PHƯƠNG PHÁP PCR KHUYẾCH ĐẠI GEN THYAMIDINE KINASE PHÁT HIỆN KOI HERPESVIRUS TRÊN LOÀI CÁ CHÉP (CYPRINUS CARPIO) Ở VIỆT NAM

1.1. Đặt vấn đề1.2. Mục đích, nội dung của đề tài Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh Koi herpesvirus trên thế giới2.1.1. Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus2.1.2. Sự phân bố toàn cầu của KHV2.1.3. Đặc điểm Koi herpesvirus2.1.4. Vật chủ và bệnh lý2.1.5. Sự phát sinh phát triển của bệnh2.2. Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép Việt Nam.2.2.1. Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam2.2.2. Tình hình nghiên cứu và chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus ở Việt Nam2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng2.3.2. Mô bệnh học2.3.3. Phân lập virus2.3.4. Miễn dịch học2.3.5. Phương pháp PCRPhần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP3.1. Đối tượng nghiên cứu3.2. Hóa chất và thiết bị3.2.1. Hóa chất3.2.2. Thiết bị3.3. Thời gian và địa điểm thực tập3.4. Phương pháp nghiên cứu3.4.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm3.4.2. Phương pháp tách ADN tổng số3.4.3. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ ADN3.4.4. Phương pháp PCR khuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase (tk)3.4.5. Phương pháp nhân dòng và xác trình tự gen3.4.6. Phương pháp tin sinh học3.4.7. Phương pháp lây nhiễm thực nghiệmPhần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Kết quả thu mẫu4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số4.3. Kết quả khuyếch đại gen đoạn tk phát hiện Koi herpesvirus trên cá4.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen tk4.4.1. Kết quả nhân dòng4.2.2. Kết quả giải trình tự và so sánh4.5. Kết quả lây nhiễm thực nghiệmPhần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ5.1. Kết luận 5.2. Kiến nghị

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

“PHƯƠNG PHÁP PCR KHUYẾCH ĐẠI GEN THYAMIDINE KINASE PHÁT HIỆN KOI HERPESVIRUS TRÊN LOÀI CÁ CHÉP (CYPRINUS CARPIO) Ở

VIỆT NAM”.

Sinh viên: Lê Văn Hoàng

Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Đức

TS Lê Văn Trường

MỤC LỤCPhần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục đích, nội dung của đề tài

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh Koi herpesvirus trên thế giới

2.1.1 Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus

2.1.2 Sự phân bố toàn cầu của KHV

2.1.3 Đặc điểm Koi herpesvirus

2.1.4 Vật chủ và bệnh lý

2.1.5 Sự phát sinh phát triển của bệnh

2.2 Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép Việt Nam.

2.2.1 Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus ở Việt Nam

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus

3.3 Thời gian và địa điểm thực tập

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm

2

3.4.2 Phương pháp tách ADN tổng số

3.4.3 Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ ADN

3.4.4 Phương pháp PCR khuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase (tk) 3.4.5 Phương pháp nhân dòng và xác trình tự gen

3.4.6 Phương pháp tin sinh học

3.4.7 Phương pháp lây nhiễm thực nghiệm

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả thu mẫu

4.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số

4.3 Kết quả khuyếch đại gen đoạn tk phát hiện Koi herpesvirus trên cá 4.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen tk

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa ẩm, địa hình có nhiều ao, hồ, sông,suối, đầm lầy… Đây là điều kiện thuận lợi cho nước ta phát triển ngành nuôi trồngthủy sản nước ngọt Và từ xa xưa đến ngày nay việc đánh bắt và nuôi trồng thủy sảnnước ngọt đã và đang mang lại nguồn lợi lớn cho nhân dân ta

Trong các loại cá nước ngọt, cá chép với chất lượng thịt thơm ngon, thích ứngrộng với các điều kiện sống khác nhau đã được nuôi phổ biến ở các ao, hồ, thủy vựcnước ngọt là nguồn cung cấp thực phẩm lớn cho nhân dân ta Loài cá này cũng được

sử dụng rộng rãi khắp thế giới như một loại thực phẩm quan trọng Đối với Việt Nam

và Trung Quốc, cá chép còn gắn liền tín ngưỡng văn hóa của nhân dân “cá chép hóarồng”, “cá chép đưa Táo quân lên trầu trời”

Ngày nay ngành công nghiệp cá cảnh phát triển, cá Koi – một loại cá chépcảnh với nhiều màu sắc và hình dáng đẹp mắt đang được thị trường Mỹ và Châu Âurất ưa chuộng Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu cá cảnh lớn, nhất là ởThành phố Hồ Chí Minh Mặc dù khủng hoảng kinh tế ảnh hưởng đển nhiều mặt hàngxuất khẩu nhưng đến những ngày đầu tháng 9-2009, lượng cá cảnh xuất khẩu ởTP.HCM vẫn đạt khoảng 4 triệu con (bằng cả năm 2008), kim ngạch xuất khẩu đạtkhoảng 7 triệu USD (Phạm Lâm Chính Văn, 2009)

