Chương 6 Kỹ Thuật hỗ trợ sinh sản TS. Đặng Đức Long

K Ĩ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ 6.2.1 Chu ẩn bị trứng • Cho tr ứng oocyte donation Kĩ thuật cho trứng được chỉ định áp dụng với những trường hợp suy buồng trứng sớm, sau đó, được sử dụng cho

Trang 1

thể sinh con bình thường gọi là kĩ thuật hỗ trợ sinh sản.

Hệ thống, hiệu quả và sự chuẩn độ của các quy trình kĩ thuật trong phòng thí nghiệm, kết hợp với các phác đồ trị liệu y học, nhằm hỗ trợ trong suốt cả giai đoạn của tiến trình sinh sản, để cuối cùng, tạo ra những cá thể mới (ở người và động vật có vú) được gọi là công nghệ hỗ trợ sinh sản hay công nghệ sinh sản được hỗ trợ (Assisted reproduction technology - ART).

Hỗ trợ sinh sản là một quy trình công nghệ, nhằm tạo ra cá

thể mới với nhiều kĩ thuật hỗ trợ phù hợp cho từng giai đoạn trong tiến trình sinh sản

Trang 2

CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ

HỖ TRỢ SINH SẢN

6.1 GI ỚI THIỆU

• Ứng dụng:

sử dụng như là một liệu pháp điều trị vô sinh, mà còn là

phương tiện hữu ích, nền tảng để tiến hành các nghiên cứu khác ở người và động vật (chuyển gen, chẩn đoán sớm, bảo tồn động vật, nhân bản, thu tê bào gốc ).

• Nội dung chính:

kĩ thuật thu nhận giao tử

kĩ thuật hỗ trợ thụ tinh

nuôi phôi

kĩ thuật chuyển phôi (cấy truyền)

một số các kĩ thuật liên quan khác

Trang 3

• Sơ lược lịch sử phát triển:

Từ thế kỉ 14, người Arập đã biết dùng miếng bùi nhùi kích thích ngựa đực đế lấy tinh trùng, sau đó, đưa tinh trùng thu được vào âm

đạo ngựa cái và con cái có chửa, đẻ Từ đó, khái niệm về phương

thức truyền giống gián tiếp hình thành

Năm 1763, Jacobi đã thực hiện các kĩ thuật thụ tinh nhân tạo cho chó và cá Năm 1780, Spallanzani, đã nghiên cứu tinh dịch, nhận thấy rằng khi đế’ tinh dịch ở nhiệt độ thấp, tinh trùng sống lâu hơn

và đã gieo tinh thành công cho 19 con chó cái, trong đó có tới 15 con thụ thai, có mang

Thụ tinh nhân tạo cho gia súc được nghiên cứu có hệ thống từ đầu thế kỉ 20 Năm 1907, Ivanov là người đầu tiên có công trong lĩnh vực này, ông phát triển thụ tinh nhân tạo ở nhiều loài ngựa, bò, dê, cừu, và quan trọng là hoàn chỉnh mô hình âm đạo giả

Trang 4

• Sơ lược lịch sử phát triển:

Năm 1959, con thỏ đầu tiên được ra đời từ phương pháp thụ tinh

không thể tiến hành cấy truyền Có 1 trường hợp báo cáo cấy thành

công, phôi có hiện tượng làm tổ, nhưng thai lại nằm ngoài tử cung

Ngày 25/7/1978, lần đầu tiên một em bé (Louise Brown) ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh Năm

1982, bé gái thứ hai (Amadine) ra đời bằng công nghệ này ở Pháp

Năm 2005, phác đồ mới trong kĩ thuật trữ trứng đã cải thiện đáng kế

tỉ lệ thụ tinh Nhiều em bé đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng đông lạnh

ra đời thành công tại Italia

Trang 5

6.2 K Ĩ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ

6.2.1 Chu ẩn bị trứng

• Cho tr ứng (oocyte donation)

