Khảo sát tình hình mang vi khuẩn non typhi salmonella không triệu chứng tại thành phố hồ chí minh

Phần lớn các týp huyết thanh của Salmonella thuộc S.enterica phân loài enterica phân loài I, là nguyên nhân gây hơn 99.9% các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.Các týp huyết thanh thư

LÊ THỊ PHƯƠNG TÚ

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH MANG VI KHUẨN

NON-TYPHI SALMONELLA KHÔNG TRIỆU CHỨNG

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: DI TRUYỀN

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS STEPHEN BAKER

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

trực tiếp hướng dẫn đề tài cũng như đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoànthành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Minh, Viện, Ánh, Nga đã dành thời gian đọc

và góp ý, chỉnh sửa cho luận văn Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến CorinneThompson và chị My đã hỗ trợ tôi trong phần phân tích kết quả Xin cảm ơn các anhchị trong phòng thí nghiệm vi sinh của đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford

đã tận tình chỉ dạy tôi những thao tác vi sinh cơ bản và giúp đỡ tôi trong thời gianlàm đề tài

Xin cảm ơn các anh chị bạn đồng nghiệp ở OUCRU, đặc biệt là Nhã Thư vàchị Thảo đã luôn ở bên cạnh chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như đã giúp đỡ tôirất nhiều trong quá trình làm đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giảng dạy tại khoaSinh Học trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh đã truyềnđạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian đại học cũng như cao học

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thành viên tronggia đình tôi đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần cũng như đốc thúc tôi hoàn thành đề tàinày

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Danh pháp và phân loại Salmonella enterica 3

1.2 Đặc điểm cấu trúc, sinh lý sinh hóa và di truyền của Salmonella enterica 4

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc 4

1.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 7

1.2.3 Đặc điểm di truyền 7

1.3 Bệnh học nhiễm trùng do NTS 8

1.3.1 Triệu chứng lâm sàng 9

1.3.2 Sự phát sinh bệnh 9

1.3.3 Chẩn đoán 10

1.3.4 Điều trị 11

1.3.5 Phòng ngừa 12

1.4 Tình hình nhiễm NTS trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.4.1 Tình hình nhiễm NTS trên thế giới 13

1.4.2 Tình hình nhiễm NTS ở Việt Nam 17

1.5 Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella enterica 17

1.5.1 Phage typing 17

1.5.2 Plasmid typing 18

1.5.3 Ribotyping 18

1.5.4 PFGE 18

1.5.5 MLEE 19

1.5.6 MLST 19

1.6 Tình trạng mang vi khuẩn không triệu chứng ở S Typhi và NTS 22

1.6.1 Tình trạng mang trùng không triệu chứng của Typhi và Paratyphi A 23

1.6.2 Tình trạng mang trùng NTS 23

1.7 Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS 24

1.7.1 Các yếu tố nguy cơ từ môi trường 24

1.7.2 Các yếu tố nguy cơ từ bản thân vật chủ 25

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Qui trình thực nghiệm 29

2.3 Hóa chất- thiết bị- phương pháp tiến hành 29

2.3.1 Phân lập và định danh Salmonella spp bằng API 20E 29

2.3.2 Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể 32

2.3.3 Xác định kháng sinh đồ 33

2.3.4 Xác định sự đa dạng di truyền bằng phương pháp MLST 35

2.3.4.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 35

2.3.3.2 PCR 7 gen giữ nhà (house keeping genes) 37

2.3.3.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 38

2.3.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 40

2.3.3.5 Giải trình tự các gen giữ nhà 42

2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự 44

2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST 45

2.3.5 Xác định các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella 46 2.3.5.1 Bảng câu hỏi khảo sát 46

2.3.5.2 Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata 47

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 3.1 Tỉ lệ nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh 49

3.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Salmonella spp phân lập từ nhóm người bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng 49

3.3 Kết quả phân loại di truyền bằng phương pháp MLST .51

3.3.1 Kết quả khuếch đại các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà 51

3.3.2 Kết quả kiểu di truyền và týp huyết thanh của những mẫu phân lập từ nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 52

3.3.3 Đặc điểm các gen giữ nhà .55

3.3.4 Kết quả cây phát sinh loài 56

3.3.5 Mối quan hệ giữa các mẫu NTS phân lập được từ nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 58

3.4 Phân tích đặc điểm lâm sàng – yếu tố nguy cơ: 61

3.4.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS trên trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh 61

3.4.2 Phác đồ điều trị 63

3.4.3 Sự phân bố các ca nhiễm NTS trong năm 63

3.4.4 Đặc điểm kinh tế xã hội cơ bản 64

3.4.5 Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS 65

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 69

4.2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 81

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

MLEE Multilocus enzyme electrophoresis

SPI Salmonella Pathogenicity Islands

S.Typhimurium Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium

SXT Trimethoprim – sulfamethoxazole

T3SS type three secretion system

Tế bào M Microfold cell

XLD Xylose-Lysine-Deoxychocolate agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn về tính kháng đối với một số kháng sinh

của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae 34

Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng cho phản ứng PCR 37

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 38

Bảng 2.4 Chương trình phản ứng khuếch đại 38

Bảng 2.5 Trình tự mồi cho phản ứng giải trình tự 42

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự 43

Bảng 2.7 Chương trình phản ứng giải trình tự 44

Bảng 3.1 Kiểu di truyền của 174 chủng Salmonella spp 52

Bảng 3.2 Sự phân bố các týp huyết thanh trong nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 53

Bảng 3.3 Nhóm huyết thanh và týp huyết thanh nổi trội ở nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 55

Bảng 3.4 Đặc điểm các gen giữ nhà 56

Bảng 3.5 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS 62

Bảng 3.6 Phác đồ điều trị cho các ca nhiễm NTS 63

Bảng 3.7 Đặc điểm cơ bản của nhóm bệnh và nhóm chứng 65

Bảng 3.8 Các yếu tố nguy cơ từ môi trường 66

Bảng 3.9 Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ chính trong nhiễm NTS 67

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu 29 Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ kháng kháng sinh của 174 chủng NTS 50 Biểu đồ 3.2 Mối liên hệ giữa số ca nhiễm và nhiệt độ trung bình theo tháng 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hệ thống phân loại của giống Salmonella 4

Hình 1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Salmonella spp và vách tế bào 5

Hình 1.3 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở người phân lập từ các châu lục khác nhau 15

Hình 1.4 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở các nguồn không từ người phân lập ở các châu lục khác nhau 15

Hình 1.5 Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica 22

Hình 2.1 Kết quả que thử API 20E cho Salmonella spp 30

Hình 2.2 Thang 100bp của Invitrogen 39

Hình 3.1 Kết quả điện di của 7 phân đoạn gen của 7 gen giữ nhà 51

Hình 3.2 Cây phát sinh loài của 174 chủng Salmonella spp 57

Hình 3.3 Cây Minimum spanning tree được vẽ từ dữ liệu MLST của 174 mẫu Salmonella spp 59

LỜI MỞ ĐẦU

Với 1.8 triệu ca tử vong mỗi năm do tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi, chiếm 19%

số ca tử vong trên trẻ em, bệnh tiêu chảy cấp vẫn là nguyên nhân gây bệnh hàng đầu ở

các nước đang phát triển Trong đó thì Salmonella là một trong những tác nhân vi

khuẩn chính gây bệnh với tổn thất kinh tế được tính bằng số ngày nằm viện và chi phí

chữa trị Bệnh cảnh phổ biến do Salmonella spp gây ra là tiêu chảy, tuy nhiên bệnh

cũng có thể gây biến chứng nặng trên người có hệ miễn dịch yếu như trẻ em, người lớn

tuổi, người nhiễm HIV… Non-typhi Salmonella (NTS) có phổ vật chủ khá rộng bao

gồm người, động vật, bò sát… cũng như có thể tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài Conđường lan truyền phổ biến nhất là thông qua việc ăn uống các thực phẩm nhiễm khuẩn

Ở Việt Nam hiện nay có rất ít các nghiên cứu về NTS, đa số các nghiên cứu đều

dừng lại ở việc xác định mức độ phổ biến của Salmonella spp phân lập được trên thực

phẩm tươi sống như gia cầm, lợn, bò, tôm, cá, hải sản… ở Hà Nội, Huế và Đồng BằngSông Cửu Long Chỉ có một số rất ít các nghiên cứu về tác nhân NTS gây bệnh trênngười ở Hà Nội với tỉ lệ NTS phân lập được vào khoảng 7% tổng số ca bệnh tiêu chảytrên trẻ em dưới 5 tuổi Riêng ở miền Nam, hầu như không có nghiên cứu nào về NTStrên người

Tình hình mang trùng không triệu chứng được mô tả đầu tiên ở S Typhi và

người mang trùng có thể truyền bệnh cho người khác trong cộng đồng Cơ chế mang

trùng của S Typhi hiện đang được nghiên cứu với các yếu tố nguy cơ bao gồm bị sỏi

mật, nhiễm sán máng… Riêng đối với NTS hiện chưa có nghiên cứu nào về tình hìnhmang trùng không triệu chứng cũng như cơ chế mang trùng Giả thuyết của chúng tôi làtrẻ em mang trùng không triệu chứng cũng góp phần quan trọng trong việc lan truyềnbệnh Ngoài ra chúng tôi cũng mong muốn tìm hiểu các yếu tố nguy cơ trong nhiễmtrùng dạ dày ruột do NTS Việc xác định các yếu tố nguy cơ chính sẽ được ứng dụngtrong việc ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng do NTS trong tương lai

- Phân tích một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS.

- Xác định các yếu tố nguy cơ chính trong bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTSbằng cách phân tích thống kê các dữ liệu dịch tễ thu thập được trên nhóm bệnh

và nhóm chứng

TỔNG QUAN

1.1 Danh pháp và phân loại Salmonella enterica

Salmonella là giống vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm nhiều vi khuẩn gây hại trên người và động vật Giống vi khuẩn Salmonella được chia thành 2 loài là enterica và bongori[10] Salmonella enterica được chia thành

6 phân loài enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica, với hơn 2500 týp huyết thanh khác nhau (hình 1.1) Việc phân loài Salmonella được dựa trên đặc

tính sinh hóa, độ tương đồng về trình tự nucleotide và gần đây được hỗ trợ bởi dữ liệugiải trình tự Týp huyết thanh được xác định bởi kháng nguyên O (kháng nguyên vỏ) vàkháng nguyên H (kháng nguyên lông roi) với công thức kháng nguyên được viết là:kháng nguyên O; kháng nguyên H (pha 1, pha 2)[41]

Phần lớn các týp huyết thanh của Salmonella thuộc S.enterica phân loài enterica

(phân loài I), là nguyên nhân gây hơn 99.9% các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.Các týp huyết thanh thường đươc đặt tên theo nơi chúng được phân lập lần đầu, khôngviết in nghiêng và chữ cái đầu được viết hoa

Ví dụ: Tên đầy đủ của týp huyết thanh Typhi là S.enterica phân loài enterica týp huyết thanh Typhi, thường được gọi tắt là S enterica týp huyết thanh Typhi, S Typhi

hoặc đơn giản hơn chỉ gọi bằng Typhi

Trong phạm vi bài này, thuật ngữ Non-typhi Salmonella (NTS) dùng để chỉ tất

cả những týp huyết thanh Salmonella gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột và nhiễm trùng

xâm lấn trên người hoặc động vật, ngoại trừ S Typhi và S Paratyphi A.

Hình 1.1: Hệ thống phân loại của giống Salmonella[60] Việc phân loài Salmonella

được dựa trên biotyping, lai DNA-DNA, phân tích 16S RNA và MLEE Serotypingđược sử dụng để phân biệt các týp huyết thanh ở mức dưới phân loài Số lượng týphuyết thanh là chữ số trong ngoặc đơn dưới mỗi phân loài

1.2 Đặc điểm cấu trúc, sinh lý sinh hóa và di truyền của Salmonella enterica

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc

Salmonella, cũng như các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae khác, là các

vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy ý, hình que, oxidase âm, không tạo bào tử và có khả năng

di động Salmonella có kích thước chiều rộng từ 0.7-1.5µM và chiều dài khoảng

2-5µM[32]

Vỏ bao tế bào có cấu trúc gồm màng trong, thành tế bào và màng ngoài (hình

1.2) Vỏ bao giữ vai trò quan trọng trong chiến lược thích ứng của Salmonella vì các

thành phần cấu trúc của vỏ bao có nhiệm vụ thu nhận chất dinh dưỡng, loại bỏ chất độc

và giúp vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào vật chủ Màng trong là lớp đôiphospholipid khá giống với các màng sinh học khác Màng trong được bao bởi thành tếbào là lớp peptidoglycan giúp gia tăng sự chắc chắn và định hình tế bào Màng ngoàinằm bên ngoài lớp peptidoglycan và hai lớp này liên kết với nhau bằng các lipoproteinmàng ngoài và porin Mặt trong của màng ngoài tương tự như màng tế bào, cũng đượccấu tạo từ phospholipid Mặt ngoài của màng ngoài bao gồm lipopolysacharride (LPS).Các cấu trúc khác của màng ngoài là lông roi và khuẩn mao Lông roi là cơ quan diđộng của vi khuẩn bao gồm thể nền, móc và flagellin hình thành sợi xoắn ốc Hầu hết

Salmonella được bao phủ bởi lớp khuẩn mao giúp cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế

bào chủ Những sợi lông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn sovới các sợi roi, cấu thành từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin

Hình 1.2: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Salmonella spp.và vách tế bào

Lipopolysaccharide bề mặt (LPS) hay còn gọi là kháng nguyên O hình thành mặtngoài của màng ngoài vi khuẩn LPS bao gồm phần lipd nhúng vào trong màng, mộtgốc oligosaccharide và một chuỗi dài polysaccharide chứa 10 đến 30 lần lặp lại của tiểuđơn vị polysaccharide đường 2-6 (gốc O) (hình 1.2) Quá trình tổng hợp kháng nguyên

O được mã hóa hóa bởi nhóm gen wba (trước đây gọi là rfb)[100] Nhóm gen wba bao gồm những gen cần cho tổng hợp đường (gen wba), enzyme glycosyl transferase thêm

gốc đường để tạo thành tiểu đơn vị O và gen chế biến kháng nguyên O bằng cáchchuyển những tiểu đơn vị O vào màng trong tế bào và polymer hóa thành chuỗi dài

kháng nguyên O (gen wzx, wzy, wzz)[86] Hơn 50 kháng nguyên O khác nhau đã được xác định ở Salmonella, chúng khác nhau bởi thành phần đường cấu tạo nên tiểu đơn vị

O, thứ tự sắp xếp và liên kết Sự đa dạng về mặt cấu trúc phản ánh sự đa dạng về mặt di

truyền của nhóm gen wba, với cấu trúc khảm chứng tỏ có sự tiến hóa bởi quá trình

chuyển gen theo hàng ngang của các loài vi khuẩn Gốc oligosaccharide được mã hóa

bởi một nhóm gen khác gọi là waa, với sự đa dạng liên quan tới sự đa dạng cấu trúc của

gốc oligosaccharide

Salmonella còn có biểu hiện kháng nguyên O LPS ngoại bào, gồm các tiểu đơn

vị O tương tự như ở kháng nguyên O LPS Quá trình tổng hợp vỏ kháng nguyên O phụ

thuộc vào những gen nằm ngoài locus wba (yihU - yshA và yihV - yihW) Kháng nguyên

O LPS ngoại bào cần thiết cho sự hình thành lớp màng sinh học trên bề mặt sỏi mật(quan trọng cho quá trình mang trùng không triệu chứng trên vật chủ có vú)[15,

16] và cho quá trình bám dính trên lá (liên quan đến con đường lan truyền qua thực phẩm)[4]

Hầu hết Salmonella có hai gen tạo lông roi gọi là fliC và fliB, nhưng chỉ biểu

hiện một gen ở mỗi giai đoạn, với tỉ lệ chuyển giữa hai pha là từ 10-3 đến 10-5 Quá

trình biến đổi pha có thể là hệ thống giúp Salmonella thoát khỏi tác động của hệ miễn dịch vì fliC được xem là kháng nguyên mục tiêu cho tế bào T trên mô hình chuột[26].

Cấu trúc bề mặt đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc tính sinh lý và sự

bám vào các mô của tế bào chủ Nếu Salmonella mất hoặc không biểu hiện kháng

nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớpLPS bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể thuộc hệ miễn dịch

1.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

Vi khuẩn Salmonella lên men đường glucose và thường sinh hơi Thêm vào đó,

chúng có khả năng mọc trên môi trường tối thiểu chỉ có đường glucose như nguồn cungcấp carbon và muối ammonium như nguồn cung cấp đạm Hầu hết các týp huyết thanhđược phân loại kiểu hình dựa trên khả năng thủy giải ure, không lên men đường lactose

và sinh H2S[49] Salmonella có chu kì phân chia tế bào là 40 phút, tăng trưởng

tốt ở nhiệt độ 37oC, tuy nhiên vẫn có khả năng tăng trưởng ở khoảng nhiệt rộng hơn, từ

6oC đến 46oC Salmonella có thể tồn tại hàng tuần bên ngoài cơ thể sống và không bị

phá hủy bởi nhiệt độ lạnh Tia UV và nhiệt độ cao có thể giết chết vi khuẩn, vi khuẩnchết khi bị đun nóng ở nhiệt độ 55oC trong một giờ, hoặc 60oC trong nửa giờ

1.2.3 Đặc điểm di truyền

Đảo độc lực trên Salmonella (Salmonella Pathogenecity Islands_SPI) là một

nhóm những gen có liên quan đến độc lực của vi khuẩn và được chuyển gen theo hàng

ngang trên bộ gen của Salmonella và có thể được xác định bởi thành phần các base

khác với phần còn lại của bộ gen (chẳng hạn như SPI-1 có 42% GC so với 52% GC ởphần còn lại của bộ gen) Trong khi phần lớn chúng mang gen mã hóa cho các tínhtrạng độc, chức năng của nhiều SPI chưa được làm rõ hoàn toàn SPI-1 và SPI-2 được

tìm thấy vào năm 1995 và 1996 và hiện diện trong toàn bộ S enterica Chúng mã hóa

cho hệ thống tiết loại 3 (T3SS), một cấu trúc giống như cây kim cho phép các proteincủa vi khuẩn được tiết vào tế bào chất của tế bào chủ[26]

SPI-1 có kích thước vào khoảng 40kb và chứa nhiều hơn 25 gen bao gồm cả hệthống tiết loại 3, yếu tố điều hòa và yếu tố tác động Nằm rải rác trên Salmonella, SPI-

1 liên quan tới khả năng bám vào thành dạ dày ruột và có khả năng cảm ứng biểu hiện

in vitro khi có sự thay đổi pH từ acid sang kiềm nhẹ, điều này phù hợp với cảm ứngbiểu hiện in vivo khi vi khuẩn vào môi trường kiềm nhẹ ở ruột non sau khi đi qua môitrường acid ở dạ dày Hệ thống T3SS vận chuyển những protein của vi khuẩn nhưprotein bám với sợi actin SptP và SopE vào trong tế bào chất của tế bào mục tiêu và dẫntới việc nuốt vi khuẩn bởi tế bào SPI-2 cũng mã hóa cho hệ thống T3SS thứ 2 và cầnthiết cho khả năng sống sót của vi khuẩn trong cả tế bào biểu bì và đại thực bào SPI-3

dài 17kb và chứa 10 khung đọc mở chứa gen mgtC Gen này cần thiết cho sự

tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường hạn chế Mg2+ như thể thực bào, và gián tiếpcho tính độc trên chuột SPI-4 là một “đảo” dài 25kb cần thiết cho sự sống sót bên trongđại thực bào và được cho là có mang T1SS liên quan đến sự tiết độc tố Phân tích trình

tự của 11kb SPI-5 cho thấy sự hiện diện của 6 gen bao gồm gen SopB, một gen mã hóa

cho protein tác động[26] SPI-6 và SPI-10 mã hóa cho operon fimbria, trong khi SPI-9

mã hóa cho hệ thống tiết loại 1 (T1SS) SPI-7 là vùng gen trên bộ gen Typhi mã hóa

gen tổng hợp kháng nguyên Vi, chỉ hiện diện trên Typhi, Paratyphi C, Citrobacter freundii và một số chủng Dublin mà không được tìm thấy ở bất kì Salmonella spp

nào khác Ngoài ra còn có một loạt các SPI khác từ SPI-11 đến SPI-22 cũng được mô tảgần đây

1.3 Bệnh học nhiễm trùng do NTS

Nhiễm Salmonella có thể có nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, phụ thuộc

mối tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ Kết quả của mối tương tác giữa chủng

Salmonella và vật chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như týp huyết thanh của

vi khuẩn, liều nhiễm, khả năng miễn dịch và hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ Phổgây bệnh khá đa dạng từ sốt thương hàn, nhiễm trùng dạ dày ruột cho tới mang trùng

không triệu chứng Salmonella enterica phân loài I enterica là tác nhân chính gây bệnh

nhiễm trùng dạ dày ruột ở động vật có vú Phân loài này thường gây bệnh thương hàn

hoặc nhiễm trùng dạ dày ruột không phải thương hàn Sốt thương hàn gây ra bởi S Typhi và S Paratyphi A và chỉ xuất hiện trên người.

NTS thường gây ra tiêu chảy, mất nước và chất điện giải, suy dinh dưỡng, hoại

tử ruột non ở trẻ sơ sinh, nhiễm trùng tại chỗ và nhiễm trùng hệ thống[24] Đôi khibệnh có thể dẫn tới các biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, viêm tủy xương,nhiễm trùng máu hoặc hiếm gặp hơn là viêm cơ tim và viêm phổi Viêm màng não do

Salmonella đặc biệt quan trọng vì bệnh có thể để lại di chứng thần kinh Khoảng từ

2-45% bệnh nhân bị tiêu chảy do NTS sẽ có biến chứng thành nhiễm trùng máu Tỉ lệnhiễm trùng máu tùy thuộc vào cơ địa và týp huyết thanh gây bệnh và tỉ lệ này là khácnhau giữa các nghiên cứu[103] Các thể bệnh do NTS này thường nghiêm trọng vànguy hiểm đến tính mạng cũng như xuất hiện mà không có triệu chứng tiêu chảy báotrước mặc dù đường tiêu hóa thường là nguồn gốc của bệnh Bệnh thường nguy hiểm ởtrẻ sơ sinh, người già và người suy yếu hệ miễn dịch, tỉ lệ chết thường cao trong nhómbệnh nhân này

1.3.1 Triệu chứng lâm sàng

Nhiễm trùng đường ruột do Salmonella gây ra về mặt lâm sàng không hoàn toàn

phân biệt được với nhiễm trùng gây ra bởi những vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác

như Shigella hoặc enterohemorrhagic Escherchia coli (EHEC) Bệnh nhân thường có

các triệu chứng khởi phát như sốt cấp tính, tiêu chảy và đau bụng Thời gian ủ bệnh tùythuộc vào từng cá thể và số lượng Salmonella nhiễm phải, nhưng thường là từ 6-72giờ[49]