Nhưng hiện nay có một mối nguy hiểm đối với cá chép và cá koi là bệnh koi

herpesvirus mà koi herpesvirus (KHV) chính là tác nhân gây bệnh trong nhiều loài cá Chép (Cyprinus carpio sp) với tỉ lệ lây nhiễm và chết rất cao Koi herpesvirus được

phát hiện lần đầu tiên ở Israel năm 1998, sau đó bệnh lây lan ra khắp các quốc giaChâu Âu, Châu Á và Châu Mỹ qua việc buôn bán cá chép cảnh koi (Hedrick và cộng

sự, 2000; Pokorova và cộng sự, 2005) Bệnh này được Bộ nông nghiệp và phát triển

nông thôn đưa vào danh mục 6 loại bệnh thủy sản phải công bố dịch (thông tư số 39/2009/TT-BNNPTNT) Hơn nữa, hiện nay việc xuất nhập khẩu cá cảnh cần phải

kiểm dịch, nhất là đối với thị trường Mỹ và Châu Âu Theo quyết định số656/2006/EC ngày 20/9/2006 của Ủy ban Châu Âu “Về điều kiện sức khỏe và chứngnhận nhập khẩu cho các loài cá dùng làm cảnh”, bệnh Koi Herpes Virus Disease(KHV) thuộc Danh mục các bệnh phải kiểm dịch, đồng thời phải kiểm soát chặt chẽcác lô hàng nhập khẩu các loài cá trên, kể cả cá làm cảnh và các sản phẩm của chúng

Ở Việt Nam gần đây một số nhà khoa học đã quan tâm và nghiên cứu xây dựngphương pháp chẩn đoán sớm bệnh KHV đã thu được một số kết quả khả quan Tại hộinghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009, Nguyễn Thị Thanh Lợi và các cộng sựViện Công nghệ sinh học công bố kết quả nghiên cứu phát hiện koi herpesvirus trênloài cá chép bằng phương pháp PCR (Nguyễn Thị Thanh Lợi và cộng sự, 2009)

Để góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm bệnh KHV trên cá chép ởViệt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phương pháp PCR khuếch đại gen Thyamidine

kinase phát hiện Koi herpesvirus trên loài cá chép (Cyprinus carpio) ở Việt Nam”.

1.2 Mục đích, nội dung của đề tài

1.2.1 Mục đích:

- Đề tài nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm bệnh Koi

herpesvirus trên loài cá chép (Cyprinus carpio) ở Việt Nam.

1.2.2 Nội dung:

- Thu thập mẫu cá chép, cá koi ở các địa phương

- Tách chiết ADN của các mẫu cá koi, cá chép nuôi ở Việt Nam

- Phát hiện sự có mặt của Koi herpesvirus trong các mẫu cá thông qua việckhuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase đặc trưng của virus

- Giải trình tự đoạn gen khuyếch đại và so sánh với các gen đã đăng kí trênngân hàng gen quốc tế

- Lây nhiễm thực nghiệm trên một số mẫu cá nhằm quan sát diễn biến của bệnh

và kiểm định lại phương pháp chẩn đoán

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh koi herpesvirus trên thế giới

2.1.1 Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus

Koi herpesvirus (KHV) là một bệnh virus truyền nhiễm cao, gây ra tỉ lệ bệnh

và chết có ý nghĩa trong cá chép thường (Cyprinus carpio) (Hedrick và cộng sự, 2000;

OATA 2001) Những dịch cấp tính của bệnh mới này trong koi và chép thường có thể

đã xảy ra sớm từ 1995-1996, nhưng đã được công nhận đầu tiên ở Đức năm 1997(Bretzinger và cộng sự, 1999) Năm 2000, virus giống herpes này đã được phân lậpđầu tiên ở Mỹ sau dịch bệnh trên cá chép koi và cá chép thường ở Isael và Mỹ; vàđược đặt tên là Koi herpesvirus (Hedrick và cộng sự, 2000) Cuộc hội thảo đầu tiên vềbệnh gây ra tỉ lệ tử vong cao của cá chép và cá koi đã được trình bày tại hội thảo quốc

tế lần thứ 9 của Hội liên hiệp Châu Âu về bệnh học cá năm 1999 (Ariav và cộng sự,1999)

Cá chép thường được nuôi như là một loại cá thực phẩm trong nhiều nước vớisản lượng hàng năm đạt 1.5 triệu tấn Chép koi là một dạng màu của cá chép thường,thu được bởi chọn tạo Cá cảnh này có nguồn gốc từ Nhật Bản Ngày nay, sự thươngmại hóa được mở rộng, Koi đã được nuôi và buôn bán rộng rãi trên khắp thế giới Sựlây lan nhanh chóng của KHV có quan hệ với sự thương mại cá toàn cầu và sự trìnhdiễn cá koi mà không có sự kiểm tra sức khỏe trước hoặc những yêu cầu về chứng chỉsức khỏe Một trong những biện pháp ngăn ngừa chống lại sự lan truyền của nguồnbệnh là kiểm tra cá trước khi vận chuyển hoặc tại nông trại sản xuất Những chươngtrình kiểm soát nên dựa vào những thủ tục chuẩn đoán đặc hiệu và nhạy cho sự pháthiện nguồn bệnh (D Pokorova và cộng sự, 2005)

2.1.2 Sự phân bố toàn cầu của KHV

Sau những báo cáo đầu tiên của bệnh KHV ở CHLB Đức (1997), Israel (1998);bệnh đã lây lan tới nhiều nước trên toàn thế giới thông qua sự thương mại chép koikhi mà sự hiểu biết và các phương pháp phát hiện nó chưa có Theo kết quả bảng điều

