NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM XT41 ỨNG DỤNG TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIA CẦM

MỞ ĐẦUNgày nay, khi xã hội phát triển càng cao, các vấn đề về chất lượng và an toànthực phẩm ngày càng chiếm một vị trí quan trọng.Tuy vậy hiện nay trong lĩnh vựcsản xuất, k

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Hoài Hà và

Th.S Phạm Thị Bích Đào, các thành viện trong nhóm đề tài nhánh: “Phân lập,

sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ Thraustochytrid ở rừng ngập mặn Xuân Thủy,

Nam Định” Phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học

Quốc gia Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ trong quá trình thực tập và thực hiệnkhóa luận Xin cảm ơn Cô và Chị đã luôn động viên giúp đỡ trong từng công việc.Tôi đã học hỏi được ở cô và chị sự cẩn thận, nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Mai Thị Đàm Linh người

đã tận tình giảng dạỵ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thànhkhóa luận

Tôi xin cảm ơn tới Thầy, Cô trong Bộ môn vi sinh vật học, Khoa Sinh Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn đến Gia đình, Anh, Chị, Em và các Bạn đồng môn đã luônđồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận và cuộc sống Các chị,các bạn và các em để lại cho tôi nhiều kỷ niệm vui và đáng nhớ trong thời giannghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Đình Tương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Thức ăn chăn nuôi gia cầm 2

1.1.1 Tình hình thức ăn chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam 2

1.1.2 Sử dụng vi tảo biển dị dưỡng trong thức ăn chăn nuôi gia cầm 3

1.1.3 Nhu cầu sử dụng VTBDD Schizochytrium trong thức ăn chăn nuôi gia cầm 4

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 5

1.2.1 Vị trí phân loại 5

1.2.2 Đặc điểm sinh học của vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 6

1.2.3 Đặc điểm hạt lipid 8

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng của VTBDD Schizochytrium 9

1.2.5 Một số nghiên cứu về vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 11

Chương II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Máy móc và dụng cụ 12

2.1.3 Hóa chất 12

2.2 Môi trường nuôi cấy 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Các phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi tảo 12

2.3.1.1 Phương pháp xác định số lượng tế bào tế bào bằng buồng đếm Neubauer 12

2.3.1.2 Xác định trọng lượng khô 13

2.3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của VTBDD Schizochytrium 13

2.3.2.1 Ảnh hưởng của pH 14

2.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 14

2.3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 14

2.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 14

2.3.3 Phương pháp lên men thu sinh khối tao trong hệ thống bình lên men

10 lít 15

2.3.3.1 Chuẩn bị cho quá trình lên men 15

2.3.3.2 Lên men 16

2.3.4 phương pháp xác định lipid và tách acid béo 17

2.3.4.1 Phương pháp nhuộm Nile red 17

2.3.4.2 Phương pháp tách acid béo 17

Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Quan sát hình dạng tế bào cuả chủng Schizochytrium XT41 19

3.2 Xác định trọng lượng khô và hàm lượng lipid của Schizochytrium XT41 .19 3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng VTBDD Schizochytrium XT41 20

3.2.1 Ảnh hưởng của pH 20

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 22

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 23

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 24

3.3 Lên men 26

3.4 Xác định lipid và phân tích thành phẩn acid béo 28

3.4.1 Xác định lipid nội bào 28

3.4.2 Phân tích thành phần acid béo 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DPA Docopentaenoic acid

EPA Eicosapentaenoic acid

LCPUFA Long Chain Polyunsanturated fatty acid - Acid béo không

no đa nối đôi mạch dàiMUFA Monounsanturated fatty acid - Acid béo không no một nối

đôiHPLC High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chăn nuôi gia cầm 2

Hình 1.2 Schizochytrium quan sát dưới kính hiển vi (×40) 7

Hình 1.3 Vòng đời của Schizochytrium 7

Hình 1.4 Hình dạng tế bào trong từng chu kỳ phát triển của Schizochytrium 8

Hình 3.6 Sơ đồ quá trình lên men 15

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của VTBDD Schizochytrium XT41 (× 40) 19

Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của Schizochytrium XT41 21

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 22

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 24

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 25 Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng của VTBDD Schizochytrium XT41 trong hệ thống bình lên men 10 lít 27

Hình 3.9 Tế bào bắt màu vàng (trái) và tế bào trước khi nhuộm Nile red (phải) của các hạt lipid trong tế bào VTBDD Schizochytrium XT41 28

