Phát hiện dioxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ

Theo Cơ quan thực phẩm Ireland, dioxin đã xâm nhập vào các thực phẩm nêu trên sau khi thức ăn chăn nuôi gia súc của một nhà sản xuất bị nhiễm dầu công nghiệp.. Mặc dù sự việc trên không

Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Bộ môn công nghệ sinh học

Lớp DH06SH

Bài báo cáo:

PHÁT HIỆN DIOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

GVHD: Nguyễn Thị Thanh Kiều Nhóm thực hiện:

Nhóm 5

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2009

PHỤ LỤC TRANG

LỜI MỞ ĐẦU 3

I Vài nét về dioxin 4

1 Dioxin là gì 4

2 Tác hại của dioxin 4

3 Cơ chế tác dụng của dioxin lên tế bào và cơ thể 5

4 Các bệnh có đầy đủ bằng chứng do dioxin 5

5 Các bệnh có bằng chứng hạn chế do dioxin 5

II Dioxin trong thực phẩm 6

1 Hàm lượng dioxin cho phép có trong thực phẩm 6

2 Nguyên nhân làm thực phẩm bị nhiễm dioxin 6

3 Các tai nạn liên quan đến dioxin 7

III Kĩ thuật sắc kí khí ghép khối phổ 9

1 Định nghĩa 9

2 Nguyên tắc 9

a Sắc kí khí 9

b Khối phổ 10

c Đọc kết quả 10

d Sắc kí khí ghép khối phổ 11

3 Các ứng dụng của kĩ thuật sắc kí khí ghép khối phổ 11

IV Phát hiện dioxin trong thực phẩm bằng kĩ thuật sắc kí khí ghép khối phổ 12

1 Vật liệu 12

2 Quy trình thực hiện 13

3 Đọc kết quả 16

4 Ưu nhược điểm của phương pháp 17

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 18

LỜI MỞ ĐẦU

Thực phẩm không an toàn chính là một trong những tác nhân hàng đầu làm tỉ lệ ung thư tăng cao trong những năm gần đây Chúng cũng có thể gây ra các bệnh về gan và thận, sự phát triển bất bình thường về trí não và thể trạng của trẻ em và nguy hiểm nhất là gây tử vong Thế nhưng, thực phẩm không an toàn vẫn có mặt ở khắp mọi nơi trên thế giới

Có rất nhiều nguyên nhân làm cho thực phẩm không an toàn như: formol, hàn the, các loại thuốc nhuộm công nghiệp, phân bón, thuốc trừ sâu, lưu huỳnh đioxit, … dùng trong chế biến thực phẩm Có thể nói, thực phẩm an toàn đang là vấn đề được mọi người quan tâm hiện nay

Dioxin là một trong những chất độc nhất được biết đến trong khoa học Nó có khả năng gây tàn phá môi trường ở diện rộng cũng như gây nguy hiểm trực tiếp cho con người Trong bản báo cáo

sơ thảo của Cục Bảo Vệ Môi Trường Hoa Kì (EPA) năm 1994 đã miêu tả dioxin như một tác nhân đe dọa nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng Cũng theo EPA, không có mức độ phơi nhiễm nào của dioxin được coi là an toàn Vì vậy, một lượng nhỏ dioxin nhiễm vào thực phẩm cũng có thể gây nguy hiểm cho người sử dụng

Sự việc đầu tháng 12/2008 tại châu Âu càng làm dioxin được quan tâm nhiều hơn Các siêu thị ở khắp Châu Âu đã phải ra lệnh thu hồi tất cả các sản phẩm thịt lợn muối hun khói, giămbông và xúc xích có nguồn gốc từ Ireland do chúng bị nhiễm dioxin Theo Cơ quan thực phẩm Ireland, dioxin

đã xâm nhập vào các thực phẩm nêu trên sau khi thức ăn chăn nuôi gia súc của một nhà sản xuất bị nhiễm dầu công nghiệp Chỉ có khoảng 10% lượng thịt lợn của nước này bị ảnh hưởng song chúng lại được chế biến và trộn với các loại thịt khác, dẫn đến tình trạng nhiễm dioxin tràn lan

Mặc dù sự việc trên không ảnh hưởng đến Việt Nam và nhiều nước khác do không nhập khẩu thịt lợn từ Ireland nhưng nó cũng đã gây sự lo ngại cho người tiêu dùng trong việc sử dụng nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm nhập khẩu từ nước ngoài Thêm vào đó, các thực phẩm khi bị nhiễm dioxin thường không có đặc điểm bên ngoài nào để nhận biết càng làm tăng sự e ngại của người sử dụng

Chính vì vậy, các quốc gia và người dân cần có sự quan tâm về loại hóa chất nguy hiểm này, đồng thời cần có cách phát hiện được dioxin trong thực phẩm một cách hiệu quả nhất để đảm bảo vấn

