Xây dựng hệ thống tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá của một số giống cây ăn quả có múi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---o0o--- VŨ LAN ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH TẾ BÀO TRẦN TỪ MÔ SẸO PHÔI HOÁ CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÂY Ă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-o0o -

VŨ LAN ANH

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH TẾ BÀO TRẦN TỪ

MÔ SẸO PHÔI HOÁ CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN

QUẢ CÓ MÚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Trồng trọt

Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ðỗ Năng Vịnh

HÀ NỘI - 2009

LỜI CÁM ƠN

Lời ñầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc ñến GS TS ðỗ Năng Vịnh, người ñã quan tâm, chỉ bảo và hướng dẫn tôi rất tận tình ñể hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới thầy cô giáo lớp cao học K16, ñã giúp

ñỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn trong suốt thời gian học cao học

Tôi xin cám ơn TS Hà Thị Thuý, cùng toàn thể các cô chú, các anh chị

và các bạn ñồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di Truyền Nông Nghiệp ñã giúp ñỡ tôi trong công việc cũng như quá trình viết luận văn

Cuối cùng, tôi xin ñược gửi lời cám ơn sự ủng hộ, ñộng viên khích lệ của gia ñình và bạn bè trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn

Vũ Lan Anh

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan luận văn là kết quả nghiên cứu hoàn toàn chính xác

và trung thực Nội dung luận văn có ñược tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin ñược ñăng tải và công bố trên các tác phẩm, tạp chí và các webside theo danh mục tài liệu của luận văn

Kết quả trình bày trong luận văn ñược xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê với ñộ tin cậy cao

Vũ Lan Anh

1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới và trong

nước

8

1.3 Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trong nước 12 1.4 Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trên thế giới 13 1.5 Cơ sở khoa học - Nguyên lý của quá trình phát sinh phôi soma 14

gi ống cây có múi

18

1.6.1 L ịch sử phát triển của phương pháp tách nuôi và tái sinh tế

23

1.6.2 Các ph ương pháp tách tế bào trần từ các nguồn mẫu khác

nhau

24

mô s ẹo phôi hoá ở citrus

25

tr ần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus

26

1.7 Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá

30

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

32

Valencia

33

2.3.4 Nghiên c ứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo

38

3.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá của 2 giống cam Sành và Valencia

42

3.1.3 Nghiên c ứu ảnh hưởng của dạng mẫu và tuổi mẫu nuôi cấy ñối

v ới tạo mô sẹo phôi hoá

47

kh ối callus của hai giống citrus

50

c ủa hai giống cây ăn quả có múi

53

3.2.4 So sánh h ệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D: 2,4 Dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các giống thương mại chính ñược trồng ở nước ta 7 1.2 Quá trình phát sinh phôi ở cây một lá mầm và hai lá mầm 17 3.1 Ảnh hưởng của H2O2 với thời gian và nồng ñộ khác nhau

ñến hiệu quả khử trùng

43

3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến

sự hình thành callus của cam Sành

45

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến

sự hình thành callus cam Valencia

46

3.4 Ảnh hưởng của dạng mẫu ñối với tạo mô sẹo phôi hoá 47 3.5 Ảnh hưởng BAP và kinetin ñến nhân sinh khối callus 50 3.6 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam

Sành và cam Valencia

52

3.7 Ảnh hưởng của thể tích môi trường khác nhau ñến nhân

3.8 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc khác nhau ñến nhân sinh khối

callus của cam Sành và cam Valencia

56

3.9 So sánh hệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc

thông thường với nhân sinh khối thông qua hệ thống

3.12 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñến sự nảy

3.13 Ảnh hưởng của nước dừa và ME ñến tỷ lệ nảy mầm của

3.14 Ảnh hưởng của loại giá thể ñến tỉ lệ sống của cây ngoài

vườn ươm

76

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Mẫu quả non và lát cắt ngang quả non dùng trong thí

nghiệm

33

3.1 Ảnh hưởng của H2O2 với thời gian và nồng ñộ khác nhau

ñến hiệu quả khử trùng mẫu

43

3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4 D + BAP và 2,4-D + kinetin

ñến sự hình thành callus cam Sành và cam Valencia

3.7 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam

3.11 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc và thể tích môi trường khác

nhau ñến nhân sinh khối callus của cam Sành và cam

Valencia

57

3.12 Mô sẹo phôi hoá trong các ñiều kiện nuôi cấy khác nhau 61

3.13 Hình ảnh tế bào trần 62 3.14 Phôi hình thành trên các môi trường có bổ sung các loại

ñường khác nhau

65

3.15 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñối với sự tạo

phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá

65

3.16 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lắc ñến hình thành phôi vô

tính ở hai giống cam Sành và cam Valencia

3.19 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñến sự nảy mầm

của phôi vô tính

72

3.20 Nảy mầm của phôi vô tính trên môi trường có bổ sung

CðHST

72

3.21 Ảnh hưởng của nước dừa và ME ñến tỷ lệ nảy mầm của

phôi vô tính ở cam Sành và cam Valencia

75

3.22 Ảnh hưởng của nước dừa ñến nảy mầm và phát triển của

phôi vô tính ở cam Valencia

75 3.23 Ảnh hưởng của loại giá thể ñến tỉ lệ sống của cây con 77

MỞ ðẦU

Cây ăn quả có múi (citrus) ñược xem là một trong những cây ăn quả

quan trọng nhất trên thế giới, nhờ giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của nó

Chính vì những giá trị ñó mà diện tích và sản lượng citrus trên thế giới trong

những năm qua liên tục tăng [31] Sản xuất quả Citrus tăng từ 22 triệu tấn năm 1960 ñến 78 triệu tấn năm 1991 và trong năm 2000 – 2004 sản lượng

cả thế giới tăng lên 117 triệu tấn với diện tích xấp xỉ 8 triệu ha [25]

Ở Việt Nam diện tích trồng cây ăn quả có múi trong những năm qua cũng tăng rất nhanh, năm 1990 cả nước có 19 062 ha cam quýt với sản lượng

119 238 tấn [2] ðến năm 2007-2008 sản lượng citrus của cả nước ñã tăng lên

624 000 tấn với diện tích khoảng 61 100 ha, riêng cam quýt chiếm 51 100 ha [25]

Các giống cam quýt của nước ta vô cùng phong phú bao gồm các giống nhà trồng, hoang dại và bán hoang dại Tuy nhiên, những giống này còn nhiều nhược ñiểm so với các giống tiêu chuẩn trên thị trường quả có múi thế giới [3] Do ñó, việc tạo giống cây ăn quả có múi ñáp ứng tiêu chuẩn về chất lượng là một trong những mục tiêu quan trọng hàng ñầu của công tác chọn tạo giống Hiện nay, ngoài các phương pháp truyền thống ñã và ñang ñược áp dụng thì phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học ñang là mục tiêu hướng ñến của các nhà chọn tạo giống Trong ñó, kỹ thuật nuôi cấy mô có thể tạo ra nguồn mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính sạch bệnh hoặc có thể tạo ra nguồn tế bào trần có khả năng dung hợp từ nhiều loại mẫu khác nhau ñể tạo nhiều con lai xa khác loài, giúp vượt qua những rào cản di truyền khi lai bằng các phương pháp truyền thống, và mở rộng cơ sở di truyền cho chọn tạo giống [13] Một trong các hướng ứng dụng quan trọng của nó là tách và tái sinh tế

bào trần từ mô sẹo phôi hoá Các nhà chọn giống cây có múi ñã nghiên cứu tạo ñược nguồn tế bào trần từ các mô khác nhau ở cây có múi như tế bào thịt

lá, mô sẹo phôi hoá, mô sẹo không phôi hoá, tế bào tứ tử (Tetrads) Kể từ ñây tái sinh cây từ tế bào trần ñã thực hiện ñược ở rất nhiều giống và loài citrus [28, 35, 29]

Trong số các giống ñược trồng phổ biến như: bưởi Phúc Trạch, bưởi ðoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Năm Roi; các giống quýt ðường Canh, quýt Bắc Sơn, quýt Tích Giang; các giống cam Xã ðoài, cam Vân Du, cam Sành, thì

cam Sành (Citrus nobilis) có phổ thích nghi rộng, trồng ñược ở cả 2 miền Bắc

Nam, có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên cam Sành lại là giống nhiều hạt và hiện

nay ñang bị nhiễm bệnh greening nặng nề Còn cam Valencia (Citrus

trồng phổ biến trong nước và trên thế giới ðây là loại cam có vỏ ngoài mỏng

và ñẹp, có tỷ lệ xơ thấp, nhiều nước, ít hạt, có mùi thơm và ngọt, có khả năng thích nghi rộng, chịu hạn cao Ngoài ra cam Valencia có ñặc ñiểm là chín muộn, và có thể thu hoạch trong thời gian dài [3] Do vậy, việc xây dựng thành công hệ thống tái sinh tế bào trần có nguồn gốc từ mô sẹo làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống mới có năng suất, chất lượng cao, không hạt thích nghi với môi trường sinh thái và thị trường trong nước là một yêu cầu quan trọng của công tác chọn tạo giống

Với lý do ñó, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Xây dựng hệ thống tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá của một số giống cây ăn quả có múi”