6

tra Koi herpesvirus toàn cầu năm 2004 và 2009 của Hannen và cộng sự, KHV đãđược phát hiện trong 30 nước: Áo (2003), Bỉ (1999), Canada, Trung quốc, Costa Rica,Cộng hòa Czech, Đan mạch (2002), Pháp (2003 trong cá nhập khẩu từ Isael), Đức(1997), Hong Kong, Indonesia (2002), Ireland, Israel (1998), Italya (2003), Nhật bản(2003), Luxembourg (2003), Malaysia, Hà lan (2001), New Zealand, Ba lan (2003),Singapore (trong cá nhập khẩu từ Malaisia), Slovenia, Nam phi (2001), Hàn quốc,Thụy điển, Thụy sĩ (2003), Đài loan (2002), Thái lan (2004 trong cá nhập khẩu từĐức), Anh (2000), và Mỹ (1998) Virus có thể đã tồn tại trong rất nhiều quốc gia khácnhưng chưa được nhận ra hoặc chưa báo cáo.

2.1.3 Đặc điểm Koi herpesvirus

• Hình thái

Hình thái và kích thước là tương tự những virus thuộc họ Herpesviridae Thểvirion bao gồm một vỏ capsid bên trong với cấu trúc đối xứng 20 mặt đường kínhkhoảng 100-110 nm Thể virion trưởng thành chứa đựng một vỏ bao lỏng lẻo bênngoài làm cho đường kính virion toàn bộ khoảng 170-230 nm Thành phần chính của

vỏ bao ngoài là một lớp màng kép lipoprotein (hình 2)

Hình 1 Sơ đồ sự lây lan toàn cầu của KHV

: dương tính, : nghi ngờ, : âm tính hoặc chưa được phát hiện (Theo Haenen và cộng sự, 2009)

• Cấu trúc bộ gen

KHV là một virus ADN sợi kép với kích thước genome được ước lượng có sựthay đổi từ ít nhất 150 kbp ( Gray và cộng sự, 2002) tới 277 kbp ( Ronen và cộng sự,2003) tới 295 kbp ( Waltzel và cộng sự, 2005) Trong sự đóng góp khác, sự nghiêncứu đặc điểm genome tại phòng thí nghiệm Weymouth CEFAS đã nhận dạng một sốgen và một vài trong những gen này chia sẽ sự tương đồng có ý nghĩa với những gen

được tìm thấy trong chanel catfish virus (CCV) và những herpesvirus khác Khoảng

80% nucleotide tương đồng được thiết lập giữa CyHV-1, CyHV-2 và KHV Hiện naytrình tự genome KHV đã được giải trình tự toàn bộ (Aoki và cộng sự, 2007)

2.1.4 Phân loại:

Koi herpesvirus là một virus thuộc họ Herpesviridae Waltzel và cộng sự đã cung cấp bằng chứng để xếp loại KHV là một herpesvirus và được đặt tên là cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) sau danh pháp của hai loài virus cá chép khác: CyHV-1

(virus bệnh đậu cá chép) và CyHV-2 (virus hoại tử máu cá vàng) Ngoài ra, dựa vàotác động trên cơ thể vật chủ KHV còn được cho cái tên là virus hoại tử mang và viêmthận cá chép (CNGV)

2.1.5 Vật chủ và bệnh lý

• Vật chủ:

Sự nhiễm KHV xảy ra trong tự nhiên mới chỉ được ghi nhận trên cá chép

thường (Cyprinus carpio carpio), chép koi (Cyprinus carpio koi) và các dạng lai của

chúng Tất cả nhóm tuổi của cá đều biểu hiện sự cảm nhiễm với bệnh KHV(Bretzinger và cộng sự, 1999; Sano và cộng sự, 2004) Cá chép thường được nuôi hỗnhợp cùng với các loại cá khác, nhưng không có dấu hiệu của bệnh hoặc chết quan sátthấy trong các loài cá khác Các loại cá khác thuộc họ cá chép như cá vàng không bịnhiễm với KHV Như vậy cá chép thường và cá koi là dễ bị nhiễm nhất đối với KHV

Bệnh lý:

Những dấu hiệu bệnh lý của KHV thường không đặc trưng Sự nhiễm KHVthường tạo ra những thương tổn mang dữ dội với sự biểu hiện là sự lốm đốm mangvới những phần đỏ và trắng Những phần trắng là vì sự hoại tử (chết) của mô mang

Hình 3: Dấu hiệu bệnh koi herpesvirus

A- Da có những phần bị mất màu B- Mắt trũng C- Mang bị hoại tử (Theo Hedrick và cộng sự, 2005)

Những thương tổn mang gây bởi bệnh KHV là dấu hiệu phổ biến nhất trong Koi bị ảnh hưởng Những dấu hiệu bên ngoài khác bao gồm rỉ máu mang, hõm mắt, những phần nhạt màu hoặc phồng rộp trên da Trong một vài trường hợp, sự nhiễm kí sinh trùng và vi khuẩn tiếp theo làm bệnh trầm trọng hơn (Hedrick và cộng sự, 2000; OATA 2001; Goodwin 2003).