đề an toàn thực phẩm Cơ quan FDA, EPA của Mĩ và các cơ quan quản lý của Châu Âu đã yêu cầu sử dụng HRGC/HRMS (high-resolution gas chromatography and high-resolution mass spectrometry) là

kĩ thuật chuẩn cho kiểm tra dioxin

I Vài nét về dioxine

1 Dioxine là gì ?

Dioxin là tên gọi chung của một nhóm hàng trăm các hợp chất hóa học tồn tại bền vững trong môi trường cũng như trong cơ thể con người và các sinh vật khác Chúng là các hợp chất thơm polychlorin có đặc tính vật lý, hoá học và cấu trúc tương tự, được hình thành như một phụ phẩm của các quá trình hoá học, từ những hiện tượng tự nhiên như núi lửa phun, cháy rừng đến các quá trình nhân tạo như sản xuất hoá chất, thuốc trừ sâu, thép, sơn, giấy, quá trình thiêu và toả khói Tùy theo

số nguyên tử Cl và vị trí không gian của những nguyên tử này, dioxine có 75 đồng phân PCDD (poly-chloro-dibenzo-dioxines) và 135 đồng phân PCDF (poly-chloro-dibenzo-furanes) với độc tính khác nhau

Điôxin là hợp chất hữu cơ không mùi, không màu, chứa carbon, hyđrô, ôxy và chlorin.Trong số

210 hợp chất điôxin khác nhau, chỉ có 17 hợp chất là độc Dạng điôxin độc hại nhất và được nghiên cứu rộng nhất là điôxin 2,3,7,8 - tetra-chlorodibenzo-p-điôxin, viết tắt là 2,3,7,8-TCDD Điôxin không hoà tan trong nước nhưng hoà tan trong chất béo, chúng gắn với chất hữu cơ và chất cặn trong môi trường và hấp thụ vào mô mỡ động vật hoặc người Ngoài ra, do không bị vi khuẩn làm thối rữa nên chúng tồn lưu và tích tụ sinh học trong dây chuyền thực phẩm Một khi điôxin lọt vào môi trường, chúng sẽ thu gom trong mô mỡ của người và động vật

Dioxine còn bao gồm nhóm các PCB (poly-chloro-biphényles), là các chất tương tự dioxine, bao gồm 419 chất hóa học trong đó có 29 chất đặc biệt nguy hiểm PCBs (polychlorin biphenyl ) là một nhóm hoá chất, chúng là hyđrôcacbon thơm clo hoá, được tổng hợp bằng cách clo hoá trực tiếp biphenyl Các hỗn hợp PCBs kỹ thuật vẫn còn phổ biến và có mặt đến ngày nay như trong vật liệu xây dựng, dầu bôi trơn, sơn phủ, chất làm dẻo và mự Có một số hợp chất PCBs có độc tính tương tự điôxin và do đó thường gọi là PCBs "giống điôxin"

Dioxin là sản phẩm phụ của nhiều quá trình sản xuất chất hóa họccông nghiệp liên quan đến

clo như các hệ thống đốt chất thải, sản xuất hóa chất và thuốc trừ sâu và dây chuyền tẩy trắng trong

sản xuất giấy

2 Tác hại của dioxin:

Dioxin gây nguy hại trực tiếp cho môi trường, tàn phá môi trường sinh thái ở diện rộng Hậu quả do dioxin gây ra thường khó khắc phục và để lại hậu quả trong thời gian dài và qua nhiều thế hệ

Công thức hóa học của dioxine

Các báo cáo của EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư cho con người Năm 1997,

Tổ chức quốc tế về nghiên cứu ung thư (IARC) thuộc WHO đã công bố 2,3,7,8-TCDD là chất gây ung thư nhóm 1 (nghĩa là nhóm đã được công nhận là gây ung thư) Đồng thời, tháng 1 năm 2001, chương trình Độc học Quốc gia Hoa Kỳ đã chuyển dioxin vào nhóm "các chất gây ung thư cho người" Cuối cùng, trong một nghiên cứu kiểm định năm 2003, các nhà khoa học cũng khẳng định không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không gây ung thư Điều này có thể hiểu là nếu một người phơi nhiễm dioxin dù lượng nhỏ nhất thì đã mang trong mình hiểm họa ung thư

Trong một đánh giá về rủi ro và nghiên cứu các vấn đề chính sách được đưa ra trong Hội nghị Quốc tế về Dioxin tổ chức tại Berlin, 2004, nhóm tác giả đến từ Cục Môi trường Liên bang Đức

