Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật hoá học, yếu tố độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli gây bệnh sưng phù đầu(edima disease) trên lợn con tại một số tỉnh miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ðỖ TUẤN LONG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH SƯNG PHÙ ðẦU

(EDEMA DISEASE) TRÊN LỢN CON TẠI MỘT SỐ TỈNH

MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ðỖ TUẤN LONG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH SƯNG PHÙ ðẦU

(EDEMA DISEASE) TRÊN LỢN CON TẠI MỘT SỐ TỈNH

MIỀN BẮC VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y

MÃ NGÀNH : 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS TÔ LONG THÀNH PGS.TS PHẠM NGỌC THẠCH

HÀ NỘI - 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… iii

đã giảng dạy tơi trong suốt thời gian học tập tại Trường

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới các thầy cơ hướng dẫn: PGS.TS Phạm Ngọc Thạch, PGS.TS Tơ Long Thành, TS Nguyễn Thị Kim Oanh Các thầy cơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi trong quá trình thực hiện và hồn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu của Ban lãnh đạo, các cán bộ cơng nhân viên Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương đã dành nhiều thời gian

và cơng sức giúp đỡ tơi trong quá trình thưc hiện đề tài

Tơi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã luơn giúp đỡ, động viên giúp tơi hồn thành luận văn này

Hà Nội tháng 11 năm 2013

Tác giả luận văn

ðỗ Tuấn Long

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iv

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E.coli và bệnh do chúng gây ra 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E.coli trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E.coli ở Việt Nam 4

1.2 ðặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli 6

1.2.8 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli 15

1.3 Bệnh phù ñầu ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra 16

1.3.3 Phương thức truyền lây của bệnh 17

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… v

1.3.8 Các loại vacxin phòng bệnh phù ñầu 22

CHƯƠNG 2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG

2.3.1 Xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn E.coli gây bệnh phù ñầu ở lợn 23

2.3.2 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23

2.3.3 Xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23

2.3.4 Xác ñịnh serotype của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23

2.3.5 Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli

2.4.3 Hóa chất, dung dịch, cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 24

2.4.4 Môi trường, nguyên liệu làm kháng sinh ñồ 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 25

2.5.2 Phương pháp phân lập, xác ñịnh vi khuẩn E.coli từ mẫu bệnh phẩm 25

2.5.3 Phương pháp giám ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli 25

2.5.4 Xác ñịnh ñộc tố VT2e và kháng nguyên F18 bằng phương pháp PCR 30

2.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 31

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vi

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn E.coli 32

3.2 Kết quả xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 36

3.3 Kết quả xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 38

3.3.2 ðộc tố Verotoxin Vt2e và yếu tố bám dính F18 39

3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 43

3.5 Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vii

PCR : Polymerase Chain Reaction

Stx2e : Shiga toxin 2e

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ viii

DANH MỤC BẢNG

2.1 Trình tự nucleotide của cặp mồi xác ựịnh yếu tố ựộc lực của vi

2.2 đánh giá kết quả ựường kắnh vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của

Hội ựồng Quốc gia Hoa Kỳ 29

2.3 Chu trình của phản ứng PCR 31

3.1 Kết quả thu thập mẫu và tỷ lệ phân lập vi khuẩn E Coli ở các ựịa

3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E coli theo tuổi lợn 34

3.3 Kết quả giám ựịnh sinh hóa của vi khuẩn E coli phân lập ựược 36

3.4 Kết quả xác ựịnh yếu tố ựộc lực của vi khuẩn E coli 40

3.5 Kết quả xác ựịnh serotype của vi khuẩn E coli phân lập ựược 43

3.6 Tỷ lệ các serotype của vi khuẩn E coli phân lập ựược 44

3.7 Kết quả kháng sinh ựồ của các chủng E coli phân lập ựược 47

3.8 Kết quả xác ựịnh tắnh kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân

lập ựược theo ựịa phương 49

3.9 Kết quả xác ựịnh tắnh kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân

lập ựược ở lợn theo lứa tuổi 51

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… ix

DANH MỤC HÌNH

1.1 Cơ chế gây bệnh sưng phù đầu của vi khuẩn E.coli 18

1.3 Phù ruột và hạch màng treo ruột 20

1.4 Phù tích nước dưới da vùng đầu 20

1.5 Lợn phù đầu, phù mí mắt, cĩ triệu chứng thần kinh 21

1.6 Phù tích nước ở vùng mặt, mí mắt 21

1.7 Niêm mạc ruột xuất huyết (bên trái) và bình thường(bên phải) 21

1.8 Niêm mạc dạ dày xuất huyết (bên trái) và bình thường (bên phải) 21

2.1 Sơ đồ chẩn đốn thường quy bệnh phù do vi khuẩn E.coli 26

3.1 Tỷ lệ phân lập E.coli ở lợn theo lứa tuổi 35

3.2 Bộ sinh hĩa cho vi khuẩn E.coli 37

3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli trên thạch MacConkey (trái), thạch

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 1

MỞ ðẦU ðẶT VẤN ðỀ

Trong những năm gần ñây, cùng với sự phát triển chung của nền nông nghiệp Việt Nam, ngành chăn nuôi nước ta ñã ñạt ñược những bước phát triển ñáng kể, với mục tiêu ñưa chăn nuôi trở thành ngành sản xuất hàng hóa ñáp ứng nhu cầu thịt, trứng, sữa trong nước và xuất khẩu Trong ñó, lợn là ñối tượng chăn nuôi chính trong các nông hộ, và cũng là hướng phát triển trang trại rất ñược chú trọng Nhằm nâng cao giá trị sản xuất của ngành chăn nuôi, ñáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu, trong những năm gần ñây, chính phủ ñã ban hành chiến lược phát triển chăn nuôi, trong ñó ñặt ra chỉ tiêu nâng tỷ trọng của chăn nuôi lợn theo hướng công nghiệp hàng hóa lên từ 30-35% vào năm 2020 Do ñó, ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam ñã và ñang phát triển theo

xu hướng chuyển dịch từ chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi tập trung trên quy mô lớn, áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật tiên tiến vào sản xuất, ñã bước ñầu thu ñược những thành tựu ñáng kể: Tổng số ñầu lợn tăng nhanh qua các năm, chất lượng và giá trị sản phẩm cũng tăng lên