Những dấu hiệu bên trong của KHV có thể thay đổi và không đặc trưng nhưng

có thể bao gồm sự dính chặt vào xoang cơ thể hơn bình thường và sự biểu hiện vết lốm đốm của những cơ quan bên trong ( Hedrick và cộng sự, 2000; Goodwin 2003)

Về hành vi, cá bị ảnh hưởng thường bơi gần bề mặt, bơi không định hướng và tần số hô hấp cao Cá có thể bị tử vong rất nhanh trong quần thể bị nhiễm, cá bị chết bắt đầu trong vòng 24-48h sau những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên

2.1.6 Sự phát sinh phát triển của bệnh

• Sự xâm nhập và vị trí của virus trong mô

Những nghiên cứu trước đây vẫn chưa biết được virus xâm nhập vào cá thông qua mang hay qua ruột (Hedrick và cộng sự, 2000; Perelberg và cộng sự, 2003) Tuy nhiên những kết quả nghiên cứu của Costes và cộng sự năm 2009, dựa vào kỹ thuật

mô tả phát quang sinh học (bioluminescence imaging) đã kết luận rằng con đường chính của virus KHV xâm nhập vào cá là da, thay vì là mang hay ruột

ADN virus đã được phát hiện trong thận và máu của cá nhiễm tại thời điểm rất sớm sau sự nhiễm, khoảng 3 -5 ngày Phân tích PCR và lai ADN đã phát hiện ADN KHV trong mô mang, dạ dày-ruột và gan của cá được lây nhiễm trong phòng thí nghiệm Ngược lại, không phát hiện thấy ADN virus trong mô não cá lây nhiễm thí nghiệm bởi lai ADN và PCR, điều này có thể gợi ý rằng ADN virus có số copy thấp trong mô não (Gray và cộng sự, 2002)

• Con đường virus lây lan

Sự lây lan của KHV bao gồm trực tiếp tiếp xúc với cá bệnh, dịch từ cá bệnh hay nước (Dishon và cộng sự, 2005) Sự tiết dịch nhớt mạnh là rất rõ ràng trong thời

10

kì sớm của bệnh KHV và ADN KHV đã được phát hiện ở mức cao trong dịch nhớt được thu từ cá chép lây nhiễm thực nghiệm (Gilad và cộng sự, 2004) Virus trong môitrường nước có khả năng gây nhiễm ít nhất 4h, điều này giải thích tại sao khả năng lây nhiễm tự nhiên của virus trong hồ rất cao (Perelberg và cộng sự, 2003).

• Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh KHV

Sự phát triển của bệnh KHV bị ảnh hưởng bởi: nhiệt độ nước, tuổi và điều kiệncủa cá, độ đồng nhất quần thể và các yếu tố strees Tuy nhiên, nhiệt độ nước là yếu tố quan trọng đến việc xảy ra dịch bệnh Nhiệt độ nước được biết là ảnh hưởng đến sự tấn công và tính dữ dội của sự nhiễm virus bởi làm thay đổi sự tái bản virus và gián tiếp làm tăng hiệu lực phản ứng kháng thể vật chủ (Alcorn và cộng sự, 2002) Cá dễ phát bệnh nhất ở nhiệt độ từ 18-28oC Ở 23oC tỉ lệ chết là 90-95%; ở 18oC là 90%; không thấy tỉ lệ chết ở 13oC (Gilad và cộng sự, 2003), tuy nhiên vẫn phát hiện thấy ADN virus ở nhiệt độ này (Gilad và công sự, 2004)

2.2 Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép

Việt Nam.

2.2.1 Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam.

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có nhiều ao, hồ, đầmlầy… Nhân dân ta lại có nhiều kinh nghiệm trong đánh bắt và nuôi thủy sản Vì vậynghề nuôi trồng thủy sản nước ngọt nước có nhiều điều kiện phát triển

Cá chép (Cyprinus carpio): Phân bố hầu như khắp trên thế giới, sống được ở

hầu hết các loại hình thủy vực nước ngọt, khắp các vùng địa lý, phổ biến nhất là ở ao

hồ, ruộng Cá có thân dẹp bên, đầu thuôn, có hai đôi râu Cá thiên nhiên thường cómàu trắng xám, lưng màu tối, bụng màu sáng, cạnh các vây màu đỏ Tuy nhiên dođiều kiện sống khác nhau nên loài cá chép ở các vùng khác nhau thể hiện biến dị rất

rõ, nhất là về hình dạng và số lượng vảy, màu sắc, kích thước và hình dạng toàn thân(Võ Văn Chi, 1993) Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 20-28oC, pH thích hợp từ 7-8, sốngđược ở vùng nước tĩnh và nước chảy Còn nhỏ ăn động vật phù du, lớn lên ăn động

vật đáy Trong ao nuôi sau 1 năm có thể đạt 0,5kg/con, cá cái lớn nhanh hơn cá đực.Sau 1 năm nuôi cá thành thục, đẻ tự nhiên trong ao nuôi, đẻ nhiều lần trong năm, phụthuộc vào chế độ nuôi, sinh sản nhân tạo được Cá đẻ trứng dính trên các giá thể thựcvật.