Kĩ thuật cho trứng được chỉ định áp dụng với những trường hợp suy buồng trứng sớm, sau đó, được sử dụng cho nhiều trường hợp khác như bất thường trong NST của người mẹ, mãn kinh sinh lí, buồng

trứng kém đáp ứng với kích thích hay phụ nữ thất bại nhiều lần khi thụ tinh in vitro bằng trứng của chính họ

Người cho trứng, trước hết sẽ được kích thích buồng trứng bằng các hormone gây chín rụng nhiều trứng hoặc được chọc hút qua siêu âm đầu dò âm đạo số lượng trứng thu nhận nhờ kích thích, mỗi lần trung bình từ 5 - 10 trứng Việc cho trứng ở người đã được nhiều quốc gia cho phép, kèm theo các quy chế nghiêm ngặt, các thủ tục về pháp lí, đạo lí

Trang 6

Người cho trứng không nên quá 35 tuổi, có sức khỏe tốt, tâm sinh lí

và quan hệ xã hội bình thường và nhất thiết phải trải qua các kiểm tra

y học, nội tiết và sản khoa nghiêm ngặt Các xét nghiệm FSH, LH, E2 được theo dõi ít nhất qua hai tháng Ngoài ra các thử nghiệm

NST, xét nghiệm HbsAg, HIV, BW cũng phải được tiến hành Hơn nữa nếu người cho trứng đã từng có ít nhất là một con bình thường thì càng tốt

Trang 7

Việc thu nhận nguồn trứng trưởng thành ở người thường được tiến hành thông qua một phác đồ trị liệu (down regulation protocol) :

- người cho trứng được tiêm GnRHa (DecapepTil 0,1 mg) dưới da mỗi ngày trong vòng 14 ngày (kể từ ngày thứ 21 của chu kì kinh

nguyệt)

- Thử lại LH và E2, nếu LH > IU/L và E2 > 50 pg/ml thì bắt đầu kích thích buồng trứng với FSH/hMG Ngược lại, nếu các giá trị trên chưa đạt, phải tiếp tục tiêm GnRHa

-Tiêm phối hợp và song song giữa GnRHa (0,05 mg) với FSH

(Puregon 50 IU; 100 IU), liều lượng tuỳ theo tuổi và trạng thái sinh lí người cho trứng

Trang 8

- Theo dõi sự phát triển (kích thước và số lượng) của nang trứng bằng siêu âm 2-3 ngày một lần Đồng thời theo dõi hormone (LH, E2) từ ngày thứ 6 sau khi kích thích

- Khi xuất hiện ít nhất hai nang trứng lớn nhất đạt kích thước siêu âm

17 mm đường kính thì tiêm hCG (Pregnyl 5000IƯ) để kích thích sự trưởng thành của noãn

- Việc chọc hút trứng tiến hành 35 - 36 giờ sau khi tiêm hCG dưới sự hướng dẫn của đầu dò siêu âm Phải tiến hành gây tiền mê cho người bằng hypnovel và fentanyl kết hợp với gây tê cục bộ cạnh cổ tử cung bằng lidocain

Trang 9

Cho noãn tương (ooplasmic donation) : thay vì thu nhận tế bào

trứng, chỉ lấy dịch bào tương của chúng hay dịch túi mầm

Chuyển tế bào chất giữa các tế bào trứng người (gọi là cho noãn

tương) và chuyển túi mầm (chứa nhân) được tiến hành gần đây như là một phương thức nhằm cải thiện hiệu quả của hỗ trợ sinh sản

Trang 10

• Gây r ụng trứng nhiều (superovulation)

Gây rụng trứng nhiều ( gây siêu bài noãn) là phương pháp kích thích sự

chín và rụng trứng hàng loạt bằng các hormone nhằm thu được nhiều trứng chín một lúc

Có thể nhằm hai mục đích : thu nguồn trứng và cho thụ tinh tự nhiên để thu nhận nguồn phôi (trong ống dẫn trứng) sau đó