(Federal environmental agency) đã đưa ra kiến nghị không có mức phơi nhiễm dioxin tối thiểu nào

có độ an toàn cho phép

Ngoài ung thư, dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh dục cho cả nam và nữ,

sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ) v.v

Hatfield (Canada) và Uỷ ban 10 - 80 xác định 7 điểm nóng dioxin tại Việt Nam: Đà Nẵng, Biên Hòa, Phù Cát, Pleiku, Nha Trang, Cần Thơ,Tân Sơn Nhất (Hậu quả cuộc chiến tranh cảu Mỹ ở Việt Nam)

Ngoài chiến tranh Việt Nam, dioxin trong chất độc màu da cam gây nên thảm hoạ sinh thái ở Seveso (Ý), và Times Beach (Missouri), Love Canal (New York),

3.Cơ chế tác động của dioxine lên tế bào và cơ thể

Cơ chế phân tử của dioxin tác động lên các tế bào và cơ thể người, động vật vẫn đang còn nhiều tranh cãi về chi tiết Thời gian bán phân huỷ của dioxin trong cơ thể động vật là 7 năm hoặc có thể lâu hơn Thông thường, dioxin gây độc tế bào thông qua một thụ thể chuyên biệt cho các hydratcarbon thơm có tên là AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) Phức hợp dioxin - thụ thể sẽ kế hợp

với protein vận chuyển ArnT (AhR nuclear Translocator) để xâm nhập vào trong nhân tế bào Tại đây

dioxin sẽ gây đóng mở một số gene giải độc quan trọng của tế bào như Cyp1A, Cyp1B, Đồng thời, một số thí nghiệm trên chuột cho thấy dioxin làm tăng nồng độ các gốc ion tự do trong tế bào Điều này, có thể là làm phá huỷ các cấu trúc tế bào, các protein quan trọng và, quan trọng hơn cả, nó có thể gây đột biến trên phân tử DNA

4 Các bệnh có đầy đủ bằng chứng do Dioxin

Khu ô nhiễm dioxin trong sân bay Đà Nẵng (Ảnh Phạm Hồng Trường)

• Ung thư phần mềm ( Sarcoma ) : là những ung thư có nguồn gốc trong mô ( trừ ung thư xương, ung thư các tạng, ung thư võng nội mô ) và ung thư các tổ chức thần kinh ngoại vi Có hơn 20 loại ung thư phần mềm

• U Lympho không Hodgkin

• U Lympho Hodgkin

• Bệnh xạm da

5 Các bệnh có bằng chứng hạn chế do Dioxin

• Ung thư phế quản phổi

• Ung thư khí quản

• Ung thư thanh quản

• Ung thư tiền liệt tuyến

• Đau tủy ( bệnh Kahler)

• Bệnh thần kinh ngoại vi cáp và bán cấp tính

• Tật gai đôi

• Bệnh nhiễm Porphyrin da chậm

II Dioxine trong thực phẩm

Thông thường khoảng 90% dioxin trong cơ thể là do tiêu thụ thực phẩm ô nhiễm, khoảng 10% là

do hít thở và ngấm qua da Theo ThS Nguyễn Đức Minh, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, các thực phẩm như thịt ngan, vịt, gà, cá quả có nguy cơ nhiễm dioxin cao, nhưng các đặc điểm cảm quan hoàn toàn bình thường, không nhận biết được bằng giác quan nên sẽ là nguồn xâm nhập dioxin vô cùng nguy hiểm cho người tiêu dùng Để đảm bảo an toàn, cách tốt nhất là người tiêu dùng chỉ tiêu thụ những thực phẩm có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng

Với các thực phẩm không rõ về nguồn gốc sản xuất, người sử dụng có thể giảm nguy cơ nhiễm dioxin bằng cách loại bỏ, không ăn các phần mỡ của thực phẩm Với sản phẩm rau, quả, củ (trừ cà rốt

và bí đỏ) rửa sạch là biện pháp an toàn để loại bỏ dioxin bám dính

1 Hàm lượng cho phép của dioxine trong thưc phẩm

Theo WHO 2002 thì mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ)/ngày

2 Nguyên nhân làm thực phẩm bị nhiễm dioxine

Thịt gà – một loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm dioxine cao

Hiện tại, chúng ta hiện đang sống trong một môi trường bị vây phủ bởi những nguồn có khả năng tạo ra ô nhiễm dioxins mà không thể nào tránh né được Những cột điện trước nhà với các vật cách điện màu nâu: đó chính là PCBs, cũng là một “người bạn” của dioxin Nơi nhà sau, sau khi bạn thiêu hủy những rác rến sau mỗi buổi party gia đình, vô tình bạn đã góp phần vào việc “tăng cường”

ô nhiễm dioxins trong không khí (vấn nạn nầy chiếm 19% tổng lượng ô nhiễm dioxins ở Hoa kỳ) Những hóa chất chứa chlor chúng ta xử dụng trong gia đình hàng ngày đều có nguy cơ tạo ra dioxins trong không khí như thuốc tẩy rửa sodium hypochlorite (bleach) Các sản phẩm plastic, tơ sợi tổng hợp đều là mầm móng của dioxin khi bị thiêu đốt