Tuy nhiên, việc phát triển nhanh quy mô ñàn lợn cũng tiềm ẩn nhiều vấn

ñề nguy cơ như: Dịch bệnh, ô nhiễm môi trường … ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất chăn nuôi và gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi Một trong

những dịch bệnh ñó là bệnh sưng phù ñầu ở lợn con do vi khuẩn E coli gây ra

Bệnh xảy ra ở nhiều nơi, xuất hiện lúc ồ ạt, lúc lẻ tẻ phụ thuộc vào thời tiết, ñiều kiện chăm sóc quản lý Ở nước ta hiện nay, việc phòng chống bệnh sưng phù ñầu ở lợn con còn gặp nhiều khó khăn do vẫn tồn tại hình thức chăn nuôi nhỏ lẻ, công tác quản lý chăm sóc và phòng bệnh bằng vacxin ở một số trại chưa tốt

Hơn nữa, vi khuẩn E coli hiện nay ñã kháng với nhiều loại kháng sinh gây khó

khăn trong quá trình ñiều trị

ðể có những hiểu biết toàn diện về ñặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 2

và ñánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu, xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, hạn chế tối ña

thiệt hại của bệnh do vi khuẩn E coli gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề

tài: “Nghiên cứu một số ñặc tính sinh vật hóa học, yếu tố ñộc lực và tính mẫn

cảm kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh sưng phù ñầu (Edema disease) trên lợn con tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ðỀ TÀI

- Xác ñịnh ñược một số ñặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli gây bệnh

sưng phù ñầu trên lợn con

- Xác ñịnh ñược yếu tố ñộc lực của vi khuẩn

- ðịnh type huyết thanh học

- Xác ñịnh ñược tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli gây bệnh

phù ñầu ở lợn con

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI

Nghiên cứu ñã bổ sung những hiểu biết ñầy ñủ hơn về một số ñặc tính sinh vật hóa học, yếu tố ñộc lực, serotype và tính mẫn cảm kháng sinh của vi

khuẩn E coli gây bệnh sưng phù ñầu trên lợn con tại một số tỉnh miền Bắc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli và bệnh do chúng gây ra

1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E coli trên thế giới

Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) ñược Theobald Escherich phân lập lần

ñầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em và ñược coi là vi khuẩn vô hại sống trong

ruột già người và ñộng vật E coli thường xuất hiện rất sớm ở ñường ruột người

và ñộng vật, ngay sau khi ñẻ 2 giờ và tồn tại cho ñến khi con vật chết ðến năm

1955, Schofield và Davis mới chứng minh ñược vai trò gây bệnh ñường ruột của

E coli trên lợn con Ở ñiều kiện bình thường, các chủng E coli không gây bệnh,

khi ñiều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, ñiều kiện ngoại cảnh bất

lợi dẫn ñến sức chống ñỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E coli trở nên

cường ñộc và có khả năng gây bệnh

Bệnh phù ñầu ñược mô tả lần ñầu tiên bởi Shanks (1938), dựa trên các nghiên cứu bệnh qua nhiều năm ở Ireland Sau ñó, bệnh phù ñầu ñược phát hiện ở nhiều nước trên thế giới, bệnh ñặc biệt phổ biến trong những năm sau chiến tranh thế giới thứ hai, khi chăn nuôi lợn công nghiệp phát triển (Timoney,1980) Schofield và cộng sự (1954) ñã sớm gọi tên là “lợn loạng choạng”, và quan sát thấy số lượng lợn mắc bệnh tăng lên cùng với việc tăng khẩu phần trong thức ăn

Sokol và cộng sự (1979) cho rằng, vi khuẩn E coli cộng sinh có mặt

thường trực trong ñường ruột của người và ñộng vật, trong quá trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận các yếu tố gây bệnh như: yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố kháng kháng sinh và ñộc tố ñường ruột Những yếu tố gây bệnh này ñã giúp cho vi khuẩn

E coli bám dính vào tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát

triển với số lượng lớn Sau ñó vi khuẩn sản sinh ñộc tố, gây triệu chứng thần

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 4

kinh, phù ñầu, tế bào nhung mao ruột non, gây tiêu chảy

E coli không chỉ có ở lợn bệnh mà còn có trong cơ thể các lợn khỏe, chúng ñược coi là một trong những nguyên nhân gây ra thiệt hại ñáng kể trong ngành chăn nuôi lợn Fairbrother và cộng sự (1992), ñã nghiên cứu các yếu tố

gây bệnh ở từng chủng vi khuẩn E coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, tác giả ñã ñặt tên các chủng vi khuẩn E coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng

có khả năng sản sinh ra như: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC), Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC), và ñã sắp xếp

các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây ra những thể bệnh ñặc trưng cho từng lứa tuổi bệnh khác nhau

Davis và cộng sự (1998) ñã nghiên cứu làm rõ vai trò của ba loại kháng

nguyên bám dính K88 trong vi khuẩn E coli là K88ab, K88ac và K88ad cho biết: Các chủng vi khuẩn E coli sản sinh ñộc tố ñường ruột (ETEC) có mang

những kháng nguyên bám dính này ñều gây tiêu chảy nặng dẫn ñến chết ở một

số lợn con Sự cảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con có liên quan mật

thiết ñến khả năng bám dính của vi khuẩn E coli

Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E coli,

việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng ñã ñược các nhà khoa học trên thế giới ñặc biệt quan tâm Akita và cộng sự (1993)