Mục ñích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình tạo mô sẹo phôi hoá in vitro ở giống cam Sành và cam

Valencia làm vật liệu tốt cho tách và nuôi cấy tế bào trần

- Xây dựng ñược phương pháp tái sinh cây từ tế bào trần ở hai giống cam Sành và cam Valencia làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về dung hợp tế

bào trần và chuyển gen

Yêu cầu

ðể ñạt ñược mục ñích trên chúng tôi tiến hành một số nghiên cứu sau:

- Xây dựng quy trình tạo mô sẹo phôi hoá của hai giống cam Sành và cam Valencia

- Xác ñịnh môi trường tối ưu cho giai ñoạn nhân sinh khối nguồn mô sẹo phôi hoá

- Tách và nuôi cấy thành công tế bào trần từ nguồn mô sẹo phôi hoá

- Tạo ñược cây con ngoài vườn ươm

Ý nghĩa khoa học thực tiễn của ñề tài

Tiếp cận và làm chủ ñược hệ thống tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá, từ ñó phục vụ tốt cho công tác chọn tạo giống cây ăn quả có múi

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây ăn quả có múi

Sản xuất quả citrus của thế giới liên tục tăng: 22 triệu tấn vào năm 1960,

78 triệu tấn vào năm 1991 và từ năm 2000 - 2004 sản lượng citrus hàng năm

ñạt 105 triệu tấn [41, 24] ðến năm 2007 - 2008 thì sản lượng Citrus trên toàn thế giới ước tính vào khoảng 116 triệu tấn, trong ñó sản lượng cam chiếm khoảng 64 triệu tấn (FAO, 2009) Trên thế giới có 140 nước sản xuất quả Citrus

tập chung chính là Florida và Braxin, với sản lượng hàng năm chiếm khoảng 85% của toàn thế giới Riêng Braxin xuất khẩu 99% sản lượng, trong khi ñó Florida thì tiêu thụ 90% Tiêu thụ quả có múi bình quân ñầu người ở các nước phát triển năm 2002 là 22kg/ người (cam, quýt), 2kg/ người (bưởi); ở các nước ñang phát triển là 8,5kg/ người (cam, quýt) và 0,5kg/ người (bưởi) [22]

1.1.1 Phân loại

Hệ thống phân loại cam quýt rất phức tạp do khả năng thích ứng rộng: ngày càng có nhiều các dạng lai tự nhiên, các ñột biến tự nhiên và quá trình chọn giống nhân tạo ñã tạo nên nhiều giống mới, loài mới, do ñó những thiếu sót và nhầm lẫn trong phân loại là không tránh khỏi

Cây ăn quả có múi thuộc tông Clauseneae, dưới họ Aurantioideae, họ

nhiều tác giả bổ sung, ñiều chỉnh [3] Theo hệ thống phân loại của Swingle

(1967), Sykes (1987) và Jones (1990) thì họ Rutaceae, dưới họ Aurantioideae

có hai tông (tông Clauseneae và Citreae), 6 tông phụ và 33 chi, trong chi

là Citrus, Poncitrus, Fortunella, Eremocitrus, Microcitrus và Clymenia ðặc

ựiểm chung của 6 chi này là cho trái có tép mọng nước Chi citrus ựược chia

làm 2 nhóm nhỏ Eucitrus và Papeda, các loài ựược trồng phổ biến hiện nay thuộc nhóm Eucitru Các loài trong nhóm Papeda thường ựược dùng làm gốc

ghép hay lai với các loài khác

Ở Việt Nam ựã ghi nhận là có 14 chi, 37 loài thuộc dưới họ

lục 1, bảng 2) Khác với Võ Văn Chi, Phạm Hoàng Hộ (1992) chia chanh kiên

và chanh tây làm hai loài riêng biệt: citrus limonia (chanh kiên) và C limon (chanh tây) và bổ sung thêm một số loài, vắ dụ, C nobilis (cam Sành, King

Mandarin)

1.1.2 Nguồn gốc

Citrus xuất hiện ựầu tiên ở đông Nam Châu Á khoảng 4000 năm trước công nguyên, sau ựó ựược di chuyển dần sang miền bắc Châu Phi chủ yếu qua con ựường thương mại [8] Tanaka (1979) ựã vạch ựường ranh giới vùng xuất

xứ của các giống thuộc chi citrus từ phắa ựông Ấn độ (chân dãy Hymalaya)

qua Úc, miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản điều này cũng khẳng ựịnh thêm

về nguồn gốc các giống cam chanh (Citrus sinensis Osbeck) và các giống

quýt ở Trung Quốc theo ựường ranh giới gấp khúc Tanaka [3]

Thanh Yên (Citron) là loại trái ựầu tiên trong loài cây có múi ựược biết ựến ở Châu Âu, và ựược mô tả trồng ở vùng vịnh Ba Tư khoảng 300 năm trước công nguyên, sau này ựược trồng nhiều ở Ý và những vùng ấm áp ở Châu Âu [18]

Cam chua (sour orange) hay cam ựắng ựược phát triển trong thế kỷ thứ

10 ở phắa ựông địa Trung Hải và muộn hơn ở Châu Phi và Nam Châu Âu Chanh tây (limon), Chanh ta (lime) và Bưởi (pomelo) cũng tương tự như vậy nhưng ựược phát hiện muộn hơn khoảng vào nửa ựầu thế kỷ 12 [18]

Cam ngọt (sweet orange) theo như tác giả Tanaka thì có nguồn gốc từ Trung Quốc và phổ biến ở Châu Âu có lẽ trong thế kỷ thứ 16

Quýt (mandarin, tangerine) cũng ựược trồng ở Trung Quốc và Nhật Bản trong thời gian rất sớm Nhiều tác giả cho rằng hầu hết các giống quýt hàng hoá có nguồn gốc ở Trung Quốc, Nhật Bản hoặc đông Nam Á, riêng quýt Satsuma có nguồn gốc hoàn toàn từ Nhật Bản

Bưởi chùm (grapefruit) có lẽ ựây là một loài lai của bưởi, cam Temple

có nguồn gốc ở miền Tây ấn độ [8]

Hiện nay cam quýt ựược trồng nhiều nơi trong vùng khắ hậu nhiệt ựới

và Á nhiệt ựới, khoảng giữa 400 vĩ Bắc và 400 vĩ Nam, nơi có ựất ựai thắch hợp, ựủ ẩm và không quá lạnh (tối thiểu từ âm 60C - âm 40C) Các yếu tố ảnh hưởng ựến vùng trồng cây ăn quả có múi bao gồm khắ hậu, ựất ựai, nhiệt ựộ tối thiểu Những nơi có nhiệt ựộ thắch hợp nhưng lượng mưa nhiều, nhiều gió, nhiều mây che phủ kèm theo bức xạ mặt trời yếu hoặc ựất ựai không phù hợp như tầng canh tác nông, khả năng giữ nước kém, lũ lụt, sẽ không thuận lợi cho cây có múi phát triển

Theo thống kê trên thế giới có khoảng hơn 90 nước trồng cây ăn quả có múi, với diện tắch trồng trọt gần 3 triệu ha Phần lớn chúng ựược trồng ở các vùng cận nhiệt ựới khoảng giữa 150 và 350 vĩ Bắc, 150 và 350 vĩ Nam, có nhiệt

ựộ mùa ựông lạnh vừa phải, có giai ựoạn ngủ nghỉ ựông và sau ựó cây ra hoa ựồng loạt vào mùa xuân Tại các vùng nhiệt ựới khoảng giữa 15 0 vĩ bắc và 15

0 vĩ nam nơi có nhiệt ựộ cao, không thắch hợp lắm cho việc trồng cam quýt nhưng bưởi và chanh lại khá phát triển do chịu ựược nhiệt Khi nhiệt ựộ cao quanh năm, cây có múi có thể ra hoa vài lần trong năm Sự ra hoa ở vùng này ựược kắch thắch bởi khô hạn hoặc các yếu tố khắc nghiệt khác Quả thường có

vỏ màu xanh khi chắn và chất lượng thấp hơn Bù lại, ở các vùng cao như cao

nguyên ở gần xích đạo, người ta vẫn cĩ thể sản xuất được quả cĩ múi chất lượng cao

1.1.3 Các giống cây ăn quả cĩ múi trồng phổ biến ở trong nước

Ở nước ta cây ăn quả cĩ múi được trồng tản mạn khắp các vùng trong

cả nước Mỗi vùng, miền đều cĩ các giống đặc sản địa phương nổi tiếng được chọn lọc từ lâu đời Giống cam được trồng phổ biến ở miền Bắc và miền Trung là cam Sành, cam Xã ðồi, cam Sơng Con, cam Vân Du; ở miền Nam lại chủ yếu là cam mật, cam Sành Các giống quýt cũng rất phong phú, nổi tiếng cĩ giống quýt ðường Canh, quýt Sen, quýt Chum [8] ở nước ta cĩ tập đồn giống bưởi rất đa dạng, cĩ nhiều giống với tên gọi khác nhau Trong số