Cá koi (Cyprinus carpio koi): hay còn gọi là cá chép Nhật, được người Nhật

lai tạo giống cách đây hơn 200 năm Cá koi có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, đỏ,vàng, đen… Tùy vào màu sắc đặc tính mà người ta có các tên gọi khác nhau cho cáccon cá (Hình 3) Cá koi có thể sống tới cả trăm năm tuổi, trong điều kiện nuôi nhântạo cá cũng có thể sống 25-35 năm Cá trưởng thành có chiều dài từ 60-90 cm, trongđiều kiện chăm sóc tốt cá có thể tăng 5-10cm mỗi năm Cá koi là loài cá hiền lành, nó

có thể sống cùng các loài cá khác Tuy nhiên, để hạn chế sự lây lan bệnh người tathường nuôi koi trong những hồ riêng Ngày nay cá koi rất phong phú về hình dáng vàmàu sắc được rất nhiều người nuôi, nhất là phương tây Koi đã trở thành một loài cáhấp dẫn người chơi và đã có những tổ chức, hội chỉ chuyên nuôi Koi trên khắp thếgiới

Hình 3 Tên gọi các dạng Koi khác nhau theo màu sắc

Hình 4 cá koi- công ty AKIKOI Hà Nội

5.5.2010

12

Hiện nay, cá koi được nuôi nhiều ở Việt Nam, nhất là các tỉnh phía nam:TP.Hồ Chí Minh, Bình Dương… nhằm mục đích xuất khẩu sang các nước phát triểnnhư Mỹ, EU Việc xuất khẩu cá cảnh koi sang thị trường này đang gặp rất nhiều khókhăn vì yêu cầu khắt khe đối với các bệnh virus của cá Đến nay tại TPHCM có 3 cơ

sở là: Công ty Sài Gòn cá kiểng, và 2 cơ sở của ông Võ Văn Sanh và Châu Tống đạtkết quả không phát hiện virus SVC và KHV, đủ điều kiện xuất khẩu sang Mỹ, EU

2.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh koi herpesvirus ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về KHV còn tương đối mới mẻ cho nên chưa cónhiều công trình công bố về đối tượng này Bùi Quang Tề là người đầu tiên mô tảhình thái cá bị nhiễm KHV ở Việt Nam (Bùi Quang Tề, 2006) Đứng trước tình hìnhdịch bệnh phát triển mạnh, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã đưa đề tài:

“Nghiên cứu phát triển phương pháp PCR với tổ hợp mồi chế tạo bộ KIT phát hiệnsớm một số virus gây bệnh nguy hiểm ở cá biển, cá cảnh” vào danh mục các đề tài/dự

án cấp bộ lĩnh vực thủy sản đưa vào thực hiện giai đoạn 2008-2010 do tiến sỹNguyễn Hoàng Uyên chủ trì Kết quả nghiên cứu của đề tài này đã phát hiện đượcKHV ở trên cá chép nuôi ở Việt Nam và xây dựng thành công phương pháp semi-nested PCR với tổ hợp mồi khuyếch đại đồng thời 3 đoạn gen trong cùng một phảnứng để phát hiện KHV trong các mẫu cá bệnh (Nguyễn Thị Thanh Lợi và cộng sự,2009)

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh koi herpesvirus

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều phương pháp phát hiện Koi herpesvirus Mỗiphương pháp có những ưu, nhược điểm riêng; tùy vào mục đích và điều kiện mà cácphương pháp được lựa chọn để sử dụng Dưới đây là những phương pháp chủ yếuđang được sử dụng để chẩn đoán KHV trên thế giới

2.3.1 Chẩn đoán dựa vào bệnh lý

Phương pháp này dựa vào các dấu hiệu bệnh lý biểu hiển ra bên ngoài của cá bịbệnh (các dấu hiệu này đã được trình bày ở mục 2.1.4) Phương pháp này đơn giản, dễthực hiện, người nông dân có thể làm được Tuy nhiên, phương pháp này có nhiềunhược điểm như độ chính xác không cao vì các dấu hiệu của bệnh KHV thườngkhông đặc trưng và dễ bị làm thay đổi bởi sự nhiễm tiếp theo của vi khuẩn và kí sinhtrùng Ngoài ra, khi phát hiện bằng chẩn đoán lâm sàng, vật chủ đã bị nhiễm virus rấtnặng, vì vậy rất khó để có thể phòng chữa kịp thời và ngăn chặn dịch bệnh

2.3.2 Mô bệnh học

Phương pháp này dựa trên những thay đổi về tổ chức mô và tế bào khi tác nhânxâm nhập và kí sính trong vật chủ để chẩn đoán Tuy nhiên, mô bệnh học của bệnhKHV thường không đặc hiệu và có thể thay đổi Những kiểm tra mô bệnh học đã xácnhận rằng sự tăng sinh lớn của biểu mô mang biểu hiện sự thoái hóa và hoại tử vànhững hình thể tròn hoặc trái xoan trong nhân trong những tế bào đang thoái hóa lànhững phát hiện nổi bật, dễ thấy nhất

Mộ bệnh học chẩn đoán KHV đã được thương mại hóa tại Mỹ (GA)

