bước đầu nghiên cứu chuyển gen adp glucose pyrophosphorylase (agpase) vào giống sắn km 94 và cây thuốc lá k326

Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tạo ra giống sắn có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp giải quyết các vấn đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc

“xóa đói giảm nghèo” cho nông dân Sắn rất quan trọng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc sau lúa và ngô, chế biến lương thực, nhiên liệu sinh học và xuất khẩu [9]

Hiện nay, tinh bột chế biến từ sắn, thậm chí sắn lát phơi khô, trở thành mặt hàng mới trong xuất khẩu, đặc biệt sau khi hàng loạt các nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học trong và ngoài nước được thành lập Lần đầu tiên sau hàng chục năm,

Bộ Công Thương đã đưa sắn và các sản phẩm chế biến từ sắn vào danh mục các mặt hàng xuất khẩu chủ lực [1]

Tuy nhiên, cây sắn cũng có một số hạn chế như trồng sắn làm kiệt đất, củ sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô nhiễm môi trường Một trong những giải pháp phát triển sắn bền vững là áp dụng giống mới và kỹ thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi nhuận cao và duy trì độ phì nhiêu của đất mà không mở rộng diện tích trồng sắn Mặc dù cây sắn dễ nhân giống vô tính bằng cành giâm nhưng rất khó khăn trong nhân giống hữu tính Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tạo ra giống sắn có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp giải quyết các vấn đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học, hàm lượng tinh

2

bột được đánh giá cao hơn năng suất KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực

ở Việt Nam do năng suất và hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối tượng chuyển gen [16]

Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây

mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật nên là đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là dùng làm đối tượng chuyển gen Gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) qui định tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp tinh bột cây trồng

Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho khóa luận

tốt nghiệp là: “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) vào giống sắn KM 94 và cây thuốc lá K326”

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase ở cây thuốc lá K326

- Xác định khả năng sống sót của mẫu sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường

chọn lọc

3 Nội dung của đề tài

- Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm tái sinh cây: Nhân nhanh cây sắn KM 94 và cây thuốc lá K326

- Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A tumefaciens mang gen đích

- Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen ở cây thuốc lá K326

- Xác định khả năng sống sót của sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc

4 Đối tượng và thời gian nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Khả năng mang gen AGPase của cây thuốc lá K326 và cây sắn KM 94 chuyển gen

3

4.2 Thời gian nghiên cứu

- Tháng 09/ 2013: Sưu tầm, nghiên cứu tài liệu liên quan đến đề tài

- Tháng 10/2013: Xây dựng đề cương đề tài

- Tháng 11/2013 đến tháng 01/2014: Chuẩn bị nguyên liệu chuyển gen, thực hiện

quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen

- Tháng 02/2014 đến tháng 03/2014: Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen

- Tháng 04/2014 đến tháng 05/2014: Viết hoàn thiện đề tài và nghiệm thu

5 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu

5.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thực hành Thực vật-Di truyền-Phương pháp-Vi sinh, Khoa Sinh Hóa –

Trường Đại Học Tây Bắc

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Đánh giá sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) ở cây

thuốc lá K326 và khả năng sống của mẫu sắn KM 94 chuyển gen

4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây thuốc lá K326

Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana tabacum , thuộc ngành hạt kín

Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà, chi Nicotiana Trong chi Nicotiana có 50 - 70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ [6] Là loài bản địa của vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới châu Mỹ, nhưng hiện đã được trồng khắp thế

giới

Hình 1 Thuốc lá (Nicotinana tabacum)

Trên thế giới cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha

với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến

nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc chí Nam,

5

chủ yếu ở các tỉnh Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Gia Lai và Đăk Lăk (khu vực miền Tây nguyên), Đà Nẵng, Ninh Thuận (khu vực miền Trung) và Tây

Ninh (khu vực phía Nam) [13]

Là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế đối với người nông dân vừa được các nhà sinh học rất quan tâm trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật Có rất nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá đã thành công Cây thuốc lá có nhiều ưu điểm như:

Dễ tái sinh, thời gian sinh trưởng ngắn (60 -70 ngày ở vụ đông xuân, 50 - 60 ngày

ở vụ hè thu), hệ số nhân cao, dễ chăm sóc.