đĩ rất nhiều giống đặc sản nổi tiếng, như bưởi ðoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Phúc Trạch, bưởi Năm Roi, bưởi Biên Hồ Tuy nhiên sự phân biệt các giống cịn nhiều hạn chế Giống chanh được ưa chuộng ở nước ta là giống chanh ta, cịn được gọi là chanh giấy, sai quả, cĩ vị rất chua

Bảng 1.1 Các giống thương mại chính được trồng ở nước ta

Cam Xã ðồi Nhập nội Vùng cam Bắc Trung Bộ và nơng

trường Cao Phong, Hồ Bình Cam Vân Du Nhập nội Nghệ An, Hà Tĩnh

Cam Sành Con lai giữa cam và

Bưởi Diễn Trong nước Hà Nội

Bưởi Phúc Trạch Trong nước Hà Tĩnh

Bưởi Năm Roi Trong nước Vĩnh Long

Trong số các giống được trồng nhiều hiện nay giống phổ biến và thích nghi rộng nhất với cả hai miền Bắc và Nam là giống cam Sành (Citrus

nobilis), cĩ giá trị kinh tế cao, nặng trung bình 3-4 quả/kg, nhiều nước, mầu vàng da cam sẫm khi chín, vị ngọt hơi chua Mặc dù cĩ hương vị rất được ưa chuộng và năng suất cao nhưng cam Sành lại là giống nhiều hạt và tính trạng này làm giảm giá trị của giống rất nhiều và khơng đáp ứng được yêu cầu của thị trường quốc tế cũng như yêu cầu trong cơng nghiệp chế biến

Ngồi các giống của địa phương, nhiều tập đồn giống cây cĩ múi đã được nhập vào Việt Nam, trong đĩ cĩ một số giống như Valencia, Navel, Clementine, giống chanh khơng hạt,… đã cho năng suất và chất lượng quả khá Vì nhiều lý do tập đồn giống quý này vẫn chưa được trồng rộng rãi và cơng nhận như là giống sản xuất trong nước

Các giống trồng sản xuất phổ biến ở nước ta đa số đều là các giống nhiều hạt, lạc hậu so với tiêu chuẩn quốc tế Vì vậy việc tạo giống khơng hạt chất lượng cao là vấn đề lớn trong chọn tạo giống cây ăn quả cĩ múi nĩi chung và giống cam Sành nĩi riêng ở nước ta

1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ quả cĩ múi trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả cĩ múi trên thế giới

Sản xuất quả citrus của thế giới liên tục tăng: 22 triệu tấn vào năm

1960, 78 triệu tấn vào năm 1991 và từ năm 2000 - 2004 sản lượng citrus hàng

năm đạt 105 triệu tấn [41, 24] ðến năm 2007 – 2008 sản lượng citrus trên tồn thế giới ước tính vào khoảng 116 triệu tấn, trong đĩ sản lượng cam

chiếm khoảng 64 triệu tấn Trên thế giới cĩ 140 nước sản xuất quả citrus tập

chung chính là Florida và Sao Paulo (Braxin), với sản lượng hàng năm chiếm khoảng 85% của tồn thế giới, riêng Braxin xuất khẩu 99% sản lượng thu được, trong khi đĩ Florida lại tự tiêu thụ tới 90%

Sản lượng cây ăn quả cĩ múi (citrus) ở các nước sản xuất chính trên thế giới trong giai đoạn 2005/2006 khoảng 72,8 triệu tấn, tăng nhẹ so với giai đoạn 2004/2005 Trong đĩ bao gồm 47,1 triệu tấn cam, 15,0 triệu tấn quýt,

4,3 triệu tấn chanh, 4,0 triệu tấn bưởi chùm và 2,4 triệu tấn các loại citrus khác Cĩ nhiều sự khác biệt giữa những nước này, sản lượng cam của Barazil được dự đốn vào khoảng 1,7 triêu tấn, trong khi đĩ Argentina, China, Mexico và Ý cũng đang cĩ xu hướng tăng thêm

Hình 1.1 Tổng sản lượng Citrus của các nước chính

Trong suốt hai thập kỉ qua, ngành sản xuất cam quýt trên thế giới khơng ngừng tăng nhanh và mức tiêu thụ quả cĩ múi trên thị trường thế giới

cũng ngày một cao hơn Tổng sản lượng citrus hàng năm đạt trên 105 triệu

tấn trong giai đoạn 2000 - 2004 [24] Ba nước sản xuất quả cĩ múi lớn nhất là Braxin, Mỹ, Trung Quốc, chiếm khoảng 60% tổng sản lượng tồn cầu Khoảng 60% sản lượng quả cĩ múi được tiêu thụ dưới dạng quả tươi, 40% cịn lại là chế biến Braxin là nước sản xuất quả cĩ múi lớn nhất chiếm 20%

tổng sản lượng citrus của thế giới, tiếp theo là Mĩ (14%), Trung Quốc (12%)

và Mexico (6%) [24]

Quả citrus được sản xuất ở khắp nơi trên thế giới, theo số liệu của FAO (2004) cĩ 140 nước sản xuất quả citrus Tuy nhiên, hầu hết sản lượng tập trung ở những vùng nhất định Diện tích trồng citrus ở bang Florida (Mĩ) là

342 041 ha, Sao Paulo (Braxin) là 338 000 ha Nước nhiệt đới trồng nhiều cam quýt là Mexico, riêng bang Veracruz đã trồng 70700 ha Mexico nằm ở 10-24o vĩ Bắc tương tự với Việt Nam và là nước cĩ sản lượng quả cĩ múi xếp thứ 5 trên thế giới [4]

Quả cĩ múi chủ yếu được tiêu thụ ở các nước phát triển, mặc dù tiêu

thụ quả citrus bình quân trên đầu người ở các nước đang phát triển đang tăng

lên do thu nhập tăng Tiêu thụ quả cĩ múi bình quân đầu người ở các nước phát triển năm 2002 là 22kg/ người (cam, quýt), 2kg/ người (bưởi); ở các nước đang phát triển là 8,5kg/ người (cam, quýt) và 0,5kg/ người (bưởi)[22] Nhưng theo FAO, tiêu thụ cam tươi ở các nước đang phát triển hiện nay cĩ xu hướng giảm do hai lý do: tiêu thụ cam tươi đang được thay thế bằng nước cam; khâu bảo quản và vận chuyển được cải thiện nên cĩ nhiều loại quả thay thế khác Tuy vậy, tiêu thụ cam tươi vẫn phổ biến ở nhiều nước đang phát triển, đặc biệt là ở những nền kinh tế khổng lồ như Mexico, Ấn ðộ, Argentina, Braxin và Trung Quốc

Bên cạnh đĩ, sản lượng nước cam trên thế giới cũng tăng lên đáng kể, năm 2005/06 dự đốn là 2,4 triệu tấn (65 độ brix), tăng 4 % so với năm 2004/05 Sản lượng nước cam tại Brazil trong năm 2005/06 (từ thỏng 7 năm

2005 đến tháng 7 năm 2006) ước tính khoảng 1,4 triệu tấn (65 độ brix) tăng 9% so với năm 2004/05 Tại Mỹ, sản lượng nước cam trong năm 2005/06 ước tính xấp xỉ 709.000 tấn, tăng 2 % so với năm 2004/05 nhưng sản lượng nước cam giảm 32% so với mức cao nhất của năm 2003/04 Thơng thường hàng năm ước tính cứ khoảng 95% tổng sản lượng được chế biến thành nước cam tại Florida Sản lượng cam năm 2005/06 tại Florida được dự đốn là tăng khoảng 27 % so với năm trước, trước khi cơn bão Wilma đổ vào Florida Mặc

dù vậy năm 2005/06 do bị ảnh hưởng của cơn bão Wilma, sản lượng cam Valencia tại Florida đuợc dự báo là tăng 11 lần so với năm 2004/05 Sản

lượng nước cam được xem là sản phẩm chính Brazil và Mỹ chiếm khoảng 89

% tổng sản lượng trên tồn thế giới

1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả cĩ múi ở nước ta

Nghề trồng cây ăn quả cĩ múi ở nước ta cĩ lịch sử phát triển lâu đời với tập đồn giống đa dạng và phân bố rộng khắp các vùng trong cả nước từ Bắc vào Nam Trồng cam, chanh, quýt, bưởi nhanh cho thu quả và lãi suất cao hơn nhiều loại cây khác [3] Ở nước ta, trong số các loại cây ăn quả, cây ăn quả cĩ múi đứng thứ hai sau chuối về tầm quan trọng và ý nghĩa kinh tế [4] Diện tích trồng cây ăn quả cĩ múi ở Việt Nam trong những năm qua tăng nhanh Năm 1990 cả nước cĩ 19 062 ha cam quýt với sản lượng 119 238 tấn [2] ðến năm 2007-2008 sản lượng citrus của nước ta đã tăng lên 624 000 tấn với diện tích khoảng 61 100 ha, riêng cam quýt chiếm 51 100 ha [25]

Tuy nhiên, tăng trưởng về diện tích và sản lượng cây ăn quả cĩ múi chưa bền vững và cĩ chiều hướng bấp bênh do bệnh dịch và cơ cấu giống chưa ổn định Diện tích trồng mới tăng nhanh, nhưng diện tích phá đi hàng năm cũng khơng nhỏ