Các núi lửa đang hoạt động cũng là một nguồn ô nhiễm dioxins trong không khí cũng giống như nạn cháy rừng

Các nguồn ô nhiễm khác: những nhà máy sản xuất chất khai quang 2,4,5-T, những công trường nông nghiệp lớn xử dụng thuốc diệt cỏ dại như ở Kazakhstan (Nga Sô), những vùng đang sử dụng một cách bừa bãi, thiếu kiến thức khoa học những loại phân bón “lạ”, những thuốc trừ sâu rầy được nhập cảng lậu, không tên, không chỉ dẫn cách dùng, và chỉ biết qua kinh nghiệm như thuốc màu nâu, xanh, màu sữa

 Dioxine ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người hoặc gián tiếp thông qua thực phẩm

3 Các tai nạn liên quan đến dioxine

• Tai nạn tại Times Beach (Missouri-Hoa kỳ) do một công ty hóa chất bán chất phế thải có chứa TCDD, sau đó một công ty có dịch vụ làm giảm thiểu bụi đường đã sử dụng số dầu trên cho dịch vụ phun xịt để ngăn chặn bụi đường ở thành phố trên trong một thời gian ngắn Kết quả là chính quyền địa phương phải di chuyển 1.400 cư dân sống trong vùng xảy ra tai nạn và phải thiêu hủy hàng trăm ngàn tấn xà bần bị ô nhiễm

• Tai nạn do việc trộn lẫn 9 Kg dầu có chứa PCBs của một công ty sản xuất thức ăn gia súc tại

Bỉ Điều này đã làm tăng lượng dioxine trong trứng gà, thịt gà, heo và bò và đã làm chấn động thị trường Âu châu một thời gian

• Trong quy trình sản xuất thức ăn gia súc, Pháp và Hà Lan đã dùng bùn khô (sludge), một phế phẩm kỹ nghệ để làm chất đệm, và làm tăng vitamins cùng chất sợi (fiber) Kết quả là các mô mỡ của heo, gà được nuôi ỡ những nơi này có chứa lượng dioxine cao (Hiện tại, Pháp vẫn còn áp dụng phương pháp này mặc dù Cộng đồng Âu châu đã nghiêm cấm từ năm 1991)

• Tại Seveso (Ý) trong một vụ nổ ở một nhà máy hóa chất, và sau đó một lượng dioxin ước tính

độ 30 Kg đã làm ô nhiễm một vùng rộng 6 Km2

• Tháng 3/2008, TP Napoli (thủ phủ vùng Campania), cơ quan chức năng của Ý đã phát hiện sữa trâu dùng làm nguyên liệu sản xuất pho mát mozzarella có chứa hàm lượng dioxin cao hơn mức cho phép  Uỷ ban châu Âu đã đưa ra các yêu cầu sau đây đối với Ý: Rút ngay các sản phẩm pho mát mozzarella nhiễm dioxin cao ra khỏi thị trường

• Tháng 12/2008, thịt heo Ireland bị phát hiện nhiễm dioxin Trước đó, loại thịt này đã được xuất đi 25 nước, chủ yếu là Anh, Nhật Bản, Đức, Nga, Pháp và Mỹ Sự việc đã gây chấn động châu

Âu và e ngại trong người tiêu dùng ở các sản phẩm: thịt lợn, dămbông, xúc xích, dồi, đùi lợn muối hoặc hun khói, bánh pudding trắng và đen, pizza

Người tiêu dùng Anh được khuyến cáo không sử dụng thịt lợn có nguồn gốc từ Ireland cho tới khi có

kết luận chính thức Ảnh: Irish Times.

Thịt lợn nhiễm chất độc có thể từ thức ăn chăn nuôi (Ảnh atangledweb)

III Kĩ thuật sắc kí khí ghép khối phổ

1 Định nghĩa

Sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc kí hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc kí khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kĩ thuật này (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hoá chất Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…

2 Nguyên tắc hoạt động

a Sắc ký khí (GC_Gas Chromatography)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động Trong

GC pha động là một khí trơ gống như helium Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách

có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động

Sơ đồ sắc kí khí ghép khối phổ

Sắc đồ của sắc ký khí

b Khối phổ:

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi

đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ;

Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là iôn, điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua được bộ lọc Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh

vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỉ lệ vật mang khối (M/Z);

Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, M/Z thường miêu tả các phân tử nặng của mảnh vụn

Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực (quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên

qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ

c Phân tích kết quả

Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector Đây là đồ thị của số khối Mỗi hóa chất chỉ tạo ra một mô hình duy nhất, nói cách khác mỗi chất có một “dấu vân tay” để nhận dạng, dựa trên mô hình ion của nó

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu