEC)

Lý do căn bản của việc sử dụng probiotic ở trẻ chưa ñầy tháng có nguy

cơ NEC là những trẻ sinh rất nhẹ cân (very low birth weight - VLBW) có vi sinh

ñồ của phân khác thường so với trẻ khoẻ mạnh sinh ñủ ngày Sự có mặt chiếm

ña số của vi khuẩn yếm khí tùy tiện trong hệ vi sinh trong mẫu phẩm phân của

trẻ em ñẻ non chịu sự chăm sóc ñặc biệt là staphylococci

Cơ chế mà vi khuẩn probiotic bảo vệ trẻ em có nguy cơ cao về bệnh NEC bao gồm tăng cường các rào cản không cho vi sinh vật có hại và sản phẩm của chúng ñịnh vị cũng như ñi qua màng nhầy, loại trừ chúng trên nguyên tắc cạnh tranh, giúp tăng cường phản ứng của cơ thể chủ ñối với sản phẩm của vi sinh vật gây bệnh, tăng cường dinh dưỡng ruột giúp ức chế các vi sinh vật gây bệnh như

Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli và Candida albicans

Tuy nhiên, chỉ sử dụng probiotic một mình không thể loại trừ hoàn toàn NEC vì NEC là căn bệnh có nhiều yếu tố ảnh hưởng, trong ñó việc ñịnh cư các

vi sinh vật hữu ích ñường ruột chỉ là một yếu tố

Probiotic ñược bổ sung cho sữa và thức ăn cho trẻ nhỏ

Ủy ban khoa học thực phẩm của Ban chấp hành Liên minh Châu Âu khuyến cáo rằng những công thức sữa bột cho trẻ em sơ sinh (dưới 4 tháng tuổi) ñược bổ sung vi sinh vật probiotic trước khi ñưa ra thị trường phải qua các nghiên cứu về ích lợi và sự an toàn theo những nguyên tắc ñánh giá của Ủy ban Mặt khác Ủy ban không phản ñối việc bổ sung vi khuẩn lactic cho các công thức sữa cho trẻ sau 4 tháng tuổi Tuy nhiên, Ủy ban cho rằng chỉ những chủng vi khuẩn ñược sử dụng phải ñược ñịnh tên, ổn ñịnh về di truyền bởi các phương pháp nuôi cấy và sinh học phân tử, ñược các cấp quản lý công nhận Mật ñộ tế bào vi khuẩn sống trong công thức phải ñược duy trì ở mức 106- 108 CFU/g cho suốt thời hạn sử dụng của sản phẩm Một số kết quả chỉ ra rằng những vi khuẩn probiotic ñược sử dụng càng sớm trong thời kỳ sơ sinh có vẻ như có khả năng tồn tại cố ñịnh trong ruột hơn nhưng vi khuẩn ñược sử dụng giai ñoạn sau của cuộc sống

Những lợi ích trực tiếp của việc sử dụng probiotic trong việc ñiều trị trẻ

sơ sinh và trẻ nhỏ với các bệnh tiêu chảy nhiễm trùng, chủ yếu là nguyên nhân virut cũng như ngăn chặn tiêu chảy do sử dụng kháng sinh

1.3 Tổng quan về gama - aminobutyric acid

Khối lượng phân tử: 103,12 g /mol

ðiểm nóng chảy: 203,7 °C( 477 K, 399 ° F )

Hình 2 Cấu trúc phân tử của GABA

GABA là chất ức chế dẫn truyền thần kinh chính trong hệ thống thần kinh trung ương ở ñộng vật có vú [31] Là một loại amino acid không thể thiếu ñối với cơ thể ñể ñảm bảo duy trì sự hoạt ñộng bình thường của não bộ ñặc biệt là các neuron thần kinh [18]

GABA ñóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt ñộng của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền Cùng với niacinamide va inositol, GABA ngăn căn cản các truyền dẫn căng thẳng và bất

an ñến vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này, khống chế các vùng tiếp nhận tin GABA ñược sản sinh ra từ glutamic acid trong não bộ ñể ức chế dẫn truyền thần kinh [31] Nó ngăn cản sự hoạt ñộng thái quá của những nerons thần kinh nhất ñịnh tại hệ thống thần kinh trung ương ñể tăng cảm giác thư thái Chất ức chế dẫn truyền này thường ñược biết ñến như một liều thuốc an thần tự nhiên do cơ thể tự sản sinh ra giúp thư giãn thần kinh, giảm huyết áp và ngủ ngon Vì thế, GABA giúp cho cơ thể ñược cảm giác thư giãn, giúp ngủ ngon, giảm huyết áp và an thần [15,29,31]

1.3.2 Lịch sử phát triển

Sự hiện diện của GABA lần ñầu ñược chứng minh ở mô thực vật và mặt sau của não chuột Lịch sử nghiên cứu của GABA trong não bắt ñầu với việc

khám phá ra sự hiện diện của chất này trong các mô của hệ thống thần kinh trung ương của ñộng vật có xương sống Trong quá trình nghiên cứu các amin acid tự do trong mô và khối u ở một số loài ñộng vật chạy bằng sắc ký giấy, với một lượng tương ñối lớn của thuốc thử ninhydrin phản ứng với một chất chưa xác ñịnh ñược tìm thấy trong dịch chiết xuất từ bộ não của chuột, thỏ, chuột lang, con người, ếch, kỳ nhông, rùa, cá sấu, và gà con Chất này ñược tìm thấy với một số lượng lớn trong dịch chiết xuất của nhiều mô, khối u và trong nước tiểu, máu bằng phương pháp sắc ký giấy Một nghiên cứu về thành phần các chất trong não chuột ñã phát hiện ra sự có mặt GABA Việc xác ñịnh ban ñầu, dựa trên sự di chuyển của GABA trên sắc ký giấy trong ba dung môi khác nhau, sau ñó xác ñịnh chính xác GABA trong dịch chiết xuất não chuột bằng phương pháp ñồng vị dẫn xuất Công trình xác nhận sự hiện diện của GABA trong não xuất hiện vào cuối năm 1950 và ñăng trên tạp chí Biologycal Chemistry

Cho ñến nay vai trò của GABA ở sinh vật vẫn chưa ñược tìm hiểu hết Ngoại trừ vai trò của GABA trong hệ thần kinh trung ương và ngoại vi của ñộng vật có

và không có xương sống; ở những phần khác nhau của thực vật như nốt rễ, hạt nẩy mầm và lá; ở một số vi sinh vật, ñặc biệt là bào tử nảy mầm của chúng

1.3.3 Hình dạng và cấu trúc

Hình dạng của GABA phụ thuộc vào môi trường Trong trạng thái khí, hình dạng nhiều nếp gấp ñược hình thành chủ yếu vì lực hút tĩnh ñiện giữa hai nhóm chức Ổn ñịnh là khoảng 50 mol/kcal theo tính toán lượng tử hóa học Ở trạng thái rắn, một cấu trúc mở rộng của nó ñã tìm thấy, với một cấu trúc dạng

trans ở amin cuối và một dạng Gauche ở cacboxyl cuối Ở dạng lỏng GABA tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác bao gồm dạng gấpkhúc, dạng mạch thẳng Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh học quan trọng [18]

1.3.4 Tổng hợp GABA

GABA ñược tổng hợp từ axit L-glutamic nhờ hoạt ñộng của enzyme

glutamic acid decarboxylase (GAD) và pyridoxal phosphate (dạng hoạt ñộng của vitamin B6) thông qua một con ñường trao ñổi chất ñược gọi là GABA shunt

Hình 3 Quá trình tổng hợp GABA

GABA shunt là một nhánh tắt của chu trình Krebs Các GABA shunt là một quá trình khép kín với hai mục ñích sản xuất và bảo tồn nguồn cung cấp GABA Glucose là tiền chất chính ñể sản xuất GABA trong cơ thể, mặc dù pyruvate và các acid amin cũng hoạt ñộng như là tiền chất Bước ñầu tiên trong GABA shunt là chuyển hóa amin của α-ketoglutarate (ñược hình thành từ sự chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) nhờ GABA α-oxoglutarate transaminase (GABA-T) thành axit L-glutamic Tiếp theo GAD xúc tác chuyển hóa axit L-glutamic thành GABA GABA ñược chuyển hóa bởi GABA-T ñể tạo thành semialdehyde succinic ðể bảo tồn nguồn cung cấp sẵn của GABA, quá trình chuyển hóa amin thường xảy ra khi hợp chất ban ñầu α-ketoglutarate chấp nhận các nhóm amin tách ra từ GABA ñể hình thành lại acid glutamic Vì vậy, một phân tử GABA ñược hình thành chỉ khi một phân tử tiền thân ñược hình

thành Semial dehyde succinic có thể bị oxy hóa bởi Semialdehyde succinic dehydrogenase (SSADH) thành succinic acid và sau ñó có thể tái nhập lại chu trình Krebs hoàn thành các vòng lặp [18,34]