Nhóm hormone gonadotropin (Pregnant mare’s serum gonatropin

-PMSG) (huyết thanh ngựa chửa) có tác dụng gây chín trứng nhanh, giống như FSH Tương tự, hCG (human chorionic gonatropin) cũng tác động gây rụng trứng như LH (Luteinizing hormone)

Liều dùng của các hormone nói trên tuỳ thuộc vào từng loài, tuổi và

trọng lượng con vật; cũng như phụ thuộc vào loại thuốc, thời gian tiêm Ớ một số loài như chuột, hiệu quả kích thích rụng trứng còn phụ thuộc vào chu kì sáng tối

Trang 11

• Gây r ụng trứng nhiều (superovulation)

Hội chứng quá mẫn buồng trứng (Ovarian hyp er-stimulation Syndrome

- OHSS)

Tác động bất lợi nhất của việc kích thích buồng trứng bằng hormone là có thể xuất hiện hội chứng quá mẫn của buồng trứng và trường hợp chửa đa thai Về mặt lâm sàng, hội chứng này nếu nhẹ, hay trung bình không quan trọng, nhưng biểu hiện nặng có thể đe dọa tính mạng Hội chứng có một

số biếu hiện:

- Nhẹ : tăng hàm lượng estrogen, buồng trứng to lên chứa các nang nhỏ.-Trung bình : ngoài các biểu hiện trên còn xuất hiện tiêu chảy, nôn ói

- Nặng : kích thước nang lớn làm buồng trứng to, độ thấm quanh mao

mạch tăng làm thoát dịch gây tích nước cổ trướng trong ố bụng và tràn

dịch màng phổi, gây khó thở

Trang 12

Thu được tế bào trứng từ ống dẫn trứng, thường phải phẫu thuật để lộ ống dẫn trứng và sử dụng ống thông bơm dung dịch PBS gội rửa lòng ống vài lần, sau đó tìm trứng trong dịch rửa và tiến hành phân loại Phương pháp này thường sử dụng cho động vật thí nghiệm vì thu được trứng có tỉ

lệ chín cao Việc xác định thời điểm trứng chín, rụng khó khăn, do vậy, để chủ động thường phải gây trứng rụng nhiều bằng kích dục tố

Ở động vật sông, để khai thác trứng nhiều lần, nên lấy tế bào trực tiếp từ nang trứng thông qua việc kích thích nhiều nang trứng chín đồng loạt

Trang 13

Ở các phương pháp nêu trên, hầu hết trứng thu nhận được còn non,

chúng cần phải được nuôi chín, mặc dù các trứng nuôi chín in vitro thường

có hiệu quả thụ tinh không cao Ớ người, sau khi kích thích gây rụng có thể thu nhận trứng bằng một trong ba phương pháp (tuỳ trạng thái bệnh nhân, điều kiện bệnh vịện) : soi ổ bụng (laparoscopic), siêu âm cục bộ buồng

trứng ultrasound) và gội rửa nang trứng (follicular flushing)

Trang 15

• Quan sát và phân loại trứng

Kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại (x6 - xl2) dùng để kiểm tra dịch vàvới độ phóng đại cao hơn (x25 - x50) được sử dụng để quan sát tế bào

trứng Nếu trứng trưởng thành, lớp tế bào cumulus sẽ làm trứng trở nên

mờ, nhạt mầu; nếu trứng chưa trưởng thành chúng sẽ tối và cũng khó quan sát

Trứng thường được quan sát với chất lượng khác nhau thông qua sự hiện diện của lớp tế bào cumulus ( kinh nghiệm của người thao tác rất quan

trọng trong việc đánh giá chất lượng trứng thông qua cảm quan hiển vi)

Nếu có một phức hợp trứng/ cumulus (oocyte/ cumulus complex - OCC) được phát hiện trong kính hiển vi, thì việc đánh giá thường dựa vào thể tích, độ đậm đặc và sự hiện diện về số lượng, hình thái của toàn bộ khối OCC Nếu phát hiện trứng có một thể cực có thể cho rằng trứng đang ở giai đoạn metaphase II (MII)