Ở nước ta, hầu hết các vườn cây cĩ múi trong cả nước đều nhiễm bệnh vàng lá nặng Các vùng sản xuất cam quýt tập trung hầu như bị tàn lụi Các vườn trồng mới được hình thành ở các vùng đã trồng cây cĩ múi truyền thống nên cây trồng mới luơn xen kẽ với cây bệnh, vì vậy tuổi thọ và năng suất của các vườn trồng mới đều bị đe doạ Các giống trồng phổ biến trong sản xuất ở nước ta như cam Sành, cam Vân Du, cam Sơng Con, cam Xã ðồi, bưởi Diễn, bưởi Phúc Trạch,… hầu hết là các giống nhiều hạt, chất lượng dùng trong ăn tươi và chế biến đều thấp Các giống đều lạc hậu so với tiêu chuẩn quốc tế, chưa sản xuất được quả khơng hạt (trừ giống bưởi Năm Roi) [4] Vì

vậy, việc tạo nguồn giống sạch bệnh và tạo giống không hạt chất lượng cao là yêu cầu cấp bách trong sản xuất quả có múi hiện nay

1.3 Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trong nước

Ở nước ta, các nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức ựộ phân loại thực vật,

cách trồng và nhân giống vô tắnh,Ầ citrus cũng là một trong những ựối tượng

ựược các tác giả như Phạm Hoàng Hộ (1992), đỗ đình Ca (1996), Võ Văn Chi (1997), đỗ Năng Vịnh (2000) nghiên cứu phân loại thực vật công phu

Việc tuyển chọn cây ựầu dòng ựã ựược các viện nghiên cứu và các ựịa phương thực hiện khá thành công Một số giống cây có múi ựặc sản, nhất là bưởi Năm Roi ựã ựược nghiên cứu phát triển tại Viện cây ăn quả miền Nam Tại miền Bắc, Viện nghiên cứu Rau Quả, Trung tâm cây ăn quả Xuân Mai, Phủ Quỳ, Phú Hộ là các trung tâm nghiên cứu, ựồng thời là nơi sản xuất giống cây có múi phục vụ sản xuất [4]

Từ năm 1991, bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Di truyền Nông nghiệp

ựã tiến hành nghiên cứu về chọn tạo giống cam, bưởi không hạt, tạo giống ựa bội và ựã thu ựược một số kết quả có ý nghĩa lý luận cơ bản, ựồng thời ựã tạo

ra nhiều dòng tam bội và nguồn gen mới có các ựặc tắnh không hạt ở cây ăn quả có múi, cụ thể như sau:

a đã nghiên cứu quy trình tạo cây tứ bội thể từ chồi ngủ của cây già, hạt

non, mô sẹo phôi hoá và cụm chồi in vitro ở các loài và giống cây ăn quả có

múi khác nhau

b Xây dựng ựược quy trình tạo và nhân nhanh mô sẹo phôi hoá, phôi vô tắnh và cây con từ cấy mô ở các giống cây ăn quả có múi bản ựịa khác nhau dùng trong nghiên cứu ựa bội hoá, biến dị và làm vật liệu cho dung hợp tế bào trần c đã tạo ựược các dòng tứ bội có giá trị, gồm tứ bội thể cam Sành, cam Vân Du, cam Xã đoài, bưởi Phúc Trạch, quýt Chum, bưởi đỏ

d đã thu ựược một số dòng bất dục ựực và ựang nhân cây bất dục phục vụ

khảo nghiệm

e Tạo ựược nhiều dòng tế bào và cây từ mô sẹo phôi hoá ở các giống như quýt đường Canh, cam Vân Du, cam Sành, cam Navel, cam Valencia,Ầ Hiện tại các cây này ựang ựược theo dõi, và tế bào phôi hoá ựược sử dụng trong

gây ựa bội thể và biến dị tế bào sôma

f đã nghiên cứu biểu hiện tắnh trạng không hạt làm cơ sở lý luận cho chọn giống và ựã xác ựịnh ựược nguồn gen với tắnh trạng không hạt ựặc trưng

Ngoài ra, các tác giả như Trịnh Bá Hữu (1966), Trần Thế Tục (1973, 1975), Ngô Xuân Bình (1998, 2001) cũng tiến hành nghiên cứu về tạo giống cây ăn quả có múi nhưng các công trình nghiên cứu này ựều thực hiện ở nước ngoài, chưa có ựiều kiện tiếp tục trong nước

1.4 Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trên thế giới

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp khác nhau ựược áp dụng ựể chọn tạo những giống citrus có giá trị như:

a Nghiên cứu tạo cây tam bội ở các giống cây ăn quả có múi, thông qua những kỹ thuật như cứu phôi, nuôi cấy nội nhũ, chiếu xạ, phương pháp dung hợp tế bào trần giữa dạng 1n và 2n

b Nghiên cứu tạo cây tứ bội ở các giống cây ăn quả có múi: Chọn tạo dòng

tứ bội có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: chọn lọc các dạng tứ bội xuất hiện với tần số khá cao trong tự nhiên [14] hoặc có thể bằng các hoá chất gây tạo ựa bội như colchicine [63,58], hoặc gần ựây các nhà khoa học ựã tạo ựược hàng loạt các dạng dị tứ bội bằng dung hợp tế bào trần [29]

c Tạo dòng dị tứ bội bằng dung hợp tế bào trần

Trong số những cây ựa bội, cây tam bội là cây quan trọng nhất vì chúng

cho quả không hạt Sản xuất citrus không hạt có thể cải thiện chất lượng quả

tươi Các giống citrus không hạt có một lợi thế thương mại rõ rệt Một số

giống có nhiều ñặc ñiểm nổi trội nhưng không có giá trị thương mại vì có quá nhiều hạt Ở những nước phát triển các giống nhiều hạt ñược trồng ở những nơi có sự khác nhau lớn về mùa, hoặc do có một số tính trạng tốt hơn, hay ñơn giản là do thiếu các giống không hạt Các nhà chọn giống ñang nghiên cứu những phương pháp cho phép tái tổ hợp giới tính nhằm tạo ra dòng quả gần như không hạt [32]

1.5 Cơ sở khoa học- Nguyên lý của quá trình phát sinh phôi soma

Chúng ta biết rằng, tất cả tế bào thực vật ñều chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết ñể tạo ra một thực vật mới hoàn chỉnh Về mặt cơ chế phân tử thì sự phát sinh hình thái này là một quá trình biểu hiện phức tạp của các gen

và ñược ñiều hòa nghiêm ngặt, ñảm bảo cho các hệ thống, cơ quan trong cơ thể sống biệt hóa ñúng thời ñiểm cần thiết khi cơ thể ñó phát triển [44, 64]

Vì vậy, việc cảm ứng phát sinh phôi cần trải qua những sự kiện: kết thúc biểu hiện của các gen ñang hoạt ñộng và thay thế bằng chương trình biểu hiện gen phôi hóa ñể hình thành phôi soma Nguyên lý này ñược Sharp và Evans ñề xuất ñầu tiên vào năm 1983 trên tạp chí Plant Cell Report Hai ông

ñã sử dụng thuật ngữ “IEDC” (Induced Embryogenic Determined Cell- tế bào ñược xác ñịnh có khả năng phôi hóa do cảm ứng) ñể mô tả tế bào phôi hóa có nguồn gốc từ tế bào không phôi hóa; còn các tế bào hình thành từ phôi ñã có sẵn chương trình biểu hiện gen phôi hóa ñược gọi là PEDC (Pre-Embryogenic Determined Cell- tế bào ñược xác ñịnh có khả năng tiền phôi hóa) Vì vậy, tùy theo từng kiểu tế bào mà có hai con ñường phát sinh phôi soma [44, 64, 52] Tuy nhiên, dù là kiểu phát sinh nào, cả hai loại tế bào IEDC và PEDC ñều có chức năng như nhau và ñược gọi chung là EDC (Embryogenic Determined Cell- tế bào ñược xác ñịnh có khả năng phôi hóa) hay ñơn giản là

EC (Embryogenic Cell- tế bào phôi hóa) [44]

Thứ nhất là con ñường phát sinh phôi soma trực tiếp, trong ñó phôi hình thành từ tế bào hoặc mô mà không qua giai ñoạn tạo callus, các tế bào này chính là PEDC Vật liệu khởi ñầu nuôi cấy phôi như vậy là các mô ñã tái

trẻ hóa như mô nucella ở Citrus có xu hướng hình thành ña phôi hoặc tế bào

thịt lá của trụ dưới lá mầm ở một số loài

Thứ hai là con ñường phát sinh phôi gián tiếp qua callus và các tế bào chuyển thành phôi chính là IEDC [52] Phôi soma ñiển hình thường xuất hiện

từ các cụm tế bào gồm một vài ñến hàng chục tế bào nhỏ có khả năng phôi hoá Ngoài ra, phát sinh phôi thứ cấp hay sản xuất phôi từ phôi soma ban ñầu

là một trường hợp ñặc biệt của con ñường này

Trong hai con ñường trên, kiểu phát sinh gián tiếp là phương pháp phổ biến hơn ñể sản xuất phôi soma, ñáp ứng nhiều mục ñích khác nhau và ñã ñược mô tả ở hàng trăm loài thực vật Nguyên tắc chung của phương pháp này là ñưa các tế bào ñã biệt hóa trở về trạng thái chưa biệt hóa rồi tái biệt hóa thành phôi, trong ñó auxin ñóng vai trò quan trọng ñể cảm ứng cho quá trình

phản biệt hóa xảy ra [52, 64]