1.3.2 Sự phát sinh bệnh

Hầu hết những hiểu biết hiện nay về bệnh nhiễm trùng do Salmonella cũng như cơ chế

gây bệnh đều xuất phát từ những nghiên cứu trên mô hình chuột, ngoài ra còn dựa trênnghiên cứu từ gia súc, chim cũng như quan sát lâm sàng trên người[49]

Sau khi xâm nhập vào dạ dày, vi khuẩn khu trú ở ruột non và ruột già Chúng sửdụng khuẩn mao hoặc các nhân tố bám dính khác để bám vào lớp màng nhầy trong ruột

và sau đó xâm nhập vào tế bào Vi khuẩn còn có thể xâm nhập tế bào M của lớp Peyer

là mô bạch huyết tại ruột non Salmonella nhân lên bên trong các tế bào biểu mô và đại

thực bào, sau đó ly giải tế bào Kết quả là xuất hiện phản ứng viêm tại nơi nhiễm trùng,thu hút bạch cầu trung tính và hoạt hóa đại thực bào, giải phóng prostaglandin làm tăng

cAMP dẫn tới mất dịch gây tiêu chảy Các nhân tố gây độc sản xuất bởi Salmonella còn

được cho là chịu trách nhiệm cho quá trình viêm và phá hủy mô gây mất dịch và chấtđiện giải Sự sản xuất độc tố có liên quan trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng của vi sinhvật gây bệnh

Hiện tại người ta vẫn chưa hiểu rõ cơ chế nào ngăn ngừa các týp huyết thanh

Salmonella từ gây bệnh nhiễm trùng tại chỗ sang nhiễm trùng hệ thống Hệ miễn dịch

với tế bào T hoạt động được cho là yếu tố cần thiết cho cơ chế này vì các bệnh nhândương tính với HIV dễ bị nhiễm trùng máu do NTS

1.3.3 Chẩn đoán

Các triệu chứng của nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella thường tương tự như

các triệu chứng tiêu chảy do các tác nhân gây bệnh khác, vì vậy kết quả chẩn đoán từphòng thí nghiệm là cần thiết để xác định bệnh Trẻ em tiêu chảy thường bị mất nước vàrối loạn điện giải Xét nghiệm tìm máu trong phân cho thấy bạch cầu đa nhân hiện diện

từ 36 đến 82% các ca nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella, nhưng kết quả này không

đặc hiệu Chẩn đoán chính xác chỉ có thể có được bằng cách phân lập tác nhân gâybệnh Ở bệnh nhân bị nhiễm trùng dạ dày ruột, việc cấy phân hoặc mẫu phết trực tràng

là dương tính ở hầu hết người bị nhiễm Mẫu phết được nuôi cấy qua đêm trong môitrường selenite để tăng sinh vi khuẩn từ phân Môi trường chuẩn để phân lập vi khuẩn

là Mac Conkey, Hektoen Enteric hoặc Xylose Lysine Desoxychocolate Salmonella

cũng có thể được phân lập từ máu của bệnh nhân nhiễm trùng máu do

Salmonella Vi khuẩn được định danh sinh hóa bằng bộ kit Api20E (Biomerieux) và

định týp huyết thanh

Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella Trong đó phương

pháp định týp huyết thanh Kauffmann-White là phương pháp định danh được côngnhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003[41] Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của

huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng

nguyên H

Định týp huyết thanh (serotyping) đã được áp dụng rộng rãi để định danh cũng

như dùng trong chẩn đoán thường qui cho Salmonella, tuy nhiên kĩ thuật này cũng có

một số hạn chế Kháng nguyên O của một số týp huyết thanh có phản ứng chéo với một

số giống khác thuộc họ Enterobacteriaceae, đặc biệt là Escherchia coli dẫn đến phản

ứng dương giả Serotyping dựa trên công thức kháng nguyên và không có khả năngphân biệt các chủng có vật chủ khác nhau Ví dụ: Typhimurium phagetype DT2 vàDT99 chỉ gây bệnh ở gia cầm trong khi DT104 và DT204 có phổ gây bệnh rộng hơn

Hiện nay nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR để định týp huyết thanh cho các týp huyết thanh phổ biến dựa trên trình tự đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên O và kháng nguyên H[5, 29]

1.3.4 Điều trị

Tiêu lỏng và nôn ói nhiều lần làm cơ thể người bệnh bị mất nước nhanh chóng,đặc biệt là ở trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ ở vùng khí hậu nóng và có kèm sốt Phác đồ điều trịtiêu chảy theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới là bù nước và chất điện giải bằngdung dịch oresol, cho uống kèm viên kẽm [108] Riêng việc điều trị bằng kháng sinhvẫn đang là vấn đề gây tranh cãi Quyết định kê đơn khá phức tạp bới các lý do (1) bệnhnhân có thể nhiễm bất cứ con nào trong số những tác nhân gây bệnh đường ruột, (2) kếtquả của nhiều nghiên cứu khác nhau cho thấy điều trị kháng sinh cho bệnh nhân

nhiễm Salmonella lại làm kéo dài thay vì hạn chế tình trạng thải Salmonella trong

phân[12, 99]

Nghiên cứu của Nelson và cộng sự cho rằng những trẻ em bị nhiễm trùng dạ dàyruột được chữa trị bằng ampicillin hoặc amoxicillin thường tăng thải thời gian thải vikhuẩn trong phân hoặc dễ tái phát bệnh hơn những trẻ em được chữa trị bằng giảdược[75] Nghiên cứu trên động vật cũng ủng hộ giả thuyết trên do kháng sinh sẽ làm

ức chế khả năng bảo vệ của hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột, do đó những chủng

Salmonella có khả năng sống sót tốt sẽ gây bệnh trở lại.

Nghiên cứu tổng hợp của Sirinavin S và cộng sự (2000) dựa trên 12 nghiên cứurandomized controlled trial của nhiều nhóm khác nhau cho thấy không có sự khác biệt

về mặt thống kê về thời gian kéo dài bệnh, số lần tiêu chảy hoặc thời gian sốt giữanhóm dùng kháng sinh và nhóm dùng giả dược[89] Thậm chí kháng sinh còn được

cho là làm tăng thời gian thải Salmonella phân và có nhiều tác dụng phụ hơn giả dược.

Liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo nên sử dụng cho những bệnh nhân cótriệu chứng rất nặng hoặc cho những bệnh nhân có nguy cơ nhiễm trùng hệ thống(bệnh nhân HIV, trẻ nhỏ, người lớn tuổi ), sau khi có kết quả cấy phân và cấy máu.Thông thường, liều chữa trị từ 3 đến 7 ngày là hợp lý Việc chữa trị bằng kháng sinhđược khuyến cáo đối với trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi, một số chuyên gia cho rằng trẻdưới 1 tuổi cũng nên dùng

1.3.5 Phòng ngừa

Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm khuẩn nênbiện pháp quan trọng hàng đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, cải thiện hệthống xử lý chất thải và nguồn cung cấp nước Rửa tay thường xuyên là biện pháp quantrọng ngăn ngừa việc lây bệnh từ người sang người thông qua thức ăn Những người

thải Salmonella trong phân không được phép tham gia chế biến thức ăn hoặc chăm sóc

trẻ cho đến khi kết quả cấy phân là âm tính

Hiện tại vẫn chưa có vắc xin hiệu quả phòng bệnh NTS Độc lực của NTS là tùythuộc vào khả năng sinh sôi của vi khuẩn trong đại thực bào của hệ võng nội mô Tìnhtrạng kháng với bổ thể, bởi chuỗi dài lipopolysacharide cũng là một tính độc quan trọng

của vi khuẩn Cả bổ thể và kháng thể đặc hiệu đều cần thiết để giết Salmonella spp in

vitro[34] Mặc dù mẫu huyết thanh của bệnh nhân Châu Phi khỏe mạnh có khả năngtiêu diệt NTS, những mẫu huyết thanh của trẻ em dưới 16 tháng tuổi thường không có