Đó cũng chính là lí do giải thích vì sao cây thuốc lá đã được các nhà khoa học sử dụng làm mô hình trong nhiều nghiên cứu biến nạp gen

là ở Braxin có 2 trung tâm và còn lại là ở Mêhicô và Bolivia Sắn được trồng cách đây khoảng 3000 – 7000 năm [8]

1.2.1.2 Phân loại

Sắn hay khoai mì có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz Thuộc ngành

Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, họ Euphorbiaceae, chi Manihot, loài

M.esculenta Sắn có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 36 là loại cây mang lại giá trị

kinh tế cũng như gái trị dinh dưỡng cao

Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống

sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-26,

KM 419, KM 325 Trong đề tài này chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94

Hình 2 Cây sắn KM 94

*Đặc điểm giống sắn KM 94

KM 94 có tên gốc là KU50 được nhập nội từ CIAT/Thái Lan trong bộ giống khảo nghiệm Liên Á năm 1990 KM 94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1 × Rayong 90 Thuộc nhóm sắn đắng, thân xanh, hơi cong ở phần gốc, không phân nhánh ở đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền núi Giống ít

bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ tươi: 33,0 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng

7

Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi toàn quốc Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với diện tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [8]

1.2.2 Giá trị cây sắn

Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt Sắn là nguồn lương thực đáng kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu cho công nghiệp Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục đích

Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn

và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu Phi Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con người Trong thập kỉ 20, có khoảng 450-500 triệu người ở 26 nước nhiệt đới sử dụng nguồn năng lượng tứ sắn tới 300 kcal/ngày.

Từ sau năm 1991, đặc biệt từ năm 1996 đến nay nhờ sự tiến bộ trong công tác nghiên cứu tuyển chọn giống sắn mới và khuyến nông sắn, với việc giới thiệu giống sắn mới KM 60, KM 94 vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề trồng sắn ở Việt Nam cùng với việc đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt động, đã đánh dấu sự chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng hàng hóa

Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn còn là nguồn thức ăn cho gia súc

8

Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi của các hộ gia đình Trong những năm gần đây, bên cạnh phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, việc nghiên cứu ủ chua sắn củ tươi phục vụ chăn nuôi lợn quy mô gia đình đã được chú ý và đã xây dựng thành quy trình kỹ thuật đang được nhiều hộ gia đình áp dụng vào chăn nuôi lợn ở khu vực miền Trung

Chế biến tinh bột từ củ sắn: Củ sắn là nguyên liệu chế biến tinh bột và tinh bột biến tính Trong đó Châu Á là lục địa chế biến và xuất khẩu đứng đầu thế giới

Sử dụng lá sắn: Lá sắn có chứa nhiều chất dinh dưỡng Lá sắn ngọt là một loại rau đối với Châu Phi, lá sắn được bó thành bó bán ở chợ như một loại rau Ở

Việt Nam, nhân dân ta dùng lá sắn non để luộc ăn hoặc muối chua [8]

1.2.3 Thực trạng phát triển sắn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35 tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng suất 4,88 tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51 tấn/ha, sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007) Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [8]

Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước Sắn

là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio- ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ

ẩm cho đất Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 –

9

1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc Đầu tư nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng lớn triển vọng [8]

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn đến năm 2020 Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô

và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi

và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính Diện tích sắn của Việt Nam

dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [8]

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nước

1.3.1 Trên thế giới

Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Colombia, và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế (IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và tạo các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô và cải thiện chất lượng sắn ở châu Lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân

và sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú [21] Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn theo cách này là cần thiết Sau một thời gian phát triển công nghệ trong

10

những năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng Mọi nỗ lực hướng vào tích hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại trong tương lai Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [21]

Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh giới loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết Ngoài ra, chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng tác nhân gây bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn Công nghệ chuyển gene ở sắn cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô Đây là mục tiêu cho chuyển gene, sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene hoàn chỉnh Ở sắn, không hệ thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô trưởng thành Tuy nhiên, nghiên cứu ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể được cảm ứng và cây được tạo ra từ mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường Murashige và Skoog (1962) bổ sung auxin Cây tái sinh theo cách này là dạng vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ nguyên tất cả các tính trạng của các tế bào mầm có được Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo ra từ các tế bào mầm [19] đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990 Sau một thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994 [20] Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác

nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện uidA và gen chỉ thị luciferine [18]

1.3.2 Tại Việt Nam

2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNA trong tạo giống cây trồng chuyển gen

kháng bệnh virus” Kĩ thuật chuyển gen vào thực vật đã được một số tác giả

nghiên cứu thành công, cụ thể như:

Năm 2008, Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi

Văn Lệ thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar-gen kháng thuốc

diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”

Năm 2008, Đỗ Tiến Phát và cộng sự tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá ảnh

hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông (Gossypium hirsutum L) thông qua Agrobacterium tumefaciens”

Năm 2007, Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn

Lệ của Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM đã tiến hành nghiên

cứu đề tài “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar-gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây

khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen” được đăng trên

tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 11, số 01, năm 2008.12 Tất cả các nghiên cứu trên đã tiến hành thành công và được công bố tuy nhiên chưa có công trình nào nghiên cứu thành công về việc chuyển gen AGPase vào giống sắn

1.4 Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen ở thực vật

1.4.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở

các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm (hình 3) Chỉ rất ít thực vật một lá

mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp Sự sinh

trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh

12

trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ xung auxin và cytokinine ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của

mô thực vật in vitro Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường

được biết chung là opine Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng

Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u Octopine và nopaline là hai loại

opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình

chóp Do đó nhiều dòng A tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine

hoặc nopaline [3]

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển

một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của quần thể vi khuẩn [3]

Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các

nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và

bờ trái của T-ADN và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của

T-ADN Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế

bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens đã được kiểm

tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô

được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi khuẩn A

tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử

dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [3]

13

Hình 3 Khối u trên thân cây gây ra do A tumefaciens

Chính plasmid đã mang gen gây khối u cho cây được gọi là plasmid Ti (Tumo inducing plasmid)

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Đó là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập Ở vi khuẩn plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập [3]

Hình 4 Ti-Plasmid

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong A tumefaciens ở

14

nhiệt độ dưới 300C Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA)

và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng

khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong A Tumefaciens [3]

Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-ADN ổn định trong genome nhân Lai Ti-plasmid với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song

song với T-ADN trong Ti-plasmid của A tumefaciens Kết quả này chứng tỏ

không có sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành Một hoặc nhiều bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp Chúng cũng

có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật Vị trí hợp nhất của T-ADN vào ADN thực vật là tương đồng hoặc không tương đồng [3]

1.4.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN

T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid,

vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái Left Border) Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho

(LB-việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho (LB-việc tiêu

hóa opine

Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB,

virD, virD2,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che

15

chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [3]

1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học

hydroxy-acetosyringon dẫn dụ vi khuẩn Dưới tác dụng của chất dẫn dụ, A.tumefaciens nhận

biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Quá trình

này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng chính các hợp chất

này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [6]

Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật

bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã Trong quá trình này một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS Gen virA

và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với

màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế

bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên

mã của gen virC [6]

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch

thẳng tương ứng với T-ADN Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính

endonuclease [3] Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân (hình 5)

16

Hình 5 Cơ chế biến nạp A.tumefaciens vào tế bào thực vật

1.5 Gen ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase)

ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) có kích thước 1500bp, là gen quy định việc tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp tinh bột trong cây Làm tăng tốc độ luân chuyển tinh bột ở cây chuyển gen

Sự biểu hiện của dạng đột biến G336D (glgC16) của APGase vi khuẩn ở củ khoai tây làm tăng 36% hoạt tính APGase và tăng tương ứng 35% hàm lượng tinh bột trong củ Sự tăng quá trình tạo thành tinh bột trong củ chỉ xảy ra khi gen glgC16 được biểu hiện ở trong củ (được điều khiển bởi promoter patatin) Ngược lại, sự biểu hiện của gen glgC16 trong tất cả các mô dẫn tới hiệu suất yếu đi, có thể

do kết quả của phân bố carbohydrate không phù hợp giữa mô đồng hoá và dị hoá Hoạt tính APGase cao hơn (200-400%) trong khoai tây chuyển gen biểu hiện gen glgC16 (dưới sự kiểm soát của promoter patatin), tuy nhiên chúng không làm tăng năng suất tinh bột Điều này là do tốc độ luân chuyển tinh bột cao hơn trong củ

