Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài ký sinh trùng sốt rét tại huyện bù đăng, tỉnh bình phước bằng kỹ thuật nhuộm giêm sa và NESTED – PCR

Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thự

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS HỒ VĂN HOÀNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2012

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS BS Hồ Văn Hoàng, người đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng em

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng

TP Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại Viện và đóng góp những ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học phân tử - Miễn dịch, Viện Sốt rét -

Ký sinh trùng - Côn trùng TP Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ các phương tiện, máy móc, hóa chất để thực hiện các thí nghiệm trong luận án; cán bộ trong khoa đã quan tâm động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Trang phụ bìa Trang

Lời cam đoan

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét 9

1.2 Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới và Việt Nam 9

1.2.2 Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam 10

1.3 Tình hình sốt rét của Việt Nam và huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 12

1.3.2 Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 14

1.4 Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện KSTSR 15

1.4.2 Các test chẩn đoán nhanh (rapid diagnostic test) 18

1.4.3 Phương pháp nhuộm nhanh AO (Acridine Orange) 20

1.4.4 Phương pháp QBC (Quantative Buffy Coat) 20

1.4.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20

1.6 Các biện pháp phòng chống bệnh sốt rét 25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 27

2.2.2 Vật liệu của kỹ thuật nhuộm Giêm sa 27

2.2.3.1 Hóa chất dùng để tách chiết DNA 28

2.2.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28

2.2.3.3 Hóa chất dùng cho điện di 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 30

2.4.2 Phương pháp thu thập số liệu 30

2.4.2.2 Thu thập mẫu máu ngoại vi trên lam kính 31

2.4.2.3 Thu thập mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM 31

2.4.3 Kỹ thuật nghiên cứu 31

2.4.3.2 Kỹ thuật soi kính hiển vi phát hiện KSTSR 32

2.4.3.3 Kỹ thuật tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR 33

2.4.3.4 Kỹ thuật Nested - PCR phát hiện KSTSR 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 Kết quả 39 3.1.1 Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật

3.1.2 Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật

3.1.3 So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR

3.1.4 Kết quả giải trình tự 54

3.2 Bàn luận 55

3.2.1 Thành phần, tỷ lệ loài KSTSR tại các điểm thu thập mẫu 55 3.2.2 Những trường hợp khác biệt kết quả giữa kỹ thuật Giêm sa và kỹ thuật PCR 56 3.2.3 Phát hiện những ca nhiễm KSTSR hiếm gặp 59

3.2.4 Ký sinh trùng lạnh 60

3.2.5 Thay đổi về cơ cấu KSTSR của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

A Kết luận 64

B Kiến nghị 65

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DNA: Acid deoxyribonucleic

dNTPs: deoxynucleotide triphosphate

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

KST: Ký sinh trùng

KSTSR: Ký sinh trùng sốt rét

Marker: Thang chuẩn

QBC: Quantative Buffy Coat

Bảng 1.2 Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 14

Bảng 1.3 Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng 2008 - 2010 15

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho Plasmodium 28

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài KSTSR 28

Bảng 2.3 Kích thước sản phẩm PCR của 4 loài KSTSR 35

Bảng 3.1 Số ca KST dương tính xác định bằng Giêm sa 41

Bảng 3.2 Cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 42

Bảng 3.3 Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Giêm sa 44

Bảng 3.4 Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 44

Bảng 3.5 Số ca KST dương tính xác định bằng Nested - PCR 47

Bảng 3.6.Cơ cấu KSTSR xác định bằng Nested - PCR 48

Bảng 3.7 Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Nested - PCR 50

Bảng 3.8 Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50

Bảng 3.9 So sánh kết quả của kỹ thuật Giêm sa và Nested - PCR 51

Bảng 3.10 Những trường hợp khác biệt giữa 2 kỹ thuật 51

Hình 1.2 Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17

Hình 1.3 Hình thể KSTSR P knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17

Hình 1.5 KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC 20

Hình 1.7 Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR 22

Hình 1.8 Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR 23

Hình 3.2 KSTSR P falciparum trên lam máu nhuộm Giêm sa 40

Hình 3.3 KSTSR P vivax trên lam máu nhuộm Giêm sa 40

Hình 3.4 KSTSR P malariae trên lam máu nhuộm Giêm sa 41

Hình 3.5 Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Giêm sa 42

Hình 3.6 Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Giêm sa 43 Hình 3.7 Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 43

Hình 3.8 Biểu đồ tần suất loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 43

Hình 3.9 Hình ảnh kết quả PCR những mẫu nhiễm P falciparum 45

Hình 3.10 Hình ảnh kết quả PCR ca nhiễm phối hợp P falciparum, P vivax

Hình 3.11 Hình ảnh kết quả PCR sản phẩm nhiễm đơn P falciparum 46

Hình 3.12 Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P falciparum, P vivax, P malariae

Hình 3.13 Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Nested - PCR 48

Hình 3.14 Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định

Hình 3.15 Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng kỹ thuật Nested - PCR 49

Hình 3.16 Biểu đồ tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sốt rét là một bệnh lây qua đường máu, do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR)

truyền từ người bệnh sang người lành bởi muỗi Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn

xóc) Sốt rét là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện có 106 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu hành Hàng năm, có khoảng 350 đến 500 triệu người mắc sốt rét và gần 1 triệu người tử vong do sốt rét, đa số là phụ nữ và trẻ em ở châu Phi [30]

Trước đây, được biết có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người là Plasmodium

falciparum (P falciparum), Plasmodium vivax (P vivax), Plasmodium malariae (P malariae), Plasmodium ovale (P ovale) Gần đây, một số báo cáo cho thấy Plasmodium knowlesi (P knowlesi), một ký sinh trùng (KST) của loài khỉ, cũng có

thể gây bệnh cho người

Bệnh sốt rét thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh gây sốt khác như: cảm cúm, sốt Dengue, sốt mò, thương hàn… Đồng thời, mỗi loài KSTSR có chu kỳ phát triển

và bệnh lý khác nhau Đặc biệt, ký sinh trùng (KST) P falciparum nếu không được

chẩn đoán và điều trị kịp thời có thể dẫn đến sốt rét ác tính với các triệu chứng sốt rét não, đái huyết cầu tố, thiếu máu nặng, suy thận, suy gan, trụy tim mạch gây tử vong Do đó, chẩn đoán chính xác và kịp thời loài KSTSR gây bệnh là một khởi đầu quan trọng đối với công tác điều trị

Xác định thành phần, cơ cấu của KSTSR tại một khu vực góp phần cung cấp

số liệu cho việc hoạch định chính sách thuốc, cung cấp phác đồ điều trị cho từng vùng, xây dựng bản đồ dịch tễ sốt rét và chiến lược phòng chống phù hợp

Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thực địa cũng như trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán, phát hiện KSTSR Phương pháp này được xem như là “chuẩn vàng”

trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một số phương pháp mới đã được nghiên cứu, triển khai đã cung cấp những hướng nghiên cứu mới về KSTSR Đặc biệt, phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ngoài việc phát hiện được KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1μl máu) còn có khả năng xác định các trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó, hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét

Tại Việt Nam, trong những thập niên qua, cùng với sự phát triển và những thành tựu của ngành y tế, công tác phòng chống sốt rét (PCSR) đã đạt được những kết quả đáng kể, làm giảm số người mắc, số người chết và hạn chế bùng phát dịch sốt rét, góp phần vào sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân Tuy nhiên,

do nước ta có điều kiện thuận lợi về địa lý, khí hậu cho sự phát triển của muỗi

Anopheles, trung gian truyền bệnh; cơ cấu KSTSR tại những vùng sốt rét lưu hành

có sự thay đổi; đồng thời, trình độ dân trí và ý thức phòng chống bệnh một số nơi chưa cao, cộng với hiện tượng di dân tự do làm cho tình hình bệnh sốt rét vẫn còn diễn biến phức tạp

Được sự quan tâm và đầu tư của Chính phủ, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam bao gồm các tỉnh, thành phố: TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Long An và Tiền Giang Đây cũng là một trong những địa phương có tình hình sốt rét lưu hành nặng Tỉnh Bình Phước với dân số 894.941 người (năm 2010), toàn tỉnh có 856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm 95,7% dân số) Theo thống kê năm

2010, cả nước có 54.297 ca mắc sốt rét, riêng tỉnh Bình Phước có 3.566 ca (chiếm

tỷ lệ 6,7%) [21]

Do đó, để thực hiện tốt công tác chăm sóc sức khoẻ nhân dân, việc nghiên cứu thành phần, tỷ lệ loài KSTSR của tỉnh Bình Phước để có biện pháp can thiệp đúng, hạn chế sự lây truyền và tiến đến loại trừ bệnh sốt rét là việc làm cần thiết

Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong hai nơi có lượng KST cao nhất tỉnh Bình Phước Tiến hành nghiên cứu tại đây sẽ cho biết cơ cấu và thành phần KST chính xác nhất Ngoài ra, đây là nơi đã có báo cáo hiện tượng giảm tác dụng của thuốc sốt rét artesunat, chọn địa điểm này sẽ giúp hiểu biết sâu hơn về cơ cấu, thành phần KST, giúp đề ra các biện pháp khắc phục

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài KSTSR tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và Nested - PCR

3 Nội dung thực hiện

+ Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa + Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR

+ So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc phát hiện KSTSR

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH SỐT RÉT

1.1.1 Định nghĩa

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do KST Plasmodium gây nên Bệnh

sốt rét truyền từ người bệnh sang người lành chủ yếu do trung gian truyền bệnh là

muỗi Anopheles

Biểu hiện điển hình của bệnh là các cơn sốt có chu kỳ với 3 triệu chứng cơ bản: rét run, sốt và ra mồ hôi Trong cơ thể người, bệnh phát triển có chu kỳ và có hạn định, nếu không bị tái nhiễm Bệnh gây miễn dịch đặc hiệu nhưng không bền vững Bệnh lưu hành địa phương, trong điều kiện thuận lợi có thể gây thành dịch Bệnh sốt rét có thuốc điều trị đặc hiệu và có thể phòng chống được; tuy nhiên, nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời có thể sẽ gây tử vong do sốt rét ác tính Vắc xin phòng sốt rét đang được nghiên cứu tích cực

Bệnh sốt rét phổ biến ở các quốc gia châu Phi, châu Á, Trung Mỹ và Nam

Mỹ Môi trường thuận lợi về vị trí địa lý, nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa và sự tiếp xúc giữa véc tơ truyền bệnh và người làm gia tăng sự lây lan của bệnh [10]

1.1.2 Ký sinh trùng sốt rét

KSTSR thuộc giới đơn bào, lớp Protozoa, họ Plasmodidae, giống

Plasmodium Có khoảng 120 loài trong đó có ít nhất 22 loài ký sinh ở động vật tứ

chi, 19 loài ký sinh ở động vật có vú, khoảng 70 loài ký sinh ở chim và bò sát Có 4

loài Plasmodium ký sinh ở người là: Plasmodium malariae (P malariae) (Laveran

mô tả năm 1881), Plasmodium vivax (P vivax) (Grassi, Feletti mô tả năm 1890),

Plasmodium falciparum (P falciparum) (Welch mô tả 1897) và Plasmodium ovale (P ovale) (Stephens mô tả năm 1922) [2]

Hiện nay, đã có báo cáo về KSTSR thứ 5 gây bệnh cho người là Plasmodium

knowlesi (P knowlesi) P knowlesi là loài ký sinh trùng sốt rét chỉ ký sinh ở khỉ,

tuy nhiên nhiều thông tin trên thế giới cũng như trong nước thời gian gần đây cho

thấy P knowlesi có khả năng nhiễm bệnh ở người, thậm chí còn có nguy cơ lan

rộng và đe dọa tử vong

Chu kỳ sinh học của KSTSR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phát triển vô tính ở

người và giai đoạn phát triển hữu tính ở muỗi [4], [13]

Giai đoạn phát triển vô tính

Thời kỳ trong gan hay còn gọi là giai đoạn tiền hồng cầu: Khi muỗi cái

Anopheles đốt người, tiêm thoa trùng vào da, thoa trùng chui qua mạch máu để luân

lưu trong máu Sau 30 phút, toàn bộ thoa trùng chui vào gan, phát triển dần thành thể phân liệt, thể phân liệt vỡ ra phóng thích các mảnh trùng trước khi xâm nhập

vào hồng cầu trong khoảng thời gian từ 7 - 12 ngày Đối với P vivax hoặc P ovale,

ngoài sự phát triển tức thì của các thoa trùng, một số thoa trùng khác không phát triển ngay thành thể phân liệt mà thành các thể ngủ (hypnozoites) Các thể này tiềm tàng trong gan, có thể sau một vài tháng thậm chí có thể sau một hai năm mới phát triển từng đợt thành phân liệt, vỡ ra, tung mảnh trùng vào máu, gây ra những cơn sốt rét tái phát

Thời kỳ trong máu (giai đoạn hồng cầu): Mảnh trùng xâm nhập hồng cầu phát triển thành thể trưởng thành thực hiện quá trình phân chia vô tính Nhân ký sinh trùng chia thành nhiều nhân con và phân chia bào tương tạo thành thể phân liệt (schizont) Thể phân liệt trưởng thành là những ký sinh trùng phát triển hoàn toàn Kết thúc quá trình phân chia vô tính, hồng cầu nứt vỡ ra và ký sinh trùng tiếp tục xâm nhập vào các hồng cầu mới Chu kỳ phân chia vô tính hồng cầu được lặp đi lặp lại trong suốt quá trình nhiễm bệnh Sau nhiều thế hệ, một số mảnh trùng khi xâm nhập hồng cầu tiếp tục phát triển thành các thể vô tính, một số khác lại phát triển

thành giao bào Thời gian hoàn thành chu trình hồng cầu đối với P falciparum là 36

- 48 giờ, đối với P vivax và P ovale là 48 giờ, với P malariae là 72 giờ

Giai đoạn phát triển hữu tính

Khi muỗi Anopheles hút máu người bệnh, chúng hút KSTSR vào dạ dày, các

thể vô tính dần dần sẽ chết đi, các thể hữu tính (giao bào) tiếp tục phát triển Giao bào đực xuất roi cho ra nhiều giao tử đực, giao bào cái phát triển thành giao tử cái Giao tử đực chui vào giao tử cái thụ tinh tạo ra hợp tử không di động (zygot); hợp

tử biến dạng dài ra và chuyển động thành trứng di động (ookinet) Trứng di động di

chuyển đến thành dạ dày muỗi và chui qua giữa lớp tế bào bên ngoài bề mặt dạ dày rồi định cư ở đó phát triển thành noãn bào (oocyst) Khi noãn bào phát triển đủ độ, bên trong có khoảng 1.000 thoa trùng Thoa trùng (sporozoit) di động phá vỡ màng noãn bào, bơi trong xoang cơ thể đến tuyến nước bọt Khi muỗi đốt người khác, thoa trùng lại xâm nhập vào máu và tiếp tục chu trình sinh sản vô tính

Thời gian cần thiết cho sự phát triển của thoa trùng thay đổi tùy theo nhiệt độ của môi trường bên ngoài Nhiệt độ thích hợp nhất là 28oC - 30oC Khi nhiệt độ bên ngoài thấp hơn 16oC và cao hơn 45oC thì chu trình hữu tính không xảy ra

Hình 1.1 Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC)

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về Anopheles trong những năm gần đây cho thấy có 62 loài Anopheles [15]

Trong đó, những véc tơ truyền bệnh chính ở Việt Nam là:

- An minimus: sống trong rừng, bìa rừng, savan Bọ gậy sống ở ven suối

quang, nước chảy chậm, muỗi phân bố ở khu vực rừng núi trên toàn quốc

- An dirus: sống ở rừng rậm, bìa rừng, rừng thưa Bọ gậy sống ở vũng nước

đọng, dưới bóng râm trong rừng, muỗi phân bố từ 20 vĩ độ bắc trở vào

- An epiroticus: sống ở vùng ven biển nước lợ

1.1.4 Vật chủ cảm thụ

Vật chủ cảm thụ là con người - người khỏe mạnh, người chưa có miễn dịch

hoặc đã có miễn dịch với sốt rét nhưng đã giảm thấp Khi muỗi Anopheles đưa thoa

trùng vào máu thì sự phát triển tiếp theo của ký sinh trùng sốt rét tùy thuộc vào tình trạng cảm thụ hoặc miễn dịch của người đó

- Miễn dịch tự nhiên: Một số nhóm người, chủng người có miễn dịch tự nhiên đối với KSTSR Một số nghiên cứu cho thấy những người gốc Phi có nhóm

máu âm tính với kháng nguyên Duffy hầu như không bị nhiễm P vivax [10]

- Miễn dịch thu được: Miễn dịch tạo thành trong bệnh sốt rét Miễn dịch trong sốt rét là miễn dịch không bền vững, độ miễn dịch này sẽ giảm và mất đi khi người đó ra khỏi vùng sốt rét Thời gian tồn tại của miễn dịch khoảng 6 tháng Chính vì có miễn dịch này mà những người sống lâu trong vùng sốt rét trở thành người mang ký sinh trùng lạnh Ký sinh trùng lạnh (Asymtomatic Malaria): “Một người hiện không có sốt hoặc không có tiền sử sốt gần đây có xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét dương tính” Về dịch tễ học, những người mang KST lạnh là nguồn bệnh sốt rét quan trọng cần phải được nghiên cứu và quản lý đầy đủ [14]

Tùy theo loài KSTSR trong người mà bệnh nhân sốt mỗi ngày một cơn (P

falciparum), hai ngày một cơn (P vivax) và ba ngày một cơn (P malariae) Cơn sốt

thường xuất hiện đúng giờ, có tính chu kỳ rõ rệt, trùng khớp với những đợt phát triển KSTSR trong cơ thể người

Tất cả mọi người đều có thể mắc bệnh sốt rét nếu bị muỗi nhiễm KSTSR đốt Một số ngành nghề liên quan đến rừng núi (làm việc trong rừng, ngủ lại trong rừng) thường có tỷ lệ mắc sốt rét cao

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét [10]

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét:

- Yếu tố tự nhiên như khí hậu, sinh cảnh, môi trường… có tác động rất lớn

đến sự phát triển của bệnh sốt rét Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh sản của Anopheles,

ảnh hưởng đến tiếp xúc giữa người và muỗi, đến quá trình phát triển của KSTSR trong cơ thể muỗi Các nghiên cứu cho thấy ở mỗi vùng địa lý có sự vượt trội của

từng loài KSTSR Vùng nhiệt đới thuận lợi cho cả 4 loài P falciparum, P vivax, P

malariae, P ovale Vùng ôn đới P vivax chiếm ưu thế Địa hình, thời tiết, khí hậu,

lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tác động lên quá trình phát triển, tới tuổi thọ và khả năng hoạt động của muỗi, qua đó, ảnh hưởng đến mức độ lây truyền

- Yếu tố về kinh tế xã hội như biến động dân cư, chiến tranh, nghèo đói, cơ

sở hạ tầng thấp kém, nhà cửa tồi tàn có tác động trực tiếp đến lan truyền sốt rét, có thể làm xảy ra dịch sốt rét, ảnh hưởng đến công tác PCSR

Trình độ văn hóa thấp, nhận thức về bệnh sốt rét hạn chế, tập quán du canh

du cư, thói quen không ngủ màn cũng tác động lớn đến tình hình sốt rét của các địa phương

1.2 PHÂN BỐ VÀ CƠ CẤU KSTSR TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới

Có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người: P falciparum, P vivax, P malariae,

P ovale Trong đó, P ovale có mặt ở một số nơi trên thế giới Tuy nhiên theo

Lysenko và Bejaev, phân bố tự nhiên của P ovale tập trung ở sa mạc Sahara châu

Phi và một số quần đảo Tây Thái Bình Dương Theo Bruce - Chwatt (1963), Gill và

Warell (3rd Essential Malariology, 1993) muỗi sốt rét lan truyền ký sinh trùng P

ovale xảy ra chủ yếu ở Tây Phi Các tài liệu y văn và báo cáo cho thấy rất hiếm gặp

ở Philippines, Việt Nam, Thailand, New Guinea, Indonesia, Myanmar, Malaysia và India [10]

Theo GS Vũ Thị Phan [15] thành phần và tỷ lệ loài KSTSR phân bố trên thế giới như sau:

- Khu vực châu Phi nhiệt đới: Vùng sốt rét chiếm 88,6% dân số Có đủ 4 loài

KSTSR, trong đó P falciparum chiếm 70 - 80%

- Bắc Mỹ: có 3 loài KSTSR P falciparum, P malariae, P vivax, trong đó P

vivax 60%, P falciparum 30%, P malariae 10%

- Nam Mỹ: P faciparum chiếm 50%

- Khu vực Trung Á: Bangladesh còn lưu hành sốt rét P falciparum 65%, P

+ Lào: có 3 loài P falciparum 70 - 80%, P vivax 19 - 25%, P malariae

0,5 - 1%

+ Campuchia: P falciparum 88%, P vivax 12%

+ Malaysia: P falciparum 75%, P vivax 24%, P malariae 1%

+ Indonesia: phát hiện được cả 4 loài trong đó P falciparum 84%, P vivax 14%, P malariae 2% và đã phát hiện được P ovale

+ Philippines: có đủ 4 loài, P falciparum 85%, P vivax 14%, P malariae 1%, P ovalae hiếm gặp

1.2.2 Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam

Qua các cuộc điều tra sốt rét trước đây thì ở Việt Nam có 3 loại Plasmodium

là P falciparum, P vivax, P malariae Hiện nay, với kỹ thuật sinh học phân tử

PCR đã nghiên cứu, phát hiện P ovale ở Việt Nam Nhưng chủ yếu vẫn là 2 loại P

falciparum và P vivax, trong đó, P falciparum chiếm 70 - 80% [10]

Cơ cấu của các loài KSTSR thay đổi tùy theo từng vùng, từng mùa và cũng thay đổi dưới sức ép của các biện pháp PCSR

P falciparum hiện diện nhiều ở vùng sốt rét lưu hành nặng (rừng núi, cao

nguyên, ven biển miền Nam từ Phan Thiết trở vào) Ở những vùng này, P

falciparum thường chiếm từ 70% - 80% số KST

P vivax chiếm từ 18% - 27%, P malariae từ 1% - 3% P vivax phân bố

nhiều hơn ở các vùng Duyên Hải miền Bắc, miền Trung và Nam Bộ

Trong quá trình tiêu diệt sốt rét với các tác động của các biện pháp PCSR

quy mô thì P falciparum giảm nhanh, P vivax giảm chậm hơn, tương quan giữa 2 loại KST này có thay đổi Sự giảm nhanh của P falciparum vừa là kết quả, vừa là tín hiệu nói lên công tác PCSR tiến triển tốt Ngược lại, P falciparum giảm chậm hoặc tăng lên thì các biện pháp PCSR hiệu quả kém (P falciparum kháng thuốc,

muỗi kháng hóa chất…) hoặc có nguy cơ sốt rét quay trở lại

Từ năm 1962 1972 tỷ lệ KSTSR thay đổi, tỷ lệ P falciparum giảm còn 50 60%, tỷ lệ P vivax tăng lên Một số nơi khu vực miền Trung (Ninh Thuận, Quảng Nam) P vivax có lúc có chiều hướng vượt trội hơn P falciparum Ngoài ra, P

-malariae vẫn được xem là hiếm ở Việt Nam với tỷ lệ rất thấp, tuy nhiên trong một

số nghiên cứu và điều tra gần đây tại Ninh Thuận thì tỷ lệ loài này chiếm tới 15 - 29% [15]

P ovale là loài ký sinh trùng sốt rét được mô tả bởi Stephen năm 1922 Phân

bố của P ovale chủ yếu ở Châu Phi, chiếm một tỷ lệ rất thấp ở các nước Tây Thái Bình Dương Ở Việt Nam, nhiễm P ovale rất hiếm gặp Một số nghiên cứu tại Việt Nam đã xác nhận có 4 trường hợp nhiễm P ovale trong số lính Mỹ đóng quân ở

một vị trí tại Nam Việt Nam vào giữa tháng 1/1966 đến tháng 3/1969 (Gleason N.N.) Riêng tại miền Trung - Tây Nguyên, theo hệ thống báo cáo từ 1976 - 2010

chỉ có 1 trường hợp nhiễm P ovale được ghi nhận từ tỉnh Đắk Lắk (1995) Gần đây,

các nghiên cứu và khảo sát sốt rét thực địa của Kawamoto F được thực hiện ở 4

tỉnh (Sông Bé, Lâm Đồng, Đắk Lắk và Khánh Hòa) từ 1994 - 1995 với kỹ thuật nhuộm AO để chẩn đoán nhanh và kỹ thuật lai dựa trên thử nghiệm khuyếch đại

chuỗi gen để chẩn đoán chính xác Kết quả có 3 trường hợp nhiễm P ovale được phát hiện Nghiên cứu của Lê Đức Đào (1996) thông báo có sự hiện diện của P

ovale (kỹ thuật PCR) tại huyện Khánh Vĩnh, Khánh Hòa [7], [8]

Tại khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng, năm 2001, Lê Đức Đào và cộng sự áp dụng kỹ thuật PCR khảo sát thành phần 4 loài KSTSR ở 3 tỉnh: Lâm Đồng, Bình Phước và Đắk Lắk Kết quả cho thấy sự tồn tại của cả 4 loài KSTSR và tỷ lệ nhiễm phối hợp 2, 3 loài rất cao Tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm phối hợp là 41%, Bình Phước 22%, Đắk Lắk 36,5%

- Tại Lâm Đồng: P falciparum chiếm 57,9%, P vivax 33,7%, P malariae 6,3%, P ovale 2,1%

- Tại Đắk Lắk: P falciparum chiếm 52,4%, P vivax 38,5%, P malariae 6,3%, P ovale 2,8% [5]

1.3 TÌNH HÌNH SỐT RÉT CỦA VIỆT NAM VÀ HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH BÌNH PHƯỚC

1.3.1 Tình hình sốt rét của Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành, là một trong những nước có nguy

cơ cao về bệnh sốt rét Chương trình quốc gia “Tiêu diệt sốt rét” đã đạt được thành tựu to lớn ở miền Bắc trong thời kỳ 1958 - 1975 và trên phạm vi cả nước từ sau ngày giải phóng 1976 - 1980 Nhưng từ năm 1980 trở đi bệnh sốt rét đã quay trở lại

và ngày càng nghiêm trọng mà đỉnh cao là năm 1991, có hơn 1 triệu người mắc, 4.646 người chết, hơn 114 vụ dịch lớn xảy ra ở nhiều địa phương trong cả nước Cũng từ năm 1991, Việt Nam chuyển hẳn sang chiến lược “Phòng chống sốt rét” và chính phủ đã đưa chương trình “Phòng chống sốt rét” thành một trong các chương trình y tế quốc gia ưu tiên [22]

Bảng 1.1 Tình hình sốt rét cả nước giai đoạn 2006 - 2010

có tỷ lệ chết do SR < 0,3/100000 dân (đạt 47,61%) (Phụ lục 2)

Tình hình sốt rét hiện nay tương đối ổn định nhưng vẫn còn là mối đe dọa sức khỏe đối với những người dân ở vùng sâu, vùng xa, vùng biên giới và đối với dân di cư

Tại Việt Nam, từ năm 2003, Chương trình quốc gia PCSR đã phân vùng dịch

tễ và can thiệp dựa vào các yếu tố về vùng địa lý, sinh cảnh, thảm thực vật rừng, khí hậu, chỉ số bệnh nhân sốt rét, KSTSR và sự có mặt của muỗi truyền bệnh sốt rét Kết quả phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 ở Việt Nam có 5 vùng như sau: vùng không có sốt rét lưu hành, vùng nguy cơ sốt rét quay trở lại, vùng sốt rét lưu hành nhẹ, vùng sốt rét lưu hành vừa, vùng sốt rét lưu hành nặng [10], [18]

Bảng 1.2 Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009

1.3.2 Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước

Bình Phước là tỉnh thuộc miền Đông Nam Bộ, là trọng điểm sốt rét của cả nước và của khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng Dân số 894.941 người trong đó có 856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm tỷ lệ 95,7%) Theo thống kê năm 2010, toàn tỉnh có 3.566 ca mắc sốt rét, trong đó có 52 ca sốt rét ác tính và 5 ca

tử vong [21]

Tại tỉnh Bình Phước, sốt rét lưu hành quanh năm, đỉnh bệnh là vào tháng 10 -

11 năm trước cho đến tháng 2 - 3 năm sau Địa hình sinh cảnh phù hợp cho véc tơ

tồn tại, phát triển quanh năm Diện tích rừng là chủ yếu

Các nhóm dân tộc ít người chiếm tỷ lệ cao (M’nông, S’tiêng, Tày, Dao, Nùng, Mường…) Dân sống bằng nghề nông nghiệp là chủ yếu: điều, cao su và cây sắn Phong tục, tập quán lạc hậu, thói quen ngủ rừng ngủ rẫy, ý thức PCSR còn

hạn chế Đặc biệt, tỉnh Bình Phước có 03 huyện giáp biên giới Campuchia, chiều

dài biên giới là 240km, tình trạng di biến động dân, giao lưu biên giới khó kiểm soát

Tỷ lệ KSTSR tại Bình Phước năm 2010 tổng số là 2.781, trong đó P

falciparum có 1.869 ca (chiếm 67,2%), P vivax có 873 ca (chiếm 31,4%) và nhiễm

phối hợp có 96 ca (chiếm 1,4%) [20]

Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với địa hình thuộc vùng đồi cao nguyên Nông nghiệp chủ yếu trồng cây sắn, cây cao su và cây điều Khí hậu chia làm 2 mùa

rõ rệt mùa mưa và mùa khô Mùa mưa từ tháng 8 đến tháng 11, mùa khô từ tháng

12 đến tháng 8 năm sau Nhiệt độ trung bình trên 20oC

Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong những “điểm nóng” về sốt rét của khu vực Nên mặc dù được nhà nước quan tâm đầu tư cho công tác PCSR nhưng bệnh sốt rét vẫn diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng trong những năm gần đây

Bảng 1.3 Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng giai đoạn 2008 - 2010

Năm nhân sốt Bệnh

rét

Chết do sốt rét

KST của huyện chiếm tỷ lệ tương đối cao so với toàn tỉnh: 22,2% năm 2008;

20,9% năm 2009 Tỷ lệ P falciparum chiếm đa số trong cơ cấu KST [20]

Ngoài ra, năm 2009, đã phát hiện KSTSR kháng artesunat đầu tiên tại Việt Nam là tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với tỷ lệ điều trị thất bại

là 14,6% càng gây khó khăn cho công tác PCSR

1.4 CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN KSTSR [4], [11], [13], [29]

1.4.1 Kỹ thuật nhuộm Giêm sa

Kỹ thuật nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi quang học là kỹ thuật cổ điển được sử dụng để phát hiện KSTSR trong máu Kỹ thuật này do Ronald Ross đưa ra

năm 1903 giúp tập trung được 20 - 30 lớp hồng cầu trên một diện tích nhỏ, cho phép phát hiện nhanh KSTSR Hiện nay, kỹ thuật soi lam máu nhuộm Giêm sa được xem như là “chuẩn vàng” trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới

Nguyên lý:

Khi nhuộm dung dịch Giêm sa, nguyên sinh chất của ký sinh trùng sẽ bắt màu xanh còn nhân bắt màu đỏ, sắc tố màu đen ánh vàng hay đen tùy thuộc vào chủng loại KST Dựa vào đặc điểm và màu sắc đó ta có thể nhận dạng và phân biệt được hình thể ký sinh trùng

Một lam máu (giọt dày và giọt mỏng) được nhuộm với dung dịch Giêm sa 5% và soi ở kính hiển vi quang học với độ phóng đại 700 - 1000 lần Soi ở giọt dày

để phát hiện và định loại KSTSR, giọt mỏng dùng để xác định chủng loại KST khi

có nghi ngờ Kết quả trả lời bao gồm: chủng loại KST, các thể KST tìm thấy trong máu cùng với mật độ của chúng

Hình 1.2 Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi

Hình 1.3 Hình thể KSTSR P knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi

Đặc điểm hình thể hồng cầu bị ký sinh

Hồng cầu bị P falciparum ký sinh kích thước gần như bình thường, không

trương to Hồng cầu màu hơi nhạt, ở rìa hồng cầu sẫm màu hơn Trên hồng cầu có thể thấy những hạt Maurer: hạt to, thưa thớt bắt màu đỏ (kích thước khoảng 1µm) hoặc có thể thấy vết Maurer

Hồng cầu bị P vivax ký sinh trương to, hình bầu dục hoặc méo mó, nhạt màu

và có nhiều hạt Schuffner: là những hạt nhỏ, nhiều lấm tấm bắt màu đỏ, rải rác khắp hồng cầu

Hồng cầu bị P malariae ký sinh không thay đổi kích thước, đôi khi còn nhỏ

hơn hồng cầu bình thường và có xuất hiện các chấm hồng nhạt Zieman

Hồng cầu bị P ovale ký sinh hơi trương to, hình bầu dục, quả lê hoặc kéo dài

có hình đuôi nheo, màu sẫm, rìa hồng cầu có dạng hình răng cưa Trên hồng cầu có hạt Schuffner rải rác bắt màu đỏ

Ưu điểm

- Nhạy: có thể phát hiện KSTSR ở ngưỡng 5 - 10 KST/l máu

- Xác định được mật độ, chủng loại và các thể KST trong máu

- Định lượng được mật độ KST

- Không cần các trang thiết bị, hóa chất đắt tiền

- Với kính hiển vi có thể làm thêm các xét nghiệm khác

- Lưu giữ được kết quả và có thể kiểm tra được

Nhược điểm

- Đòi hỏi công sức và thời gian (60 phút)

- Độ chính xác tùy thuộc vào: vật tư (chất lượng kính hiển vi, lam kính); kỹ thuật nhuộm và xét nghiệm viên

- Khó phát hiện các trường hợp có quá ít KST trong máu (< 10KST/1μl máu) hoặc nhiễm đồng thời nhiều loài KSTSR mà trong đó có một loài trội hẳn về số

lượng Ngoài ra, P faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen có thể làm biến dạng

hình thái các chủng loại rất khó chẩn đoán đầy đủ và chính xác

1.4.2 Các test chẩn đoán nhanh (rapid diagnostic test)

Dựa trên việc phát hiện kháng nguyên của KST có trong máu đã bị ly giải, bằng phương pháp sắc ký miễn dịch Thường trình bày ở dạng que thử, cassette hay bìa cứng có gắn các kháng thể đơn dòng chống lại kháng nguyên của KST Thử nghiệm có kết quả vào phút thứ 15 Hiện có nhiều nhãn hiệu trên thị trường (Parasight F, ICT Malaria Pf, RapidMal Pf, Paracheck Pf, Optimal…)

Các kháng nguyên mà que thử chẩn đoán nhanh hiện nay phát hiện

- Protein giàu histidin II (HRP-II): một protein tan trong nước từ các thể tư

dưỡng và giao bào non Các test hiện nay chỉ phát hiện HRP-II của P falciparum

- Men lactat dehydrogenaz (pLDH) của các thể KST vô tính và hữu tính Các test hiện nay phát hiện pLDH của cả 4 loại KST SR của người Chúng có thể phân

biệt P falciparum với không P falciparum, nhưng không phân biệt được P

falciparum, P vivax, và P malariae

- Các kháng nguyên khác có ở tất cả 4 loại KST cũng được các test khác

nhắm đến (aldolase…) Các test này kết hợp việc phát hiện HRP-II của P

falciparum với một kháng nguyên chung cho tất cả các loại khác

Hình 1.4 Test chẩn đoánh nhanh

1.4.3 Phương pháp nhuộm nhanh AO (Acridine Orange)

Tiêu bản máu sau khi nhuộm AO, soi trên kính hiển vi có ánh sáng huỳnh quang, KSTSR có nhân bắt màu vàng, nguyên sinh chất bắt màu đỏ da cam

Dụng cụ, hóa chất xét nghiệm: kính hiển vi có nguồn sáng huỳnh quang (tia cực tím), dung dịch AO và các dụng cụ khác tương tự kỹ thuật nhuộm Giêm sa

1.4.4 Phương pháp QBC (Quantative Buffy Coat)

Đây là một phương pháp dựa trên cơ sở ly tâm phân lớp các thể của

Plasmodium kết hợp với phương pháp nhuộm nhanh AO

Các tế bào máu sau ly tâm xếp thành các lớp sau: hồng cầu, bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu, huyết tương Trong lớp hồng cầu: hồng cầu lành, hồng cầu chứa thể nhẫn, thể tư dưỡng muộn, giao bào, phân liệt Sau ly tâm, soi ống

vi quản dưới kính hiển vi có ánh sáng huỳnh quang Mẫu máu có KSTSR được nhuộm AO sẽ phát quang dưới ánh sáng cực tím và tập trung phần giữa lớp bạch cầu và hồng cầu

Hình 1.5 KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC

1.4.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để khuếch đại in vitro DNA

lên hàng triệu lần Nguyên lý của phương pháp là dựa trên hoạt tính của DNA polymerase có khả năng tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn với cặp mồi được thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu

Người phát minh ra phương pháp PCR vào năm 1985 là nhà hóa sinh học người Mỹ Karry Mullis

Đầu tiên, PCR sử dụng enzyme Klenow của E coli, enzyme này bất hoạt ở nhiệt độ 75oC, vì vậy phải tách riêng từng chu kỳ, sau mỗi giai đoạn biến tính của từng chu kỳ phải bổ sung thêm enzyme Klenow Năm 1988 Frances C., David Gelfand và Susanne Stoffel phân lập được DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq - DNA polymerase) có khả năng chịu nhiệt Sự phát minh ra Taq - DNA polymerase giúp cho kỹ thuật PCR nhanh, đơn giản và có thể thực hiện tự động trên máy luân nhiệt

Hình 1.6 Chu trình phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR trong xét nghiệm KSTSR

Kỹ thuật PCR sử dụng trong chẩn đoán, xác định loài KSTSR là Nested - PCR (PCR lồng) Kỹ thuật này có khả năng phát hiện được KST ở mật độ rất thấp (1 KST/μl máu) Kỹ thuật Nested - PCR có thể phân tích được các mẫu máu thu thập từ thực địa và phát hiện được 4 loài KSTSR gây bệnh cho người Đoạn DNA đích cần nhân bản trong kỹ thuật PCR này là gen ghi mã 18 đơn vị nhỏ RNA

ribosome (18 small subunit ribosomal RNA, 18ss - rRNA) Đoạn gen này đã được xác định trình tự và đặc hiệu cho từng loài KSTSR Sự khác nhau về trình tự oligonucleotide của 4 loài cho phép thiết kế những đôi mồi đặc hiệu loài phù hợp

- Bước một, thực hiện phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium

với 2 mồi (primer) Sản phẩm thu được sẽ dùng cho bước hai

- Bước hai, sản phẩm của bước 1 sẽ được sử dụng để nhân bản gen đặc hiệu

cho từng loài Plasmodium với các đôi mồi đặc hiệu cho P falciparum, P vivax, P

malariae và P ovale Mồi sử dụng cho PCR lần 2 được thiết kế nằm trong đoạn đã

biết của sản phẩm PCR lần 1

Hình 1.7 Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR

Kết quả các sản phẩm Nested - PCR được kiểm tra trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide

P ovale

P falciparum

P malariae

P vivax

Hình ảnh chạy điện di trên gel agarose 2% nhuộm ethidium

bromide phát hiện các băng đặc hiệu của Plasmodium DNA

Hình 1.8 Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR

Thuận lợi lớn nhất của kỹ thuật này là tăng độ nhạy lên rất nhiều lần, nhưng cũng có bất lợi là tăng thời gian, tăng hóa chất và tăng khả năng bị tạp nhiễm Tuy nhiên, để phát hiện được một KST trong toàn bộ hệ gen còn quan trọng và cần thiết hơn các điều kiện bất lợi trên

Kỹ thuật PCR ngoài việc phát hiện được KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1μl máu) còn có khả năng xác định các trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó, hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét Với ưu điểm này, kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong công tác PCSR

Nhiều tác giả đã thực hiện các công trình nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán trên

Một nghiên cứu của nhóm tác giả Postigo M tiến hành tại Venezuela (1998)

100 mẫu máu bệnh nhân thu thập được phân tích bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật thường quy soi lam máu nhuộm Giêm sa Trong số 100 mẫu, PCR xác định được

99% các trường hợp nhiễm P vivax; 100% các trường hợp nhiễm P falciparum Có

6 trường hợp kỹ thuật Giêm sa không phát hiện được (6%) Kỹ thuật PCR phát

hiện: 29% (17/59) các trường hợp Giêm sa xác định nhiễm đơn P vivax có sự hiện diện của P falciparum [27]

Sedigheh Zakeri và cộng sự (2002) đã thu thập 120 mẫu máu tại trung tâm y

tế huyện Chahbahar, Iran Soi lam máu nhuộm Giêm sa kết quả phát hiện được 107

ca dương tính trong đó nhiễm đơn P vivax là 84 ca (70%) và nhiễm đơn P

falciparum là 20 ca (16,7%) và chỉ phát hiện được 3 ca nhiễm phối hợp P vivax, P falciparum (2,5%) Kỹ thuật PCR có độ nhạy cao hơn so với nhuộm Giêm sa phát

hiện được 31 ca nhiễm phối hợp và phát hiện 9 ca dương tính trong số 13 ca có kết quả âm tính đối với kỹ thuật nhuộm Giêm sa [31]

Lê Đức Đào và cộng sự (2002) sử dụng đồng thời 3 kỹ thuật: soi lam máu

nhuộm Giêm sa, Paracheck và PCR xác định P falciparum trên đối tượng trẻ em dưới 10 tuổi, bệnh nhân sốt rét P falciparum sau 14 ngày điều trị thuốc sốt rét và

đồng bào dân tộc Bana, tại xã Đaksong huyện Krongchro tỉnh Gia Lai năm 2003

Kỹ thuật PCR phát hiện được 41,6% số mẫu có KSTSR trong các mẫu điều tra đối tượng trẻ em dưới 10 tuổi có kết quả Paracheck âm tính Kỹ thuật PCR cũng phát

hiện 3 mẫu có P falciparum trong 25 và 20 mẫu mà kỹ thuật Giêm sa và Paracheck

có kết quả âm tính ở ngày thứ 14 của bệnh nhân sau khi điều trị Fansidar hoặc Artesunate [6]

Nguyễn Quốc Hưng và cộng sự (2003) tiến hành xét nghiệm 2770 bệnh nhân bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và test Paracheck Pf Kết quả so sánh với nhuộm Giêm sa thì Paracheck Pf có độ nhạy 80,7%; độ đặc hiệu là 96,8% Test Paracheck

Pf có độ nhạy giảm nếu mật độ KST <500 KST/μl máu [12]

Sự ra đời của các phương pháp chẩn đoán mới đều nhằm mục tiêu chẩn đoán chính xác, phát hiện KSTSR ở giai đoạn sớm Điều này giúp bệnh nhân có một hướng điều trị kịp thời cũng như ngăn chặn sự lây nhiễm KSTSR

1.5 ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT

1.5.1 Nguyên tắc điều trị

- Điều trị sớm, đúng và đủ liều

- Điều trị cắt cơn sốt kết hợp với chống lây lan (sốt rét do P.falciparum) và điều trị tiệt căn (sốt rét do P.vivax)

- Các trường hợp sốt rét do P.falciparum không được dùng một thuốc sốt

rét đơn thuần, phải điều trị thuốc sốt rét phối hợp để hạn chế kháng thuốc và tăng hiệu lực điều trị

- Điều trị thuốc sốt rét đặc hiệu kết hợp với điều trị hỗ trợ và nâng cao thể trạng

1.5.2 Thuốc sốt rét theo nhóm người bệnh, chủng loại ký sinh trùng sốt rét

Chloroquin +Primaquin (14 ngày)

Chloroquin Dihydroartemisinin - Piperaquin +

Primaquin (14 ngày)

Quinin +

Quinin + Clindamycin

- Phun hóa chất diệt muỗi phun trong nhà, các loại sản phẩm bảo vệ cá nhân

có tác dụng xua côn trùng để bôi lên da hoặc quần áo

- Sử dụng màn tẩm hóa chất, dùng lưới che cửa sổ và cửa ra vào ngăn không cho muỗi vào nhà, mặc quần áo dài tay để tránh muỗi đốt

- Sử dụng tác nhân sinh học như các loại cá thích ăn ấu trùng muỗi, vi khuẩn diệt ấu trùng muỗi (chế phẩm bacillus thuringensis H, bacillus sphaericus…)

- Dọn vệ sinh, cải tạo môi trường, phát quang cây cối

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

Người dân sống tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước, không phân biệt độ tuổi và giới tính Ghi nhận những trường hợp đang sốt (nhiệt độ cơ thể đo ở nách ≥ 37,5 oC) hoặc có sốt trong vòng 15 ngày trước đó

2.1.2 Thời gian

Thời gian thu thập mẫu: thực hiện 2 đợt thu thập mẫu vào tháng 9/2010 và tháng 12/2010 Vì tháng 9 và tháng 12 là mùa bệnh sốt rét tăng cao, giúp cho việc thu thập mẫu được thuận lợi và nhanh chóng

2.1.3 Địa điểm: huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu chứng dương

Sử dụng chủng chứng dương của P falciparum là F25 và T96 được nuôi cấy

bằng môi trường RPMI 1640 tại labo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP

Hồ Chí Minh do hiện nay, tại các phòng thí nghiệm chỉ nuôi cấy được chủng P

falciparum chưa nuôi cấy được các chủng khác Do đó, không có các chủng P vivax, P malariae, P ovale chuẩn để đối chứng

2.2.2 Vật liệu của kỹ thuật nhuộm Giêm sa

- Kính hiển vi

- Kim chích máu, lam sạch, lam để kéo máu, giá lam

- Dầu soi kính

- Máy đếm KSTSR

- Cồn ethanol 70%, cồn methylic tuyệt đối

- Dung dịch Giêm sa mẹ (được pha từ bột Giêm sa 3,8g; cồn methanol 250ml; Glycerol 250ml) Pha dung dịch Giêm sa 5% trong nước cất để sử dụng

2.2.3 Vật liệu của kỹ thuật PCR

2.2.3.1 Hóa chất dùng để tách chiết DNA

Plu Plu5 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’

Plu6 5’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài KSTSR

FAL FAL1 5’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3’

FAL2 5’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3’ VIV VIV1 5’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3’

VIV2 5’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3’ MAL MAL1 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3’

MAL2 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3’ OVA OVA1 5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3’

OVA2 5’-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3’

- Taq polymerase và các hóa chất đi kèm gồm: đệm dùng cho phản ứng PCR 10X, dung dịch MgCl2 25mM (Sigma)

- dNTPs ( dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 10mM (Sigma)

2.2.3.3 Hóa chất dùng cho điện di

- Thang DNA (Molecular Weight Marker): Thang DNA sử dụng là thang

100 bp (ABgene) và thang X174 HaeIII (ABgene)

Tris base 108g Boric acid 55g EDTA 0,5M (pH 8) 40ml Nước cất vừa đủ 1 lít

- Đệm tải mẫu (loading buffer): Brommophenolblue 15mg, TE 1X 50ml, Glycerol 50ml

- Dung dịch nhuộm màu: Ethidium bromide 5mg/ml

- Dung dịch đệm diện di: TBE 1X

2.3 CÁC THIẾT BỊ CHÍNH

- Kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần (Olympus)

- Máy luân nhiệt Eppendorf 5330

- Máy lắc (Ika Labortechnik)

- Máy ly tâm (Eppendorf)

- Bộ nguồn và khay điện di (Hoefer)

- Hệ thống chụp gel và xử lý ảnh (Biorad)

- Các loại micropipet có dung tích từ 0,5μl đến 1000μl, eppendorf 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml và các loại hóa chất, thiết bị phòng thí nghiệm thông thường khác

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu cắt ngang mô tả

2.4.2 Phương pháp thu thập số liệu

Mỗi điểm điều tra khoảng 217 đối tượng để phân tích các chỉ số

2.4.2.2 Thu thập mẫu máu ngoại vi trên lam kính

Sát khuẩn bằng cồn 70o, sử dụng kim chích máu lấy máu ở đầu ngón tay đối với người lớn, ở trẻ em lấy ở ngón chân cái Bỏ giọt máu đầu Lấy 2 đến 3 giọt máu

để làm giọt dày, lấy 1 giọt máu và dùng 1 cạnh lam khác để kéo máu với góc 45o làm giọt mỏng Để khô lam tự nhiên Ghi đầy đủ các thông tin trên lam Soi và trả lời kết quả tại thực địa

2.4.2.3 Thu thập mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM

Tương tự như lấy máu trên lam kính Nhỏ máu lên giấy thấm sao cho giọt máu thấm đều đường kính 1cm (30 - 50μl) Để khô cho vào những túi nylon riêng biệt ghi cùng ký hiệu với lam máu bảo quản ở nhiệt độ 4 - 8oC đem về phòng thí nghiệm thực hiện kỹ thuật PCR

2.4.3 Kỹ thuật nghiên cứu

2.4.3.1 Kỹ thuật nhuộm Giêm sa

- Cố định giọt mỏng bằng cồn methylic tuyệt đối trong 30 giây

- Nhỏ dung dịch nhuộm Giêm sa 5% (pH 7,2) lên lam máu, thời gian nhuộm

30 phút

- Rửa thuốc nhuộm bằng nước sạch và để khô lam

2.4.3.2 Kỹ thuật soi kính hiển vi phát hiện KSTSR

- Soi bằng vật kính dầu có độ phóng đại 100x, thị kính 10x

- Nhỏ một giọt dầu soi vào giọt dày và một giọt vào phần đuôi của giọt mỏng

- Đặt tiêu bản lên kính soi giọt dày trước, giọt mỏng sau

- Soi lần lượt giọt máu theo hình díc dắc để tránh bỏ sót và lặp lại

- Soi phát hiện KSTSR ở giọt máu dày và định loại KSTSR ở giọt máu mỏng

- Soi 100 vi trường trên tiêu bản giọt dày nếu phát hiện được KSTSR thì dừng soi trả lời kết quả

- Soi 200 vi trường trên tiêu bản giọt dày nếu không phát hiện được KSTSR mới kết luận âm tính

Cách ghi kết quả xét nghiệm

Lam máu dương tính được ghi rõ loài, thể, mật độ KSTSR

Theo quy ước, dùng dấu + để chỉ mức độ nhiễm KSTSR trong máu nhiều hay ít Nhiều dấu + là bệnh nhân có nhiều KSTSR trong máu (Mức độ nặng của bệnh nhân)

Ft++ hoặc Ft++s+g+ hoặc Vt++g++

F: Viết tắt của loài ký sinh trùng P falciparum

V: Viết tắt của loài ký sinh trùng P vivax

t: Viết tắt thể tư dưỡng (Trophozoite) của KSTSR

s: Viết tắt thể phân liệt (Schizonte) của KSTSR

g: Viết tắt thể giao bào (Gametocyte) của KSTSR