Trang 16

có hai kĩ thuật (trực tiếp và gián tiếp) để đánh giá sự trưởng thành của trứng từ phức hợp OCC

Kĩ thuật đánh giá gián tiếp thường thông qua các trứng còn gắn khối

cumulus,; việc đánh giá này thiếu chính xác, tuy nhiên đơn giản

Cách thứ nhất được mô tả chi tiết bởi Weeck và cs, đó là việc làm dẹt phức hợp OCC bằng cách gây xung động mạnh đĩa nuôi dưới kinh hiển vi.Trứng được đánh giá dựa vào sự hiện diện của túi mầm hay thể cực thứ nhất Khi quan sát thấy túi mầm (vùng chứa nhân), trứng được cho là đang

ở giai đoạn túi mầm (GV) Nếu túi nhân không còn hiện diện trong trứng, trứng được cho là ở trạng thái vỡ túi mầm (GVBD) Khi thế cực thứ nhất hiện diện, trứng đã hoàn thành lần giảm phân đầu tiên và đang nghỉ ở

metaphase Trứng chắc chắn đang ở trạng thái MII

Trang 17

Kĩ thuật trực tiếp thứ hai liên quan đến việc phân tách khối cumulus

bằng enzyme Các phức hợp OCC phải được đặt vào trong đĩa bốn giếng

đã chứa sẵn môi trường thu trứng có bổ sung 0,4% BSA và hialuronidase

80 IU/ml tại 37°c trong 30 - 60 giây Dùng một pipette nhọn tách lớp

cumulus xung quanh trứng ra khỏi phức hợp OCC Rửa trứng vài lần bằng dung dịch thu trứng có bổ sung 10% huyết thanh Khi trứng đã tách khỏi các cumulus, tiêu chuẩn đánh giá cũng giống như khi trứng còn lớp

cumulus Kĩ thuật này thuận lợi là trứng được đánh giá cấn thận hơn và thường sử dụng trong ICSI

Trang 19

maturation - IVM) : nuôi trứng trưởng thành (chín).

Một trứng được coi là chín khi đã trưởng thành cả về nhân và tế bào

chất Trưởng thành nhân được hiểu là quá trình biến đổi nhân của trứng trong suốt kì giảm phân, tạo thể đơn bội từ bộ NST lưỡng bội Sự trưởng thành về tế bào chất được miêu tả là sự hoàn tất các cơ chế và các sản phẩm nội bào cần thiết cho quá trình thụ tinh, cũng như sự phát triển của phôi sau đó

Trang 20

đưa vào môi trường nuôi chín, trứng phải được rửa bằng môi trường thu nhận (đã được làm ấm 37°C) và lần cuối cùng rửa bằng môi trường nuôi chín Sau đó đưa trứng vào các giọt môi trường nuôi đã tạo sẵn trên đĩa Petri, mỗi giọt thường chứa từ 1-10 tế bào trứng

Môi trường nuôi chín trứng khác nhau giữa các loài, đồng thời khác

nhau về mục đích sử dụng và đôi khi tuỳ thuộc vào các phòng thí nghiệm Môi trường cho IVM được chia thành hai loại : đơn giản (simple medium)

và phức tạp (complex medium) Môi trường đơn giản là hệ thống đệm

bicarbonate chứa các muối như pyruvate, lactate và glucose

Trang 21

Sự khác biệt chủ yếu giữa các loại môi trường đơn giản với nhau là nồng

độ ion và nồng độ các chất cung cấp năng lượng trong môi trường Các môi trường thường được cung cấp huyết thanh hay albumin và một lượng thích hợp các kháng sinh (thường dùng là penicillin, streptomycin và

gentamicin) Các môi trường phức tạp thường chứa thêm một số yếu tố như amino acid, vitamin, purine và những chất khác