1.3.5 Cơ chế hoạt ñộng của GABA

Khi ức chế dẫn truyền thần kinh trong não, GABA tác ñộng ảnh hưởng của nó bằng cách gắn vào hai thụ thể riêng biệt, GABA-A và GABA-B Các thụ thể GABA-A thuộc họ thụ thể ion dinh dưỡng có một phần vai trò trong việc sát nhập các protein Khi GABA gắn vào thụ thể GABA-A trên màng tế bào thần kinh mở kênh ion Cl- ñưa ñến sự cực màng gây ức chế Các loại thuốc chống lo

âu của họ benzodiazepine, gây hiệu ứng nhẹ nhàng của mình bằng cách tăng ái lực giữa thụ thể GABA-A và GABA Các thụ thể GABA-B thuộc họ thụ thể chuyển hóa dinh dưỡng, có cấu trúc gần giống cấu trúc thụ thể chuyển hóa glutamate Thụ thể GABA-B trú tại tiền synap và hậu synap dẫn tới mở kênh ion cho phép kênh ion mang ñiện tích âm ñi vào trong tế bào, kênh mang ñiện tích dương ra ngoài tế bào Quá trình này tạo ra ñiện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trí này thường xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [18]

1.3.6 Chức năng của GABA

GABA là một loại amino acid không thể thiếu ñối với cơ thể ñể ñảm bảo duy trì sự hoạt ñộng bình thường của não bộ ñặc biệt là các nơron thần kinh Nó ngăn cản sự hoạt ñộng thái quá của những nơron thần kinh nhất ñịnh tại hệ thống thần kinh trung ương và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền ñể tăng cường cảm giác thư thái trong hệ thần kinh Chất ức chế dẫn truyền này thường ñược biết ñến như một liều thuốc an thần tự nhiên do cơ thể tự sản sinh giúp thư giãn thần kinh và có giấc ngủ ngon Cùng với niacinamide và inositol, GABA ngăn căn cản các truyền dẫn căng thẳng và bất an ñến vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này, khống chế các vùng tiếp nhận tin Chính vì những chức năng trên nên GABA có rất nhiều vai trò quan trọng với cơ thể [7,15,29]

1.3.7 Các nguồn sinh tổng hợp GABA

GABA ñược phân bố rộng rãi trong tự nhiên GABA có nhiều nhất trong não của các ñộng vật có vú Ngoài ra còn tồn tại với một lượng thấp trong một

số bộ phận như nốt rễ, lá…của số loại thực vật như cà chua, chuối, rau bina, lá

chè xanh…GABA cũng ñược tìm thấy ở một số vi sinh vật như E.coli, các

chủng vi khuẩn lactic [21, 23,30,37]

Sau khi phát hiện ra các chức năng quan trọng của GABA thì việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất GABA rất ñược quan tâm Mặc dù GABA ñược tìm thấy với hàm lượng lớn trong não ñộng vật có vú, những nguồn này không thể áp dụng ñược trong sản xuất Hàm lượng GABA sinh tổng hợp ñược trong thực vật thì thấp Vì vậy nguồn sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật chiếm nhiều ưu ñiểm

hơn cả E.coli là vi sinh vật ñầu tiên ñược ứng dụng trong sản xuất GABA,

nhưng có quá nhiều khó khăn và nguy hiểm tồn tại trong quá trình lên men bởi

E.coli Một số chất ñộc trong quá trình tổng hợp GABA bởi chủng E.coli là

nguyên nhân gây một số bệnh ở người [23] Do vậy, các nhà nghiên cứu ñã nỗ lực tìm kiếm ra nguồn vi sinh vật khác có khả năng sinh tổng hợp GABA an toàn hơn Cụ thể là một số chủng vi sinh vật phổ biến và an toàn bao gồm các chủng vi khuẩn lactic( LAB) Chúng ñược nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng

trong sản xuất GABA trong những năm gần ñây Trong ñó Lactobacillus brevis, L.paracasei, L.lactis là những chủng vi khuẩn lactic ñược nghiên cứu và ứng dụng ñể sản xuất thực phẩm giàu GABA và dược phẩm tổng hợp GABA

Các nghiên cứu gần ñây ñã ứng dụng một số chủng lactic như

Streptococcus thermophilus và Lactobacillus delbruekii phân lập từ sữa chua trên thị trường và Lactococcus lactis từ phomat [24] có khả năng sinh tổng hợp

GABA ñể ứng dụng trong lên men thực phẩm Quá trình làm giàu hàm lượng GABA cũng ñược tìm thấy trong một số thực phẩm như; trà xanh ủ yếm khí và thóc ngâm nảy mầm, sữa gạo [26,33,34], ñồ uống lên men từ thực vật và cám gạo

ở Thái Lan [19,28,37], quả mâm sôi ñen và kim chi ở Hàn Quốc [20]…

1.3.8 Vai trò của GABA với sức khỏe con người

Giúp có giấc ngủ ngon và sâu hơn

Bằng việc giảm bớt trạng thái căng thẳng, bất an, GABA giúp an thần trong ñó bao gồm cả ngủ ngon Các nghiên cứu khác cho thấy, GABA làm tăng chu kỳ giấc ngủ cho cơ thể, các bệnh nhân có ñược giấc ngủ sâu và yên tĩnh nên ñạt ñược thời gian nghỉ ngơi nhiều hơn và giúp cơ thể hồi phục nhanh chóng hơn Con người sẽ có nhiều năng lượng và cường tráng cơ bắp là thế mạnh của GABA

Mất tự chủ tạm thời

Có mối quan hệ giữa việc giảm hàm lượng GABA trong cơ thể và hiện tượng mất tự chủ tạm thời trong hành vi của một số bệnh nhân Trong những trường hợp này, bổ sung thêm GABA có thể vô hiệu hóa hoạt ñộng các tế bào thần kinh trong não bộ tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân

ðau nhức kéo dài (kinh niên)

Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự ñau nhức Như một chất dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng ñau nhức kéo dài bằng cách giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan ñến ñau nhức giúp cho chúng ta bớt cảm giác về sự ñau nhức ñó

Trầm cảm

Khi người sử dụng rượu hoặc thuốc gây nghiện (heroin, cocaine, thuốc lắc, cần sa ) họ không cảm thấy chán nản và sự trầm cảm của mình Họ ñã tạm thời bị che lấp bởi ảo giác trong não do opiod tạo ra Khi thuốc hết tác dụng, trạng thái trầm cảm sẽ trở lại Tại sao lại có hiện tượng này, bởi vì bộ não ñã bị

ảo giác rằng nồng ñộ GABA trong não vẫn cao do opiod gây ra Thực tế hàm lượng GABA trong não bị giảm Vì vậy khi bổ sung GABA có thể giảm bớt hiện tượng trầm cảm

Hoảng loạn

Thiếu hụt GABA ựược xem là một trong các nguyên nhân gây ra hiện tượng hoảng loạn Vì vậy bổ sung GABA có thể giúp làm giảm hiện tượng

hoảng loạn GABA có thể sản xuất ra endorphin trong não và ngăn ngừa tâm trở

nên quá kắch ựộng Endorphin là chất ựem lại cho mọi người một cảm giác hạnh

phúc và ựược kắch thắch trong các hoạt ựộng vui chơi và tập thể dục

Trạng thái tâm lý trước thời kỳ kinh nguyệt (PMS-premenstrual syndrome)

Phụ nữ có kinh nguyệt dễ thay ựổi dẫn ựến trầm cảm Trong thời kì này trong máu của họ có hàm lượng GABA thấp GABA ựược coi là có thể ựiều trị ựược PMS ựối với phụ nữ

Kắch thắch tạo ra hoocmon tăng trưởng (HGH)

HGH là 1 peptid do thùy trước tuyến yên tiết ra Nó kiểm soát các cơ quan và chức năng trong cơ thể tái tạo mô thay thế tế bào cải thiện chức năng não thiết lập giấc ngủ Tăng HGH làm giảm quá trình lão hóa của tế bào do vậy GABA ựược dùng ựể tăng lượng HGH nội sinh cho cơ thể đã có hàng trăm nghiên cứu lâm sàng về GABA và vô số nghiên cứu về khả năng của GABA làm tăng HGH Các nghiên cứu cho thấy khi uống 5 gam GABA có thể làm tăng 55% lượng hoocmon HGH Trong một số nghiên cứu về dinh dưỡng, GABA ựược thử nghiệm trực tiếp ở các trung tâm y tế Một nghiên cứu nổi bật ở phòng khám bệnh tuyến ựầu ở trường đại Học Milan ở Milan, Italy ựể giải thắch cách hoạt ựộng của GABA tăng HGH, kết quả cho thấy trong 19 người tham gia nghiên cứu, so sánh với 18 người ở nhóm ựối chứng, lượng HGH tăng có ý nghĩa thống kê (trên 5ng/ml) với liều cấp 5g GABA Lượng hóc môn HGH tăng 55% trong huyết tương sau 90 phút dùng GABA Sự tăng này thực sự có ý nghĩa, không có một chất dinh dưỡng nào có thể ựạt ựược mức tăng trưởng như vậy Các nghiên cứu về GABA ựã thực hiện cả trên ựường uống và ựường tiêm tĩnh mạch và kết quả cho thấy ựường uống có hiệu quả một cách rõ rệt Hiệu lực