17

chuyển gen Kết quả này cho thấy các mức độ trạng thái ổn định tinh bột trong củ chuyển gen có thể bị ảnh hưởng bởi nhu cầu nguồn – nơi chứa của các mô khác cũng như bởi tốc độ tiềm năng của quá trình tổng hợp ADP – glucose

Uzoma Ihemere và cs giả thiết rằng sự tạo ADP – glucose được tăng cường bởi APGase vi khuẩn với sự điều hoà allosteric đã được biến đổi có thể làm tăng quá trình tạo tinh bột trong củ sắn do khả năng tạo sucrose của cây sắn được tăng cường Nhóm nhà nghiên cứu này đã tạo ra cây chuyển gen biểu hiện gen glgC E.coli đã bị biến đổi (G336D) Các cây này có hoạt tính APGase gần như cao gấp đôi và sinh khối rễ và bộ phận trên mặt đất (thân, lá) lớn gấp 2 lần so với cây hoang dại Các nhà nghiên cứu này cho rằng sự tạo thành sinh khối phía trên mặt đất được tăng cường thể hiện sự giải phóng ức chế ngược ở quang hợp (sự tích luỹ chất khô), tương tự như khi biểu hiện gen glgC ở củ khoai tây và nội nhũ lúa mì và nội nhũ lúa [23]

Trong lục lạp xảy ra quá trình quang hợp tổng hợp chất hữu cơ Sản phẩm đầu tiên của quá trình quang hợp là một chất hữu cơ có 3 cacbon AlPG (Alđêhit phôtphogliêric – là một triôzơ-P) Trong chu trình Calvin kết thúc giai đoạn khử phân tử AlPG được tách ra khỏi chu trình, đó là chất khởi đầu tổng hợp nên C6H12O6 rồi từ đó tổng hợp nên tinh bột Glucose -1- phosphat chuyển thành ADP – glucose sử dụng một gốc phosphat từ phân tử ATP và có sự xúc tác của ADP glucose pyropgosphorylase ((hình 6)

18

Hình 6 Sơ đồ quá trình tổng hợp tinh bột có sự xúc tác

của enzyme AGPase

Đoạn thân non, mảnh lá chưa trưởng thành, mảnh lá mầm sắn KM 94

2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens thuộc chủng CV58 mang gen ADP glucose

+ Nguồn cacbon: Đường glucose

+ Các loại kháng sinh: Kanamycin, rifamycin, cefotaxim

+ Các chất điều hòa sinh trưởng và các VTM như: BAP, Picloram, VTM C, VTM mix

+ Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Agar

20

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

Bảng 1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog)

Môi trường

nuôi khuẩn

(YEB)

YEB lỏng

1g/l Yeast extract + 5g/l beef extract + 5g/l pepton + 5g/l NaCl + 5g/l sacarose

YEB đặc

1g/l Yeast extract + 5g/l beef extract + 5g/l pepton + 5g/l NaCl + 5g/l sacarose + 15g/l agar

Môi trường

đồng nuôi

Thuốc

lá MS đặc + BAP 1mg/l + AS 200mg/l, pH 5,8)

Chọn lọc sắn

MS + Picloram 12mg/ml+ Kanamycin 50mg/l + Cefotaxim 250mg/l, pH 5,8

Môi trường cảm ứng

Môi trường tạo mô sẹo

hay tái sinh

MS bột + Picloram 12mg/l + 1ml/l VTM C + 1ml/l VTM mix

MS đặc 20ml/l MS I + 10ml/l MS II + 10ml/l MS III

+10ml/l MS IV + 10ml/l MS V + 30g/l đường + 7,5g/l agar, pH 5,8

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

- Lựa chọn vật liệu chuyển gen: Lá chưa trưởng thành, đoạn thân non, lá mầm sắn

KM 94 và mảnh lá K326

- Cảm ứng vật liệu chuyển gen trước khi gây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens

trên môi trường MS bổ sung picloram nồng độ 12mg/l (đối với thuốc lá thì thay picloram bằng BAP nồng độ 1mg/l trong thời gian 2 ngày

- Gây nhiễm với vật liệu chuyển gen: Gây nhiễm mô vật liệu với vi khuẩn Agrobacterium ở mật độ OD = 0,8 Trong khoảng thời gian 30 phút