ñã nghiên cứu sản xuất kháng thể ñặc hiệu qua lòng ñỏ trứng gà dùng trong phòng và chữa bệnh tiêu chảy cho lợn con

1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E coli ở Việt Nam

Bệnh tiêu chảy và phù ñầu do vi khuẩn E coli gây ra ñã ñược nghiên cứu

từ lâu tại Việt Nam

Nguyễn Thị Nội (1986), ñã nghiên cứu vai trò của vi khuẩn E coli trong

bệnh phân trắng ở lợn con và thăm dò vacxin tiêm phòng ở 7 tỉnh phía bắc gồm:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 5

Hà Tây, Hải Hưng, Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hoá Tác giả ñã xác ñịnh những serotype chủ yếu gây bệnh cho lợn con ở các vùng ñã ñiều tra là: 0149, 0147, 0141, 0139, 0138, 0117, 0115 ðịnh type kháng nguyên OK có

24 serotype, chế vacxin bằng một số chủng E coli có chứa kháng nguyên K88

phân lập ñược tại các cơ sở có lợn bệnh, hiệu lực phòng bệnh từ 49% ñến 65,5%

Nguyễn Khả Ngự (2000), ñã xác ñịnh các yếu tố gây bệnh của E coli

trong bệnh phù ñầu lợn con ở ñồng bằng Sông Cửu Long cho rằng tỷ lệ bệnh phù ñầu ở lợn con sảy ra là 58,78%, tỷ lệ chết 53,54% so với lợn ốm Phân lập

97 chủng E coli có ñầy ñủ các ñặc tính sinh hoá ñiển hình

Tìm hiểu nguyên nhân của hội chứng thần kinh, phù mắt ở lợn sau cai sữa, các tác giả ñã phân lập 135 mẫu hạch màng treo ruột của lợn bệnh phù ñầu, xác ñịnh các type kháng nguyên của 70 gốc E coli bao gồm: 0138: K81; 0139: K82; 0141: K85ab; O141: K85ac; K88; K87 (Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự, 2000)

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây phù trên lợn sau cai sữa, Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2001) cho rằng vi khuẩn này có khả năng tạo ñộc tố Verotoxin, một số chủng sản sinh ñộc tố ñường ruột ST, LT

chỉ gặp ở các chủng E.coli thuộc nhóm kháng nguyên O141, rất ít ở nhóm kháng

nguyên O138 và O139

Nguyễn Viết Không và cộng sự (2008), nghiên cứu “Biến ñộng kháng thể

kháng E coli phù ñầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp" cho biết: Biến ñộng theo lứa tuổi của kháng thể ñặc hiệu kháng E coli gây bệnh phù ñầu ñược khảo sát ở

các lứa tuổi, chăn nuôi kiểu công nghiệp, bằng phương pháp ELISA kháng thể,

sử dụng kháng nguyên F18 - pili

Nguyễn Thị Kim Lan (2003), ñã ñiều tra tình hình bệnh phù ñầu, những

biểu hiện lâm sàng và bệnh tích của lợn con do E coli ở một số ñịa phương của

tỉnh Thái Nguyên Tác giả ñã ñiều tra tổng số 3.754 con có tỷ lệ mắc bệnh trong ñàn là 45,77%, tỷ lệ lợn chết là 61,44% trong số lợn bị bệnh

Phạm Ngọc Thạch và cộng sự (2004) ñã nghiên cứu một số ñặc ñiểm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 6

bệnh lý ở lợn con mắc bệnh phù ñầu do E coli và biện pháp phòng trị Tác giả

ñã kiểm tra theo dõi một số chỉ tiêu sinh hoá máu và chỉ tiêu sắc tố mật, so sánh với lợn khoẻ và thử nghiệm một số kháng sinh ñiều trị, kháng sinh ñiều trị có hiệu quả là Enrofloxacin, Oxytetracyclin và Colistin

Nghiên cứu một số ñặc ñiểm dịch tễ học của bệnh phù ñầu lợn con từ 21-

60 ngày tuổi tại huyện Sóc Sơn - Hà Nội cho thấy lợn thường mắc bệnh vào mùa

hè, chiếm 24,23% và mùa ñông 19,27% Thời gian cai sữa cho lợn cũng ảnh hưởng ñến tỷ lệ mắc bệnh Cai sữa cho lợn con vào lúc 45 ngày tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất 22,97% và cai sữa lúc 21 ngày tuổi có tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất 12,65% (Lê Thanh Nghị và cộng sự, 2005)

Như vậy, trong thời gian qua ở nước ta, những nghiên cứu về bệnh phù ñầu do vi khuẩn E coli gây ra ñã ñược một số tác giả quan tâm nghiên cứu và bước ñầu có ñược những kết quả về mầm bệnh Nhưng ñể có thể khống chế ñược bệnh thì cần phải có những nghiên cứu sâu hơn nữa về mầm bệnh

1.2 ðặc tính sinh học của vi khuẩn E coli

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichieae Trong các vi khuẩn ñường ruột thì loài Escherichia coli (E coli)

là phổ biến nhất

1.2.1 ðặc ñiểm hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, kích thước 2-3 x 0,6 µm, ñứng

riêng lẻ ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn Có khi trong môi trường nuôi cấy có những trực khuẩn dài 4 - 8 µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già, chúng bắt màu Gram âm, có thể bắt màu ñều hoặc sẫm ở 2 ñầu