đủ kháng thể đặc hiệu để tiêu diệt NTS một cách hiệu quả[69] Điều này có thể giảithích cho khuynh hướng mắc bệnh nhễm trùng hệ thống do NTS ở trẻ em nhỏ tuổi vàcũng giúp hiểu được sự bất thường về hệ miễn dịch của bệnh nhân nhiễm HIV cũngkhiến những bệnh nhân này dễ mắc bệnh nhiễm trùng xâm lấn do NTS Nghiên cứu gầnđây nhất của Calman và cộng sự (2010) cho thấy kháng thể trong máu của bệnh nhânHIV thay vì bám vào protein trên màng tế bào (outer membrane protein) cho phép hệ

miễn dịch nhận biết và tiêu diệt Salmonella thì lại bám vào LPS khiến các kháng thể

bình thường không làm được nhiệm vụ tiêu diệt[68, 87] Nghiên cứu này cho thấyprotein màng tế bào có thể là nhân tố hứa hẹn trong sản xuất vắc xin thay vì sử dụngLPS như mục tiêu tiềm năng[33]

1.4 Tình hình nhiễm NTS trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình nhiễm NTS trên thế giới

Ước tính hàng năm có khoảng 93.8 triệu ca nhiễm trùng dạ dày ruột do

Salmonella trên toàn thế giới, với tỉ lệ tử vong là 155.000 ca Trong đó khoảng 80.3

triệu ca là do ngộ độc thực phẩm [71] Riêng tại Mỹ, ước tính hàng năm có khoảng 1.4

triệu ca ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Salmonella[72, 101].

Hai týp huyết thanh gây bệnh ở người phổ biến nhất ở cả 6 châu lục là S Enteritidis và S Typhimurium[30] S Enteritidis là týp huyết thanh phổ biến toàn cầu, đặc biệt là ở Châu Âu (chiếm 80% số ca bệnh) và Châu Á (38% số ca) Đại dịch S.

Enteritidis được ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 80 và có nguồn gốc từ trứng gia

cầm bị nhiễm khuẩn[40] Trứng gia cầm thường được sử dụng trong thực phẩm khôngcần qua quá trình gia nhiệt, chẳng hạn như bột làm bánh, kem làm tại nhà, sốtmayonaise và được phân phối rộng khắp Vì vậy những thực phẩm nhiễm bẩn này cótác động đáng kể đến vấn đề y tế công cộng.

S enterica týp huyết thanh Typhimurium (Typhimurium) là một trong những

nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm trùng thực phẩm và được chú trọng trong hệthống khảo sát của các quốc gia trên toàn thế giới Công thức kháng nguyên cho týphuyết thanh này là 1,4,[5],12 :i :1,2 nhưng có nhiều subtype đã được mô tả, phần lớnbởi phage typing và ít phổ biến hơn là bằng MLST[93] Những subtype này thườngđược gọi là biến thể (variant) hoặc pathovariant của Typhimurium vì chúng khác biệt cả

về mặt kí chủ và mức độ thích nghi với kí chủ Ở các nước phát triển, Typhimurium làmột trong những týp huyết thanh phổ biến gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột Tuy nhiên

ở các nước kém phát triển thuộc khu vực sa mạc Sahara của Châu Phi,Typhimurium ST 313 thường gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên người[58].Typhimurium ST19 là biến thể gốc của Typhimurium, đã được ghi nhận trong cơ sở dữliệu MLST phân lập từ gia súc, heo, người, gia cầm và ngựa

Nhiễm Typhimurium cũng qua đường ăn uống giống như Typhi, mặc dù bệnhcảnh thường thấy là nhiễm trùng dạ dày ruột hơn là nhiễm trùng hệ thống.Typhimurium cũng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, nhưng có liên quan đến sự tiết IL-8

ở tế bào chủ và thu hút bạch cầu trung tính neutrophil đến nơi nhiễm trùng, gây phảnứng viêm tại chỗ Vi khuẩn không phát tán khắp cơ thể, triệu chứng tiêu chảy gây ra bởinhiễm trùng thường tự khỏi trong vòng vài ngày

Sự phân bố của các týp huyết thanh ở động vật, thực phẩm, thức ăn gia súc vàmôi trường đa dạng hơn so với các týp huyết thanh phân lập từ người[81] Sự khácnhau này có thể được giải thích do sự khác biệt về khả năng gây bệnh của các týp huyếtthanh khác nhau Sự phân bố các týp huyết thanh này khác nhau ở từng châu lục

(hình 1.3 và 1.4) phản ánh sự khác biệt về vị trí địa lý, tập quán chăn nuôi hoặc sự hạnchế về khả năng phân lập và định danh của các phòng thí nghiệm khác nhau trên thếgiới dẫn đến việc báo cáo ít đi các týp huyết thanh.

Hình 1.3: Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở người phân lập từ các châu lục khác nhau[30]

Hình 1.4: Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở các nguồn không từ người phân lập

ở các châu lục khác nhau[30]

Mặc dù có hơn 1500 týp huyết thanh thuộc S.enterica phân loài enterica đã

được biết (hình 1.1), độc lực của hầu hết các týp huyết thanh đó chưa được xác định

Chỉ một số ít týp huyết thanh Salmonella gây bệnh trên người và động vật, và khác

nhau bởi vật chủ và triệu chứng chúng gây ra[50] Một số týp huyết thanh gây bệnh tiêuchảy trên phổ rộng các loài vật chủ khác nhau, ví dụ như Typhimurium và Enteritidis

chịu trách nhiệm cho từ 40-90% số ca nhiễm trùng tiêu hóa do Salmonella trên người ở

nhiều nơi trên thế giới, cũng như phần lớn các bệnh nhiễm trùng trên động vật nuôi.Một số týp huyết thanh gây bệnh tùy theo vật chủ, thường liên quan đến nhiễm trùng hệthống trên một số ít vật chủ nhưng đồng thời cũng có liên quan đến một số bệnh hiếmgặp trên những động vật khác Ví dụ như týp huyết thanh Dublin và Choleraesuis nhìnchung thường gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên gia súc và heo, nhưng đồng thời cũnggây bệnh trên người và một số động vật khác[77] Tương tự là Typhimurium, một týphuyết thanh gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột rất phổ biến ở người, cũng gây bệnhnhiễm trùng hệ thống trên chuột Typ Gallinarum chủ yếu gây bệnh trên gà[95] Cuốicùng là một số týp huyết thanh thuộc loại chỉ gây bệnh trên một số vật chủ nhất định,gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên một số loài có quan hệ rất gần nhau Ví dụ như týphuyết thanh Typhi và Paratyphi A chỉ gây bệnh trên người và những động vật linhtrưởng bậc cao khác, bệnh cảnh là nhiễm trùng hệ thống dưới dạng sốt thương hàn.Thỉnh thoảng, những týp huyết thanh có phổ gây bệnh rộng hoặc những týp huyết thanhthích nghi trên vật chủ không phải là người cũng có thể gây bệnh nhiễm trùng xâm lấntrên người (với tên gọi là nhiễm trùng xâm lấn do NTS)[50,

60] Điều này được cho là tùy thuộc vào độc lực của vi khuẩn, sự khiếm khuyết về miễndịch của cá thể người, hoặc là sự kết hợp của cả 2 yếu tố đó[25, 26] và có thể khác nhautùy vào vị trí địa lý[60] Ví dụ như Typhimurium và Enteritidis có liên quan mật thiếtvới số ca nhiễm trùng hệ thống do NTS ở trẻ em và người lớn nhiễm HIV ở nhiều nơithuộc Châu Phi[39, 48, 58], trong khi Choleraesuis lại là týp huyết thanh chính gâybệnh này ở Đài Loan[14]

1.4.2 Tình hình nhiễm NTS ở Việt Nam

Một số ít các nghiên cứu dịch tễ về những tác nhân gây tiêu chảy ở Hà Nội trên bệnh nhi nhỏ hơn 5 tuổi cho thấy bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS đang tăng nhanh từ 0% năm 2004[76] lên 3.6% năm 2007[46] và 7% năm 2008[45] Các dữ liệu này cho thấy NTS đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở miền Bắc

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella spp trên thịt (heo,

bò, gà) và hải sản (tôm) ở Đồng bằng Sông Cửu Long là khá cao, dao động từ 21% đến69.9%[82] Các týp huyết thanh phân lập được cũng khá đa dạng Nghiên cứu của Tran

TP và cộng sự (2004) cũng cho kết quả tương tự, cho thấy các týp huyết thanh khác

nhau của Salmonella spp được phân bố rộng khắp trên động vật nuôi ở miền Nam[98]

pháp này rất hữu ích trong việc xác định các chủng Salmonella phân lập ở những nơi

khác nhau vào các thời điểm khác nhau là giống hay khác tùy vào phản ứng nhạy khángvới một hỗn hợp các phage dùng để phân loại

Phage typing có thể phân biệt các chủng có mối quan hệ gần gũi nhưng khả năngphân biệt bị hạn chế bởi số loại phage hiện có cũng như một số chủng không thể địnhtype bằng kĩ thuật này Phage typing đòi hỏi việc duy trì nhiều loại bacteriophage chỉ cóthể hiện diện trong các phòng thí nghiệm chuẩn Hơn nữa, việc diễn giải kết quả

đòi hỏi kinh nghiệm nhất định Một trong những yếu tố quan trọng của phương phápphage typing là tính ổn định dài hạn của hỗn hợp phage.

1.5.2 Plasmid typing

Plasmid typing là phương pháp phân biệt dựa trên sự khác biệt về kiểu hình cắtgiới hạn của plasmid Các chủng vi khuẩn được phân biệt dựa trên sự hiện diện, sốlượng và kích thước các phân đoạn plasmid có trong vi khuẩn sau khi được xử lý bằngenzyme cắt giới hạn và điện di trên gel agarose Tuy nhiên hạn chế của phương pháp

này không phải chủng Salmonella nào cũng có mang plasmid vì vậy những chủng

không mang plasmid sẽ không được phân biệt bằng phương pháp này[27] Hơn nữaplasmid là chỉ thị di truyền không ổn định, có thể được thu nhận và mất đi, vì vậyplasmid typing không thích hợp cho các nghiên cứu về tiến hóa

1.5.3 Ribotyping

Trong phương pháp ribotyping, DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giớihạn, phân tách bằng điện di trên gel agarose và lai với mẫu dò DNA cho gen rRNA.Mặc dù gen rRNA có tính bảo tồn cao, chúng lại được bao hai đầu bằng những vùng cókích thước khác nhau cho phép phân biệt những chủng khác nhau Phương pháp này có

độ lặp lại cao và có thể được thực hiện tự động Ngoài ra, có thể áp dụng nhiều enzymecắt giới hạn cùng lúc để tăng khả năng phân biệt của phương pháp Tuy nhiên phươngpháp này có mặt hạn chế trong khả năng phân biệt một số týp huyết thanh do số lượnghạn chế các gen rRNA ở một số týp huyết thanh[27]

1.5.4 PFGE

PFGE được phát triển để phân loại các mảnh DNA kích thước từ 30-2000Kb

trên gel agarose để phân loại phân tử nấm Saccharomyces cerevisiae Trong PFGE, tế

bào vi khuẩn được ly giải và DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giới hạn trong cácplug agar để ngăn ngừa sự đứt gãy bộ gen và những mảnh DNA được phân tách bằng

điện di trong trường xung Phương pháp này được sử dụng để phân tích những mẫu S.

Typhi rời rạc hoặc những mẫu trong trận dịch PFGE từ đó được sử dụng rộng rãi để

phát hiện và nghiên cứu các vụ nhiễm Salmonella Nhờ vào khả năng phân loại cao so

với các phương pháp truyền thống như phage typing và nhiều phương pháp sử dụngenzyme cắt giới hạn khác, PFGE trở thành tiêu chuẩn vàng cho những nghiên cứu về

dịch tễ Salmonella từ năm 2001 Dữ liệu phân tử của những PFGE profile của nhiều týp huyết thanh Salmonella khác nhau được lưu trữ bởi CDC, cho phép nhiều nhà khoa học

và nhà dịch tễ học thuộc mạng lưới PFGE (PulseNet) tham khảo[110]

PFGE là phương pháp tốn nhiều công sức và thời gian cũng như cần nhiều kĩnăng để hoàn thành qui trình và diễn giải kết quả Một số chủng có thể được xem nhưtương đồng khi chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn, vì vậy nhiều lần chạy PFGE khácnhau với nhiều enzyme cắt giới hạn khác nhau là cần thiết để kết quả có độ phân giảicao hơn

1.5.5 MLEE

Multi locus enzyme electrophoresis (MLEE) dùng để phân loại các chủng dựa trên khả năng di động trên gel của nhiều enzyme nội bào khác nhau Đột biến trên những gen mã hóa cho các enzyme này sẽ dẫn đến sự thay đổi các acid amin trong cấu trúc enzyme, từ đó ảnh hưởng đến cấu hình tích điện của các enzyme và vì vậy làm thay đổi tính di động trong điện trường của chúng Tuy nhiên, phương pháp phân loại dựa trên điện di này lại khá chủ quan trong việc diễn dịch kết quả và khó chuẩn hóa giữa các phòng thí nghiệm

1.5.6 MLST

Multi locus sequence typing (MLST) là phương pháp được phát triển vào năm

1998 để áp dụng nguyên lý của MLEE trên trình tự DNA, ví dụ như sự phát hiện nhữngđột biến được tích lũy chậm chạp trên các loci có chọn lọc trung tính Những allele nàyđược phân lập trực tiếp từ trình tự nucleotide dài từ 400 đến 600 bp của

những gen giữ nhà thay vì so sánh khả năng di động của các enzyme chuyển hóa.Trong phương pháp MLST, những gen giữ nhà được chọn nằm rải rác trên bộ gen của

vi khuẩn Một đoạn DNA có kích thước xác định của mỗi gen giữ nhà được khuếch đại

và giải trình tự Một trình tự độc nhất được gán cho 1 số allele riêng biệt và tập hợpnhiều allele khác nhau cho một kiểu di truyền (sequence type) riêng biệt Nhiều hạn chếcủa phương pháp MLEE đã được giải quyết nhờ phương pháp MLST Kết quả có độ lặplại và dữ liệu được lưu trữ ở dạng số trên website cho phép việc trao đổi thông tin được

dễ dàng giữa các phòng thí nghiệm MLST còn có thể được thực hiện tự động với sốlượng mẫu lớn Những allele được phân lập bằng MLST đến nay nhiều hơn MLEE vìchỉ có 5% sự thay đổi về mặt di truyền làm thay đổi tính chất di động của các enzymechuyển hóa Giá thành giải trình tự ngày càng giảm cũng là yếu tố hỗ trợ cho kĩ thuậtnày MLST đã được sử dụng để nghiên cứu về mặt tiến hóa và mối quan hệ di truyềncủa nhiều sinh vật gây bệnh và không gây bệnh[70] Phương pháp này đã được áp dụngrộng rãi và hiện có đến 48 hệ thống MLST cho nhiều sinh vật khác nhau

Hiện có 3 hệ thống MLST đã được phát triển để nghiên cứu mối liên hệ về mặt

tiến hóa giữa những chủng Salmonella spp Hệ thống MLST phân loại Salmonella do

Kotetishvili và cộng sự đưa ra vào năm 2002 dựa trên bốn gen: 16S RNA,

phosphomannomutase (manB), glutamine synthetase (glnA) và 1,2-propanediol utilization factor (pduF)[59] Hệ thống này được phát triển để nghiên cứu dịch tễ của những trận dịch do Salmonella gây ra và được cho là phân biệt tốt hơn PFGE Tuy

nhiên việc chỉ sử dụng 4 gen có thể hạn chế việc ứng dụng kỹ thuật này trên một số

lượng lớn mẫu Sau khi nghiên cứu 12 loci trên Meningococcus, 7 loci được chọn để có

độ phân giải vừa đủ và kết luận đáng tin cậy[70] Hầu hết các hệ thống MLST hiện nayđều phải dựa trên từ 6 đến 10 loci

Hệ thống MLST khác do Sukhnannand và cộng sự phát triển năm 2005[91] gồm

việc giải trình tự của 5 gen giữ nhà là panB (ketopentoate hydroxymethyltransferase), icd (isocitrate dehydrogenase), manB (phosphomannomutase), mdh (malate dehydrogenase), aceK (isocitrate dehydrogenase kinase/phsophatase) và 2 gen mã hóa tính độc là gen fimA (fimbrial gene A) và spaN (surface presentation of antigens N).

Những kiểu di truyền đặc hiệu cho týp huyết thanh được quan sát thấy ở các chủng

enterica dưới loài khác nhau Tuy nhiên hệ thống này lại có những hạn chế trong việc

nghiên cứu tiến hóa ở vi khuẩn Salmonella vì nó bao gồm 2 gen mã hóa cho tính độc và

2 gen này có thể chịu ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên

Hệ thống MLST do Kidgell và cộng sự phát triển năm 2002[56] dựa trên 7 gengiữ nhà nằm rải rác trên bộ gen của Salmonella Typhi CT18, 7 gen này mã hóa chonhững enzyme chuyển hóa vì vậy không nằm dưới áp lực chọn lọc Hệ thống 7 gen này

gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol dehydrogenase), purE (phosporibosylaminoimidazole carboxylase), sucA (α-ketoglutarate dehydrogense) và thrA (aspartokinase and homoserine dehydrogenase) Hệ thống này phù hợp với yêu cầu

của một hệ thống MLST cơ bản vì vậy được áp dụng để phân loại tất cả các chủng

Salmonella Cây phân loại di truyền được xây dựng dựa trên trình tự 7 gen giữ nhà của nhiều chủng Salmonella cho thấy khoảng cách tiến hóa giữa các phân loài S enterica và S.bongori (hình 1.5).

Hình 1.5: Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica[28]

Cây phân loại di truyền được dựa trên trình tự của 7 gen giữ nhà Vòng tròn màu xanh

là S enterica thuộc phân loài 1 Vòng màu vàng bao gồm S enterica thuộc các phân loài II, IIIa, IIIb, IV và VI Vòng màu đỏ là S bongori hay còn gọi là phân loài V.

1.6 Tình trạng mang vi khuẩn không triệu chứng ở S Typhi và NTS

Người mang trùng mãn tính đầu tiên được phát hiện là Typhoid Mary, một đầubếp người Mỹ và người này đã lây bệnh cho hàng trăm người Mang trùng không triệu

chứng được mô tả bằng việc thải một lượng lớn S Typhi trong phân gây nhiễm bẩn

thức ăn hoặc những vật dụng dùng chung khác, dẫn tới việc gây bệnh cho các cá thểkhác trong cộng đồng Tình trạng mang trùng không triệu chứng được cho là hệ thốnggiúp một vi sinh vật gây bệnh tồn tại một thời gian nhất định khi số lượng người nhạycảm với bệnh không đủ lớn để duy trì vi sinh vật gây bệnh trong quần thể Đây là đặctính phổ biến của vi sinh vật gây bệnh có vật chủ hạn chế nhưng có thể không cần thiếtđối với những týp huyết thanh có vật chủ đa dạng hơn[35]

1.6.1 Tình trạng mang trùng không triệu chứng của Typhi và Paratyphi A

Typhi và Paratyphi A có thể sinh sôi trong tuyến tụy và được thải ra ngoài theophân trong một thời gian dài Con người là vật chủ duy nhất cho Typhi và Paratyphi A,

vì vậy những người mang trùng không triệu chứng được xem là góp phần quan trọngtrong việc lưu giữ những chủng Typhi và lan truyền bệnh trong cộng đồng Ở nhómbệnh nhân nhiễm sốt thương hàn không chữa trị, khoảng 10% trong số này sẽ thải vikhuẩn trong vòng 3 tháng (gọi là tình trạng mang trùng tạm thời) Khoảng 4% bệnhnhân sốt thương hàn sẽ trở thành người mang trùng mãn tính với thời gian dài hơn 1năm sau khi bình phục[19] Hiện tượng này thường xảy ra ở bệnh nhân có sẵn bệnh lý

ở túi mật (ví dụ: sỏi mật), phổ biến ở phụ nữ hơn là ở đàn ông[17].Việc mang trùngmãn tính ở túi mật được xem là có liên quan đến nguy cơ bị ung thư túi mật, tuyến tụy

và ruột già[62] Tình hình mang trùng mãn tính thậm chí còn có thể xuất hiện ở bệnhnhân không có triệu chứng của bệnh thương hàn với 25% số người mang trùng khôngtriệu chứng cho biết chưa có tiền sử bị bệnh sốt thương hàn[55] Ngoài ra, việc thải vikhuẩn trong nước tiểu cũng được ghi nhận, thường xảy ra ở bệnh nhân có đường tiểubất thường, và được cho là có liên quan tới việc nhiễm sán máng trong đường tiểu[43].Bệnh nhân nhiễm sán máng làm kéo dài tình trạng mang trùng không triệu chứng vì

Salmonella có thể xâm nhập và sinh sản bên trong thân sán và được bảo vệ khỏi tác

động của kháng sinh Bất thường về mặt cấu trúc của túi mật hoặc đường tiểu cũng

khiến cho việc loại bỏ hoàn toàn Salmonella gặp thất bại do chúng được bảo vệ ở

những phần bị tắc nghẽn

1.6.2 Tình trạng mang trùng NTS

Sự nhiễm trùng do NTS thường dẫn đến các triệu chứng tiêu chảy Sau quá trình

hồi phục, bệnh nhân trưởng thành thường tiếp tục thải Salmonella trong vòng 6 tháng 38% bệnh nhân thải Samonella trong phân trong vòng 2 tuần sau khi khỏi bệnh, 7% vẫn thải trong 8 tuần và 2% thải trong 6 tháng[11] Tỉ lệ thải Salmonella này phổ biến

ở tất cả các lứa tuổi, ngoại trừ trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi, với 27% số trẻ vẫn tiếp tục

thải Salmonella trong phân sau 8 tuần và 8% trong 6 tháng sau nhiễm bệnh Thông thường có khoảng 1% bệnh nhân nhiễm Salmonella sẽ trở thành người mang trùng mãn tính không triệu chứng và tiếp tục thải Salmonella trong nhiều năm Người mang trùng Salmonella không triệu chứng có tiềm năng truyền bệnh cho các thành viên khác trong

cộng đồng[18, 22, 57]

1.7 Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS

Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do Salmonella bao gồm lớn tuổi, sự xáo

trộn hệ vi sinh vật trong ruột (do sử dụng kháng sinh hoặc phẫu thuật), bệnh tiểuđường, khối u ác tính, thấp khớp, tắc nghẽn hệ võng nội mô trong các bệnh lý tán huyết(ví dụ, do nhiễm sốt rét, hồng cầu hình liềm hoặc nhiễm trùng do Bartonella), nhiễmHIV, và những phương pháp trị liệu ức chế miễn dịch các loại Các bất thường về giảiphẫu như sỏi thận và những bất thường đường sinh dục khác, sỏi mật, nhiễm sán máng(schistosomiasis), lắp các bộ phận giả… có thể là các yếu tố nguy cơ làm nhiễm trùng

Salmonella kéo dài.

1.7.1 Các yếu tố nguy cơ từ môi trường

Nước và thức ăn: số ca nhiễm NTS thường đạt cao điểm vào mùa mưa trên cả

người lớn và trẻ em cho thấy các yếu tố nguy cơ từ môi trường đóng phần quantrọng[53] Vi sinh vật trong phân thường được tìm thấy với nồng độ cao trong nướcuống ở Châu Phi vào đầu mùa mưa và điều này có thể liên quan tới việc tăng nguy cơnhiễm trùng NTS từ nước uống Việc bảo vệ nguồn nước sinh hoạt bao gồm lọc nước,khử trùng bằng chlor và đun sôi có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm bệnh do NTS

Một số dịch bệnh do thức ăn nhiễm NTS ở các nước phát triển cũng được mô tảvới kết quả tương tự ở Châu Phi Thịt, trứng và các sản phẩm từ sữa cũng được xem làphương tiện lan truyền NTS xâm nhiễm và khu trú trên hầu hết các loài động vật có vú.Những thực phẩm từ động vật, chẳng hạn như thịt gà đã được kiểm soát kỹ lưỡng

trong những nỗ lực nhằm làm giảm sự lây nhiễm NTS sang người ở các nước pháttriển NTS còn được phân lập từ bò, dê, cừu và heo ở những lò giết mổ ở Châu Phi.

Việc tiếp xúc với động vật, đặc biệt là những trẻ em chơi với gà con, được xem

là yếu tố nguy cơ cho nhiễm NTS ở các nước công nghiệp Mặc dù không được xem làyếu tố nguy cơ phổ biến trong nhiễm trùng NTS trong những nghiên cứu ở các nướcphát triển, con đường lan truyền từ người sang người được cho là khá quan trọng ởChâu Phi Nghiên cứu bởi Kazuki và cộng sự năm 2006 mô tả sự tương đồng giữachủng NTS phân lập từ phân của người nhà và phân của bệnh nhân nhiễm trùng máu doNTS, trong khi không tìm thấy được những chủng như vậy từ mẫu của vật nuôi hay từmôi trường xung quanh nhà người bệnh, mặc dù khả năng lây nhiễm từ nước hoặc thức

ăn vẫn chưa được loại trừ[52] Tình trạng mang trùng NTS không triệu chứng cũng đãđược mô tả ở Châu Phi[78] Một nghiên cứu ở Keynya cho thấy 20 (3.6%) trên

556 trẻ em mang trùng NTS không triệu chứng lúc nhập viện ở bệnh viện trong khi tỉ lệnày trên 111 người lớn là 0%[80] Ở các nước phát triển, đã có nghiên cứu cho thấy trẻ

em thường thải NTS trong phân trong vòng vài tuần sau hồi phục do nhiễm trùng đườngtiêu hóa[54]

1.7.2 Các yếu tố nguy cơ từ bản thân vật chủ

Tuổi: trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 3 tuổi thuộc nhóm nguy cơ cao mắc bệnh nhiễm

trùng xâm lấn do NTS[36, 74] Nhiễm trùng máu do NTS cũng được mô tả ở bệnh nhântrên 50 tuổi ở các nước phát triển Lớn tuổi có thể là một yếu tố nguy cơ trong nhiễmtrùng NTS ở quần thể người Châu Phi[84] Bệnh do NTS cũng thường gặp trên ngườitrẻ tuổi nhiễm HIV[37]

Sử dụng thuốc kháng sinh: việc sử dụng kháng sinh đã được chứng minh là

yếu tố nguy cơ trong tiêu chảy do NTS Sử dụng kháng sinh và suy dinh dưỡng gópphần làm biến đổi hệ vi sinh vật đường ruột và làm tăng nguy cơ nhiễm trùng NTS[61]

Sốt rét và bệnh thiếu máu: từ lâu bệnh sốt rét đã bị nghi ngờ làm tăng nguy cơ

nhiễm trùng xâm lấn do NTS và có thể góp phần tăng tỉ lệ nhiễm trùng theo mùa[67].Mặc dù cơ chế của mối liên quan giữa bệnh sốt rét và NTS chưa được làm rõ hoàntoàn, tình trạng ly giải tế bào máu trong bệnh sốt rét có thể dẫn tới sự bất thường của đạithực bào và sai lệch chức năng của bạch cầu trung tính do sự tích lũy các phần tử sốt rétbởi tế bào thực bào, độ bão hòa các protein gắn sắt và tăng nồng độ sắt trong máu choNTS, một vi khuẩn ưa sắt, sử dụng Mặc dù có một số nghiên cứu cho thấy có sự liênquan giữa nhiễm trùng máu do NTS và sốt rét, một số khác đã mô tả sự liên quan giữaviệc nhiễm sốt rét gần đó hoặc thiếu máu do sốt rét với NTS, so sánh với những nguyênnhân gây nhiễm trùng máu khác Do đó, việc kiểm soát sốt rét có thể giúp giảm dần tìnhtrạng nhiễm trùng xâm lấn do NTS ở những nước nhiệt đới của Châu Phi

Suy dinh dưỡng: suy dinh dưỡng thường liên quan tới nhiễm trùng máu do

NTS trên trẻ em ở Kilifi, Kenya[6] Suy dinh dưỡng, bệnh sởi và tiêu chảy thường lànguyên nhân nhập viện phổ biến ở trẻ em sau đó phát bệnh nhiễm trùng do NTS từbệnh viện ở Rwanda[64] Mặc dù trẻ em dưới 3 tuổi có nguy cơ cao nhiễm trùng NTS,những trẻ sơ sinh dưới 4 tháng lại thường được bảo vệ khỏi bệnh do được thừa hưởngkháng thể từ mẹ truyền sang trong thai kì hoặc do bú sữa mẹ và do đó làm giảm nguy

cơ tiếp xúc với thức ăn và nước uống nhiễm bẩn[85]

Nhiễm HIV: Nhiễm trùng máu do NTS ngày càng phổ biến trên người nhiễm

HIV, đặc biệt mối tương quan này xuất hiện cao nhất ở người trưởng thành[37] Liệupháp ngăn ngừa bằng trimethoprim-sulfamethoxazole được khuyến cáo để ngừa bệnhnhiễm trùng cơ hội trên bệnh nhân nhiễm HIV[104] Chiến lược này được xem là kháhiệu quả thậm chí ở những vùng có tỉ lệ kháng trimethoprim-sulfamethoxazole cao trêncác tác nhân gây bệnh như NTS[102] Việc kết hợp liệu pháp kháng virus đã làm giảmnhanh tỉ lệ tiêu chảy do NTS và nhiễm trùng máu do NTS trên bệnh nhân nhiễm HIV ở

các nước phát triển[47] Nhiễm HIV được xem là yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng máu ở trẻ em, bao gồm nhiễm trùng máu do NTS[6].

Giảm tiết dịch vị dạ dày: Sử dụng thuốc làm giảm tiết dịch vị dạ dày có liên

quan đến việc tăng nguy cơ nhiễm trùng dạ dày ruột[63] Trẻ em với hệ tiêu hóa kémphát triển so với người lớn nên càng tăng nguy cơ nhiễm NTS

Hồng cầu hình liềm: Những người mang đồng hợp tử trong bệnh hồng cầu hình

liềm có nguy cơ cao trong nhiễm trùng máu, bao gồm nhiễm trùng máu do NTS[106].Trong số 78 ca viêm tủy cấp do biến chứng của bệnh hồng cầu hình liềm ở Nigeria gồmbệnh nhân ở độ tuổi trung vị là 12 (khoảng từ 9 tháng đến 50 tuổi), 32 người được cấy

máu và một nửa trong số đó gây ra bởi Salmonella[23].

Nhiễm sán máng (Schistosomiasis): nhiễm sán máng có thể là yếu tố nguy cơ

trong nhiễm trùng xâm lấn do NTS ở trẻ em vùng dịch tễ bệnh[31] Tuy nhiên trênbệnh nhân người lớn nhiễm HIV ở Malawi, sự hiện diện của loại sán đường ruột này lạikhông liên quan với bệnh nhiễm trùng máu do NTS[21]

VẬT

LIỆU-PHƯƠNG PHÁP