1.5.1 Quá trình phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus

1.5.1.1 Sự hình thành callus

Về cơ bản, callus là mô ung thư, ít hoặc nhiều chưa cơ quan hóa và thường hình thành từ vết thương của các mô cơ quan ñã biệt hóa [52]

Theo Pierik (1987), quá trình phản biệt hóa ñóng vai trò rất quan trọng

ñể tế bào trưởng thành có khả năng ñược tái xác ñịnh Trong quá trình này, các tế bào trưởng thành có thể chuyển từ trạng thái trưởng thành sang trạng thái trẻ hóa và hệ quả tất yếu là tế bào ñược cảm ứng phân chia mạnh hơn, có tốc ñộ sinh trưởng nhanh hơn và tạo ra callus, một loại mô biệt hóa kém và chưa cơ quan hóa Tuy nhiên, callus thường không ñồng dạng do chúng ñược

hình thành từ hai loại mô: biệt hóa và không biệt hóa, tức là chúng sẽ có khả năng phát sinh phôi soma khác nhau

Như vậy, ñể con ñường phát sinh phôi gián tiếp xảy ra, ñiều kiện quan trọng nhất là callus phải có khả năng phôi hóa, hình thành phôi và cây hoàn chỉnh [44, 52] Nhiều nghiên cứu ñã báo cáo quá trình phát sinh phôi soma ở thực vật nhưng việc xác ñịnh những ñặc trưng của tế bào phôi hóa (EC- Embryogenic Cell) và chưa phôi hóa (NEC- Non- Embryogenic Cell) vẫn còn rất hạn chế

Mặt khác, những ñiểm khác nhau giữa EC và NEC trên ñây có thể thay ñổi tùy từng ñối tượng thực vật Thông thường các nhà nghiên cứu sử dụng cà

rốt Daucus carota làm mẫu hình chuẩn ñể tìm hiểu quá trình phát sinh phôi

gián tiếp ở thực vật (Komamine et al., 2005) Ngoài ra, một số báo cáo cũng

tập trung vào củ cải ñường Beta vulgaris L Gần ñây, Moghaddam và Taha

(2005) ñã quan sát những ñiểm khác biệt giữa EC và NEC ở ñối tượng này, thấy rằng callus thu ñược có hai loại: NEC có mức ñộ ña bội hóa cao, có mật

ñộ lưới nội chất thô, polysome, nhân con lớn hơn, vách tế bào không hoàn chỉnh và bất thường hơn so với EC

Tóm lại, ñể quá trình hình thành phôi xảy ra thì sự kiện quan trọng ñầu tiên là sinh khối tế bào chưa cơ quan hóa với không bào trung tâm lớn phải chuyển thành các tế bào giàu sinh chất, có khả năng phôi hóa dưới ảnh hưởng của yếu tố cảm ứng (auxin) Những tế bào này tiếp tục phân chia tích cực và

sẽ phát triển thành phôi khi loại bỏ yếu tố cảm ứng ñó ra khỏi môi trường nuôi cấy [44]

1.5.1.2 Sự tái sinh phôi

Quá trình phôi hoá thường khó quan sát nên vẫn còn nhiều tranh cãi về nguồn gốc tạo phôi là từ một hay nhiều tế bào Phôi soma có thể hình thành từ các tế bào callus phôi hóa ðể phân biệt với phôi hợp tử phát triển từ các tế

bào trứng ựã thụ tinh, người ta còn gọi phôi soma hay phôi vô tắnh dưới nhiều cái tên như cấu trúc giống phôi, phôi phụ hoặc thể phôi [52]

Quá trình phát sinh phôi soma ựã ựược báo cáo ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm với ựặc ựiểm chung là ựều bắt ựầu từ giai ựoạn phôi hình cầu và

có phân cực hóa dẫn ựến xuất hiện tiền lá mầm và tiền rễ, ựây là những dấu hiệu quan trọng trong biệt hóa tế bào phôi [44] Trong ựó, phôi hình cầu ựánh dấu sự khởi ựầu biệt hóa cấu trúc phôi, tiếp theo là thiết lập trục phôi với sự xuất hiện của các protein ựặc hiệu không gian ở nửa bán cầu trên và dưới của phôi, từ ựó hình thành cực rễ và cực chồi tại các nửa tương ứng [64] Tuy nhiên, tùy thuộc vào bản chất là thực vật một hay hai lá mầm, quá trình phát sinh phôi có sự khác nhau ở mỗi giai ựoạn phát triển

Bảng 1.2 Quá trình phát sinh phôi ở cây một lá mầm và hai lá mầm

Tái sinh phôi soma

qua 3 giai ựoạn:

Hình cầu→ Hình

khiên → Lá mầm lớn

Tái sinh phôi qua 4 giai ựoạn:

Hình cầu→ Tim→ Thủy lôi→

Hai lá mầm

Merkle et al., 1995 Komamine et al., 2005

S ự kiện quan trọng

nh ất: Hình cầu→

Hình khiên

S ự kiện quan trọng nhất: Hình cầu→ Hình tim

Yeung, 1995 Komamine et al., 2005

Giai ựoạn hình khiên:

Phôi có dạng ựặc

trưng với tiền lá mầm

và bao lá mầm bao

quanh nó

Giai ựoạn hình tim và thủy

lôi: đánh dấu sự xuất hiện

tiền lá mầm

Yeung, 1995 Komamine et al., 2005 Firoozabady & Moy,

cực rễ

Tribulato et al., 1997 Merkle et al., 1995 Firoozabady & Moy,

2004

Những thí nghiệm nuôi cấy mô ñầu tiên thực hiện ở cây có múi ñã tạo thành công phôi vô tính từ mô phôi tâm nhằm mục ñích tái sinh cây sạch bệnh [54, 55] Từ mục ñích ban ñầu này ngày nay mô sẹo phôi hoá - phôi vô tính là nguồn thực liệu ñược sử dụng rộng rãi trong các chương trình chọn tạo giống cây có múi, như chọn lọc biến dị dòng vô tính, tái sinh cây sạch bệnh, bảo tồn nguồn gen, dung hợp tế bào trần và chuyển gen [49] Kỹ thuật này là phương pháp giúp các nhà chọn tạo giống cây có múi vượt qua những vướng mắc về cấu trúc di truyền và mở rộng cơ sở di truyền cho chọn tạo giống

Từ thí nghiệm ban ñầu tạo phôi vô tính từ mô phôi tâm nucellar ñến nay ñã tạo ñược mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính từ rất nhiều kiểu dạng mẫu nuôi cấy khác nhau Khả năng tạo mô sẹo phôi hoá và tái sinh phôi vô tính bị ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố khác nhau như giống, mẫu cấy, môi trường [41]

Như vậy, phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus là quá trình phổ biến, ñược sử dụng như một công cụ hữu ích ñể nhân nhanh và cải tiến giống cây trồng ở nhiều loài thực vật, ñặc biệt là cây một lá mầm dạng củ và căn hành Những thành công trong nghiên cứu quá trình phát sinh phôi trên các ñối tượng này có ý nghĩa về mặt lý luận và thực tiễn, ñóng góp vào sự hiểu biết còn tương ñối hạn chế về hiện tượng phức tạp nhưng lý thú này ở thực vật

[48, 53]

1.5.2 Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tạo mô sẹo phôi hoá ở giống cây có múi

Khả năng phát sinh phôi in vitro phụ thuộc chặt chẽ vào giống, loài và

vật liệu khởi ñầu, song một yếu tố ảnh hưởng cũng hết sức quan trọng là ñiều kiện nuôi cấy, trong ñó CðHST ñóng vai trò chủ yếu Nhiều báo cáo ñã ñề cập ñến vai trò của auxin trong giai ñoạn khởi ñầu tạo callus và phôi Nồng ñộ auxin cao cần thiết cho sự cảm ứng hình thành phôi, song ñể phôi tiếp tục

phát triển thì auxin cần có nồng ñộ thấp hơn hoặc trong một số trường hợp, phải loại bỏ hoàn toàn auxin khỏi môi trường nuôi cấy [39] Nguyên nhân của hiện tượng này chủ yếu do auxin là một nhân tố sinh trưởng, kích thích sự giãn nở của vách tế bào, làm tế bào tăng trưởng về kích thước [45] Ngoài ra, auxin còn là một yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh phôi, ñóng vai trò quan trọng trong kênh thông tin tế bào, làm tế bào biến ñổi tới trạng thái cuối cùng ñã ñược chương trình hóa ñể tạo thành phôi soma [64]

1.5.2.1 Ảnh hưởng của giống ñối với tạo mô sẹo phôi hoá

Những mô sẹo phôi hoá mềm, xốp ở các giống ña phôi ñược tạo ra bằng nuôi cấy noãn Phụ thuộc vào kiểu gen, những noãn này có thể tạo ra mô sẹo phôi hoá, mềm xốp, mô sẹo xanh và cứng hoặc chỉ là phôi Những kết quả nghiên cứu isoenzyme và phân tích mô học cho thấy các mô sẹo phôi hoá mềm, xốp này có nguồn gốc từ mô phôi tâm (nucellar) [49]

Mô sẹo phôi hoá ñầu tiên ở cây có múi ñược tạo ra từ nuôi cấy noãn của giống cam ngọt ‘Shamouti’ [38], từ ñó ñã có rất nhiều phôi soma của các

giống ña phôi như C sinensis, C aurantium, C paradisi, C reticulata, C

có múi ñã thử nghiệm các giống cam ngọt cho phản ứng tạo mô sẹo phôi hoá cao nhất là giống Yoshima navel và Murcott có tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá tương ứng là 29,4% và 23,7% Giống chanh Eureka và cam chua chỉ tạo ñược

mô sẹo không phôi hoá có nguồn gốc từ vỏ Giống quýt Satsuma (C

non, tuy nhiên lại có phản ứng tạo mô sẹo phôi hoá khi nuôi cấy hạt lép ở quả

chín [40] Ở những loài họ hàng, cam ba lá (Poncirus trifoliata Raf.) và kumquat (Fortunella crassifolia Swingle) ñã tái sinh ñược cây của mô sẹo

phôi hoá [11]

Những nỗ lực tạo mô sẹo phôi hoá ở các giống có múi ñơn phôi vẫn chưa thành công, nguyên nhân có thể do ở các giống có múi ñơn phôi thiếu phôi tâm hoặc các tế bào mầm [36] Tuy nhiên mới ñây Ling (1997) ñã tạo ñược mô sẹo phôi hoá từ phôi hợp tử của giống có múi ñơn phôi Hơn thế nữa Vardi et al (1986) và Ling (1997) ñã thấy rằng mô sẹo phôi hoá của những

loài họ hàng dại ñơn phôi như Microcitrrus sp Citropsis gabunensis và

1.5.2.2 Ảnh hưởng của mẫu cấy ñối với tạo mô sẹo phôi hoá

Mẫu thích hợp nhất cho tạo mô sẹo phôi hoá là noãn ở quả non sau thụ phấn một vài tuần Mô sẹo phôi hoá có thể ñược tạo ra từ nuôi cấy lát cắt

nhuỵ cái (style) ở chanh tây (Limon) (Carimi et al., 1995), ñầu nhuỵ cái (stigma) và chân nhị cái (style) của nhiều giống citrus khác nhau như cam chua (C aurantium), Quýt (Citrus deliciosa), Chanh tây (C Limon), Quất Citron (C medical.), bưởi chùm - Grapefruit (C paradisi), cam Navel (C

kết quả tạo mô sẹo và tái sinh phôi tốt nhất Ngoài ra mô sẹo phôi hoá còn có thể ñược tạo ra từ phôi, trụ dưới lá mầm, bao phấn, nội nhũ, tép quả hay hạt lép của quả chín… Tuy nhiên, khi sử dụng những mẫu này tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá thấp và không ổn ñịnh [41] Mặc dù ngoài những mẫu trên ñã có rất nhiều loại mẫu khác nữa như chồi ñỉnh, chồi thân, trụ lá mầm, lá mầm và mô

rễ ñược sử dụng trong nuôi cấy mô cây có múi nhưng từ những mẫu này chỉ tái sinh ñược chồi hoặc cây [21, 20]

1.5.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñối với tạo mô sẹo phôi hoá

Nhìn chung các auxin tổng hợp như 2,4-D, picloram và dicamba thường ñược sử dụng ñể tạo mô sẹo phôi hoá ở nhiều loài thực vật bậc cao Tuy nhiên, ở loài có múi mô sẹo phôi hoá có thể ñược tạo ra khi sử dụng cytokinin và một số chất phụ gia khác rất quan trọng cho tạo mô sẹo phôi hoá

như là casein hydrolysate, malt extract Auxin dường như không có vai trò gì quan trọng trong tạo mô sẹo phôi hoá ở cây có múi [41] Kobayashi cho rằng auxin kích thích sự hình thành mô sẹo từ vỏ nhưng lại ức chế sự hình thành

mô sẹo phôi hoá từ mô phôi tâm ðặc biệt malt extract (ME) rất tốt cho sự phát sinh phôi khi nuôi cấy mô phôi tâm (nucellar) [12, 38, 55, 56] Nghiên cứu của Button và Borman (1971) về tác ñộng của ME ñã thấy rằng ME có tác dụng kích thích sự phát triển của cấu trúc giả bào tử (embryolike structures) từ tế bào ñơn mô sẹo của giống cam ngọt ‘Shamouti’ Sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo tăng trong môi trường có 500mg/l ME nhưng cũng ở nồng ñộ này lại gây ức chế cho sự phát triển và sinh trưởng của phôi

và cây [54] Những thí nghiệm sau này ñã chứng minh rằng ME thúc ñẩy sự phôi hoá của mô phôi tâm cả ở noãn trước và sau thụ phấn [55, 56, 12]

Mô sẹo phôi hoá có thể ñược tạo ra trên môi trường MT (Murashige và Tucker, 1969) có bổ sung malt extract (ME) 500mg/l [38, 62], hoặc trên môi trường MT có bổ sung cytokinin với hàm lượng cao [36] Báo cáo của Hidaka

và Omura (1989) cho biết môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có chứa 500mg/l ME và 50àM kinetin là hiệu quả nhất cho tạo mô sẹo từ phôi non, tác giả cũng cho rằng bổ sung NAA và GA3 vào môi trường nuôi cấy kết quả chỉ tạo ra những mô sẹo cứng và những mô sẹo này không tạo ñược phôi

* Nhân sinh khối nguồn mô sẹo phôi hoá thông qua hệ thống bioreactor nuôi cấy tự ñộng

Nhu cầu sản xuất nhanh nguồn mô sẹo phôi hoá phục vụ cho công tác nghiên cứu ứng dụng, ñòi hỏi các nhà sinh lý thực vật phải có những bước cải

tiến mạnh mẽ về quy trình vi nhân giống in vitro ñể ñạt ñược bb hệ số nhân

cao nhất Vì vậy, việc sử dụng những hệ thống nuôi cấy có thể ñiều khiển các thông số môi trường một cách dễ dàng như bioreactor là giải pháp hợp lý cho vấn ñề này [53] Bioreactor là bình nuôi cấy mô tế bào thực vật, có dung tích

từ vài lít ñến vài nghìn lít ñể tạo ra sinh khối thực vật lớn trong một thời gian ngắn ðây là những hệ thống nuôi cấy tự ñộng hoàn toàn, tiết kiệm chi phí lao ñộng và dễ dàng tăng quy mô nhân giống [10]

Tuy nhiên, vấn ñề quan trọng nhất hiện nay là việc thiết kế các bioreactor cho nuôi cấy mô tế bào thực vật phải ñảm bảo thông khí và giảm tối ña các tổn thương cơ học (khuấy, thông khí) ñối với mô tế bào ñó [42] Trong lĩnh vực này, các nhà nghiên cứu Hàn Quốc là những chuyên gia thiết

kế bioreactor cho nuôi cấy thực vật ðặc biệt nhóm tác giả Paek, Chakrabarty

và Hahn thuộc ðại học Quốc gia Chungbuk (Hàn Quốc) ñã có nhiều báo cáo

nổi bật về nhân giống thương mại Lilium trong bioreactor Những bioreactor

ñược thiết kế theo kiểu bình dạng bóng ñèn nhằm loại bỏ hiện tượng tạo bọt, phù hợp cho nuôi cấy liên tục hoặc nuôi cấy tạm thời (không liên tục) Nói chung, với những ưu ñiểm vượt trội, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào kết

hợp với bioreactor sẽ là công nghệ nhân nhanh in vitro ñầy hứa hẹn ở nhiều

loài thực vật [10, 51]

Sự phát sinh phôi soma (sinh dưỡng) cũng ñược áp dụng trong việc nhân nhanh cây trồng với số lượng lớn trong bioreactor tự ñộng Vi nhân giống truyền thống ñòi hỏi một lực lượng lao ñộng lớn sẽ hạn chế khả năng ứng dụng và tính thương mại Phôi soma dễ sử dụng do chúng có kích thước tương ñối nhỏ và ñồng ñều về kích cỡ, chúng không cần phải ñược cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh Thêm vào ñó, phôi soma có thể bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt ñộ thấp hay sấy khô, thuận tiện cho vận chuyển và sản xuất với số lượng lớn Sự sản xuất phôi soma trong bioreactor ñó ñược công bố trên nhiều loài ðối với việc nghiên cứu ứng kỹ thuật nuôi cấy trong bioreactor, vấn ñề cần thiết hướng ñến là cải thiện các ñiều kiện về môi trường hóa lý - như gia tăng sự trao ñổi không khí,

tăng cường ñộ ánh sáng và hàm lượng khí CO2 - ñể kỹ thuật này ñược áp dụng tốt hơn trong thực tế [34].

1.6 Tách và nuôi tế bào trần ở citrus

1.6.1 Lịch sử phát triển của phương pháp tách nuôi và tái sinh tế bào trần

Năm 1972, các nhà khoa học Nhật Bản báo cáo ñã tạo ñược mô sẹo phôi hoá từ mô phôi tâm ở giống cam ngọt 'Shamouti' bằng cách nuôi cấy noãn [38] Năm 1977, người ta ñã tách nuôi tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá của giống cam này và ñã tái sinh ñược cây cam ñầu tiên từ tế bào trần [62, 27] ðến nay, tái sinh cây từ tế bào trần ñã ñược thực hiện thành công ở rất

nhiều giống và loài Citrus

Năm 1985, các nhà khoa học Nhật Bản [50] lại thành công trong dung hợp tế bào trần của 2 loài cây ăn quả có múi khác nhau và ñã tái sinh ñược

cây lai từ tế bào dung hợp giữa giống cam ngọt Trovita và giống cam Ba Lá

a Tách tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá của giống cam ngọt Trovita

b Tách tế bào trần từ mô thịt lá của loài họ hàng là cam Ba Lá Poncirus

trifoliata

c Dung hợp 2 loại tế bào trần trên với nhau và tái sinh tế bào lai thành cây Phương pháp của Ohgawara và Cộng sự ñã trở thành phương pháp kinh ñiển trong lai tế bào trần hay còn gọi là lai tế bào sinh dưỡng hoặc lai tế bào

sôma) ở Citrus Trong ñó một trong 2 loại tế bào dùng ñể lai phải có nguồn

gốc từ mô sẹo phôi hoá, vì chỉ tế bào mô sẹo phôi hoá hoặc tế bào lai với nó

mới có khả năng tái sinh thành cây in vitro

Sau ñó cây lai tế bào trần ñã ñược tạo ra ở nhiều cặp lai khác loài trong chi Citrus như: Cây lai sôma khác loài ñược tạo ra giữa giống cam ngọt ăn tươi nổi tiếng Washington Navel) và giống quýt Hayashi thuộc nhóm quýt Ôn

Châu hay còn gọi là quýt Satsuma (C unshiu) Kết quả nghiên cứu này ñã mở

ra tiềm năng quan trọng ñối với cải thiện giống mà các phương pháp chọn tạo giống thông thường khó thực hiện ñược

1.6.2 Các phương pháp tách tế bào trần từ các nguồn mẫu khác nhau

Tế bào trần có thể ñược tách nuôi từ nhiều nguồn mô và tế bào khác nhau và cũng có khả năng tái sinh hoàn toàn khác nhau

1.6.2.1 Từ huyền phù tế bào (hay dịch lỏng tế bào = Suspension cells) phôi hoá

Nuôi cấy phôi hoá huyền phù khởi nguồn từ callus có nguồn gốc từ noãn, cung cấp một nguồn tế bào trần tối ưu sử dụng cho dung hợp Nuôi cấy như vậy có thể ñược duy trì trong môi trường không có chất ñiều hoà sinh trưởng [28] hoặc trong môi trường chứa BA cao [50]

1.6.2.2 Từ tế bào mô sẹo phôi hoá có nguồn gốc từ mô phôi tâm hoặc các

mô của hoa non

Tế bào trần có thể ñược tách ra dễ dàng từ callus xốp phôi hoá có nguồn gốc từ noãn nuôi cấy trên môi trường không có chất ñiều hoà sinh trưởng và từ callus ban ñầu xốp không phôi hóa có nguồn gốc từ cơ quan của hạt ñược nuôi trên môi trường có hàm lượng auxin cao

1.6.2.3 Từ tế bào mô thịt lá (Lớp tế bào Mesophyll cells nằm giữa lớp biểu

bì trên và lớp biểu bì dưới của phiến lá bánh tẻ)

Nguồn vật liệu lá tốt nhất cho thí nghiệm dung hợp là từ mẫu cây phát sinh từ hạt sinh trưởng trong ống nghiệm ðiều này loại bỏ sự cần thiết phải khử nhiễm trước khi tách Mẫu chuẩn bị tế bào trần từ lá rất dễ ñể dung hợp

và chúng cung cấp cả những thể tế vi từ bố mẹ không tái sinh mà dễ dàng hợp nhất thành những thể dị nhân sau dung hợp

1.6.2.4 Tách tế bào trần từ tế bào tứ tử (Tetrads)

Tứ tử ñược tạo ra trong quá trình phát triển của giao tử ñực phấn hoa khi bao phấn ñang còn non Mỗi tứ tử gồm 4 tiểu bào tử ñơn bội mới ñược tạo

ra từ một tế bào mẹ hạt phấn sau khi phân bào giảm nhiễm

Tế bào trần tiền hạt phấn ñơn bội có thể ñược tách từ bộ bốn tìm thấy

trong chồi hoa citrus Chồi hoa của bưởi chùm (P paradisi), và bưởi (C

suất của việc tách rất khác nhau phụ thuộc vào hiệu quả của việc lấy bao phấn

và làm mềm Quy trình này chuẩn bị ñược những mẫu tế bào trần ñơn bội sạch và dễ dung hợp hơn tế bào trần nhị bội

Tế bào trần từ các mô có nguồn gốc khác nhau có khả năng tái sinh rất khác nhau ðể tách ñược tế bào trần từ tế bào bắt buộc phải có sự tham gia của dung dịch các enzym (dùng ñể phân huỷ màng liên kết giữa các tế bào và màng bảo vệ của mỗi tế bào) và các chất tạo áp suất thẩm thấu, chất ñệm và chất ổn ñịnh cấu trúc của tế bào trần

1.6.3 Thành công trong nghiên cứu hệ thống tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus

Vardi và Cộng sự (1987) lần ñầu tiên ñã thành công trong việc hoàn thiện hệ thống tái sinh tế bào trần ñể tạo ra con lai tế bào chất ở cây có múi

Tế bào trần mang nguyên vẹn nhân tế bào và tế bào chất của một giống chanh (chanh 'Villafranca') dung hợp với tế bào trần ñã ñược giết nhân tế bào của

một giống lai khác (con lai của cam 'Poorman' x Poncirus trifoliata) Tế bào

lai sau ñó ñược tái sinh thành cây lai mang bộ gen nhân của giống chanh 'Villafranca' và tế bào chất lai (hỗn hợp tế bào chất của cả 2 giống bố mẹ) Phương pháp này cho phép chuyển lục lạp và ty thể từ một giống sang một giống khác Sử dụng kỹ thuật này người ta cũng ñã thành công trong việc

chuyển bộ gen lục lạp và ty thể của loài họ hàng Micro Citrus vào Citrus

Phương pháp này cung cấp cho ta các thông tin quan trọng về chức năng của các gen chứa trong tế bào chất, từ ñó giúp cho việc tạo giống mới mang ñặc tính di truyền tế bào chất ưu việt như khả năng kháng bệnh, tính trạng bất dục ñực tế bào chất, vv…[61,62]

Hiện nay ñã có nhiều những công bố khác nhau về hệ thống tái sinh ở nhiều giống citrus và những các loại cây có giá trị khác như cây cải dầu, thuốc

lá Những ñiều này ñã ñánh dấu những bước ngoặt lớn trong công tác chọn tạo giống trong tương lai

1.6.4 Những ứng dụng trong nghiên cứu hệ thông tái sinh tế bào trần từ

mô sẹo phôi hoá ở citrus

1.6.4.1 Cải thiện gốc ghép

* Tạo ra cây lai dị tứ bội từ những giống hiện có

Từ những nguồn tế bào trần chúng ta có thể phát triển và cải thiện cây gốc ghép của citrus Một con ñường là tạo ra thể lai dị tứ bội từ những giống hiện có mà có các tính trạng bổ sung Bởi vì lai soma là thêm vào mà không phân ly, các tính trạng ñược ñiều khiển bởi các gene trội hoặc ñồng trội ở một cây bố hoặc mẹ có nhiều khả năng ñược biểu hiện ở bất kỳ một thể lai soma

dị tứ bội nào Những tính trạng ở citrus ñược biết là ñược ñiều khiển bởi gene

trội bao gồm chịu lạnh, ña phôi, kháng ñược bệnh thối rễ (Phytophthora

(Hutchison 1985) Hơn thế nữa những gene lặn có hại ñược che giấu ở bố mẹ

sẽ vẫn ñược che giấu và không biểu hiện ở con lai Xem xét những cây lai liên

giống giữa hai loài tương hợp C sinensis 'Hamlin' (cam ngọt) và P trifoliata

'Flying Dragon' Có thể con lai này sẽ mang tất cả những tính trạng bổ sung của từng bố mẹ như kháng thối rễ, virus tristeza, tuyến trùng citrus của 'Flying Dragon' và chịu bệnh thối cây từ cam ngọt Không may vì chưa có sự hiểu

biết về sự ñiều khiển di truyền học và tính có thể di truyền ñược về khả năng giới hạn chịu bệnh thối cây hiện có trong nguồn gen Cây lai này có thể có khả năng làm giảm kích thước cây ñể trồng mật ñộ cao 'Flying Dragon' ñược

sử dụng như là cây gốc ghép lùn ở một số vùng trồng citrus, nhưng nhìn chung kích thước cây giảm quá nhiều Carrizo và Troyer (citranges) cây lai

nhị bội hữu tính giữa C sinensis và P trifoliata là cây gốc ghép ñược sử dụng

phổ biến trên thế giới (Castle 1987), nhưng chúng không mang những tính trạng của bố mẹ ñã ñược ñề cập, bởi vì có sự phân ly ở phân bào giảm phân ðiều này gợi ñến ý tưởng có thể kết hợp bổ sung các giống hiện có tạo con lai như là gốc ghép tiềm năng

* Tạo cây lai soma giữa những loài có kiểu gen không tương hợp ñể làm tăng nguồn gen

Con ñường thứ hai là sử dụng lai soma như là một phương tiện vượt qua những trở ngại của lai hữu tính ñể tái sinh cây cây lai soma dị tứ bội liên giống giữa citrus với những loài họ hàng hoang dại không tương hợp mở rộng nguồn gen và phát triển giống [28]

1.6.4.2 Cải thiện cây mắt ghép

* Tạo cây giống bố mẹ dị tứ bội sử dụng cho lai 4x:2x Từ những nghiên cứu

về cây chanh 'Persian' tam bội chứng tỏ cây citrus tam bội có thể là cây khoẻ mạnh, sai quả và gần như không hạt Tạo thế hệ con cái tam bội ở citrus nhìn chung thông qua lai cây tứ bội với cây nhị bội, ở ñây cây tứ bội ñược dùng như cây mẹ [57] Gần ñây Lee (1988) ñã ñưa ra tổng quan xuất sắc về ña bội thể ở citrus Hơn nữa gần ñây từ lai giữa cây citrus bố mẹ tứ bội và nhị bội ñã tạo ra ñược hai giống cây tam bội không hạt 'Oroblanco' và 'Melogold' ñược Soost và Cameron (1980; 1985) tạo ra từ lai giống bưởi ngọt với giống bưởi chùm tứ bội thuần Thể tứ bội thuần có thể xuất hiện tự phát trong quần thể

cây từ hạt hoặc từ những cây có nguồn goóc nuôi cấy mô của rất nhiều các giống ña phôi nhị bội Oiyama và Okudai (1986) ñã mô tả phương pháp tạo ra cây tứ bội thuần từ những giống nhị bội ñơn phôi 'Clementine', 'Hassuku' và 'Hyuganatsu' bằng sử dụng colchicine kết hợp với kỹ thuật vi ghép Tuy nhiên chỉ có rất ít cây giống tứ bội bố mẹ thích hợp là có sẵn

* Tạo cây tam bội trực tiếp qua con ñường dung hợp tế bào trần n + 2n

Tạo cây lai tam bội khác loài ở Nicotiana và cây lai trong loài ở

mắt ghép citrus một hướng ñi Những cây tam bội này ñược tạo ra từ dung hợp tế bào trần soma nhị bội với tế bào trần giao tử ñơn bội ñược tách từ giảm

phân bộ bốn ở chồi hoa Ứng dụng kỹ thuật này ở citrus có thể dẫn ñến việc

trực tiếp tạo giống không hạt mới Nhiều những giống ăn quả tươi phổ biến, ñặc biệt tangelos và mandarin, rất nhiều hạt, sự phát triển của những giống không hạt loại này với chất lượng quả tương tự có thể khuấy ñộng sự tăng trưởng của thị trường quả tươi Những cây lai như vậy có thể ñược ra bằng dung hợp tế bào trần nhị bội tách từ phôi hoá của những giống thành công với

tế bào trần giao tử tách từ chồi bộ bốn của các kiểu gen ñược lựa chọn có các tính trạng bổ sung Ví dụ dung hợp tế bào trần phôi hoá của 'Dancy' tangerin (một giống quýt phổ biến nhiều hạt, dễ bóc vỏ) với tế bào trần giao tử của giống bưởi chùm hoặc bưởi dẫn ñến phát triển cây tangelos tam bội không hạt Trái với dung hợp soma: soma giữa hai bố mẹ cùng loài, tất cả những cây tái sinh từ dung hợp n + 2n sẽ chỉ là duy nhất vì mỗi một tế bào trần ñơn bội

là một sản phẩm của phân ly Nếu thành công phương pháp này sẽ có một số

ưu ñiểm hơn các phương pháp tạo cây tam bội từ lai nhị bội và tứ bội trước Một trong những ưu ñiểm rõ ràng là giảm ñược thời gian tạo cây tam bội Ưu ñiểm thứ hai sử dụng bộ gen nhị bội nguyên vẹn, không trải qua phân ly và tái

tổ hợp nhưng nó bảo vệ sự biểu hiện của các gen lặn có hại ở thế hệ con cái

tam bội Những tính trạng quan trọng ñiều khiển bởi gene trội hoặc ñồng trội

ở bố mẹ nhị bội hoặc các gen lặn ở cả hai bố mẹ sẽ ñược biểu hiện ở cây tam bội tái sinh từ dung hợp n + 2n Kết quả sẽ là thế hệ con cái mang tỷ lệ tính trạng mong muốn cũng như không mong muốn cao hơn so với thế hệ con cái của lai hữu tính giữa nhị bội và tứ bội Số lượng sự kết hợp này bị hạn chế bởi các dòng callus phôi hoá sẵn có và cây của các giống mà cung cấp bộ bốn của các chồi có kích thước phong phú chịu ñược khử nhiễm

* Chuyển một phần bộ gen

Chuyển một phần bộ gen có thể xuất hiện tự phát hoặc sau khi chiếu tia thể cho Những cây lai soma khác loài tam bội nhận ñược từ dung hợp tế bào

trần phôi hoá của C sinensis 'Hamlin' (cam ngọt) với tế bào trần có nguồn gốc

từ callus từ hạt không phôi hoá của Severinia buxifolia (cam hoàng dương Chinese) Dòng callus của S buxifolia ñược bắt ñầu và nuôi giữ trên môi

trường có hàm lượng 2,4-D tương ñối cao (0.55mg/l) Tất cả các cây ñược tái sinh từ sự dung hợp với cây bố mẹ này là cây tam bội [30] Cả hai dòng bố

mẹ ñược cho là nhị bội tại thời ñiểm dung hợp Có thể giải thích sự tồn tại của

tế bào ñơn bội trong một dòng tế bào của bố hoặc mẹ, hoặc NST bị loại bỏ sau khi dung hợp Những phân tích isozym xa hơn có thể xác ñịnh ñược ñặc tính của những gene bị mất này ðiều này gợi ý có thể dùng 2,4-D ñể callus phát triển như là bố mẹ không toàn năng trong dung hợp ñể ñạt ñược chuyển

1 phần của bộ gen

* Chuyển cơ quan tử

Lai tế bào chất ñã ñược sử dụng ñể chuyển thông tin di truyền ñược mã hoá bởi cơ quan tử [62].Yếu tố hạn chế của phương pháp này là không biết những tính trạng làm vườn quan trọng nào ñược mã hoá trong bộ gen cơ quan

tử của citrus và loài họ hàng

1.7 Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá

1.7.1 Tạo phôi vô tính ở cây ăn quả có múi

Phôi vô tính ở cây có múi có thể phát sinh trực tiếp khi nuôi cấy phôi tâm trên môi trường có bổ sung malt extract mà không qua giai ñoạn phát sinh

mô sẹo [56] Ngoài ra phôi vô tính còn phát sinh gián tiếp từ mô sẹo Mô sẹo

có khả năng phát sinh phôi thường xốp và có chứa nhiều nước trong tế bào chất [43], những mô sẹo này chính là những mô sẹo phôi hoá

Nhân tố quan trọng nhất của quá trình tạo phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá là tác dụng của các nguồn carbon (ñường) [38] Theo báo cáo của Ben Hayyim và Neumann (1983) phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá có thể ñược tạo

ra khi thay ñường sucrose trong môi trường bằng một số loại ñường khác như galactose, lactose và glycerol Mô sẹo phôi hoá có khả năng tự sinh trưởng là

do sự cân bằng auxin: cytokinin [43] cho rằng khi nuôi cấy mô sẹo phôi hoá trên các môi trường có bổ sung các nguồn ñường trên thì những nguồn ñường này có khả năng ức chế tổng hợp auxin dẫn ñến sự thay ñổi cân bằng auxin ðiều này cũng cho thấy sự hình thành phôi thích hợp với ñiều kiện nồng ñộ auxin nội sinh thấp [37] Ảnh hưởng của những ñường này cũng ñược Kobayashi et al (1984), Hidaka và Omura (1989) và Kunitake et al (1991) báo cáo Hơn thế nữa, nghiên cứu của Hidaka và Omura (1989) cho thấy ñã tạo ñược phôi vô tính không chỉ trên môi trường có ñường galactose và lactose mà còn trên môi trường bổ sung ñường maltose và cellobiose từ ñường này tạo ra ñường glucose Tuy nhiên cơ chế sinh lý học của quá trình tạo ñường glucose ở mô sẹo phôi hoá của cây có múi vẫn chưa ñược hiểu rõ

Mô sẹo phôi hoá của các giống khác nhau có phản ứng khác nhau với các loại ñường khác nhau [62, 38]

Ảnh hưởng của CðHST lên quá trình tạo phôi vô tính ñã ñược nghiên cứu, Axít Gibberellic [37], cytokinin [38, 36] và auxin [38] ñược cho là ức