Vi khuẩn E coli di ñộng nhờ có lông ở xung quanh thân, nhưng khi nuôi

cấy trong ñiều kiện bất lợi sẽ mất lông và không di ñộng Vi khuẩn không sinh nha bào Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày ñể nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi sẽ không thấy ñược (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 7

1.2.2 ðặc tính nuôi cấy

E coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt ñộ 5- 46oC, nhiệt ñộ thích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,2- 7,4 nhưng có thể phát triển ñược ở môi trường pH từ 5,5- 8 (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001)

Vi khuẩn có thể phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số vi khuẩn có thể phát triển ñược ở môi trường tổng hợp ñơn giản nên người ta thường chọn chúng làm mẫu ñể nghiên cứu về sinh học Khi nuôi cấy trên các môi trường, ñể trong tủ ấm ở 37oC sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau:

- Trên môi trường thạch thường: sau 24 giờ hình thành những khuẩn

lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi, ñường kính 2-3 mm

- Trong môi trường nước thịt: sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ thấy vi khuẩn

E coli phát triển tốt, môi trường rất ñục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống

ñáy, ñôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường Môi trường có mùi phân thối

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 8

- Trên mơi trường thạch máu: hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền

khơng gọn, màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm Cĩ khi gây dung huyết

- Trên mơi trường thạch Mac Conkey: hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh

sen, trịn nhỏ, hơi lồi, khơng nhày, rìa gọn, khơng làm chuyển màu mơi trường -

Thạch SS (Salmonella – Shigella): E coli cĩ khuẩn lạc màu đỏ

- Mơi trường Cimon citrate: khuẩn lạc khơng màu trên nền xanh lục

- Mơi trường chẩn đốn chuyên biệt EMB (Eosin Methyl Blue): khuẩn lạc

cĩ màu ánh kim đặc trưng

- Mơi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ

- Trên mơi trường thạch Brilliant Green: E coli hình thành khuẩn lạc

dạng S (Smooth) màu vàng nhạt

1.2.3 ðặc tính sinh hĩa

- Chuyển hĩa đường

Vi khuẩn E coli cĩ khả năng lên men sinh hơi các loại đường glucoza,

fructoza, galactoza, lactoza, maniton, mannit, levuloza, xyloza

Khơng lên men các loại đường andonit và innozit, lên men khơng chắc

chắn với các loại đường dulciton, saccaroza, salixin

- Các phản ứng khác

Indol: + Di động: + Catalaza: + MR: + Oxidaza: - VP: - Ureaza: - H2S: -

Vi khuẩn E coli cĩ khả năng hồn nguyên nitrate thành nitrit, khử

cacboxyl trong mơi trường lysine decacboxylase

1.2.4 Sức đề kháng

E coli khơng sinh nha bào nên nĩ cĩ sức đề kháng kém với nhiệt độ, bị

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 9

diệt ở 50oC/ 1 giờ, 60oC/ 30 phút, ñun sôi ở 100oC chết ngay Các chất sát trùng thông thường như axit phenic, biclorua thủy ngân, formol 0,2%, hydroperoxit 1‰ diệt vi khuẩn sau 5 phút

1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên

E coli ñược chia làm các serotype khác nhau dựa theo cấu trúc kháng

nguyên O, K, H và F Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học ñã tìm ñược

250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F (Carter, 1995), (Fairbrother, 1992)

- Kháng nguyên O (kháng nguyên thân - Ohne Hauch): ðây là thành phần

chính của vỏ vi khuẩn và ñược coi như là một yếu tố ñộc lực của vi khuẩn Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) LPS ñược cấu tạo bởi 3 thành phần chính là lipid A, nhân Oligosaccharide (core - Oligosaccharide)

và chuỗi O - specific polysaccharide Các nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn ñược xác ñịnh dựa trên sự khác nhau của phần O - specific polysaccharide Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Ngưng kết kháng nguyên tạo thành những hạt nhỏ, khó tan

Kháng nguyên O chịu ñược nhiệt, không bị phá hủy khi ñun nóng ở 100oC trong 2 giờ Dưới tác ñộng của cồn, axit HCl nồng ñộ 1N chịu ñược 20 giờ nhưng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%

- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch): Kháng nguyên H là

thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein

Kháng nguyên H có ñặc tính dễ bị phá hủy ở 60oC trong 1 giờ, bị cồn và các enzyme phân giải protein phá hủy; kháng nguyên H vẫn tồn tại khi xử lý bằng formol 0,5% Kháng nguyên H không phải là yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn

so với kháng nguyên O

Kháng nguyên H của vi khuẩn E coli không có vai trò bám dính, không có

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 10

ñộc tính và cũng không có ý nghĩa trong ñáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít ñược quan tâm nghiên cứu nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác ñịnh giống loài của vi khuẩn (Orskov F, 1978)

- Kháng nguyên K (Kháng nguyên giáp mô - Capsular)

Kháng nguyên K còn ñược gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) và có bản chất hóa học là polysaccharide

Vai trò của kháng nguyên K chưa ñược thống nhất Có ý kiến cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về ñộc lực Ý kiến khác cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về ñộc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu

tố phòng vệ của vật chủ và giúp gắn kết kháng nguyên bám dính vào tế bào biểu

mô nhung mao ruột dễ dàng

- Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh ñều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng

nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và lớp trên màng nhày ñể xâm nhập và

gây bệnh, ñồng thời chống lại khả năng ñào thải vi khuẩn của nhu ñộng ruột

Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli ) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4 (K88), F5

(K99), F6 (987P), F18 và F41 (Cater.G.R và cs, 1995)

1.2.6 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli

a Yếu tố bám dính

ðể gây bệnh, các chủng ETEC, EPEC phải bám dính lên trên tế bào biểu

mô của ruột non Quá trình bám dính ñược thực hiện qua 3 giai ñoạn: hấp thụ, gắn kết và bám dính Hầu hết các chủng ETEC ñều có các yếu tố bám dính bao gồm F4, F5, F6, F17, F18, F41, F42 và F165

Các chủng E coli gây bệnh phù ñầu thường có yếu tố bám dính là F18,

ñược Bertchinger phát hiện năm 1988 trên những chủng E coli phân lập từ lợn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 11

mắc bệnh phù ñầu (Berschinger và cs, 1988) Có 2 biến chủng F18 ñược ghi nhận dựa vào tính kháng nguyên chung (a) và 2 yếu tố ñặc hiệu (b) và (c), thường gọi là F18ab và F18ac (Smeds và cs, 2001) Hai biến chủng này có thể phân biệt ñược bằng phản ứng huyết thanh học Biến chủng F18ab thường gặp ở

các chủng E coli thuộc nhóm kháng nguyên O139, có sản sinh ñộc tố Shiga

biến thể 2e (Stx2e) gây phù ñầu lợn sau cai sữa Biến chủng F18ac thường gặp ở

các chủng vi khuẩn E coli thuộc nhóm kháng nguyên O138, O141, O149 và có

khả năng sinh ñộc tố ñường ruột gây tiêu chảy ở lợn con trước và sau cai sữa (Nagy và cs, 1997)

b Yếu tố xâm nhập

Yếu tố xâm nhập giúp cho vi khuẩn E coli qua ñược hàng rào bảo vệ của

lớp nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc ñể xâm nhập vào tế bào biểu mô ñồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi ñó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập không thể qua ñược hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua ñược hàng rào này sẽ bị bắt bởi tế bào ñại thực bào của

tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1976)

c Vai trò gây bệnh của các yếu tố kháng nguyên

Vi khuẩn E coli có nhiều loại kháng nguyên Trong ñó, có loại tạo miễn

dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch cho vật chủ nhưng ñều tham gia quá trình gây bệnh bằng cách tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào

tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu

tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ

Các kháng nguyên tham gia quá trình trên gồm kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F (Garten và cs, 1974)

d Yếu tố dung huyết (Hly) của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli có khả năng tiết men Haemolyzin làm phân hủy hồng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 12

cầu gây dung huyết, ñây ñược coi là một yếu tố ñộc lực gây bệnh của vi khuẩn

E coli phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài ñường ruột có khả năng

dung huyết cao hơn nhiều so với E coli phân lập từ phân

Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E coli là: α - haemolysin, β -

haemolysin, γ - haemolysin, ε - haemolysin nhưng quan trong nhất là kiểu α - haemolysin và β - haemolysin (Smith, 1963)

e ðộc tố của vi khuẩn E coli

E coli bám dính, xâm nhập vào niêm mạc ruột và sản sinh ra các loại ñộc

tố ñường ruột Các ñộc tố này làm thay ñổi quá trình trao ñổi chất và chất ñiện giải ở ruột non, dịch ruột non tiết ra quá nhiều và không ñược hấp thu ở ruột già gây tiêu chảy Sản sinh ñộc tố ñược xem là một khả năng quan trọng của vi

khuẩn E coli ðộc tố và yếu tố bám dính là những yếu tố ñộc lực vô cùng quan trọng Vi khuẩn E coli sản sinh nhiều loại ñộc tố: nhóm ñộc tố ñường ruột

(Enterotoxin), nhóm ñộc tố tế bào (Shiga/ Verotoxin), Neurotoxin Mỗi loại ñộc

tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra Trong ñó, nhóm ñộc tố tế bào Verotoxin là nguyên nhân gây bệnh sưng phù ñầu lợn

* ðộc tố tế bào Verotoxin (VT2e) gây bệnh phù ñầu ở lợn

Từ năm 1977, Konowalchuck và cs ñã phát hiện một loại ñộc tố hoạt ñộng trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero (do ñó ñược ñặt tên là ñộc tố tế bào

Vero), ñược sản sinh bởi vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy

và bệnh phù ñầu ở lợn con

Cũng trong năm ñó, Konowalchuck và cộng sự (1977), O’Bien và cộng sự

(1977) tìm thấy một số chủng E coli , bao gồm cả chủng H30 ở người, có ñộc tố

tế bào trong môi trường nuôi cấy tế bào Hela ðộc tố tế bào này ñược trung hòa bởi kháng thể ñặc hiệu cho ñộc tố Shiga (Stx) của vi khuẩn gây bệnh lỵ, do ñó

nó còn ñược gọi là ñộc tố giống như Shiga (SLT)

ðến năm 1987, Marques và cộng sự ñã so sánh ñộc tố sản sinh ra do các

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 13

chủng vi khuẩn E coli gây bệnh phù ựầu ở lợn với các chủng sinh SLT I và

SLT II gây bệnh ở người và kết luận rằng yếu tố ựộc lực này là một biến chủng của SLT II nên sau ựó ựược ký hiệu là SLT-IIe

Sự phát hiện của các nhóm nghiên cứu khác nhau về các loại ựộc tố tế bào này ựã ựưa ra nhiều thuật ngữ tương ựồng Thuật ngữ ựộc tố Vero (VTs) hay ựộc

tố giống như Shiga (SLTs) ựược sử dụng trong nhiều năm bởi các nhà nghiên cứu ở Canada và Anh, nhưng nhóm nghiên cứu ở Mỹ lại hay dùng thuật ngữ vi

khuẩn E coli gây ựộc tố Vero (VTEC) hay vi khuẩn E coli sản sinh ựộc tố

giống như Shiga, mặc dù chúng là những từ ựể chỉ một khái niệm như nhau Gần ựây, Caldewood và cộng sự (1996) ựã ựề nghị sử dụng tên ựộc tố Shiga (Shiga toxin - Stx) cho tất cả những ựộc tố tế bào này