2.3.3 Phân lập virus

Phương pháp này được nhiều phòng thí nghiệm thực hiện để xác định tác nhângây bệnh KHV được phân lập lần đầu tiên năm 1998 bởi Hedrick và cộng sự Virusđược phân lập từ những mô lớn của cá có dấu hiệu bệnh bao gồm: mang, thận, lá lách,gan Virus đã cảm ứng sự dung hợp và không bào hóa tế bào chất mạnh mẽ trongnhững tế bào KF-1 trong vòng 5 ngày sau tiếp xúc khả nhiễm ở 20oC Bệnh tích tế bào(CPE) có thể thấy rõ từ ngày thứ 7-10 và đã phát triển liên quan đến tất cá các tế bàosau 14 ngày (Hedrick và cộng sự, 2000)

Ưu điểm của phương pháp này là độ chính xác cao Tuy nhiên, virus chỉ phânlập được trên một số dòng tế bào nhất định và những dòng tế bào này có thể khó thao

14

tác Mặt khác sự phân lập nuôi cấy tế bào không nhạy bằng phương pháp PCR do sựbảo quản mẫu bệnh phẩm trong tủ lạnh làm mất khả năng sinh trưởng của KHV ( Haenen và cộng sự, 2004).

2.3.4 Miễn dịch học

Phương pháp này dựa vào phản ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên – khángthể, phát hiện virus thông qua việc phát hiện kháng thể của cá chống lại virus Trongchẩn đoán KHV, hai phương pháp thường được sử dụng là: ELISA (enzyme-linkedimmunosorbent assay) và IFAT (Indirect fluoescent antibody test)

Phương pháp ELISA có ưu điểm là thời gian phân tích nhanh Tuy nhiên,những tế bào miễn dịch cần một thời gian để tạo kháng thể Nếu một con cá bị ốmkhông lâu, sự tạo kháng thể đặc hiệu KHV có thể chậm lại, do đó phương phápELISA có thể không thể phát hiện được những trường hợp này Ngược lại, nếu sựnhiễm đã xảy ra trong những năm trước đó nhưng cá đã được khỏi bệnh nhưng khángthể kháng KHV vẫn còn tồn tại trong cá thì kết quả ELISA sẽ cho dương tính Vì vậyphương pháp này được khuyến cáo nên sử dụng như một phương pháp phát hiện bổsung

Hiện nay, test ELISA đã được thương mại hóa tại Anh (phòng thí nghiệmWeymouth CEFAS) và Irael

Mồi xuôi: KHV9/5F 5‘-GACGACGCC-GGAGACCTTGTG-3’

Mồi ngược: KHV9/5R 5’-CACAAGTTCAGTCTGTTCCTCAAC-3’

Cặp mồi này được thiết kế dựa trên trình tự một đoạn cắt giới hạn của ADN KHV,khuyếch đại một đoạn 484 bp và không khuyếch đại ADN genome từ các virus CHVhay CCV

Cũng trong năm 2002, Gray và cộng sự đã phát hiện enzyme cắt giới hạn củaADN virus nhận được từ những chủng KHV khác biệt nhau về dịch tễ học là đồngnhất với nhau Những mẫu dò ADN SphI và BamHI nhân dòng đã lai đặc hiệu vớiADN KHV, và không lai với ADN có nguồn gốc từ các herpesvirus khác Từ đây mộtphân tích PCR đặc hiệu KHV đã được phát triển cho việc phát hiện nhanh ADN củaKHV trong mô cá bị nhiễm Phản ứng này khuyếch đại một đoạn 290 bp với mồi SphI-5 Phương pháp này được cải tiến bởi Yuasa và cộng sự (2005) và đã được hợp nhấttrong đường lối chỉ đạo chính thức của Nhật Bản trong việc phát hiện KHV

Hai phương pháp PCR của Gilad và Gray là dựa trên những trình tự ADNKHV được lựa chọn ngẫu nhiên Tuy nhiên, những phân tích PCR dựa vào trình tựADN chọn lựa ngẫu nhiên và với chức năng không rõ ràng có thiên hướng mất giá trịchẩn đoán của chúng bởi những đột biến tự nhiên hoặc sự mất nucleotide hơn là mộtphân tích PCR dựa vào những trình tự của tính độc cần thiết hoặc gen cấu trúc.Bercovier và cộng sự (2005) đã nhận ra từ thư viện genome KHV một khung đọc mở

(ORF) mã hóa cho một protein với ý nghĩa tương đồng với thyamidine kinase (tk) và

đã phát triển một phân tích PCR mới dựa vào những trình tự này và đã cho thấy nhạy

hơn có ý nghĩa so với những phân tích PCR trước đó Dựa vào trình tự gen tk,

Bercovier và cộng sự đã thiết kế cặp mồi như sau:

KHV-TKf 5’-GGGTTACCTGTACGAG-3’

KHV-TKr 5’-CACCCAGTAGATTATGC-3’

Cặp mồi này khuyếch đại một đoạn gen 409 bp Phương pháp PCR khuyếch

đại gen tk đã không khuyếch đại nhưng ADN herpesvirus cá khác như Herpesvirus cyprini (CHV) và chanel catfish virus (CCV) Phương pháp PCR dựa vào sự khuyếch đại đoạn gen tk đã được so sánh với những phương pháp PCR miêu tả trước đó và với

16

sự nuôi cấy virus trong cá bệnh và đã cho thấy đây là phương pháp chẩn đoán nhạynhất đối với KHV (Bercovier và cộng sự, 2005).