DANH M C B NGỤC BẢNG ẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 12 Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng số và trọng lượng khô của VTBDD Schizochytrium XT41 phân lập từ RNM Xuân Thủy, Nam Định 20 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 .22 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41 .23 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự sinh trưởng của VTBDD

Schizochytrium XT41 25 Bảng 3.6 Theo dõi quá trình lên men 26

Bảng 3.7 Thành phần acid béo của VTBDD Schizochytrium XT41 29

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội phát triển càng cao, các vấn đề về chất lượng và an toànthực phẩm ngày càng chiếm một vị trí quan trọng.Tuy vậy hiện nay trong lĩnh vựcsản xuất, kinh doanh và chăn nuôi gia cầm còn tồn tại nhiều vấn đề đáng lo ngại.Thức ăn chăn nuôi được sử dụng các chất kích thích tăng trưởng, hormone tăngtrọng thúc đẩy sinh trưởng để tạo ra những sản phẩm "siêu nạc" Theo đó, mộtlượng lớn các hóa chất, kháng sinh tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hạinghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, việc chủ động tìm nguồn dinhdưỡng thay thế bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để đảm bảo chất lượng thực phẩm là

vô cùng cần thiết

Theo nhiều nghiên cứu, vi tảo có giá trị sử dụng không giới hạn trong thựcphẩm sấy khô và thức ăn chăn nuôi Vi tảo có tốc độ sinh trưởng nhanh, năng suấttạo sinh khối cao, dễ nuôi trồng, ít cạnh tranh với đất nông nghiệp, đặc biệt giàu cácchất dinh dưỡng có khả năng tiêu hóa cao, đa phần là các acid béo không no đa nốiđôi (Polyunsanturated fatty acid - PUFAs) và carbohydrates ở dạng tinh bột,glucose, polysaccharides Trong số khác vi tảo được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi,loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) được sử dụng rộng rãi Một số loài VTBDD sản

xuất nhiều ω-3 như: Thrautochytrium aureum, Schizochytrium spp., Crypthecodinium cohnii, Ulkenia spp., Amphidinium carterae và Labyrinthula spp., trong đó loài Schizochytrium cho sản lượng DHA cao nhất, đạt đến 138 mg/l/h Mặt

khác, việc sử dụng VTBDD để sản xuất DHA có rất nhiều ưu điểm như: dễ dàngduy trì điều kiện nuôi cấy tối ưu và thuần, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và khíhậu, có thể kiểm soát được quá trình sản xuất và chất lượng sản phẩm.Vì vậy, việcsàng lọc được vi tảo cho sản xuất thức ăn chăn nuôi là hết sức quan trọng Tuynhiên, giá trị dinh dưỡng loại vi tảo này thay đổi tùy theo điều kiện môi trường vàyếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng Xuất phát từ thực tế trên chúng

tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy vi tảo biển

dị dưỡng schizochytrium XT41 ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi gia cầm " Với mục đích: xác địch điều kiện tối ưu cho Schyzochytrium sinh trưởng và

phát triển Tách chiết được các hợp chất quan trọng bổ sung vào thức ăn chăn nuôinhư PUFAs, Asthaxanthin

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Thức ăn chăn nuôi gia cầm

1.1.1 Tình hình thức ăn chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam

Trong 10 năm gần đây, chăn nuôi nước ta phát triển mạnh, với tốc độ tăngtrưởng 6%/năm Theo thống kê của Phòng Thức ăn chăn nuôi (Cục Chăn nuôi - BộNông Nghiệp và Phát triển Nông thôn), giai đoạn 2002 - 2011, mức tăng trưởngtrung bình của sản lượng toàn ngành thức ăn chăn nuôi công nghiệp đạt khoảng13,5%/năm Đây là một minh chứng đáng mừng cho sự phát triển của ngành chănnuôi nói chung và chăn nuôi công nghiệp nói riêng của nước ta [18]

Hình 1.1 Chăn nuôi gia cầm [27]

Nguyên liệu chính để sản xuất thức ăn chăn nuôi là ngô, thóc, gạo, khoai, sắnchiếm từ 70-80% khối lượng thức ăn hỗn hợp, nhóm thức ăn giàu protein, khoángchất, vitamin và amino acid chiếm 20-30% khối lượng thức ăn hỗn hợp gồm có lạc,

cá, bột xương Trên thực tế, nguồn cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôirất phong phú bao gồm các sản phẩm khai thác nuôi trồng và sản phẩm phụ củangành công nghiệp thủy sản Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năngcung ứng của nguồn này đến ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi trong nước Cụ thể,diện tích ngô và sắn khó mở rộng thêm, đậu tương cho năng suất thấp, không cóquỹ đất chuyên canh, diện tích vụ đông khó mở rộng do giá lao động nông thôn tăngcao Chính vì vậy nhiều năm qua, ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi trong nước taphải phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu Theo Cục Chăn nuôi, năm 2011, nước ta nhậpkhẩu xấp xỉ 8.9 triệu tấn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, tăng 3 lần so với năm 2006

Trong đó, nhóm thức ăn giàu năng lượng như ngô, lúa mỳ, cám mỳ là 3.86 triệu tấn(chiếm khoảng 43%), thức ăn giàu đạm như đỗ tương, khô dầu các loại, bột cá, bộtthịt xương chiếm gần 5 triệu tấn (khoảng 54%), thức ăn bổ sung khoảng 0.2 triệutấn (chiếm 3%) Riêng 8 tháng đầu năm 2012 cả nước đã nhập 1.1 triệu tấn ngô và1.8 triệu tấn lúa mỳ Việc phụ thuộc quá nhiều vào nguyên liệu nhập khẩu khiến chogiá thành sản xuất bị đẩy lên quá cao, các doanh nghiệp buộc phải nhiều lần điềuchỉnh giá bán sản phẩm, khiến cho thị trường thức ăn liên tục biến động [19]

Một trong những giải pháp quan trọng là tìm ra nguồn nguyên liệu mới bổ sungcùng lúa, ngô và giải quyết tình trạng phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu.Việc chủ động tối ưu hóa nguồn nguyên liệu trong nước để sản xuất và cung cấpnguồn thức ăn giàu protein là cần thiết

Do nhu cầu sử dụng protein trong thức ăn cho gia cầm ngày một tăng cao nênnhiều nguồn dinh dưỡng từ VTBDD với hàm lượng docosahexaenoic acid (DHA)và các acid béo có chất lượng cao đang được xem xét để bổ sung vào chế độ ăn chogia cầm

1.1.2 Sử dụng vi tảo biển dị dưỡng trong thức ăn chăn nuôi gia cầm

Các vấn đề liên quan đến sức khỏe và an toàn thực phẩm đang gây áp lực đếnviệc tìm kiếm các loại nguyên liệu tốt hơn mở ra một thị trường rộng lớn cho sinhkhối vi tảo Ngoài việc cải thiện dinh dưỡng, khi bổ sung vi tảo vào thức ăn còn cóthể mang lại sức khỏe cho động vật Đây là nguyên liệu duy nhất có thể thu hoạchquanh năm do đó chúng có thể cung cấp nguồn nguyên liệu cho thị trường thức ănchăn nuôi ổn định và an toàn

Vi tảo là các sinh vật thủy sinh có thể sản xuất tinh bột, dầu, protein, vitamin,sắc tố và các chất hữu cơ Chúng phát triển nhanh hơn nhiều so với cây trồng vìkhông cần sử dụng năng lượng cho rễ, thân, lá Tuy không được cung cấp nhiềunguồn năng lượng nhưng mỗi ngày sinh khối của chúng vẫn có thể tăng gấp 3 hoặc

4 lần Tảo có thể phát triển theo tất cả các hướng nên tốn ít diện tích nuôi trồng, 1hecta nuôi trồng tảo có thể sản xuất cùng một lượng protein trong một năm so với

21 hecta đậu nành hoặc 49 hecta ngô [24]

Ở điều kiện phát triển trong hệ thống mở, hầu hết vi tảo tự dưỡng phải phụthuộc chặt chẽ vào nguồn năng lượng ánh sáng để cố định CO2 tạo nguồn cung cấp

carbon Tuy nhiên, hệ thống này gặp phải một số nhược điểm lớn như: ánh sángkhuyếch tán không đều trên khắp hệ thống nuôi cấy, dễ nhiễm các loại vi sinh vậtkhác hay các sinh vật phù du Do đó, các loại VTBDD với khả năng chuyển hóatrao đổi năng lượng từ các hợp chất hữu cơ đơn giản, và phát triển với số lượng tếbào khá cao trong quá trình lên men đã được xem xét để sản xuất sinh khối lớn, sửdụng quá trình lên men để làm giảm chi phí nuôi trồng Ước tính chi phí cho việcsản xuất 1kg sinh khối VTBDD thấp hơn 5 dollar so với chi phí sản xuất ở hệ thốngquang sinh học đối với tảo tự dưỡng [26]

VTBDD được sử dụng cho sản xuất DHA thương mại như Cryptothecodinium cohnii thuộc ngành Dinophyta, và Schizochytrium spp., thuộc ngành Heterokonta.

Việc sử dụng các loài khác nhau thuộc chi Thraustochytrium và Ulkenia trong ngành Heterokonta với cùng một mục đích hiện đang được nghiên cứu

Tuy nhiên, do nguồn gốc VTBDD là loài sống cộng sinh nên sinh khối của nókhó thuần nhất và lưu giữ Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu,nuôi giữ giống thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm và quy trình côngnghệ nuôi chưa thích hợp để đảm bảo nhân nhanh sinh khối từ giống ban đầu Hiệnnay, ở Việt Nam, các chủng giống tảo sử dụng trong ngành chế biến thức ăn chănnuôi chủ yếu có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình công nghệ nuôi trồng chưa thíchhợp với điều kiện khí hậu trong nước nên hiệu quả đem lại chưa cao Do vậy, việcphân lập, định loại và sử dụng vi tảo làm thức ăn vẫn gặp nhiều khó khăn, chưa khaithác hết vai trò của vi tảo cũng như chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế

1.1.3 Nhu cầu sử dụng VTBDD Schizochytrium trong thức ăn chăn nuôi gia cầm

Sử dụng vi tảo làm thức ăn chăn nuôi cho động vật được bắt đầu từ đầu nhữngnăm 70, ước tính có khoảng 30% sản lượng vi tảo trên thế giới được dùng cho sảnxuất thức ăn chăn nuôi Một số nghiên cứu đã chỉ ra các chất béo có trong VTBDDbao gồm: glycerol có khả năng este hóa các acid béo no và không no, một số khác

có tầm quan trọng đặc biệt như ω-3 và ω-6 Ngoài ra, tảo là nguồn cung cấp cácvitamin thiết yếu như: A, B1, B2, B3, B12, C, E, nicotinic acid, biotin, folic acid, vàbantothinic acid, và giàu các sắc tố chlorophyl (chiếm 0.5% đến 0.1% trọng lượngkhô) và carotenoids (chiếm 0.1% đến 0.2% trọng lượng khô) Trong khẩu phần ăncủa gia cầm, có thể sử dụng 5-10% sinh khối vi tảo thay thế một phần các protein

thông thường Chất béo còn cung cấp các acid béo thiết yếu như acid linoleic, acidlinolenic và acid arachidonic Chất béo giúp hòa tan các vitamin A, D, E và K, cácsắc tố để cho cơ thể dễ hấp thu làm da và mỡ vàng, tăng màu vàng của lòng đỏtrứng Gà khi được nuôi bằng sinh khối vi tảo thì các đặc điểm như màu vàng của

da, cũng như lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể [4]

Ngoài ra chất béo trong thức ăn cũng có tác dụng làm giảm độ bụi giúp giảmthiếu các bệnh về đường hô hấp Khi bổ sung chất béo vào thức ăn cần chú ý bổsung các chất chống oxy hóa để bảo vệ các axit béo không no, bảo vệ các vitamintrong thức ăn

Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium là một lựa chọn thay thế lý tưởng cho các

nguồn ω-3 truyền thống (dầu cá) trong chế độ ăn cho gà thịt Theo nhiều báo cáo,

Schizochytrium không những giàu DHA, mà còn không chứa các chất độc hại cũng

như không có khả năng gây bệnh Các phân tích hóa sinh cho thấy các chủng

Schizochytrium không có sự xuất hiện của các loại độc tố tảo thông thường [17].

Hàm lượng PUFA n-3 và DHA trong gà Broiler tăng từ 2.8 đến 4.0 lần khi

nuôi với chế độ ăn có bổ sung 2.2% Schizochytrium Đối với gà mái đẻ trứng, trong chế độ ăn có bổ sung Schizochytrium với hàm lượng tương đương 165mg

DHA/con/ ngày, hàm lượng DHA trong trứng tăng lên 135mg/trứng, tăng gấp 5 lần

so với trứng thường (28mg DHA/trứng) Ngoài ra, hàm lượng DHA trong trứng có

thể tăng lên đến 220mg/ trứng đối với gà cho ăn Schizochytrium tương đương với

825mg DHA/con/ngày [14]

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium

1.2.1 Vị trí phân loại

Thraustochytrids là một nhóm sinh vật biển nguyên sinh, không có khả năng

quang hợp bao gồm bảy chi: Althornia, Diplophrys, Elina, Japonochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, và khoảng 35 loài [6] Chúng sử dụng

nitơ cho sự tăng trưởng và sử dụng carbon để tích lũy acid béo

Trước kia, Thraustochytrids được xếp vào họ nấm bởi vì nó có khả năng sống dịdưỡng và cũng có hình thái tương đối giống so với họ nấm, tuy nhiên trong vài nămtrở lại đây, dựa trên các kết quả nghiên cứu về gene và hệ protein, người ta đã thốngnhất, cho rằng Thraustochytrids được xếp vào các loại tảo có khả năng dị dưỡng,

đặc trưng bởi sự hiện diện của cơ quan seaenogenetosome, mạng lưới ectoplasmic,thành tế bào với lớp màng cellulose Vòng đời của nó có thể bao gồm các dạng tếbào như: tế bào sinh dưỡng, túi động bào tử và các động bào tử [10] Việc xác địnhThraustochytrids chủ yếu dựa vào hình thái học ở giai đoạn Thallic và sự khác nhautrong quá trình phát sinh và giải phóng bào tử.

Gần đây, Thraustochytrids đã được chú ý do có khả năng sản xuất một lượnglớn acid béo ω - 3, bao gồm: docosanhexaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoicacid (EPA), cả hai acid này đều quan trọng đối với sức khỏe con người cũng nhưtrong nuôi trồng thủy sản Tổng lượng dầu của Thraustochytrids chiếm từ 10 - 50%sinh khối, trong số đó DHA chiếm 30 - 70% Thraustochytrids cũng sản xuất trên90% acid béo không no một nối đôi (Mono Unsaturated Fatty Acid - MUFA) nhưpalmitoleic acid (C16:1), oleic acid (C18:1), eicosenoic acid (C20:1), và erucic acid(C22:1)

Vi tảo biển Schizochytrium là một chi của họ Thraustochytrids Trong hệ thống phân loại học, Schizochytrium được sắp xếp như sau [15]:

Giới: Chromista (Stramenopilia)

1.2.2 Đặc điểm sinh học của vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium

Schizochytrium được tìm thấy nhiều nơi trên thế giới, từ vùng cửa sông ra tới

biển, là loài hoại dưỡng (hấp thụ các chất hữu cơ hòa tan) và được phân lập chủ yếutrên các mảnh vụn hữu cơ như lá cây, thân cây mục vùng biển ngập mặn Sinh khốicủa chúng có thể lên tới khoảng 2.5×108 tế bào/g trọng lượng khô (TLK) và hoàntoàn không liên quan đến các nhóm tảo có khả năng sinh độc tố

Schizochytrium có dạng hình tròn, tập trung thành từng cụm, có mạng lưới ngoại chất xuất phát từ bề mặt tế bào, kích thước 2,5 đến 17 µm Schizochytrium

đặc trưng bởi sự phân đôi liên tục của các tế bào từ tetrads và octads đến việc sảnxuất các động bào tử, các tế bào amip với hình dạng bất thường [5]

Hình 1.2 Schizochytrium quan sát dưới kính hiển vi (×40)

Quá trình phát triển của tảo được bắt đầu bằn việc, các tế bào sẽ giải phóng cácđộng bào tử Trong suốt 8 giờ sau khi nuôi cấy, các động bào tử nhanh chóng mấtroi, đồng thời tăng kích thước Cùng với quá trình tăng kích thước là sự phân chiacủa nhân tế bào và tế bào tạo ra những tế bào mới Các tế bào đó tiếp tục sinhtrưởng và phát triển thành động bào tử hoặc các nhóm tế bào sinh dưỡng [7] Hình

1.3 mô tả quá trình sinh sản của họ Schizochytrium

Hình 1.3 Vòng đời của Schizochytrium [21]

Vòng đời của Schizochytrium bao gồm 3 chu kỳ phát triển [21]:

Chu kỳ 1: các tế bào trong giai đoạn sinh trưởng khi đạt được đến một kíchthước nhất định, chúng có thể hình thành nên các động bào tử, và giải phóng độngbào tử Mặt khác, chúng có thể hình thành nên các tế bào dạng amip, hoặc tiếp tụcsinh trưởng đến giai đoạn trưởng thành rồi thực hiện quá trình phân chia tiếp theo.Chu kỳ 2: tế bào tiếp tục phân chia đến 8, tế bào sau đó các tế bào được giảiphóng tạo thành các tế bào đơn, tiếp tục sinh trưởng tạo tế bào trưởng thành

Chu k 3: n i ch t bên trong c a t b o trội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ủa tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ưởng thành được hoàn thiện, bắtng th nh ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt được hoàn thiện, bắtc ho n thi n, b tào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ện, bắt ắt

u t o th nh các ng b o t Sau m t th i gian các ng b o t c gi i

đ ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt đội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ử Sau một thời gian các động bào tử được giải ội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ời gian các động bào tử được giải đội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ử Sau một thời gian các động bào tử được giải được hoàn thiện, bắt ảiphóng v phát tri n th nh t b o ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ển thành tế bào đơn theo chu kì khép kín ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt ào trưởng thành được hoàn thiện, bắt đơn theo chu kì khép kín.n theo chu kì khép kín

Hình 1.4 Hình dạng tế bào trong từng chu kỳ phát triển của Schizochytrium

A) Sự giải phóng các động bào tử, B) Tế bào trưởng thành C) Sự phân chia liên tiếp của tế bào, D) Hình thành các túi động bào tử,

E) Hình thành tế bào dạng amip

1.2.3 Đặc điểm hạt lipid

Nghiên cứu về hình thái học đã chứng minh rằng, Thraustochytrids chứa các hạtlipid dễ dàng quan sát được trên mặt tế bào, có chứa hàm lượng DHA cao Các hạt

lipid của Schizochytrium là tập hợp proteolipid, đa dạng về kích thước, thành phần,

nguồn gốc phát sinh, và trạng thái tế bào Các hạt này đóng vai trò quan trọng trongviệc lưu trữ, vận chuyển chất béo trong cả tế bào động thực vật Mặc dù các hạtlipid trong một số loài Thrausrochytrids dễ dàng nhận thấy được nhưng chúng tabiết rất ít về sự hình thành và đặc tính của chúng [7].

Lượng lipid tích lũy trong vi sinh vật có thể được nâng cao bằng việc cung cấp

dư thừa carbon trong khi hạn chế nitơ

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng của VTBDD Schizochytrium

VTBDD Schizochytrium có hàm lượng lipid chiếm 70% trọng lượng chất khô,

DHA chiếm đến 35% tổng số acid béo [1] Tương tự, trong báo cáo của Leaño [1],DHA (24 - 35% tổng acid béo) và acid palmitic (39 - 42% tổng acid béo) là hai acid

béo nhiều nhất trong các chủng Thraustochytrium phân lập từ đảo Panay, Philippines Schizochytrium sp (ATCC 20888) cũng sản xuất một lượng lớn DHA

(32.9% tổng acid béo) và palmitic acid (25.1% tổng acid béo) Trong nghiên cứukhác của Leaño, DHA chiếm 31.53% và palmitic acid chiếm 34.9% trong tổng số

acid béo của chủng S Mangrovei IAO-1.

Schizochytrium có khả năng tổng hợp một lượng lớn PUFAs như:

eicosapenteanoic acid (C20:5n-3, EPA), arachidonic acid (C20:4n-6, AA),docosahexanenoic acid (C22:6n-3 DHA) và docopentaenoic acid (C22: 5n-6, DPA).Trong đó, EPA và DHA là hai acid béo ω-3 quan trọng [3] EPA có lợi cho hệ timmạch và đã được sử dụng trong điều trị xơ vữa động mạch, tâm thần phân liệt vàung thư DHA là một acid béo thiết yếu cho người cũng như động vật có xươngsống khác, là acid béo chính trong các nơron thần kinh của vỏ não và võng mạcmắt Vì vậy, DHA có vai trò quan trọng trong sự phát triển của vỏ não, võng mạc,sự hình thành bào thai, giai đoạn con non và duy trì chức năng não trong suốt quátrình trưởng thành Ngoài ra, DHA cũng có ảnh hưởng tích cực trong điều trị cácbệnh về tim mạch như: bệnh tim mạch vành, đột quỵ, tăng huyết áp và có thể đốivới cả các bệnh rối loạn thần kinh như mất trí, Alzheimer's và trầm cảm

Các eicosanoid như prostaglandins, prostacyclins, và leukotrienes nguồn gốc từPUFA n-3 cũng rất quan trọng trong sự phát triển của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, chốnglại sự điều biến mạch máu, và chữa lành vết thương PUFAs là những chất rất quantrọng trong các lĩnh vực dược phẩm, y tế, và chất dinh dưỡng [9]

Hiện nay, dầu cá là nguồn cung cấp PUFAs chính Tuy nhiên, nguồn cung cấpnày là có giới hạn Ngoài ra, vấn đề về an toàn dầu cá đã được đề xuất bởi vì nó cóthể bị ô nhiễm đáng kể bởi các chất độc như kim loại nặng, polychlorinatedbipheyls và dioxins - là những chất đặc biệt nguy hiểm với phụ nữ mang thai và trẻ

em Ứng dụng của dầu cá như một chất phụ gia thực phẩm bị hạn chế do các vấn đềliên quan tới đặc điểm mùi, vị khó chịu, và tính ổn định oxy hóa kém [8] Do đó,việc nghiên cứu nguồn cung cấp PUFAs thay thế PUFAs từ dầu cá đã và đang đượcđặc biệt quan tâm

Các VTBDD có thể chứa một lượng lớn DHA và chúng được xem là nguồn sản

xuất DHA đầy tiềm năng Schizochytrium được xem là loài có khả năng sản xuất

DHA lớn, bởi hàm lượng lipid chiếm đến 70% trọng lượng khô và trong tổng sốacid béo: DHA chiếm đến 35%, palmitic acid chiếm 24%, DPA chiếm 13.6% vàmyristic acid chiếm 10.1% Sinh khối vi tảo này cũng đặc biệt thích hợp cho quátrình tách chiết và tinh sạch acid béo không no đa nối đôi mạch dài (LCPUFA), dochúng có thành phần rất ổn định LCPUFA từ vi tảo nuôi cấy không có cholesterol,không bị nhiễm kim loại nặng hay polychlorobiphenyl (PCB) và có mùi dễ chịu[1]

Ngoài ra, một số carotenoid nhất định mà đặc biệt là astaxanthin cũng được tìm

thấy trong Schizochytrium.

Astaxanthin là một loại carotenoid, một dạng sắc tố hòa tan trong chất béo cómàu vàng, cam hay đỏ, công thức hóa học là 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4’dione,

có mặt trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như cây cối, tảo, nấm hay

vi khuẩn Nó được bổ sung vào thực phẩm và sử dụng như thuốc nhuộm cho cánuôi, gia cầm và tôm [14]

Schizochytrium có khả năng tích lũy 6.1 mg/l astaxanthin trong 4 ngày nuôi cấy

ở môi trường có chứa 10% glucose và nguồn nitơ ít hơn 0.3%, còn trong môi trường

có chứa 2% glucose, schizochytrium có khả năng sản sinh ra 8mg/l β-caroteniod.

Một nhà máy sản xuất rượu Shochu ở Nhật Bản đã sử dụng nước thải của nhà máy

để nuôi Schizochytrium và nhận thấy chúng có thể tạo ra 7.7 mg/l astaxanthin [13].

1.2.5 Một số nghiên cứu về vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium

Ở Việt Nam, năm 2005, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập thành công loại

vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula sp., và Schizochytrium sp., tại một số vùng biển ở

Việt Nam, có hàm lượng DHA (Docosahexaenoic, C22:6 n-3) và DPA(decosapentaenoic, C22:5 n-3) cao gấp 5-10 lần so với các loại vi tảo biển khác

Một quy trình công nghệ nuôi trồng Schizochytrum do công ty Martek

Biocience (Mỹ) thiết lập với hiệu xuất 20g sinh khối tảo khô/lít sau 48h nuôi cấy vàhàm lượng PUFAs n-3 chiếm 10% sinh khối tế bào

Ở Nhật Bản, hiệu xuất lên men của chủng Schizochytrium sp., SR1 đạt 48,1g

trọng lượng khô/lít và 13,3g DHA/lít sau 4 ngày nuôi cấy

Chương II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium XT41 được nhận từ Phòng Sinh học

Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu việc lựa chon môi trường nuôi cấy GPY, có bổ sung thêm 2loại kháng sinh Ampicillin và Streptomycin Nước biển dùng để pha môi trường lấytừ RNM Xuân Thủy - Nam Định, chất lượng nước không thay đổi trong thời giantiến hành thí nghiệm Môi trường nuôi cấy được vô trùng ở 110°C trong 20 phúthoặc 115°C trong 15 phút

Môi trường GPY (g/l)

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi tảo

2.3.1.1 Phương pháp xác định số lượng tế bào tế bào bằng buồng đếm Neubauer

Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer [22] Cấu tạo buồng đếmNeubauer:

Buồng đếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, được chia làm 2phần Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi 2 rãnh dọc Phần giữa được chia đôi

do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1 mm tạo ra hai ngăn đếm giống nhau.Mỗi ngăn đếm hình vuông, được chia thành 16 ô lớn và mỗi ô lớn lại được chia thành

16 ô nhỏ, mỗi một ô nhỏ có diện tích là 1/400 m2, và chiều cao là 1/10mm

Số lượng tế bào được tính theo công thức:

D = ( a /64)× 106Trong đó:

D: là số lượng tế bào (số tế bào /ml)

a: là số tế bào trung bình trong một buồng đếm

Cách tiến hành:

Buồng đếm và lamen được lau sạch bằng bông cồn, thấm khô trước khi chomẫu vi tảo vào Lamen được đặt trên buồng đếm, sao cho khi nhìn nghiêng thấy cósự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen Sau đó, dùngpipete Pasteur hút một ít dịch chứa mẫu đã được lắc đều trước chấm vào cạnh củalamen dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng đếm

Buồng đếm có chứa Schizochytrium được đưa lên kính hiển vi và quan sát ở

vật kính 40 thị kính 10 Đối với những mẫu đếm quá đặc không thể chính xác đượcthì ta đem pha loãng trước khi đếm và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả

2.3.1.2 Xác định trọng lượng khô

Trọng lượng khô của tế bào VTBDD được xác định bằng bộ lọc có gắn với máylọc chân không và sinh khối vi tảo đã biết mật độ tế bào

Cách tiến hành:

Lấy 5ml sinh khối VTBDD cho vào giấy lọc sợi thủy tinh (kích thươc lỗ lọc1–m) đã được xác định trọng lượng và được kết nối với một máy bơm chân không Sau đó sấy khô bộ lọc ở 100°C trong 4 giờ Sau 4 giờ sấy, cân sinh khối 3 lần liêntiếp cho đến khi trọng lượng không đổi

2.3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của VTBDD Schizochytrium

Sự phát triển của các chủng Schizochytrium được xác định theo bốn thông số:

độ pH, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ glucose và nồng độ muối Mỗi thông số đượckiểm tra ở các mức độ khác nhau

2.3.2.1 Ảnh hưởng của pH

VTBDD Schizochytrium được nuôi lắc trong bình tam giác 250ml với tốc độ

lắc 200 vòng/phút trong môi trường GPY ở nhiệt độ 28°C, nồng độ muối 17‰,glucose là 2% Sau khi nuôi cấy giống vi tảo gốc có số lượng 105 tb/ml được sửdụng trong thí nghiệm để xác định khoảng pH thích hợp cho nuôi thu sinh khối vitảo Thí nghiệm được thực hiện với dải pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9 Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy

mẫu xác định số lượng tế bào và TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2

2.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sau khi xác định được điều kiện pH thích hợp, tiến hành xác định nhiệt độ thích

hợp cho sự phát triển của Schizochytrium.

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của VTBDD Để xácđịnh mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng, tạo sinh khối của

Schizochytrium tiến hành nuôi lắc trong bình tam giác 250ml với số lượng tế bào

gốc là 105 tb/ml tốc độ 200 vòng/phút trong môi trường GPY ở pH thích hợp đã xác

định ở mục 2.3.2.1, nồng độ muối 17‰, glucose là 2%, sử dụng các dải nhiệt độ:

25, 28, 30, 32 và 37°C Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và

TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2

2.3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Mỗi loại vi tảo có biên độ chịu mặn khác nhau: có loài có khả năng thích nghivới độ mặn cao có loài khả năng thích nghi độ mặn thấp Để xác định khoảng độmặn tối ưu cho nuôi sinh khối vi tảo, thí nghiệm được thực hiện với dải độ mặn: 0,

5, 10, 15, 20, 25‰ Môi trường GPY với pH và nhiệt độ đã được xác định ở mục 2.3.2.1và 2.3.2.2, nuôi lắc trong bình tam giác 250 ml, tốc độ 200 vòng/phút,

glucose là 2% Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và TLK

theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2

2.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Hàm lượng glucose có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và kích thước của

tế bào VTBDD Schizochytrium Để xác định nồng độ glucose thích hợp cho sự phát triển thu sinh khối của Schizochytrium, thí nghiệm được tiến hành nuôi lắc trong môi trường GPY với pH, nhiệt độ, pH và nồng độ muối được xác định ở các mục 2.3.2.1, 2.3.2 2,.2.3.2.3, với dải nồng độ glucose: 1, 3, 6, 9, 12% Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2