Stx sản sinh bởi E coli bao gồm 2 nhóm: Stx1 là nhóm ựộc tố giống như

Stx của vi khuẩn gây bệnh lỵ, và Stx2 là nhóm ựộc tố có liên hệ với Stx

Loại Stx1 ựược sản sinh từ chủng E coli H19, H30, các loại ựộc tố khác

nhau trong nhóm Stx1 chỉ khác nhau ở một axit amin và không gây khác biệt ở tắnh ựộc tố hay tắnh kháng nguyên

độc tố Stx2e (Shiga toxin 2e) hay VT2e ở lợn là một loại trong nhóm ựộc

tố Stx2 với một số khác biệt trong ựặc tắnh sinh học Stx1 và Stx2 gây ựộc cho các tế bào Hela Stx2e kém ựộc hơn so với các loại ựộc tố Stx2 khác Stx2e ựộc hơn cho tế bào Vero từ 10-100 lần so với tế bào Hela Các quan sát này có liên quan tới lượng receptor chuyên biệt có mặt trên các loại tế bào (Blanco, 1983)

Stx2e ựóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân gây bệnh và sự xuất hiện các triệu chứng của bệnh phù ựầu Sau khi tụ ựám và phát triển ở ruột, vi

khuẩn E coli sinh ựộc tố Shiga (STEC) sản sinh ra Stx2e, ựộc tố này ựi qua tế

bào biểu mô ruột vào máu Từ ựó Stx2e gắn kết với các receptor có mặt ở các tế bào màng trong của ựộng mạch, các tiểu ựộng mạch ở các mô và cơ quan khác nhau gây ra các tổn thương vi thể đó cũng là cơ sở của những tổn thương ựại thể và triệu chứng lâm sàng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 14

Triệu chứng cũng có thể thấy khi tiêm tĩnh mạch ñộc tố Stx2e tinh lọc (Macleod và cộng sự, 1991)

1.2.7 Khả năng gây bệnh

Căn cứ vào các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn E coli ñược chia làm 6 nhóm

chính (Trích theo Võ Thành Thìn, 2012)

- Enteropathogenic E coli (EPEC): mang yếu tố bám dính và có khả năng

xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột; gây triệu chứng sốt, tiêu chảy Vi khuẩn nhóm này gây bệnh ở người, thỏ, chó, mèo, lợn và ngựa

- Enterotoxigenic E coli (ETEC): Vi khuẩn nhóm này thường có khả năng

mang một số kháng nguyên bám dính (kháng nguyên pili và sinh ñộc tố ñường tiêu hóa LT (heat labile enterotoxin) và ST (heat stable enterotoxin) Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy trên người, lợn, cừu, gà, bò, chó và ngựa

- Enteroinvasive E coli (EIEC): Vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào

ruột kết, làm dung giải thể thực bào (phagosome) Vi khuẩn nhóm này chủ yếu phân lập ñược ở người

- Enterohaemorhagic E coli (EHEC): Vi khuẩn nhóm này thường sản

sinh yếu tố xâm nhiễm, ñộc tố Shiga (Stx) Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thường gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng Vi khuẩn thường phân lập ñược

từ người và ñộng vật nhai lại

Dựa trên khả năng sinh ñộc tố Shiga của vi khuẩn thuộc nhóm EHEC, một số tác giả xếp vi khuẩn này vào 1 nhóm khác là Shiga-toxin producing

E coli (STEC) hay còn có tên khác là Verotoxigenic E coli (VTEC)

- Enteroaggregative E coli (EAEC): Vi khuẩn bám lên trên thành ruột

non và ruột già, sản sinh ñộc tố tế bào và ñộc tố ñường tiêu hóa (EAST1) Vi khuẩn nhóm này chỉ có thể tìm thấy ở người và có thể ở lợn, bò

- Diffusely adherent E coli (DAEC): có thể tìm thấy trong ruột non, ñặc

biệt là ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 15

1.2.8 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli

Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh trong thú y chưa ñược quản lý chặt

chẽ, người chăn nuôi sử dụng kháng sinh sai nguyên tắc, hầu hết sử dụng kháng sinh tổng hợp ñể ñiều trị bệnh mà không xác ñịnh chính xác nguyên nhân gây bệnh, dùng kháng sinh ñể phòng bệnh, trộn kháng sinh vào thức ăn ñể phòng bệnh và kích thích tăng trưởng… Do ñó, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng khiến cho việc ñiều trị bệnh do vi khuẩn gây ra gặp rất nhiều khó khăn Nhiều loại kháng sinh ñã bị kháng hoàn toàn dẫn ñến các nguồn

kháng sinh sử dụng ñược bị thu hẹp Trong ñó, vi khuẩn E coli cho ñến nay ñã

có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh và việc nghiên cứu tính mẫn cảm

kháng sinh của E coli ñang ñược các nhà khoa học quan tâm nhằm ñưa ra ñược

phác ñồ ñiều trị hiệu quả nhất

Yếu tố quy ñịnh khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli nằm trong plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn E coli nói riêng và vi

khuẩn thuộc họ vi khuẩn ñường ruột nói chung có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn Vì vậy, nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo rắc tính kháng thuốc Sử dụng một loại thuốc hóa học trị liệu nào ñiều trị vi khuẩn E coli trong một thời gian dài thì vi khuẩn sẽ có khả năng kháng không chỉ thuốc ñó mà cả các thuốc khác nữa Các gen quy ñịnh tính kháng thuốc thường là: gen blaCMY2 kháng với các kháng sinh nhóm Cephalosporin, gen dfA17 kháng với Trimethoprim, gen aadA5 kháng với