của GABA làm tăng hóc môn tăng trưởng là ñối thủ tiềm lực của các phức hợp dược chất khác

Béo phì

Béo phì là nguyên nhân hàng ñầu dẫn ñến bệnh cao huyết áp, tim, ñột quỵ

và 2 loại bệnh tiểu ñường Hiện có khoảng 300 triệu người trên thế giới bị béo phì, WHO cho biết WHO cũng ñưa ra chỉ số khối lượng cơ thể (BMI) của mỗi người ñể xác ñịnh sự tương xứng của cân nặng (kg)/chiều cao(m) Một người thừa cân thì chỉ số BMI vượt quá 25 kg trên một mét, và nếu chỉ số này vượt quá con số 30 là béo phì Khi các chất dẫn truyền tương tác với các phân tử trong vùng cấu tạo dưới ñồi (là trung tâm quan trọng ñiều khiển ñói, khát, thân nhiệt ) trong não, làm tăng thêm nhiều GABA trong não, sự tích lũy quá mức của GABA sẽ dẫn ñến sự kích thích họ ăn nhiều hơn bình thường ðiều này giải thích vì sao nhiều người béo quá mức

thay ñổi, cân bằng ñộng Glutamate - GABA luôn luôn ở trong tình trạng mất cân ñối, glutamat thắng thế, làm cho người ñó dễ phát sinh sự thèm khát, dễ tái nghiện Dù quan hệ nhân quả thế nào thì có một sự thực hiển nhiên là: nếu dùng một liệu pháp tác ñộng vào hệ cân bằng ñộng Glutamate - GABA làm cho GABA thắng thế, thụ thể D3 giảm xuống, dopamin giảm xuống thì nhất ñịnh sẽ chống lại ñược nghiện Theo hướng này, các nhà khoa học dùng một số chất chống nghiện mới Trước hết, dùng chính các thuốc chống ñộng kinh topiramat, vigabtrin Hai chất này có tác dụng ngăn chặn sự phân giải GABA (làm bền vững, tăng số lượng GABA) làm giảm sự tiết glutamate (giảm lượng glutamate) Với tác dụng ở cả hai ñầu như vậy, chúng làm cho cân bằng ñộng glutamate- GABA thay ñổi theo hướng có lợi, GABA chiếm ưu thế và chống lại ñược nghiện Tại Mỹ, nhiều thầy thuốc ñã cho dùng các thuốc ñộng kinh trên ñể cai nghiện và thu ñược kết quả khá mĩ mãn Trước ñây, dùng methadon cai ma túy, dùng nicotin cai thuốc lá Chúng chính là chất nghiện Dùng chúng, người nghiện vượt qua cơn vật vã do thiếu chất nghiện, sau ñó giảm liều dần rồi ngừng hẳn mà không bị vật vã nữa Tương tự dùng disulfiram ñể cai rượu Thực ra, ñây chỉ là những chất làm cản trở sự chuyển hóa của alcol, tạo ra chất gây khó chịu, làm cho người nghiện sợ rượu Tất cả chúng ñều không tác ñộng vào chính cơ

sở vật chất của nghiện Các thuốc theo hướng mới có ưu ñiểm là tác ñộng vào chính quá trình vật chất của nghiện (cân bằng ñộng Glutamate- GABA) nên có hiệu quả chống nghiện hơn

Một số vai trò khác

Ngoài ra GABA còn có những tác dụng như: chống ñộng kinh, an thần và

ức chế các xung ñộng thần kinh chức năng Các nhà khoa học ñã tìm ra ñược nguyên nhân trực tiếp của các chứng bệnh hưng phấn thần kinh là do có sự suy giảm nồng ñộ GABA trong máu não GABA còn có những tác dụng như giúp cho sự ổn ñịnh hoạt ñộng chức năng sinh tổng hợp và bài tiết nhiều loại