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu cá chép nuôi thương phẩm (Cyprinus carpio carpio), cá koi (Cyprinus carpio koi) và cá chép trần thu thập từ: Hà Nội và Bắc Ninh trong thời gian

từ 01/2010 – 06/2010 và một số mẫu cá được thu từ các địa phương khác từ trướcđược tách chiết ADN và bảo quản tại phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinhhọc

- Trong đó bao gồm các mẫu cá bình thường, các mẫu cá được lây nhiễm virusnhân tạo và các mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý của bệnh KHV như: cá bỏ ăn, bơi lờ đờgần bề mặt, mang bị hoại tử

Hoá chất điện di:

- Dung dịch đệm TAE 1X được pha loãng từ TAE 50X

- Dung dịch đệm chạy điện di TAE 50X (1lit)

Tris base: 242gGlacial acetic acid: 57.1mlEDTA 0.5M, pH 8.0: 100ml

- Agarose 0.8 – 2%, loading dye 6X, Ethidium Bromine, thang chuẩnGeneRuler 1kb Ladder, Fermentas

Hóa chất cloning:

18

- Bộ CloneJET PCR Cloning Kit để tạo dòng của hãng Fermentas bao gồm:vectơ nhân dòng pJET1.2/blunt, đệm phản ứng 2X, T4 DNA Ligase, DNA BluntingEnzyme, mồi giải trình tự F, R, H2O không nuclease.

- Bộ Plasmid Mini extraction Kit để tách ADN plasmid của hãng Bioneer

3.2.2 Thiết bị

- Máy li tâm lạnh Vision VS-15000 CFN II

- Máy PCR Eppendorf Mastercyler personal và may PCR Techne TC-312

- Tủ cấy vô trùng Heal force®

- Bộ điện di ADN multi α cua Advance

- Máy soi gel UV transiluminator WEALTEC

- Bể ổn nhiệt SSY-H

- Nồi hấp khử trùng

- Máy khuấy trộn Vortex Vision VS-100BM cua Siencific

- Cân phân tích, cân điện

- Máy đo pH

- Máy tính và các phần mềm sử dụng trong phân tích so sánh kết quả như:chromas, Blast…

- Các loại pipet, đầu côn, que cấy, đĩa cấy, bình tam giác, ống falcon…

3.3 Thời gian và địa điểm thực tập

- Thời gian thực hiện từ 15/01 đến ngày 15/06/2010

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm (Theo tổ chức Thú y thế giới OIE)

Để thu được mẫu phục vụ cho việc nghiên cứu, các mẫu cá được thu theonhững tiêu chí sau: có dấu hiện bệnh lý hoặc chưa có dấu hiệu bệnh lý nhưng có hiện

tượng chết và các mẫu bình thường Ngoài ra còn có các mẫu cá của các cơ sở sảnxuất gửi đến để xét nghiệm.

Thu mẫu bệnh phẩm: Chỉ kiểm tra những mẫu cá còn sống, sắp chết hoặc mớichết còn tươi Kiểm tra dấu hiệu bệnh lý ở bên ngoài và nội tạng của cá mẫu, khửtrùng dụng cụ và vị trí lấy mẫu bằng cồn Lấy mẫu (mang, thận hoặc nhớt) và tiếnhành tách chiết ADN ngay Hoặc nếu lấy mẫu ở nơi xa phòng thí nghiệm (trại nuôi,

ao hồ) thì tiến hành lấy mẫu (mang hoặc nhớt) và bảo quản trong hộp đá lạnh

3.4.2 Phương pháp tách ADN tổng số

Tách ADN tổng số của mẫu cá bằng bộ Genomic ADN purification Kit từhãng Fermentas Trình tự tiến hành theo quy trình của hãng:

• Lấy mẫu vào ống Eppendorf và nghiền kĩ bằng chày nghiền

• Thêm 200 µl TE 1X, tiếp tục nghiền sau đó trộn đều, tránh tạo bọt

• Thêm 400 µl dung dịch Lysis và ủ ở 65oC trong 10 phút

• Thêm 600 µl dung dịch Chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần Ly tâm10.000 vòng/phút trong 3 phút

• Chuẩn bị dung dịch kết tủa bằng cách trộn 720 µl nước khử ion với 80 µl dungdịch Supplied 10X

• Hút toàn bộ dịch trên chứa ADN sang một ống Eppendorf mới và thêm 800 µldung dịch kết tủa vào Trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo ống vài lần 1-2phút ởnhiệt độ phòng và ly tâm 10.000 vòng/p trong 2 phút

• Loại bỏ dịch nổi Hòa tan tủa ADN trong 100 µl dung dịch NaCl 1.2M

• Thêm 300 µl cồn tuyệt đối và ống và để ở -20oC trong 10 phút

• Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, đổ cồn đi Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70o:thêm 500 µl cồn 70o, trộn đều Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút Đổ cồnđi

• Làm khô ADN tự nhiên trong box sạch

20

• Hòa tan ADN trong 30 µl TE1X Kiểm tra độ sạch và định lượng ADN trên gelagarose 0.8% và độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm.