Spectinomycin Ngoài ra, vi khuẩn E coli còn có khả năng truyền kháng theo chiều ngang cho nhiều loại vi khuẩn khác như: Salmonella sp, Klebsiella pneumonia, Proteus Carl M Schroeder et al (2002) ñã nghiên cứu tính kháng thuốc của 752 chủng E coli ñược phân lập ở người và ñộng vật cho biết: Với

các chủng phân lâp từ gia súc gia cầm có 71% chủng kháng với Streptomycin, 63% chủng kháng với Tetracyclin, 20% kháng với Gentamycin, 16% kháng với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 16

SXT và Ampicillin Các chủng phân lập từ lợn và mèo thì cho thấy tỉ lệ kháng thuốc khá cao có 82% chủng kháng với Sulfamethoxazole/Trimethoprme, 76% chủng kháng với Streptomycin, 67% kháng với Tetracyclin

Năm 2002, khi nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng E coli

phân lập từ lợn con theo mẹ ở miền Bắc Việt Nam, ðỗ Ngọc Thúy và cs ñã thu ñược kết quả: Các chủng E coli có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường vẫn dùng ñể ñiều trị bệnh như: Amoxicillin (76,42%), Chloramphenicol (79,25%), Streptomycin (88,68%), Tetracyclin (97,17%), Trimethoprim/Sulfamethoxazol (80,19%) Hiện tượng kháng trên 3 loại thuốc của vi khuẩn là phổ biến (chiếm 90,57%)

Như vậy, các chủng E coli ở mỗi thời gian và ñịa ñiểm khác nhau cũng

có tính kháng kháng sinh khác nhau

1.3 Bệnh phù ñầu ở lợn do vi khuẩn E coli gây ra

1.3.1 Mầm bệnh

Bệnh phù ñầu ở lợn (Edema Disease in pig) là bệnh do vi khuẩn E coli có

yếu tố bám dính Fimbriae 18 (F18) và có khả năng sản sinh ñộc tố Verotoxin 2e (VT2e) gây ra

Theo Marques và cộng sự (1987), bệnh sưng phù ñầu hay còn gọi là

“bệnh phù thũng” hoặc “bệnh phù ruột” là sự tích ñọng nhiều nước dịch tại các

tổ chức trong cơ thể, dịch tích ñọng ở thành dạ dày, thành ruột, hoặc dưới mí mắt và nhiều bộ phận khác của cơ thể, song ở não là quan trọng nhất, nó gây ra các triệu chứng thần kinh

Các giống vi khuẩn ñã phân lập ñược từ bệnh phù ñầu thường gặp nhất là các serotype huyết thanh: O138:K81, O139: K82, O141: K85

Serotype O139 ñược tìm thấy trên khắp thế giới và có yếu tố bám dính F18ab

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 17

1.3.2 Dịch tễ học

Bệnh phù thũng thường xảy ra ở ñộ tuổi từ 4 - 12 tuần tuổi, ñặc biệt là giai ñoạn 1 – 2 tuần sau cai sữa Lợn con chưa cai sữa cũng có thể bị mắc phù ñầu và mức ñộ trầm trọng phụ thuộc vào kháng thể trong sữa của con mẹ Ở lợn trưởng thành, phù ñầu thường là nguyên nhân của triệu chứng thần kinh và là nguyên nhân gây chết ñáng kể Lợn bị bệnh thường là những con phát triển nhanh nhất trong ñàn

Bệnh xảy ra nhanh và kết thúc cũng nhanh, quá trình diễn biến của bệnh

từ 4 - 14 ngày, trung bình khoảng 1 tuần Tỷ lệ chết khoảng 65 - 90 %

Bệnh xuất hiện lẻ tẻ, ít lây lan từ ñàn này sang ñàn khác Bệnh xảy ra rải rác quanh năm nhưng thường gặp nhất vào giai ñoạn chuyển mùa từ xuân sang

hè, thu sang ñông, trong nhân dân hay gọi là ‘‘mùa phù ñầu”

1.3.3 Phương thức truyền lây của bệnh

Các chủng E coli gây bệnh ñược lợn ốm bài thải theo phân, truyền lây

sang lợn khỏe qua không khí, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi và các nhân tố trung gian khác, xâm nhập vào lợn khỏe và gây bệnh

Môi trường ở chuồng cai sữa có thể là nguồn lây nhiễm các chủng E coli gây bệnh phù ñầu Lợn chưa cai sữa có thể nhiễm trong chuồng ñẻ và mang

nó ñến chuồng cai sữa Việc xâm nhập của các chủng E coli gây bệnh vào các

ñàn ñược nuôi trong các ñiều kiện ñặc biệt và không có mầm bệnh (Specific pathogen free - SPF) vẫn có thể gặp với thời gian ngắt quãng là 1 ñến 2 năm Những serotype gây bệnh phù ñầu sau cai sữa thường giống nhau trong những vùng rộng (Aareshup và cs, 1997)

Ở một vùng bị nhiễm E coli gây bệnh thì chủng ñó có khả năng lưu tồn

một thời gian dài, các chủng E coli gây phù ở một vùng thì giống nhau

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 18

1.3.4 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn E coli có trong ñường tiêu hóa của lợn con, khi có sự thay ñổi

lớn về dinh dưỡng, ñiều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi, dẫn ñến sức ñề kháng của con vật suy giảm, vi khuẩn

E coli sẽ tăng về số lượng, ñộc lực và có khả năng gây bệnh

ðầu tiên vi khuẩn E coli (mang yếu tố bám dính F18) tập trung thành ñám

ở lớp màng nhầy của riềm bàn chải ñể có thể bám dính ñược vào thành ruột Mức

ñộ tập trung này quyết ñịnh liệu có gây ra bệnh hay không Chúng bám dính vào

cơ quan cảm nhận (receptor) nằm ở riềm bàn chải, sau ñó vào lớp tế bào biểu mô rồi nhân lên, sản sinh ñộc tố VT2e Từ lớp tế bào biểu mô, ñộc tố vào máu ñến các cơ quan ñích như các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa, hô hấp, não, tại các cơ quan này ñộc tố VT2e gây hoại tử thành mạch máu, làm thay ñổi tính thấm thành mạch gây phù, mất cơ chế ñiều chỉnh luồng máu trong não, làm tổn thương mô não làm xuất hiện các triệu chứng thần kinh và có thể gây chết

Hình 1.1 Cơ chế gây bệnh sưng phù ñầu của vi khuẩn E coli

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19

1.3.5 Triệu chứng

Trong ñàn có thể xuất hiện những lợn chết ñột ngột mà không biểu hiện triệu chứng Những trường hợp khác thấy lợn có triệu chứng thần kinh như: mất thăng bằng, ñi lảo ñảo, ñầu nghiêng, chạy lung tung, 4 chân yếu hoặc liệt, lúc gần chết có hiện tượng bơi chèo Thở khó, kêu khàn khàn do thanh quản

Hiện tượng phù có thể quan sát ñược vào ngày thứ 2 - 3, sưng phù mí mắt thường xuất hiện trước khi có dấu hiệu thần kinh Sau ñó là sưng phù mũi, mắt, môi, ñầu, mặt và tai

Biểu hiện thần kinh ngày càng nặng, giai ñoạn cuối con vật co giật, ho, khó thở Ở thể quá cấp con vật có thể chết nhanh trong vòng 6 - 20 giờ

Hình 1.2 Lợn mất thăng bằng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 20

1.3.6 Bệnh tích

- Bệnh tích ñại thể

Phù là biểu hiện ñặc trưng của bệnh, bao gồm: Phù mí mắt, mặt, ñầu lợn, sưng phù dưới da, ñặc biệt là phù dưới lớp niêm mạc dạ dày, phù ở màng treo ruột ñoạn kết tràng là bệnh tích rất ñiển hình

Bề ngoài xác lợn thấy da ñỏ lên ở phần bụng, máu ñặc thẫm, hạch ruột và hạch bẹn nông sưng

Lớp dưới niêm mạc ñường cong lớn của dạ dày, ở lớp màng nhầy của ñoạn cuối ruột non, ñầu ruột già xuất huyết

Xoang bụng và xoang ngực tích nước

Viêm phổi và màng phổi, lách, thận sưng, tụ máu hoặc xuất huyết

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 21

hưởng Phù ở các tế bào cơ quan nội tạng, tổn thương ở não cùng với tổn thương

Hình 1.7 Niêm mạc ruột xuất huyết

(bên trái) và bình thường(bên phải)

Hình 1.8 Niêm mạc dạ dày xuất huyết (bên trái) và bình thường

(bên phải)

(Nguồn: Tư liệu phịng Vi trùng – Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung Ương)

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 22

1.3.7 Chẩn đốn

- Chẩn đốn bệnh dựa vào: Lứa tuổi mắc bệnh, dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể của lợn bệnh

- Chẩn đốn vi khuẩn học trong phịng thí nghiệm theo các bước:

+ Nuơi cấy vi khuẩn trên các mơi trường: Thạch máu , thạch MacConkey, nhuộm tiêu bản và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi

+ Phân lập, thuần khiết vi khuẩn: Chọn khuẩn lạc đặc trưng ria cấy lại trên mơi trường thạch và nước pepton, để ở 37oC/24 giờ

+ Giám định tính chất sinh hĩa: Tiến hành làm các phản ứng sinh hĩa đặc

trưng của vi khuẩn E coli

+ Cĩ thể kiểm tra khả năng sản sinh độc tố VT2e bằng cách tiêm cho động vật thí nghiệm hoặc dùng phản ứng PCR phát hiện gene VT2e

- Cần chẩn đốn phân biệt với các bệnh giả dại hoặc viêm não

1.3.8 Các loại vacxin phịng bệnh phù đầu

Hiện nay, các nhà khoa học cĩ xu hướng nghiên cứu sản xuất vacxin

chuồng Người ta phân lập một số chủng E coli gây bệnh phù đầu ở một vùng,

một địa phương, rồi dùng để chế tạo vacxin phịng bệnh cho lợn ở chính vùng đĩ ðây là một vacxin vơ hoạt cĩ hiệu lực phịng bệnh cao Cĩ thể cho uống hoặc tiêm vacxin sau khi lợn được 3 - 5 tuần tuổi (Nguyễn Bá Hiên và cộng sự, 2009) Bên cạnh đĩ, việc nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lịng đỏ trứng gà để phịng

chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E coli ở lợn cũng đang được quan tâm

Ngồi ra, trên thị trường nước ta cĩ lưu hành một số loại kháng thể E coli

phịng bệnh phù đầu như: Hanvet K.T.EHI của cơng ty Hanvet (Nguyễn Hữu Vũ

và cộng sự, 2010),Hanvet TOBACOLI

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 23

CHƯƠNG 2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu phân lập được từ lợn nghi mắc bệnh ở

một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam

2.2 ðịa điểm nghiên cứu

ðể triển khai các nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tơi đã thực hiện nghiên cứu tại Phịng Vi trùng thuộc Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung Ương

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu ở lợn

2.3.2 Xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn E coli phân lập được

2.3.3 Xác định yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được

- Khả năng dung huyết

- ðộc tố Verotoxin Vt2e và yếu tố bám dính F18

2.3.4 Xác định serotype của vi khuẩn E coli phân lập được

2.3.5 Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được