Môi trường IVM còn được bổ sung hormone (FSH, LH/ hCG, estradiol, prolactin ), nhằm tác động trực tiếp lên quá trình trưởng thành của trứng, cải thiện sự phát triển của phôi giai đoạn trước làm tổ Nhân tố tăng

trưởng cũng được bổ sung gồm IGF (vai trò giống insulin - like growth factor), EGF (nhân tố tăng trưởng biểu mô - epidermal growth factor) và TGF-L Chúng tác động lên sự phân bào, kích thích tổng hợp RNA và

protein Ví dụ: Nhiệt độ thích hợp cho IVM trứng bò và trâu là 38°C 39°C, nồng độ khí thích hợp là 5%C02 5%O2 và 90% N2

-

Trang 22

• Hay được sử dụng Âm đạo giả (Artificial vagina - AV) cấu tạo gồm vỏ ngoài cứng, ruột bằng cao su mềm, phễu hứng tinh, đai cao su (với heo cần phải có thêm song liên cầu dể tạo áp lực và các nhu động).

• Thời điểm tốt nhất để lấy tinh dịch thử là sau khi kiêng giao hợp hoặc xuất tinh từ 3 - 5 ngày (có thể từ 2 - 7 ngày) đê’ tránh sự giảm thế tích tinh dịch và số lượng tinh trùng Nếu kiêng giao hợp quá lâu (> 7 ngày),

có thể giảm độ di động, tăng số lượng tinh trùng chết và dị dạng trong mẫu tinh dịch, khả năng thụ tinh của tinh trùng cũng bị giảm

Trang 23

6.2.2 Chu ẩn bị tinh trùng

b/ Đánh giá tinh dịch và tinh trùng

• Đo thế' tích tinh dịch thu được bằng syringe hay các pipette chia vạch, sau

đó đánh giá mật độ và độ di động của tinh trùng trong mẫu tinh dịch Sử dụng phòng đếm hồng cầu (haemocytometer) đếm mẫu tinh trùng đã bị làm bất động, đánh giá mật độ tinh trùng, ước tính độ di động và bất

động, xác định các kiểu di động của tinh trùng Qua đó, chọn lựa phương pháp thích hợp đế’ chuẩn bị mẫu cho các kĩ thuật hỗ trợ

• Hệ thống thước Macleod có nhiều loại, đại thể từ 0 - 4 thẹo các vạch mức như sau : Vạch mức 0 : tinh trùng bất động; Vạch mức 1 : tinh trùng di động, không tiến tới; Vạch mức 2 : tinh trùng di động, tiến tới yếu; Vạch mức 3 : tinh trùng di động, tới vừa phải, nhẹ nhàng; Vạch mức 4 : tinh

trùng di động, tiến tới trước nhanh, hợp lí

• Hầu hết mẫu tinh bình thường đều có khả năng thụ tinh Không sử dụng các mẫu chứa lượng tinh trùng bất thường (hình dạng) cao bởi tiềm năng thụ tinh của chúng kém

Trang 24

6.2.2 Chu ẩn bị tinh trùng

b/ Đánh giá tinh dịch và tinh trùng

• Đếm số tinh trùng di động trong cả 20 ô vuông Nếu số tinh trùng hiện diện trên buồng đếm ban đầu ít hơn 10 triệu/ ml, nên đếm cả 100 ô vuông

• Độ di động được tính bằng số tinh trùng di động trong n ô đếm nhân với

100, sau đó chia cho tổng số tinh trùng đếm được trong n ô vuông đó.

• Những nghiên cứu về hình dạng tinh trùng người được thông qua kĩ thuật nhuộm màu và gắn chất phát huỳnh quang (vào NST), có thể được sử

dụng như một yếu tố phụ để xác định hình dạng sau khi quan sát Các tinh trùng có hình dạng xấu có thể do quá trình đóng gói NST còn lỏng, và

điều này sẽ làm thất bại sự khử xoắn (decondensation) trong quá trình thụ tinh

• Đối với những hư hỏng trên NST của tinh trùng, có thể sẽ được phát hiện bằng phương pháp nhuộm chromomycin (CMA3) và nhuộm Aniline blue (AAB)

Định dạng
Số trang	30
Dung lượng	502,06 KB