3.4.3 Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ ADN

Phương pháp đo quang phổ kế

Dựa vào sự hấp phụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở 260nm của các base nitơ purin

và pyrimidin Giá tri mật độ quang ở bước sóng 260 (OD260) cho phép xác định nồng

độ ADN dựa vào tương quan sau

Một đơn vị OD ở 260nm tương ứng với:

50µg/ml đối với ADN sợi đôi40µg/ml đối với ARN và ADN sợi đơn

Do vậy nồng độ ADN được tính theo công thức sau:

CADN = OD260.50.dTrong đó CADN là nồng độ ADN (µg/ml)

d là độ pha loãng

Để kiểm tra độ sạch của mẫu, cần tiến hành đo OD ở 280nm Đây là bước sóng

mà ở đó các protein hấp thụ cao nhất Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng tửngoại ở 260nm, do đó làm sai lệch giá trị đo Theo các nhà khoa học thì một dungdịch acid nucleic có tỉ số OD260/OD280 ở trong khoảng 1.8-2.0 được xem là sạch(không tạp nhiễm)

Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

Tại pH trung tính, ADN tích điện âm do có nhóm phosphate nên dưới tác độngcủa dòng điện một chiều, phân tử ADN sẽ di chuyển về điện cực dương

Cách tiến hành:

• Chuẩn bị gel agarose

o Để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch ADN tổng số nồng độ gel 0.8%được khuyến cáo sử dụng Cân 0.8g agarose cho vào lọ thủy tinh với

100 ml TAE 1X

o Gel được đun kĩ đến khi các hạt gel được tan hoàn toàn.

o Chờ cho gel giảm nhiệt độ xuống khoảng 60oC Đổ gel nhẹ nhàng vàohộp gel đã chuẩn bị sẵn khuôn và lược Sau khoảng 30 phút có thể rútlược ra để điện di được

• Điện di

o Chuẩn bị bể điện di, đổ đệm TAE 1X và đặt khuôn gel đã chuẩn bị vào

o Trộn 6 µl dung dịch ADN và 1 µl loading dye 6X, sau đó tra vào cácgiếng Hút 4 µl thang chuẩn 1kb tra vào một giếng để chạy so sánh

o Cắm nguồn điện vào hiệu điện thế 100V, sau khoảng 35 phút hoặc khivạch màu xanh chạy khoảng 2/3 bản gel thì dừng điện di

• Nhuộm gel và phân tích kết quả

o Gel được lấy ra khỏi khuôn gel và nhuộm trong Ethilium bromide 10phút, thỉnh thoảng lắc để gel nhuộm được tốt

o Đặt gel lên máy soi UV và chụp bằng máy ảnh Các vạch ADN đậm,gọn là đạt yêu cầu

3.4.4 Phương pháp PCR khuyếch đại gen Thyamidine kinase (TK)

Phương pháp PCR được thực hiện theo nguyên tắc do Karl Mullis và cộng sựphát minh năm 1985 Mạch ADN mới được tổng hợp từ mạch khuôn với mồi đặc hiệunhờ enzyme Taq polymerase với sự có mặt của các dNTP và ion Mg2+ và được thựchiện trên các máy chu trình nhiệt (gọi là máy PCR)

Cặp mồi để khuyếch đại gen tk được thiết kế dựa trên trình tự đoạn gen tk 409

bp và trình tự gen TK AJ 535112 trên Genbank Trình tự cặp mồi như sau:

KHV F: 5’- CTATGCTGGAACTGGTGATCGGAC- 3’

KHV R: 5’- GTGGAGCGGCTGACACGACG- 3’

Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được miêu tả như sau

22

Chu trình nhiệt thực hiện như sau:

95oC -5 phút; 35 chu kỳ tiếp theo: 95 oC -30s, 68 oC -30s, 72 oC -30s;

72 oC -5 phút Sau đó giữ mẫu ở 4 oC cho tới khi điện di

3.4.5 Phương pháp nhân dòng và xác trình tự gen

Phương pháp nhân dòng (cloning)

Để thực hiện nhân dòng sản phẩm PCR đã khuyếch đại, chúng tôi sử dụng bộCloneJET™ PCR Cloning Kit của hãng Fermentas

cả những chủng E.coli phòng thí nghiệm thông thường đều có thể chuyển nạp trựctiếp với sản phẩm gắn

Vectơ pJET1.2/blunt khép vòng biểu hiện một enzyme giới hạn gây chết saukhi biến nạp và không được nhân lên Kết quả là, chỉ có những dòng tái tổ hợp chứađựng đoạn chèn xuất hiện trên đĩa nuôi cấy Do đó, sàng lọc trắng xanh là không cầnđến.

Các bước tiến hành: Thực hiện theo quy trình của hãng

• Tạo đầu bằng cho sản phẩm PCR và thực hiện phản ứng gắn

1 Đặt phản ứng tạo đầu bằng

5 Sử dụng trực tiếp hỗn hợp gắn cho sự biến nạp vi khuẩn

• Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương

pháp sốc nhiệt.

Màng tế bào vi khuẩn dưới tạc dung của CaCl2 trở nên xốp và tạo lỗ cho cácphân tử ADN ngoại lai có thể chui vào (gọi là các tế bào khả biến) Sau đó các tếbáo đượclàm phục hồi trong môi trường có bổ sung một số nguyên tố vi lượng(Sambrook và cộng sự, 1989)

24